專利名稱：使用微生物生產(chǎn)氨基酸的方法
使用微生物生產(chǎn)氨基酸的方法本申請要求DE 10 2005 043 979. 9的優(yōu)先權(quán)。本發(fā)明涉及用于在產(chǎn)氨基酸的微生物中生產(chǎn)氨基酸的方法，在所 述方法中通過發(fā)送蛋白(Transmitter-Protein)來降低2-酮戊二酸 脫氫酶的活性。現(xiàn)有技術(shù)氨基酸具有巨大的經(jīng)濟(jì)利益，其中氨基酸的用途是多種多樣的 優(yōu)選地使用它們來改善基礎(chǔ)食物和飼料的品質(zhì)。因此，它們具有極大 的經(jīng)濟(jì)重要性；對于它們的需求日益增加。例如，需要L-賴氨酸以及 L-蘇氨酸、L-甲硫氨酸和L-色氨酸用作飼料添加劑，需要L-谷氨酸用 作調(diào)料添加劑，制藥工業(yè)中需要L-異亮氨酸和L-酪氨酸，需要L-精 氨酸和L-異亮氨酸用作藥物，或者需要L-谷氨酸、L-天冬氨酸和L-苯丙氨酸用作用于合成精細(xì)化學(xué)品的起始物質(zhì)。用于制備這些各不相同的氨基酸的優(yōu)選方法是通過微生物進(jìn)行的 生物技術(shù)制備，因?yàn)檫@樣可直接獲得各種氨基酸的生物學(xué)活性和旋光 活性形式，并且能夠使用簡單和便宜的原料。目前，通過微生物生產(chǎn) 超過1.5 X 106噸的氨基酸。已知通過棒狀細(xì)菌特別是谷氨酸棒桿菌 (CoiT/7e6acfer/咖^7i/"邊/'c咖)菌林的發(fā)酵來制備氨基酸。由于其 巨大的重要性， 一直進(jìn)行努力以改進(jìn)制備方法。方法的改進(jìn)可以為發(fā) 酵技術(shù)措施例如攪拌和供氧，或營養(yǎng)培養(yǎng)基的組成例如發(fā)酵過程中的 糖濃度，或通過例如離子交換層析逐步形成產(chǎn)物形式，或微生物本身 的內(nèi)在性能特征。使用誘變、選擇和突變體選擇的方法來改善所述微生物的性能特征。如此，獲得這樣的菌林，其對于抗代謝物(例如，賴氨酸類似物S- (2-氨基乙基)半胱氨酸)具有抗性或?qū)τ谠谡{(diào)控上重要的代謝物為 營養(yǎng)缺陷型的，并且產(chǎn)生L-氨基酸。近些年來，通過擴(kuò)增單個(gè)氨基酸生物合成途徑并研究對氨基酸產(chǎn) 量的影響，還將重組DNA技術(shù)的方法用于產(chǎn)氨基酸的棒桿菌菌林的菌 林改進(jìn)。除其他以外，可在Kinoshita ( "Glutamic acid bacteria"， in: Biology of Industrial Microorganisms, Demain和Solomon (Eds.)， Benjamin C翻ings， London, UK, 1985， 115-143)， Hilliger (BioTec 2， 40-44 (1991))， Eggeling (Amino Acids 6: 261-272 (1994))， Jetten和Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995))，和Sahm等人(Annals of the New York Academy of Sciences 782， 25-39 (1996))中找到關(guān)于該方面的綜述。細(xì)菌通常只以生長所需的量產(chǎn)生氨基酸，從而不形成和不排出 (aussheiden)過量的氨基酸。其原因是，在所述細(xì)胞中以多種方式 控制氨基酸的生物合成。因此，已知許多不同的方法通過關(guān)閉控制機(jī) 制來增加產(chǎn)物的形成。在這些方法中使用例如氨基酸類似物以終止有 效的生物合成調(diào)節(jié)。因而，例如，描述了其中使用對于L-酪氨酸類似 物和L-苯丙氨酸類似物具有抗性的棒桿菌菌林的方法(JP 19037/1976 和39517/1978 )。還描述了其中使用對于L-賴氨酸類似物或者還有 L-蘇氨酸類似物具有抗性的細(xì)菌以克服控制機(jī)制的方法(EP 0 205 849， GB 2 152 509 )。此外，還已知通過重組RNA技術(shù)構(gòu)建的微生物，在所述微生物中 同樣通過克隆和表達(dá)編碼不再可被反饋抑制的關(guān)鍵酶的基因來取消生 物合成調(diào)節(jié)。例如，已知重組的產(chǎn)L-賴氨酸的細(xì)菌，其具有由質(zhì)粒編 碼的反饋抗性的天冬氨酸激酶(EP 0 381 527 )。還公開了重組的產(chǎn) L-苯丙氨酸的細(xì)菌，其具有反饋抗性的預(yù)苯酸脫氫酶(JP 123475/1986， EP 0 488 424)。此外，還通過過表達(dá)不編碼反饋敏感性的氨基酸合成的酶的基因 而獲得了增加的氨基酸產(chǎn)率。例如，通過二氫吡啶二羧酸合酶的合成增加來改善賴氨酸的形成(EP 0 197 335 )。同樣，通過蘇氨酸脫水 酶的合成增加來獲得改善的異亮氨酸的形成(EP 0 436 886 )。進(jìn)一步地，在Izumi Y， Yoshida T， Miyazaki SS， Mitsunaga T， 0hshiro T， Shiamo M， Miyata A和Tanabe T (1993) Applied Microbiology and Biotechnology, 39: 427-432中描述了借助于曱 基營養(yǎng)菌例如生絲微菌屬(i^; 力o邊/crM/i/邁)的細(xì)菌從甲醇和甘氨酸 發(fā)酵制備L-絲氨酸。用于增加氨基酸產(chǎn)量的其他努力旨在改善中央代謝的細(xì)胞初級代 謝物的供給。在此已知通過重組技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)酮醇酶過表達(dá)使得能夠 改善L-色氨酸、L-酪氨酸或L-苯丙氨酸的產(chǎn)物形成(EP 0 600 463 )。 此外，降低棒桿菌中的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性導(dǎo)致改善了芳香族 氨基酸的形成(EP 0 3331 145 )，然而增強(qiáng)棒桿菌中的磷酸烯醇丙酮 酸羧化酶的活性導(dǎo)致增加了天冬氨酸家族的氨基酸的排出 (Ausscheidimg) (EP 0 358 940 )。還在工業(yè)上使用谷氨酸棒桿菌來制備谷氨酸家族的L-氨基酸，特 別是L-谷氨酸。W0 99/18228A2公開了，在由于酶的遺傳改變而導(dǎo)致 丙酮酸羧化酶的活性增強(qiáng)后或在丙酮酸羧化酶基因的表達(dá)增加后，微 生物對于天冬氨酸和/或谷氨酸家族的氨基酸產(chǎn)生增加。L-谷氨酸是從檸檬酸循環(huán)中間體2-酮戊二酸形成的。兩個(gè)反應(yīng)竟 爭所述2-酮戊二酸將2-酮戊二酸與銨發(fā)生反應(yīng)并還原成L-谷氨酸 的NADPH依賴性L-谷氨酸脫氫酶(GDH),和作為檸檬酸循環(huán)的組成 部分使2-酮戊二酸脫羧成琥珀酰-CoA并在該過程中將MD+還原成 NADH的2-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物(0DHC)。在谷氨酸棒桿菌中，對于 2-酮戊二酸來說GDH的L-值是5. 7 mM (Shiio和0zaki， J. Biochem (Tokyo) 68: 633-647 (1970))，這是為80 jiM的對于2-酮戊二酸來 說0匿的L-值(Shiio和Ujigawatakeda， Agric. Biol. Chem. 44: 1897-1904 (1980))的大約70倍。更近的研究表明，棒桿菌中的2-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物的活性是對于谷氨酸的產(chǎn)量影響最大的因素 (Shimizu等人，Bioproc. Biosys. Eng. 25: 291-298 (2003))，因?yàn)镚DH活性的增強(qiáng)不產(chǎn)生有利于谷氨酸合成的偏移。通過文獻(xiàn)中的下述提示確認(rèn)了 ODH復(fù)合物的影響該酶的活性在 導(dǎo)致谷氨酸排出的條件(例如生物素限制、添加去污劑或添加青霉素) 下降低(Kawahara 等人，Biosci. Biotechnol. Biochem. 61: 1109-1112 (1997)) 。 GDH的活性在相同的條件下不被改變。此外， 在誘導(dǎo)溫度敏感型谷氨酸棒桿菌菌林形成谷氨酸的情況下，也顯示出 降低的0DHC活性(Uy等人，Bioproc. Biosyst, Eng. 27: 153-162 (2005))。此夕卜，Kimura (J. Biosc. Bioeng.，第94巻，No. 6， 545-551， 2002 )描述了，在谷氨酸棒桿菌中dtsRl基因缺失的情況下，ODHC的 活性比親本菌林中的ODHC的活性低30%(Kimura， J. Bioscience Bioeng. 94: 545-551 (2002) ) 。 dtsRl缺失突變體對于油酸和油酸 酯是營養(yǎng)缺陷型的，并且甚至在生物素過量的情況下也分泌大量的L-谷氨酸(Kimura等人，Biochem. Biophys. Res. Comm. 234: 157-161 (1997))。迄今，只有通過缺失基因gdh( B5rmann等人，Mol. Microbiol. 6: 317-326 (1992); B5rmann-El Kholy 等人，Appl. Environm. Microbiol. 59: 2329-2331 (1993))和odhA (編碼0DHC的Elo; Usuda 等人，Microbiology 142: 3347-3354 (1996))或者改變它們的表達(dá) 才能獲得2-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物和谷氨酸脫氫酶的活性的靶向改 變。2-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物(0DHC)存在于大多數(shù)生物中，其由三 種具有不同酶活性的不同蛋白質(zhì)即2-酮戊二酸脫氫酶(Elo) 、 二氫 硫辛酰胺-S-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶(E2)和二氫硫辛酰胺脫氫酶(E3)組成。 棒桿菌的Elo蛋白(由odhA基因編碼)具有特殊的結(jié)構(gòu)，因?yàn)槠湓诎?基末端區(qū)域中具有與E2亞基的羧基末端區(qū)域同源的區(qū)域(Usuda等人， Microbiology 142: 3347-3354 (1996))。Cowley等人(Mol. Microbiol. 52: 1691-1702 (2004))顯示， 在結(jié)核分枝桿菌(妙co6a"er/"邁"6ercw/o"'s) H37Rv中，通過pknG基因的缺失使細(xì)胞中的谷氨酸和谷氨酰胺濃度之和增加為相應(yīng)親本菌林的2. 64倍。然而，沒有描述單種氨基酸谷氨酸和谷氨酰胺的細(xì)胞內(nèi) 濃度。pknG基因編碼其細(xì)胞功能迄今未曾被描述的絲氨酸/蘇氨酸蛋 白激酶。只認(rèn)識到PknG蛋白對細(xì)胞生長的重要性。沒有pknG基因的 結(jié)核分枝桿菌H37Rv突變體于在Cowley等人(Mol. Microbiol. 52: 1691-1702 (2004))中所指定的生長條件下達(dá)到其最大值只有親本菌 林的細(xì)胞密度的一半的細(xì)胞密度，這可通過600 nm處的光密度來測定。發(fā)明目的本發(fā)明的目的是指明增加氨基酸特別是谷氨酸和谷氨酰胺的排出 的進(jìn)一步的可能性，這更加有效并且不再具有現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)。發(fā)明描述通過用于在產(chǎn)氨基酸的微生物中生產(chǎn)氨基酸的方法實(shí)現(xiàn)了該目 的，在所述方法中通過發(fā)送蛋白來降低2-酮戊二酸脫氬酶復(fù)合物的活 性。術(shù)語"活性，，描述酶將底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的能力。可在所謂的"活 性測試"中通過產(chǎn)物的增加、底物(或反應(yīng)物)的減少或特定輔因子性。根據(jù)本發(fā)明，2-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物的活性是指將2-酮戊二 酸、輔酶A和NAD+催化轉(zhuǎn)化成琥珀酰-CoA、 C02、 NADH和H+。根據(jù)本發(fā)明，活性、產(chǎn)量或濃度的增加或減少，原料、產(chǎn)物、反 應(yīng)物或底物的增加和減少涉及在相同條件下在比較實(shí)驗(yàn)中與親本菌抹 的比較，所述親本菌林不具有2-酮戊二酸脫氬酶活性的根據(jù)本發(fā)明的 降低。親本菌抹是指這樣的微生物的菌抹，其用作起始菌株并且經(jīng)歷改變以根據(jù)本發(fā)明降低2-酮戊二酸脫氫酶的活性。如果ODHC的活性降低，那么底物2-酮戊二酸主要通過谷氨酸脫 氬酶(GDH)與銨、NADOPH和H+反應(yīng)，從而產(chǎn)生L-谷氨酸和NADP+, 由此增加細(xì)胞的谷氨酸含量。因?yàn)長-谷氨酸是在從相應(yīng)的2-酮基化合 物合成L-氨基酸中最重要的氨基供體，因此谷氨酸濃度的增加也增加 了作為后繼產(chǎn)物的其他氨基酸的產(chǎn)量。作為實(shí)例在此提及谷氨酰胺、 天冬氨酸、鳥氨酸、天冬酰胺、精氨酸、賴氨酸、纈氨酸、亮氨酸、 異亮氨酸、曱硫氨酸、半胱氨酸和/或脯氨酸。作為本發(fā)明的主題的微生物可從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥 芽糖、糖蜜、淀粉、纖維素或者從甘油和乙醇產(chǎn)生氨基酸，特別是L-谷氨酸。作為微生物使用棒狀細(xì)菌，優(yōu)選革蘭氏陽性棒狀細(xì)菌，棒桿菌科 (Coiy"e6s"eT/aceae)、分枝桿菌科(妙co6a"er/aceae)、 丙酸 桿菌科(尸ro/7/aa/6a"er/flcae)、鏈霉菌科(^re/^咖/c"aceae) 或乳桿菌科(^c^ 6ac/7/scae)，特別優(yōu)選棒桿菌科或分枝桿菌科或 鏈霉菌科的細(xì)菌。下列可以是棒狀細(xì)菌的代表，例如，諾卡氏菌科(^ canf/aceae)、 迪茨氏菌科("/"ziaceae)、戈登氏菌科(Co油/2/aceae)、冢村氏 菌科(7^ir3;z7ure//flcese)、紅球菌屬()、斯科曼氏菌 屬(5^eT7Z/a/ /a) 、 /^'///aiz^/acefle,優(yōu)選棒桿菌科，特別是棒桿菌屬 (a>iT"e&c"r/wz7)的細(xì)菌。在棒桿菌屬中，可特別提及谷氨酸棒桿 菌和0 iy/2e^crer/wz/ e/Y7c/e/7S類型，所述細(xì)菌就其產(chǎn)生L-氨基酸 的能力而言在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的(Eggeling， L.和Bott， M. ， Handbook of Corynebacterium glutamicum， CRC Press, Boca Raton, USA (2005))。棒桿菌屬特別是谷氨酸棒桿菌類型的合適的菌林例如是已知的野 生型菌林谷氨酸棒桿菌ATCC13032,醋谷棒桿菌(Cor"e^s"er/咖ac"o^7W緒/cw邁)ATCC15806，嗜乙酰乙酸棒桿菌(Coiy/ e6acfer/i;/z7 acefoac/ifo/7A//wz7) ATCC13870,棲糖蜜棒桿菌(Car7fle6s"er/咖/z7e/ssseco7fl ) ATCC17965， 熱產(chǎn)氛棒軒菌(Cor/zze6ac^er/wz7 f力er邁( a/z7/i3C^e/7es ) FERM BP-1539,黃色短桿菌(Sre".6fl"eW咖/7歸邁)ATCC14067， 乳發(fā)酵短桿菌(A，/^s"er/咖/s"0尸e飾/7f咖)ATCC13869,和擴(kuò)展短桿菌(Are"'6a"er/咖力Var/c"咖)ATCC14020。 原則上，所有已知用于氨基酸的生物技術(shù)工業(yè)生產(chǎn)的微生物可用于本發(fā)明的方法。棒狀細(xì)菌的其他菌林也是合適的，例如產(chǎn)氨性短桿菌 (AreF/6fl"er/'i/邁膝/z2(^e/7es )、 擴(kuò)展短桿菌、產(chǎn)氨短桿菌 (Are7/6a"eW咖緒邁o/z/age/zes)、 黃色短桿菌(5re「/6a"er/咖 /7肝咖)、乳發(fā)酵短桿菌、玫瑰色短桿菌("re"'6fl"eW咖，e咖)、 解糖短桿菌(Are"'6a"eW咖^<3^力3_^//〃<7//邁)、AreF/6s"er/咖 /邁頂ai"/o/7力/7wz7、 嗜乙酰乙酸棒桿菌、百合棒桿菌(Cor7"/7e6sc^er/w/B 、美棒桿菌(Cor7ne6a"eW咖cfl//w/2<2e)和力士棒桿菌 (Cor/z7e6a"er/咖Aercw/is)。 在"Handbook of Corynebacterium glutamicum，， ， L. Eggeling和M. Bott (eds.)， CRC Press, Boca Raton, USA (2005)，第2. 4章中指出了本發(fā)明可使用的其他細(xì)菌， 例如無枝菌酸棒桿菌(fl邊/co/s^邊)、irro/7/7e/L^^/〃/、非典 型棒桿菌(a077/c咖)、耳炎蘇黎世菌(77/r/ce"a 0〃〃力'iO 、 美棒桿菌、C e/77c/e/7s、產(chǎn)氨棒桿菌(C.炎棒桿菌(C. c"〃"V")、多毛棒桿菌(C. J3270S咖)、產(chǎn)氨棒桿 菌、無枝菌酸棒桿菌、干燥棒桿菌(C. "r^/s)、模仿棒桿菌(C. // /"/75)、假白喉棒桿菌(/^ei/^^//;7/^Aer/〃ci//zO 、科寸尹爾棒 桿菌(C. 、紋帶棒桿菌(C. s"/W咖)、苛求棒桿菌(C.尸a"/ /os咖)、產(chǎn)粘棒桿菌(C.銜c/尸ac/e/7s)、接近棒桿菌(Cpro/72./7《uu邁)、易混棒桿菌(C. co/2尸"s咖)、C su/7"Fa//e/7se、 C. f力o釘se力//、灰綠棒桿菌(C. ^7ayc咖)、C, 7//70/7力"o/7amz7、 類真菌棒桿菌(C町c"o/^)、闌尾炎棒桿菌(C. fl/7/7e/2f/ec/s)、 模仿棒桿菌、美棒桿菌、C. e/77"'e/2S、 C, /7cesce/2S、解脲棒桿菌(C. urea7/〃c咖)、杰氏棒桿菌(C. /e/le/w邁)、C. 尸"se/7/7、 牛棒桿菌(C, ^r/s)、變異棒桿菌(C. KaWaW/")、白喉?xiàng)U菌(C. d/p/^力er/ae) 、 C. F/faeri//!7//72 、庫氏棒軒菌(C. iri/fsc力er/')、 解葡萄糖苷棒桿菌(C. ^wc"ro/7o/y〃c"邊)、牛腎盂炎棒桿菌(C. re"a/e)、乳腺炎棒桿菌(C /zws〃7/f//s)、堅(jiān)初棒桿菌(C. ^/r"/z )、 ,^>色棒軒菌(C. nigricans)、極"、棒軒菌/ss/zzzw/z )、 模擬棒桿菌(C. s/范w/s/7《)、C. "r/7e/zo"6A/wz 、假結(jié)核棒桿菌(C. 卿油勵(lì)e徹7o《/s)、假白喉棒桿菌、科伊爾棒桿菌。為了產(chǎn)生氨基酸，可以連續(xù)地或不連續(xù)地在分批法(批量法)或 補(bǔ)料分批法(進(jìn)料法)或重復(fù)的補(bǔ)料分批法中培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明制備的 微生物。在Chmiel的教科書(Bioprozesstechnik 1. Einftlhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag， Stuttgart, 1991))中或者在Storhas的教科書(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag， Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) 中描述了關(guān)于已知的培養(yǎng)方法的綜述。待使用的培養(yǎng)基必須以合適的方式滿足各自菌林的要求。美國細(xì) 菌學(xué)學(xué)會(huì)的手冊"Manual of Methods for General Bacteriology"(Washington D.C.， USA, 1981)中包括了關(guān)于不同微生物的培養(yǎng)基 的描述。作為碳源可以使用糖類和碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖、乳 糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉和纖維素，油和脂肪例如大豆油、葵 花籽油、花生油和椰子油，脂肪酸例如棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸，醇 類例如甘油和乙醇，以及有機(jī)酸例如醋酸。作為氮源可以使用含氮有 機(jī)化合物例如蛋白胨、酵母提取物、肉骨、麥芽汁、玉米漿、大豆粉 和尿素，或者無機(jī)化合物例如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝 酸銨?？梢詥为?dú)地或以混合物的形式使用氮源。作為磷源可以使用磷酸、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或者相應(yīng)的含鈉鹽。培養(yǎng)基應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步 包含生長所需的金屬鹽例如硫酸鎂或硫酸亞鐵。最后，除了上述物質(zhì) 外，還可使用必需生長物質(zhì)例如氨基酸和維生素。此外，可向培養(yǎng)基 中加入合適的前體?？梢詫⑺龅奶砑恿弦詥未翁砑拥男问郊尤肱囵B(yǎng) 物中或者在培養(yǎng)過程中以合適的方式加料入培養(yǎng)物中。通過以合適的方式使用堿性化合物例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨或氨水或者酸性化合物例如磷酸或硫酸來控制培養(yǎng)物的pH?？梢允褂?消泡劑例如脂肪酸聚乙二醇酯來控制泡沫形成。為了保持質(zhì)粒的穩(wěn)定 性，可以向培養(yǎng)基中加入合適的起選擇作用的物質(zhì)例如抗生素。通過 向培養(yǎng)物中導(dǎo)入氧氣或含氧氣體混合物例如空氣來維持需氧條件。培養(yǎng)溫度通常為2ox:至45X:，優(yōu)選25匸至40X:。繼續(xù)培養(yǎng)直至產(chǎn)生氨基酸優(yōu)選谷氨酸的最大量。當(dāng)培養(yǎng)上面所列的微生物時(shí)，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法 例如生物素限制、添加青霉素或其他抗生素、添加去污劑例如Tween-40和Tween-60、添加乙胺丁醇、消除(ausschal ten)基因和其他脂肪酸生物合成基因的作用或增加溫度來誘導(dǎo)谷氨酸的排出。谷氨酸形成的誘導(dǎo)是指與在條件無上述改變的情況下的微生物培 養(yǎng)相比，谷氨酸的排出增加。可通過在用鄰苯二醛衍生化后進(jìn)行反相高壓液相色譜，通過熒光 檢觀'J來分析L-谷氨酸，如在Lindroth和Mopper (Anal. Chem. 51: 1667-1674 (1979))中所述。優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中增加氨基酸的L-異構(gòu)體的產(chǎn)量。以其質(zhì)子化形式命名的氨基酸名稱例如谷氨酸(glutamic acid )、 以其脫質(zhì)子化形式命名的氨基酸名稱例如谷氨酸根和以其鹽形式命名 的氨基酸名稱例如谷氨酸鈉或天冬氨酸鈉是等價(jià)的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，氨基酸的產(chǎn)量增加為至少1. 1、 1. 2、 1.3、 1.4、 1.5、 2.0、 3. 0倍，優(yōu)選4. 0、 5. 0倍，特別優(yōu)選10. 0倍 或更多倍。本發(fā)明方法的本質(zhì)特征是通過發(fā)送蛋白來降低2-酮戊二酸脫氫 酶復(fù)合物的活性。發(fā)送蛋白是指這樣的蛋白質(zhì)，其抑制2-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物的 活性但不影響編碼2-酮戊二酸脫氬酶復(fù)合物的基因的表達(dá)。本發(fā)明還涉及由包括下列核酸序列的核酸序列編碼的發(fā)送蛋白a) 具有SEQU. ID No. 1中所示核酸序列的核酸序列；或b) 能夠根據(jù)簡并的遺傳密碼而通過從SEQU. ID No. 2中所示氨 基酸序列倒譯來推導(dǎo)出的核酸序列；或c) 與SEQ ID NO: 1具有至少50%同 一性的核酸序列。 優(yōu)選地，核酸序列c)與SEQ ID NO: 1具有至少60%、 65%、 70%、75%、 80%,特別優(yōu)選85%、 90%,特別地91%、 92°/。、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%或99°/。的同一性。術(shù)語"同源的"或"同源性"也可用作術(shù)語"同一性"的等同術(shù)語?；赟mith, T. F.和Waterman, M. S (Adv. Appl. Math. 2: 482-489 (1981))的算法，通過借助于BESTFIT程序進(jìn)行的比較來計(jì) 算兩個(gè)核酸序列或多肽序列之間的同 一性，對于氨基酸設(shè)置下列參數(shù)缺口產(chǎn)生罰分8缺口延伸罰分2， 和對于核酸設(shè)置下列參數(shù)缺口產(chǎn)生罰分50缺口延伸罰分3。 優(yōu)選地，通過在各自總序列長度上的核酸序列/多肽序列的同 一性 來定義兩個(gè)核酸序列或多肽序列之間的同一性，如基于Needleman， S. B.和Wunsch， C. D. (J. Mol. Biol. 48: 443-453))的算法通過借 助于GAP程序進(jìn)行的比較來計(jì)算的，對于氨基酸設(shè)置下列參數(shù)缺口產(chǎn)生罰分8缺口延伸罰分2, 和對于核酸設(shè)置下列參數(shù)缺口產(chǎn)生罰分50 缺口延伸罰分3。 本發(fā)明的目標(biāo)為SEQ ID NO: 1的其他同源物或功能等價(jià)物，所述 同源物或功能等價(jià)物在嚴(yán)緊條件下與該核酸序列雜交。在此處，"功能等價(jià)物"原則上描述了這樣的核酸序列，其在標(biāo) 準(zhǔn)條件下與核酸序列或核酸序列的一部分雜交，并且能夠在細(xì)胞或生 物體中導(dǎo)致表達(dá)具有與谷氨酸棒桿菌的發(fā)送蛋白0dhl相同的性質(zhì)的 蛋白質(zhì)。為了進(jìn)行雜交，有利地使用具有例如保守區(qū)域或其他區(qū)域的大約 10-50 bp,優(yōu)選15-40 bp的長度的短寡核苷酸，所述區(qū)域可以以本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知的方法通過與其他相關(guān)基因的比較來確定。然而，長 度為100-500 bp的本發(fā)明核酸的更長片段或完整的序列也可用于雜 交。依賴于所使用的核酸/寡核苷酸、片段或完整序列的長度，或者依 賴于用于雜交的核酸的類型(即DNA或RNA)，這些標(biāo)準(zhǔn)條件可變化。 例如，DNA:DNA雜交體的解鏈溫度比相同長度的DM: RNA雜交體的解 鏈溫度低大約10匸。標(biāo)準(zhǔn)雜交條件是指例如，依賴于核酸，在具有0. 1至5xSSC (1 xSSC = 0. 15 M NaCl， 15 mM檸檬酸鈉，pH 7.2)的濃度的水性緩沖 液中或者額外地在50%甲酰胺存在的情況下于42。C和58。C之間的溫 度，例如在5xSSC、 50%甲酰胺的情況下42匸。有利地，用于DNA:DNA 雜交體的雜交條件是0. 1 xSSC和大約20X:至65T的溫度，優(yōu)選大約 30。C至45r的溫度。有利地，用于DNA:RNA雜交體的雜交條件是O. 1 xSSC和大約30。C至65。C的溫度，優(yōu)選大約45。C至55。C的溫度。這 些所給出的雜交溫度是在甲酰胺不存在的情況下對于具有大約100個(gè) 核苷酸的長度和50。/。的G+C含量的核酸示例性地計(jì)算出的解鏈溫度值。 用于DNA雜交的實(shí)驗(yàn)條件描述于有關(guān)的遺傳學(xué)教科書例如Sambrook 等人，"Molecular Cloning" ， Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 中，并且可以例如依照核酸長度、雜交體的類型或G+C含量，根據(jù)本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知的公式來進(jìn)行計(jì)算。本領(lǐng)域技術(shù)人員可在下列教科書中荻得關(guān)于雜交的其他信息Ausubel等人(eds) ， 1985， "Current Protocols in Molecular Biology" ， John Wiley & Sons, New York; Hames和Higgins (eds)， 1985， "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach" ， IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991， Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 0xf ord。此外，功能等價(jià)物還指這樣的核酸序列，其與特定核酸序列("原 始核酸序列")具有高至指定百分?jǐn)?shù)的同源性或同一性，并且具有與所 述原始核酸序列相同的活性，此外特別地還具有所述核酸序列的天然 或人工的突變。0dhl的氨基酸序列基元Glu-Thr-Thr-Ser是發(fā)送蛋白Odhl的功 能所必需的。本發(fā)明的目標(biāo)為Odhl的其他功能等價(jià)物，所述功能等價(jià) 物包含氨基酸序列基元Glu-Thr-Thr-Ser。本發(fā)明的發(fā)送蛋白Odhl抑制處于非磷酸化狀態(tài)的2-酮戊二酸脫 氫酶復(fù)合物的活性。優(yōu)選地，所述發(fā)送蛋白在位置14和/或15，優(yōu)選 位置14處的蘇氨酸殘基上不被磷酸化。在該實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明，活性、產(chǎn)量或濃度的增加或減少， 原料、產(chǎn)物、反應(yīng)物或底物的增加和減少涉及在比較實(shí)驗(yàn)中與親本菌 株的比較，所述親本菌株具有被至少部分磷酸化的發(fā)送蛋白Odhl。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，氨基酸的產(chǎn)量增加為至少1.1、 1.2、 1.3、 1.4、 1.5、 2.0、 3. G倍，優(yōu)選4. 0、 5. 0倍，特別優(yōu)選IO. 0倍 或更多倍。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過使蛋白激酶PknG失活來阻止 0dhl的磷酸化。優(yōu)選地，發(fā)送蛋白不被由包括下列核酸序列的核酸序列所編碼的 蛋白激酶PknG磷酸化a) 具有SEQU. ID No. 3中所示核酸序列的核酸序列；或b) 能夠才艮據(jù)簡并的遺傳密碼而通過從SEQU. ID No. 4中所示氨基酸序列倒譯來推導(dǎo)出的核酸序列；或c)與SEQ ID NO: 3具有至少50%同 一性的核酸序列。 在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，降低蛋白激酶PknG的活性。根據(jù)本發(fā)明，可通過在轉(zhuǎn)錄、翻譯和/或翻譯后水平上的改變來使 蛋白激酶PknG的活性降低。所述改變例如是指改變調(diào)控元件例如啟動(dòng) 子活性，所形成的mRNA或蛋白質(zhì)對于核酸酶或蛋白酶降解的穩(wěn)定性， 或者由核糖體結(jié)合導(dǎo)致的翻譯起始或催化酶活性本身的降低或通過改還包括由于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物或RNA聚合酶亞基的失活或修飾而導(dǎo)致的表達(dá) 的改變。此外，還考慮了由于pknG基因的失活而導(dǎo)致的蛋白激酶PknG的 活性低或完全喪失，根據(jù)本發(fā)明這是優(yōu)選的。這可通過本身已知的各 種基因技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)，所述基因技術(shù)方案例如為插入或缺失誘變或 者使用誘變劑對細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)處理。優(yōu)選的是pknG缺失突變體。上述 方法在此只用于舉例說明本發(fā)明而不是限定性的。特別優(yōu)選地，通過缺失包括下述核酸序列的核酸序列來降低蛋白 激酶PknG的活性a) 具有SEQU. ID No. 3中所示核酸序列的核酸序列；或b) 能夠根據(jù)簡并的遺傳密碼而通過從SEQU. ID No. 4中所示氨 基酸序列倒譯來推導(dǎo)出的核酸序列；或c) 與SEQ ID NO: 3具有至少50%同 一性的核酸序列。 優(yōu)選地，核酸序列c)與SEQ ID NO: 1具有至少60%、 65%、 70%、75%、 80%,特別優(yōu)選85%、 90%，特別地91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%的同一性。術(shù)語"同源的，，或"同源性"也可用作術(shù)語"同一性"的等同術(shù)語?；赟mith, T. F.和Waterman, M. S (Adv. Appl. Math. 2: 482-489 (1981))的算法，通過借助于BESTFIT程序進(jìn)行的比較來計(jì)算兩個(gè)核酸序列或多肽序列之間的同 一性，對于氨基酸設(shè)置下列參數(shù):缺口產(chǎn)生罰分8缺口延伸罰分2， 和對于核酸設(shè)置下列參數(shù)缺口產(chǎn)生罰分50缺口延伸罰分3。 優(yōu)選地，通過在各自總序列長度上的核酸序列/多肽序列的同 一性 來定義兩個(gè)核酸序列或多肽序列之間的同一性，如基于Needleman， S. B.和Wunsch， C. D. (J. Mol. Biol. 48: 443-453))的算法通過借 助于GAP程序進(jìn)行的比較來計(jì)算的，對于氨基酸設(shè)置下列參數(shù)缺口產(chǎn)生罰分8缺口延伸罰分2， 和對于核酸設(shè)置下列參數(shù)缺口產(chǎn)生罰分50缺口延伸罰分3。 Niebisch和Bott在Arch. Microbiol 175， 282-294 (2001)中 描迷了用于缺失基因的方法，其也可用于根據(jù)本發(fā)明來缺失pknG基 因。在另一個(gè)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的 方法例如RNA干擾、反義技術(shù)或基因沉默來使pknG基因失活。此外，可通過突變對于Odhl蛋白的磷酸化來說所必需的在PknG 中的那些氨基酸殘基來使pknG基因失活。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過突變Odhl蛋白中的蘇氨 酸殘基14和/或15并在棒桿菌中表達(dá)所述經(jīng)突變的蛋白質(zhì)來荻得 Odhl介導(dǎo)的對于ODHC活性的抑制。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過在谷氨酸棒桿菌中只表 達(dá)Odhl蛋白的部分來獲得Odhl介導(dǎo)的對于ODHC活性的抑制，所述 Odhl蛋白的部分包含序列基元ETTS,但不包含對于與蛋白激酶相互作 用來說所必需的羧基末端Fha結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)在于與各自的親本菌林相比，氨基酸優(yōu)選谷 氨酸的產(chǎn)量明顯增加。特別地，增加了比生產(chǎn)率，即每單位時(shí)間和細(xì) 胞質(zhì)量的情況下排出至培養(yǎng)基中的氨基酸的量。此外，本發(fā)明的方法也導(dǎo)致更高的生產(chǎn)率(空間-時(shí)間產(chǎn)率)。 在下面，將參考實(shí)施例來更詳細(xì)地舉例說明本發(fā)明。實(shí)施例1.谷氨酸棒桿菌中pknG和/或odhl基因的缺失將在Niebisch和Bott(Arch. Microbiol. 175: 282-294 (2001)) 中描述的方法用于缺失谷氨酸棒桿菌ATCC13032中的基因。為了擴(kuò)增pknG基因的5，-和3，-側(cè)翼區(qū)域，分別使用寡核苷酸對 DpknG-l (SEQ ID N0 5 )和DpknG-2 ( SEQ ID NO 6 ) (5'-區(qū)域)以及DpknG-3 ( SEQ ID NO 7 )和DpknG-4 ( SEQ ID NO 8 ) ( 3，-區(qū)域)DpknG-1: 5'畫GACGTCGACGATCACCGACGAACGCGC-3'; SEQ ID NO 5DpknG-2: 5'-CCCATCCACTAAACTTAAACAATCTTCATTATCCTTCATCGTTTTC-3';SEQ ID NO 6DpknG-3: 5'-TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGCGAATGCCGTGCGGCCACT-3' ; SEQ ID NO 7DpknG4: S'-GATTCTAGAGTrAGCTATCGCTAGGTACG-S' ; SEQ ID NO 8使用寡核苷酸DpknG-5 (SEQ ID NO 9)和DpknG-6 (SEQ ID NO 10) 通過PCR來監(jiān)控pknG基因的成功缺失DpknG-5: 5'-GCTGCGCGGTTTTGAAGTGG-3' ; SEQ ID NO 9 DpknG-6: 5'~GATCGATCCAGAGCGTAACGC-3' SEQ ID NO 10獲得在成功缺失的情況下所預(yù)期的1364 bp DM片段，而非在野 生型情況下所預(yù)期的3. 76 kb DM片段。jt匕夕卜，通過Southern-卩跡分才斤法(Southern, E. M. ， J， Mol. Biol. 98: 503-517 (1975))來檢查pknG基因的成功缺失，其中使用經(jīng)洋地黃毒苷標(biāo)記的交叉PCR (cross-over PCR )產(chǎn)物作為探針。如所預(yù)期的，在經(jīng)HindIII消化的谷氨酸棒桿菌野生型ATCC13032的染色體DNA中檢測到6. 5 kb和2. 4 kb的雜交DNA片段，然而在經(jīng)HindIII消化的pknG突變體的染色體DNA中只檢測到6. 5 kb的DNA片段。為了缺失谷氨酸棒桿菌ATCC13032中的odhl基因，分別使用寡核苷酸對Dodhl-l ( SEQ ID NO 11 )和Dodhl-2 ( SEQ ID NO 12 ) ( 5，-區(qū)域)以及Dodhl-3 (SEQ ID NO 13)和DodhI-4 (SEQ ID NO 14)(3'-區(qū)域)來擴(kuò)增odhl基因的5，-和3，-側(cè)翼區(qū)域Dodhl-1GACAAGCTTGATCAGTCCGTGAGGGAAC ; SEQ ID NO "Dodh卜2 CCCATCCACTAAACTTAAACAGCCGTTGTTGTCGCTCATTAAAC ; SEQID NO 12Dodhl-3 TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGAAGTTCCGCCTGGTTTTCCTCG ; SEQ ID NO 13Dodh卜4 GTCGGATCCGAGGAGGMCCAAGGATG ; SEQ ID NO 14通過Southern印跡分析法(Southern, E. M, ， J. Mol. Biol. 98: 503-517 (1975))來檢查odhl基因的成功缺失，其中使用經(jīng)洋地黃毒 苷標(biāo)記的交叉PCR產(chǎn)物作為探針。如所預(yù)期的，在經(jīng)Sphl消化的野生 型的染色體DNA中檢測到2.6 kb的雜交DNA片段，然而在經(jīng)Sphl消 化的odhl突變體的染色體DNA中只檢測到2. 3 kb的DNA片段。如所 預(yù)期的，在經(jīng)Pstl消化的野生型的染色體DNA中檢測到0. 7 kb和1. 5 kb的雜交片段，然而在經(jīng)Pstl消化的odhl突變體的染色體DNA中只 檢測到1. 8 kb的片段。2.谷氨酸棒桿菌ATCC13032中pknG的缺失對于內(nèi)部谷氨酸和谷氨酰 胺濃度的影響首先在3(TC下在具有卡那霉素(25 mg/1)的腦心浸液瓊脂上溫 育下列菌抹24小時(shí)用質(zhì)粒pEKEx2(Eikmanns等人，Gene 102: 93-98 (1991))轉(zhuǎn)化的谷氨酸棒桿菌ATCC13032、用質(zhì)粒pEKEx2轉(zhuǎn)化的谷氨 酸棒桿菌ApknG和用質(zhì)粒pEKEx2-pknG (包含處于存在于pEKEx2上的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制之下的谷氨酸棒 桿菌pknG基因，所述基因包含其自身的核糖體結(jié)合位點(diǎn))轉(zhuǎn)化的谷氨 酸棒桿菌厶pknG。從該瓊脂平板培養(yǎng)物開始，接種預(yù)培養(yǎng)物(試管中 的5 ml的具有2% (w/v)葡萄糖、25 mg/1卡那霉素和1 mM IPTG的 腦心浸液培養(yǎng)基)。在30'C和170 rpm下在搖動(dòng)器上溫育這些預(yù)培養(yǎng) 物16小時(shí)。用這些預(yù)培養(yǎng)物接種主培養(yǎng)物，以使起始ODe。。為1。對于 主培養(yǎng)物，使用經(jīng)修飾的CGXII基本培養(yǎng)基(Keilhauer等人，J. Bacteriol. 175: 5595-5603 (1993))，該培養(yǎng)基不含尿素和疏酸銨 并且含有5mM葡萄糖和lOOmML-谷氨酰胺分別作為碳源和碳和氮源。 此外，向該培養(yǎng)基中加入25 mg/l卡那霉素和l mM IPTG。在30匸和 150 rpm下在搖動(dòng)器上溫育主培養(yǎng)物12小時(shí)。在這之后，培養(yǎng)物在600 nm處的光密度(OD,)已達(dá)到4. 0至5. 6。才艮據(jù)由Wittmann等人(Anal. Biochem， 327: 135-139 (2004))所描述的過濾方法來測定細(xì)胞內(nèi)的 谷氨酸和谷氨酰胺濃度，其中不破壞(quenchen)細(xì)胞。為此，借助于 真空通過玻璃纖維過濾器(Millipore APFC02500 )快速過濾出包含 0. 5至1 mg干生物質(zhì)的培養(yǎng)物體積，并用0. 9% NaCl溶液(室溫)洗 滌與過濾器結(jié)合的細(xì)胞4次。為了提取內(nèi)部代謝物，將具有結(jié)合至其 上的細(xì)胞的過濾器于95。C在1. 3 ml 50 pM的鳥氨酸溶液中溫育15分 鐘。在離心后，如上所述通過HPLC對上清液(細(xì)胞提取物)中的氨基 酸進(jìn)行定量。為了計(jì)算細(xì)胞內(nèi)濃度，使用1.5ml/g干細(xì)胞的細(xì)胞體積 (Kilmer等人，Eur. J. Biochem. 194: 929-935 (1990))。圖l描 繪了本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。從三個(gè)獨(dú)立的培養(yǎng)中計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。從

圖1中可以看出，菌林谷氨酸棒桿菌ApknG/pEKEx2 (圖1中的 ApknG)具有比比較菌林谷氨酸棒桿菌/pEKEx2 (圖1中的Wt)的內(nèi) 部谷氨酸濃度高94%的內(nèi)部谷氨酸濃度。通過具有質(zhì)粒pEKEx2-pknG 的菌林谷氨酸棒桿菌△ pknG (圖1中的△ pknG/pknG )的補(bǔ)充作用，再 次逆轉(zhuǎn)了內(nèi)部谷氨酸濃度的增加。在谷氨酰胺的情況下，菌林谷氨酸 棒桿菌ApknG中的內(nèi)部濃度比親本菌林高27%。3. 在500 mg/1作為誘導(dǎo)劑的乙胺丁醇存在的情況下，谷氨酸棒桿菌 ATCC13032中pknG的缺失對于生長和谷氨酸形成的影響首先在30X:下在腦心浸液瓊脂上溫育下列菌林24小時(shí)谷氨酸 棒桿菌ATCC13032 (圖2中的Wt )和谷氨酸棒桿菌ApknG (圖2中的 DpknG)。從該瓊脂平板培養(yǎng)物開始，接種預(yù)培養(yǎng)物(試管中的5 ml 的腦心浸液培養(yǎng)基)，并在301C和170 rpm下在搖動(dòng)器上溫育6小時(shí)。 在100 ml錐形瓶中用這些預(yù)培養(yǎng)物接種第二系列的預(yù)培養(yǎng)物并在30 。C和150rpm下在搖動(dòng)器上溫育16小時(shí)，所述第二系列的預(yù)培養(yǎng)物具 有20 ml的含5% (w/v)葡萄糖的CGXII基本培養(yǎng)基。然后，從這些預(yù) 培養(yǎng)物開始，在500 ml錐形瓶中接種主培養(yǎng)物直至OD,為1，并在 30。C和150 rpm下在搖動(dòng)器上溫育指定的時(shí)間。對于主培養(yǎng)物，使用 含有作為碳源的5% (w/v)葡萄糖的50 ml CGXII基本培養(yǎng)基 (Keilhauer等人，J. Bacteriol. 175: 5595-5603 (1993))，并將 該培養(yǎng)基與500 mg/1乙胺丁醇混合。在指定的時(shí)間點(diǎn)取出樣品用于測 定OD鋼以及培養(yǎng)基中的谷氨酸濃度。該實(shí)施例證明，pknG缺失突變體 中谷氨酸形成速率和谷氨酸終濃度與親本菌林相比顯著增加。相反地， 在突變體中細(xì)胞收獲量減少。4. 用于在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)未突變的和突變的Odhl蛋白的質(zhì)粒的 構(gòu)建為了在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)未突變的Odhl蛋白，從谷氨酸棒桿菌 ATCC13032的染色體DNA開始，使用寡核苷酸odhl-for-2和 odhl-rev-2通過PCR擴(kuò)增出谷氨酸棒桿菌的odhl基因。在此，通過 寡核苷酸odhl-rev-2在odhl基因的終止密碼子之前導(dǎo)入編碼 StrepTag—II的序歹寸(Skerra， A.和Schmidt, T. G. M. ， Methods Enzymol. 326: 271-304 )。通過用寡核苷酸odhl-for-2和odhl-rev-2 引入的BamHI切割位點(diǎn)，將所述PCR產(chǎn)物克隆入大腸桿菌(^c力er/c力/aco//)-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pJCl (Cremer， J.等人，Mol. Gen. Genet. 220: 478-480 (1990))中，其中使用大腸桿菌DH5a (Invitrogen)作為宿主細(xì)菌。odh卜for-2: 5'-GACGGATCCTGAGAACTATGAAATTCC-3'; SEQ ID NO 15 odhl-rev-2: 5'-GAGGATCC丌AC丌CTCGAACTGTGGGTGGGACCACTCAGCAGGGCCTGCG-3'; SEQ ID NO 16 e通過DNA序列分析來研究重組質(zhì)粒(pJCl-odhl)的編碼0dhl的 序列，由此證明，除了編碼StrepTag-II的序列外，其與在谷氨酸棒 桿菌ATCC13032基因組中的編碼0dhl的序列同一 (Kalinowski， J. 等人，J. Biotechnol. l(M: 5-25 )。然后，通過電穿孔將質(zhì)粒 pJCl-odhl轉(zhuǎn)移入所希望的谷氨酸棒桿菌菌林中，并在含有25 mg/1 卡那霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)相應(yīng)的菌林。為了在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)突變的0dhl蛋白(其中將谷氨酸棒桿菌0dhl蛋白的位置14處的蘇氨酸殘基的ACC密碼子替換為編碼丙氨酸的GCC密碼子)，首先使用寡核苷酸對odhl-for-2和T14A-rev以及T14A-for和odhl-rev-2和谷氨酸棒桿菌ATCC13032的染色體DM來制備PCR產(chǎn)物。然后，通過交叉PCR將獲得的兩種PCR產(chǎn)物與寡核苷酸odhl-for-2和odhl-rev-2融合，并通過經(jīng)最后所述兩種寡核苷酸而引入的BamHI切割位點(diǎn)將其克隆入載體pJCl中。在此，再次^f吏用大腸桿菌DH5a作為宿主生物。T14A-for GCCACAGGTCGAGGCCACCTCAGTATTCC ; SEQ ID NO 17 T14A-rev GGAATACTGAGGTGGCCTCGACCTGTGGC ; SEQ ID NO化通過DNA序列分析來研究重組質(zhì)粒(pJCl-odhl-T14A)的編碼0dhl 的序列，由此證明，除了 0dhl-密碼子14的所希望的突變(GCC，替 代ACC )和編碼StrepTag-II的序列外，其與在谷氨酸棒桿菌ATCC13032 基因組中的編碼0dhl的序列同一 (Kalinowski, J.等人，J. Biotechnol. 104: 5-25 )。然后，通過電穿孔將質(zhì)粒pJCl-odhl-T14A 轉(zhuǎn)移入所希望的谷氨酸棒桿菌菌林中，并在含有25 mg/l卡那霉素的 培養(yǎng)基中培養(yǎng)相應(yīng)的菌株。5.具有蘇氨酸-14至丙氨酸的置換的Odhl蛋白對于生長(0D6。。)和 谷氨酸形成的影響用質(zhì)粒pJCl-odhl-T14A轉(zhuǎn)化其中已通過上述方法(Niebisch和 Bott， Arch. Microbiol. 175: 282-294 (2001))缺失了染色體odhl 基因的谷氨酸棒桿菌ATCC13032的菌林。該質(zhì)粒攜帶有處于在栽體 pJCl (Cremer等人，Mol. Gen. Genet. 220: 478-480 (1990))中的 其天然啟動(dòng)子和其天然核糖體結(jié)合位點(diǎn)控制之下的谷氨酸棒桿菌 odhl基因。由于位置14處的蘇氨酸殘基至丙氨酸的突變，該質(zhì)粒所 編碼的Odhl-T14A蛋白可以不再被蛋白激酶PknG磷酸化。作為比較菌 林使用用質(zhì)粒pJCl轉(zhuǎn)化的野生型菌林谷氨酸棒桿菌ATCC13032。首先在30X:下在含有25 mg/1卡那霉素的腦心浸液瓊脂上溫育下 列菌林24小時(shí)谷氨酸棒桿菌ATCC13032/pJCl (圖3中的Wt)和谷 氨酸棒桿菌Aodhl/pJC1-odhl-T14A。從該瓊脂平板培養(yǎng)物開始，接種 預(yù)培養(yǎng)物(100 ml錐形瓶中的20 ml含有2% (w/v)葡萄糖和25 mg/1 卡那霉素的LB培養(yǎng)基)，并在30X:和150 rpm下在搖動(dòng)器上溫育16 小時(shí)。然后，從這些預(yù)培養(yǎng)物開始，在500 ml錐形瓶中接種主培養(yǎng)物 直至OD鋼為l，并在30X:和15() rpm下在搖動(dòng)器上溫育指定的時(shí)間。 對于主培養(yǎng)物，使用50ml含有作為碳源的5% (w/v)葡萄糖和25mg/l 卡那霉素的CGXII基本培養(yǎng)基(Keilhauer等人，J. Bacteriol. 175: 5595-5603 (1993)),并將該培養(yǎng)基與500 mg/1乙胺丁醇混合。在指 定的時(shí)間點(diǎn)取出樣品用于測定0D6。。以及培養(yǎng)基中的谷氨酸濃度。在各 情況下，分析兩種菌林的兩個(gè)獨(dú)立的培養(yǎng)物。菌林谷氨酸棒桿菌Aodhl/pJCl-odhl-T14A生長非常緩慢，從0. 5 的最初OD,至大約2的0D6Q。。然而，在該時(shí)段內(nèi)，其形成的谷氨酸大 約為在本實(shí)驗(yàn)中生長至16- 19的0D6。。的菌林谷氨酸棒桿菌/pJCl的2 倍。由此可計(jì)算出，菌林谷氨酸棒桿菌pJCl形成平均每克干細(xì)胞2. 3 mmol的谷氨酸，然而菌林谷氨酸棒桿菌Aodhl/pJCl-odhl-T14A形成平均每克干細(xì)胞37.63 mmol的谷氨酸。1的0D,相應(yīng)于每升0.25 g 干細(xì)胞。6. 蛋白激酶G在蘇氨酸殘基14上對0dhl蛋白的磷酸化為了證明Odhl蛋白被蛋白激酶G磷酸化，借助于質(zhì)粒pAN3K-odhl 在大腸桿菌DH5a中過量產(chǎn)生經(jīng)羧基末端StrepTag-II(Skerra， A. and Schmidt, T. G. M. ， Methods Enzymol. 326: 271-304 )修飾的Odhl 蛋白5然后按照廠商說明書(IBA GmbH， G5ttingen， Germany)在 StrepTactin-Sepharose上通過親和層析純化至外觀均質(zhì)。同樣地， 純化兩種突變的Odhl蛋白，即在其中位置14處的蘇氨酸殘基已被替 換成丙氨酸的0dhl-T14A和在其中位置15處的蘇氨酸殘基已被替換成 丙氨酸的0dhl-T15A。借助于質(zhì)粒pEKEx2-pknGst在谷氨酸棒桿菌 ATCC13032中過量產(chǎn)生經(jīng)羧基末端StrepTag-II修飾的PknG蛋白，然 后按照廠商說明書 (IBA GmbH， G5ttingen， Ger顏y )在 StrepTactin-Sepharose上通過親和層析純化至夕卜觀均質(zhì)。將純化的蛋白質(zhì)0dhl、 0dhl-T14A和0dhl-T15A (各l pg )與純 化的PknG蛋白(0. 5 jug )和[y-32P]-ATP —起在37C下溫育30分鐘。 此外，在不存在純化的PknG蛋白的情況下將純化的0dhl蛋白(1 jag) 與[Y-"P]-ATP—起在37X:下溫育30分鐘。然后通過SDS-聚丙烯酰 胺凝膠電泳來分離所述蛋白質(zhì)，干燥凝膠，并使用磷光成像儀 (Phosphorimager)進(jìn)行分析。結(jié)果描繪于圖4中。證明了蛋白質(zhì)0dhl 和0dhl-T15A^皮PknG磷酸化，而蛋白質(zhì)0dhl-T14A不^皮PknG磷酸化。 此外，還證明0dhl蛋白不具有自身磷酸化活性。7. 磷酸化的和未磷酸化的0dhl蛋白對于2-酮戊二酸脫氬酶復(fù)合物的 活性的影響為了檢測2-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物被0dhl蛋白抑制，從菌林谷氨酸棒桿菌ApknG Aodhl的細(xì)胞中制備了無細(xì)胞提取物，在所述菌 林中，蛋白激酶G和0dhl蛋白的基因被缺失。因而，在這些細(xì)胞提取 物中既不包含PknG蛋白也不包含OdhI蛋白。在PD-10柱(Amersham Pharmacia )上對所述無細(xì)胞提取物進(jìn)行層析，從而從所述細(xì)胞提取物的低分子量組分中分離出所述蛋白質(zhì)。依據(jù)在340 nm處的吸收增加，在30。C下在含有50 mM TES 7.7、 3 mM L-半胱氨酸、10 mM MgCh、 0.9 mM二磷酸疏胺素、0.2 mM輔酶 A、 2 mM NAD+和1. 5 mM 2-酮戊二酸的測試緩沖液中通過分光光度法來 測量2-酮戊二酸脫氫酶的活性。為了計(jì)算比活性，使用6.3 mM-1 cnf1 的NADH在340 nm處的消光系數(shù)。1 U的活性相應(yīng)于每分鐘形成1 pmol 的勵(lì)Ho在0dhl不存在的情況下，細(xì)胞提取物具有大約35mU/mg蛋白(35 nmol分鐘—1 (mg蛋白)—"的2-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物活性。通過加 入純化的、未磷酸化的0dhl蛋白，抑制了 2-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物 的活性，并且依賴于Odhl的濃度(圖5 )。在關(guān)于Odhl蛋白對于2-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物活性的影響的進(jìn) 一步實(shí)驗(yàn)中，從谷氨酸棒桿菌菌林(谷氨酸棒桿菌odhAst)中富集所 述復(fù)合物，在所述菌抹中作為ODHC的El亞基的OdhA蛋白包含羧基末 端StrepTag-II。按照廠商說明書(IBA GmbH， G5ttingen )在 StrepTactin-Sepharose上通過親和層析來富集2-酮戊二酸脫氫酶復(fù) 合物。富集的復(fù)合物具有2.5 U/mg蛋白的2-酮戊二酸脫氫酶活性。 將2 富集的0DHC復(fù)合物在無其他添加物的情況下(反應(yīng)混合物1 )， 或者與0. 2 pg未磷酸化的Odhl蛋白和2 mM ATP —起(反應(yīng)混合物2 )， 或者與0. 2 |ng未磷酸化的0dhl蛋白、2. 2 pg PknG蛋白和2 mM ATP 一起(反應(yīng)混合物3)在30TC下溫育60分鐘，然后測定2-酮戊二酸 脫氫酶的活性。如圖6中所描述的，加入未磷酸化的Odhl蛋白導(dǎo)致 2-酮戊二酸脫氫酶活性的抑制，然而加入0dhl、 PknG和ATP不導(dǎo)致抑 制。8. o必/基因缺失對于由谷氨酸棒桿菌進(jìn)行的谷氨酸產(chǎn)生的影響從甘油培養(yǎng)物開始，將菌株谷氨酸棒桿菌ATCC13032 (野生型)和谷氨酸棒桿菌△ m力/在腦心浸液瓊脂平板上劃線，并在3o x:下溫育過夜。對于每種主培養(yǎng)物，制備預(yù)培養(yǎng)物，為此用來自板的單個(gè)菌落 接種30 ral的腦心浸液液體培養(yǎng)基。在301C和150 rpm下溫育預(yù)培養(yǎng) 物15-18小時(shí)，然后通過離心收獲細(xì)胞，用0. 9% NaCl洗滌一次，然 后重懸浮于5-10 ml的0. 9% NaCl中。測定這些懸浮液在600認(rèn)處的 光密度(0D6。。)。如果通過加入Tween-40 (圖x， A和B )或乙胺丁醇(圖x， C和 D)觸發(fā)谷氨酸的產(chǎn)生，那么用所述懸浮液接種主培養(yǎng)物至0. 5-0.9的 0D6。。。在500 ml的具有兩個(gè)折流板(Schikane)的錐形瓶中，主培養(yǎng) 物包含60ml具有4% (w/v)的CGXII基本培養(yǎng)基，并在301C和150 rpm 下進(jìn)行溫育。為了觸發(fā)谷氨酸的形成，在6或7小時(shí)后向培養(yǎng)物中加 入2 g/1 Tween-40或在接種后立即加入500 mg/1乙胺丁醇。如果通 過生物素限制來觸發(fā)谷氨酸的產(chǎn)生(圖x， E和F)，那么用所述懸浮 液接種在含有4%葡萄糖但只有2. 5 ng/ml生物素(常規(guī)CGXII基本培 養(yǎng)基含有300 ng/1的生物素)的CGXII基本培養(yǎng)基中的進(jìn)一步預(yù)培 養(yǎng)物。將這些預(yù)培養(yǎng)物在30匸和150 rpm下溫育正好24小時(shí)，然后 離心出細(xì)胞，洗滌細(xì)胞并重懸浮于0. 9% NaCl中。然后，將這些懸浮 液接種主培養(yǎng)物至0. 5 - 0. 9的OD6。。。對于主培養(yǎng)物，使用含有4%葡 萄糖和1 jig/1生物素的CGXII基本培養(yǎng)基。在第0小時(shí)、第4小時(shí)、 第6小時(shí)、第7小時(shí)、第24小時(shí)和第30小時(shí)這些時(shí)間點(diǎn)上從主培養(yǎng) 物中取出1 ml的樣品，并測定OD,以及在無細(xì)胞上清液中的谷氨酸 濃度。在圖7中描繪了上述主培養(yǎng)物的生長和谷氨酸形成。所述值是至 少4個(gè)獨(dú)立培養(yǎng)物的平均值。很明顯，在Tween-40存在的情況下(圖 7A和7B)和在乙胺丁醇存在的情況下(圖7C和7D)以及生物素限制 的情況下(圖7E和7F)，與野生型相比，菌林谷氨酸棒桿菌Ao必/不形成或只形成非常低的谷氨酸濃度。這些結(jié)果確認(rèn)，Odhl蛋白對于 有效的谷氨酸形成是至關(guān)重要的。附圖描述圖1,在菌林谷氨酸棒桿菌/pEKEx2 (Wt)、谷氨酸棒桿菌A pknG/pEKEx2 ( △ pknG )和谷氨酸棒桿菌△ pknG/pEKEx2-pknG ( △ pknG/pknG)中谷氨酸(Glu)和谷氨酰胺(Gln)的細(xì)胞內(nèi)部濃度。同 樣地標(biāo)明三個(gè)獨(dú)立的培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)差。圖2.由谷氨酸棒桿菌ATCC13032 ( Wt)和谷氨酸棒桿菌ApknG 突變體(ApknG)產(chǎn)生的生長(0D6。。)和谷氨酸形成。所述值是三個(gè) 獨(dú)立培養(yǎng)的平均值，標(biāo)準(zhǔn)差小于20%。圖3.由谷氨酸棒桿菌ATCC13032/pJCl (野生型/pJCl)和谷氨 酸棒桿菌Aodhl/pJCl-odhl-T14A ( △ o必J/pJC1-o必/-T14A )產(chǎn)生的 生長(0D6。。)和谷氨酸形成。顯示了各情況下兩個(gè)獨(dú)立的培養(yǎng)的值。圖4.蛋白質(zhì)0dhl和0dhl-T15A被蛋白激酶G磷酸化的檢測。將 蛋白質(zhì)Odhl和PknG (泳道1) 、 Odhl (泳道2 ) 、 0dhl-T14A和PknG (泳道3 )以及0dhl-T15A和PknG (泳道4 )與[y -32P] -ATP —起在 37"C下溫育30分鐘，然后通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。使用 磷光成像儀分析經(jīng)干燥的SDS凝膠。圖5.純化的、未磷酸化的Odhl蛋白對于在菌林谷氨酸棒桿菌A pknG Aodhl的細(xì)胞提取物中的2-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物的活性的抑 制。圖6.在添加物不存在的情況下(第1號)、在未磷酸化的Odhl 蛋白存在的情況下(第2號)以及在Odhl、 PknG和ATP存在的情況下 (第3號)，富集的2-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物的活性。在PknG和ATP 存在的情況下，Odhl被磷酸化并且不抑制ODHC的活性，但未磷酸化 的Odhl蛋白具有抑制作用。圖7.在加入2 g/1 Tween-40的情況下(A和B )、在加入0, 5 g/1 乙胺丁醇的情況下(C和D)和在生物素限制(1 pg/1)的情況下(E 和F)，由菌林谷氨酸棒桿菌ATCC13032 (野生型)和谷氨酸棒桿菌 o必/產(chǎn)生的生長(A、 C、 E)和谷氨酸形成(B、 D、 F)的比較。將所 述菌林在30C和150 rpm下在含有4% (w/v)的葡萄糖的CGXII基本培 養(yǎng)基中培養(yǎng)。基于在600 nm處的光密度(0D,)來測定生長，通過HPLC 分析來測定培養(yǎng)物上清液中的谷氨酸濃度。
權(quán)利要求
1. 用于在產(chǎn)氨基酸的微生物中生產(chǎn)氨基酸的方法，在所述方法中通過發(fā)送蛋白來降低2-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物的活性。
2. 權(quán)利要求l的方法，其特征在于，所述微生物是棒狀細(xì)菌，優(yōu) 選革蘭氏陽性棒狀細(xì)菌，特別優(yōu)選棒桿菌科或分枝桿菌科或鏈霉菌科 的棒狀細(xì)菌。
3. 權(quán)利要求l的方法，其特征在于，所述微生物來自棒桿菌屬。
4. 權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所迷微生物是谷氨酸棒桿菌
5. 權(quán)利要求1的方法，其特征在于，谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨 酸、鳥氨酸、天冬酰胺、精氨酸、賴氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨 酸、甲硫氨酸、半胱氨酸和/或脯氨酸，優(yōu)選谷氨酸和/或谷氨酰胺， 特別優(yōu)選谷氨酸的產(chǎn)量增加。
6. 權(quán)利要求1的方法，其特征在于，氨基酸的L-異構(gòu)體的產(chǎn)量 增力口。
7. 權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述發(fā)送蛋白由包括下列核 酸序列的核酸序列編碼a) 具有SEQU. ID No. 1中所示核酸序列的核酸序列；或b) 能夠根據(jù)簡并的遺傳密碼而通過從SEQU. ID No. 2中所示氨 基酸序列倒譯來推導(dǎo)出的核酸序列；或c) 與SEQ ID NO: 1具有至少50°/ 同一性的核酸序列。
8. 權(quán)利要求l的方法，其特征在于，所述發(fā)送蛋白不被磷酸化。
9. 權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述發(fā)送蛋白在位置14和/ 或15，優(yōu)選位置14處的蘇氨酸上不被磷酸化。
10. 權(quán)利要求l的方法，其特征在于，所述發(fā)送蛋白不被蛋白激 酶PknG磷酸化。
11. 權(quán)利要求l的方法，其特征在于，所述發(fā)送蛋白不被由包括 下列核酸序列的核酸序列所編碼的蛋白激酶PknG磷酸化a) 具有SEQU. ID No. 3中所示核酸序列的核酸序列；或b) 能夠根據(jù)簡并的遺傳密碼而通過從SEQU. ID No. 4中所示氨 基酸序列倒譯來推導(dǎo)出的核酸序列；或c) 與SEQ ID NO: 3具有至少50%同 一性的核酸序列。
12. 權(quán)利要求1的方法，其特征在于，降低蛋白激酶PknG的活性。
13. 權(quán)利要求l的方法，其特征在于，通過缺失包括下列核酸序 列的核酸序列來降低蛋白激酶PknG的活性a) 具有SEQU. ID No. 3中所示核酸序列的核酸序列；或b) 能夠根據(jù)簡并的遺傳密碼而通過從SEQU. ID No. 4中所示氨 基酸序列倒譯來推導(dǎo)出的核酸序列；或c) 與SEQ ID NO: 3具有至少50%同 一性的核酸序列。
14. 權(quán)利要求l的方法，其特征在于，在通過缺乏生物素、添加 去污劑或青霉素、添加乙胺丁醇、消除dtsRl基因或其他脂肪酸生物 合成基因的作用或增加溫度而導(dǎo)致誘導(dǎo)谷氨酸過量產(chǎn)生的條件下培養(yǎng) 所述微生物。
15. 由包括下列核酸序列的核酸序列所編碼的發(fā)送蛋白a) 具有SEQU. ID No. 1中所示核酸序列的核酸序列；或b) 能夠根據(jù)簡并的遺傳密碼而通過從SEQU. ID No. 2中所示氨 基酸序列倒譯來推導(dǎo)出的核酸序列；或c) 與SEQ ID NO: 1具有至少50%同一性的核酸序列。
16. 權(quán)利要求15的發(fā)送蛋白用于控制微生物中2-酮戊二酸脫氬 酶復(fù)合物的活性的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于在產(chǎn)氨基酸的微生物中生產(chǎn)氨基酸的方法，在所述方法中通過發(fā)送蛋白來降低2-酮戊二酸脫氫酶的活性。
文檔編號C07K14/34GK101268191SQ200680034103
公開日2008年9月17日 申請日期2006年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月15日
發(fā)明者A·尼比施, M·伯特 申請人:于利希研究中心有限公司