專利名稱：使用抗體表達(dá)優(yōu)化序列的表達(dá)控制的制作方法
專利說(shuō)明使用抗體表達(dá)優(yōu)化序列的表達(dá)控制 本發(fā)明涉及產(chǎn)生抗體的方法，其中特定抗體分子的重鏈和輕鏈由存在于雙順?lè)醋有畔⒅械腄NA編碼。更特別地，本發(fā)明提供了當(dāng)以雙順?lè)醋有畔⒌男问奖磉_(dá)抗體時(shí)優(yōu)化抗體的表達(dá)和產(chǎn)量的成組序列。
WO03/048208描述了可用于優(yōu)化抗體的表達(dá)和產(chǎn)量的特定雙順?lè)醋有畔ⅰ?br> 本發(fā)明提供了可用于當(dāng)以雙順?lè)醋有畔⒌男问奖磉_(dá)抗體時(shí)提高抗體的表達(dá)和產(chǎn)量的成組11個(gè)抗體表達(dá)優(yōu)化序列(AEOS)。因此，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生抗體分子的雙順?lè)醋有畔?，其中上游順?lè)醋影幋a抗體的輕鏈的DNA，下游順?lè)醋影幋a相應(yīng)的重鏈的DNA，其特征在于雙順?lè)醋有畔x自AEOS1(SEQ ID NO1)、AEOS2(SEQ ID NO2)、AEOS3(SEQ ID NO3)、AEOS4(SEQ ID NO4)、AEOS5(SEQ IDNO5)、AEOS6(SEQ ID NO6)、AEOS7(SEQ ID NO7)、AEOS8(SEQ IDNO8)、AEOS9(SEQ ID NO9)、AEOS10(SEQ ID NO10)和AEOS11(SEQID NO11)的序列。
本發(fā)明的雙順?lè)醋有蛄芯幋a特定抗體分子的重鏈和輕鏈。本發(fā)明的抗體可以是具有可變區(qū)(VH/VL)和恒定區(qū)(CH/CL)的任何重鏈和輕鏈對(duì)，其中抗體的輕鏈恒定區(qū)優(yōu)選是κ同種型?？贵w可以是完整的抗體或特別地是其片段例如WO2005/003170中描述的Fab或Fab′或截短的Fab片段。
本發(fā)明的Fab′片段可具有天然的或經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)。所述的天然的絞鏈區(qū)是與抗體分子的CH1結(jié)構(gòu)域正常連接的絞鏈區(qū)。經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)是在長(zhǎng)度和/或組成上與天然鉸鏈區(qū)不同的任何鉸鏈區(qū)。此類鉸鏈區(qū)可包含來(lái)自任何合適的物種例如人、小鼠、大鼠、兔子、豬、倉(cāng)鼠、駱駝、駱馬(11ama)或山羊鉸鏈區(qū)的鉸鏈區(qū)。其他經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)可包含來(lái)源于不同類型或亞類(根據(jù)CH1結(jié)構(gòu)域的不同劃分的)的抗體的完全鉸鏈區(qū)。因此，例如，γ1類型的CH1結(jié)構(gòu)域可附著至γ4類型的鉸鏈區(qū)。可選擇地，經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)可包含天然鉸鏈的部分或重復(fù)單位(其中重復(fù)中的各單位來(lái)源于天然鉸鏈區(qū))。在進(jìn)一步的選擇中，可通過(guò)將一個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸或其他殘基轉(zhuǎn)變成中性殘基例如丙氨酸或通過(guò)將適當(dāng)放置的殘基轉(zhuǎn)變成半胱氨酸殘基來(lái)改變天然鉸鏈區(qū)。通過(guò)該方法，可增加或減少鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基的數(shù)目。此外可控制鉸鏈的其他特征例如鉸鏈半胱氨酸與輕鏈鏈間半胱氨酸的距離、鉸鏈的半胱氨酸之間的距離和鉸鏈中其他氨基酸的組成，所述特征可影響鉸鏈的性質(zhì)例如柔性，例如可將甘氨酸整合入鉸鏈以增加轉(zhuǎn)動(dòng)柔性或可整合入脯氨酸以減少柔性?？蛇x擇地，可將帶電荷或疏水殘基的組合整合入鉸鏈以提供多聚化性質(zhì)。其他經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)可以是完全合成的和可經(jīng)設(shè)計(jì)而具有希望的性質(zhì)例如長(zhǎng)度、組成和柔性。例如在US5,677,425、WO99/15549、WO98/25971和WO2005/003171中已描述了許多經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)，這些參考資料在此引用作為參考。
本發(fā)明的抗體可來(lái)源于任何抗體同種型，包括例如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE和其亞類(包括例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。優(yōu)選本發(fā)明的抗體來(lái)源于IgG1。優(yōu)選鏈可變區(qū)為κ同種型?？贵w可獲自任何物種，包括例如小鼠、大鼠、兔子、豬、倉(cāng)鼠、駱駝、駱馬、山羊或人。優(yōu)選至少本發(fā)明的抗體的恒定區(qū)是人的?？贵w的部分可獲自多個(gè)物種例如抗體可以是嵌合抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，恒定區(qū)來(lái)自一個(gè)物種，可變區(qū)來(lái)自另一個(gè)物種。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用重組DNA基因工程技術(shù)產(chǎn)生抗體的可變區(qū)。此類基因工程改造的形式包括例如通過(guò)在或向天然抗體的氨基酸序列中插入、缺失或改變氨基酸殘基而從天然抗體可變區(qū)產(chǎn)生的抗體形式。該類型的特定實(shí)例包括經(jīng)基因工程改造的可變區(qū)，所述可變區(qū)包含來(lái)自一種抗體的至少一個(gè)CDR和任意地一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架氨基酸并且可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的其余部分來(lái)自第二抗體。
用于建立和產(chǎn)生重組抗體的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的(參見(jiàn)例如，Boss等人，US 4,816,397；Cabilly等人，US 6,331,415；Shrader等人，WO 92/02551；Orlandi等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，3833；Riechmann等人，1988，Nature，322，323；Queen等人，US 5,585,089；Adair，WO91/09967；Mountain和Adair，1992，Biotechnol.Genet.Eng.Rev，10，1-142；Verma等人，1998，Journal of Immunological Methods，216，165-181)。
本發(fā)明的抗體通常能夠選擇性結(jié)合抗原?？乖梢允侨魏渭?xì)胞相關(guān)抗原，例如細(xì)胞(例如細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、T細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞)上的細(xì)胞表面抗原，或其可以是可溶性抗原?？乖€可以是任何醫(yī)學(xué)相關(guān)抗原例如在疾病或感染期間被上調(diào)的抗原，例如受體和/或其相應(yīng)的配體。細(xì)胞表面抗原的特定實(shí)例包括粘著分子，例如整聯(lián)蛋白，例如β1整聯(lián)蛋白例如VLA-4、內(nèi)皮細(xì)胞選擇素(E-selectin)、P選擇素或L選擇素、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD11a、CD11b、CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD45、CDW52、CD69、癌胚抗原(CEA)、人乳脂肪球蛋白(human milk fat globulin)(HMFG1和2)、MHC I類和MHC II類抗原以及VEGF和當(dāng)合適時(shí)，其受體?？扇苄钥乖ò准?xì)胞介素例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-16或IL-17、病毒抗原例如呼吸道合胞病毒或細(xì)胞巨化病毒抗原、免疫球蛋白例如IgE、干擾素例如干擾素α、干擾素β或干擾素γ、腫瘤壞死因子α、腫瘤壞死因子β、集落刺激因子例如G-CSF或GM-CSF和血小板衍生的生長(zhǎng)因子例如PDGF-α和PDGF-β以及當(dāng)適當(dāng)時(shí)其受體。
本發(fā)明的雙順?lè)醋有畔⒖砂铣傻腄NA、cDNA或基因組DNA或其任何組合。
可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法獲得特定抗體的編碼DNA序列。例如，當(dāng)想要時(shí)，可從確定的DNA序列或基于相應(yīng)的氨基酸序列合成編碼抗體重鏈和輕鏈的部分或全部的DNA序列。
可使用分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備編碼特定抗體分子的重鏈和輕鏈并且包含本發(fā)明提供的序列的DNA序列?？墒褂霉押塑账岷铣杉夹g(shù)完全或部分地合成希望的DNA序列。適當(dāng)時(shí)可使用定點(diǎn)誘變和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)。
本發(fā)明的雙順?lè)醋有畔⒖砂诤现辆幋a抗體鏈中的一條鏈的DNA序列的、編碼效應(yīng)子或報(bào)告蛋白的DNA序列。
本發(fā)明的雙順?lè)醋有畔⑦€可包含融合至編碼抗體鏈中的一條鏈的DNA序列的、編碼肽鍵的DNA序列，從而其可允許效應(yīng)子或報(bào)告蛋白或分子隨后附著至從雙順?lè)醋有畔⒈磉_(dá)的抗體。
本發(fā)明的雙順?lè)醋有畔⑦€可包含分泌信號(hào)序列，所述序列融合在編碼抗體鏈的一條或兩條鏈的DNA序列的上游，從而允許抗體鏈靶向周質(zhì)或細(xì)胞外部。
優(yōu)選，分泌信號(hào)序列是OmpA肽序列。優(yōu)選重鏈和輕鏈的分泌信號(hào)都是OmpA肽序列。
優(yōu)選由本發(fā)明的雙順?lè)醋有畔⒕幋a的抗體分子是抗腫瘤壞死因子α抗體。更優(yōu)選，由本發(fā)明的雙順?lè)醋有畔⒕幋a的抗體分子具有對(duì)于人TNFα的特異性和包含由圖8中給出的序列(SEQ ID NO24)組成的輕鏈以及由圖9中給出的序列(SEQ ID NO25)組成的重鏈。優(yōu)選當(dāng)由雙順?lè)醋有畔⒕幋a的抗體是抗TNF-α抗體的Fab′片段時(shí)，雙順?lè)醋有畔蛄蠥EOS11(SEQ ID NO11)。在一個(gè)實(shí)施方案中，由雙順?lè)醋有畔⒕幋a的抗體是抗TNF-α抗體Fab′片段，雙順?lè)醋影琁GS 17的序列(SEQ ID NO22)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙順?lè)醋有畔?br>
圖10中提供的序列(SEQ ID NO26)。
已就長(zhǎng)度、序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)方面對(duì)本發(fā)明的抗體表達(dá)優(yōu)化序列進(jìn)行了修飾，從而獲得兩個(gè)順?lè)醋拥奶岣叩姆g偶聯(lián)。
如WO03/048208中所描述的，存在幾種可影響下游順?lè)醋拥姆g的雙順?lè)醋有畔⒌男再|(zhì)。這些性質(zhì)包括上游順?lè)醋又蠸hine-Dalgarno(SD)基序的存在、SD基序列的性質(zhì)、SD位置和下游順?lè)醋拥腁UG起始密碼子之間的距離、上游順?lè)醋拥慕K止密碼子和下游順?lè)醋拥腁UG起始密碼子之間的距離以及該插入序列的性質(zhì)。
本發(fā)明的AEO序列全都包含Shine-Dalgano(SD)基序列(核糖體結(jié)合位置)和從該序列至雙順?lè)醋又械膬蓚€(gè)基因的第二基因的起始(開始)密碼子的特定范圍的核苷酸距離。與之前描述序列(參見(jiàn)WO03/048208)相反，在各序列中使用統(tǒng)一的SD和終止密碼子以優(yōu)化順?lè)醋又械诙虻谋磉_(dá)水平。
本發(fā)明提供的AEO核苷酸序列是圖1中所示的AEOS1(SEQ ID NO1)、AEOS2(SEQ ID NO2)、AEOS3(SEQ ID NO3)、AEOS4(SEQ IDNO4)、AEOS5(SEQ ID NO5)、AEOS6(SEQ ID NO6)、AEOS7(SEQID NO7)、AEOS8(SEQ ID NO8)、AEOS9(SEQ ID NO9)、AEOS10(SEQID NO10)和AEOS11(SEQ ID NO11)。
顯示的序列包括 i)人cκ的3′12bp(編碼NRGECC) ii)內(nèi)部Shine-Dalgarno位置(下劃線標(biāo)示的) iii)TAA終止密碼子(*)和終止密碼子與起始密碼子ATG之間的基因間序列間隔子。
iv)起始密碼子ATG 還顯示了第一順?lè)醋拥慕K止密碼子與第二順?lè)醋拥腁TG之間的距離。
將認(rèn)識(shí)到，起始密碼子ATG可由其他合適的密碼子例如GTG和TTG取代。
可使用下列方法根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定給定的抗體分子的最適抗體表達(dá)優(yōu)化序列。方法包括構(gòu)建系列合適的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含選自AEOS1(SEQ ID NO1)、AEOS2(SEQ ID NO2)、AEOS3(SEQ ID NO3)、AEOS4(SEQ ID NO4)、AEOS5(SEQ ID NO5)、AEOS6(SEQ ID NO6)、AEOS7(SEQ ID NO7)、AEOS8(SEQ ID NO8)、AEOS9(SEQ ID NO9)、AEOS10(SEQ ID NO10)和AEOS11(SEQ ID NO11)的系列AEO序列變體，在所述載體中可插入抗體分子以進(jìn)行檢測(cè)?？赏ㄟ^(guò)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入合適的宿主，然后分析抗體的表達(dá)和產(chǎn)量來(lái)對(duì)各抗體的各AEO序列進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)檢測(cè)。本申請(qǐng)中描述的成組的AEO序列(其可在長(zhǎng)度和序列上發(fā)生變化)可用于構(gòu)建此類載體，可從所述載體選擇特定抗體分子的最佳AEO序列。本發(fā)明還提供了成組的包含各AEO序列的DNA盒，在所述AEO序列中統(tǒng)一的限制位點(diǎn)用于幫助克隆構(gòu)建(圖2)。這些盒包含了分別適合用于插入抗體的輕鏈和重鏈的HindIII和MunI限制位點(diǎn)，其中重鏈序列之前為OmpA前導(dǎo)序列。這些盒在第一順?lè)醋又邪p鏈恒定區(qū)的C末端cκ(SFNRGEC)和在第二順?lè)醋又邪琌mpA前導(dǎo)序列的N末端的部分(MKKTAIAI)。本發(fā)明提供的盒序列是IGS5(SEQID NO12)、IGS8(SEQ ID NO13)、IGS9(SEQ ID NO14)、IGS10(SEQID NO15)、IGS11(SEQ ID NO16)、IGS12(SEQ ID NO17)、IGS13(SEQ ID NO18)、IGS14(SEQ ID NO19)、IGS15(SEQ ID NO20)、IGS16(SEQ ID NO21)、IGS17(SEQ ID NO22)和IGS18(SEQ ID NO23)。
因此，本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的雙順?lè)醋有畔⒌谋磉_(dá)載體。
合適的表達(dá)載體在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。此類載體的實(shí)例包括WO03/048208中描述的pTTO和pTTOD。
本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的雙順?lè)醋有畔⒖寺≥d體。
可用于構(gòu)建表達(dá)和克隆載體的一般方法、轉(zhuǎn)化方法和培養(yǎng)方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的。
本發(fā)明還提供了產(chǎn)生特定抗體分子的方法，其包括在適合于導(dǎo)致編碼所述抗體分子的DNA表達(dá)的條件下培養(yǎng)已用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌宿主細(xì)胞，和分離所述抗體分子，其中已優(yōu)化所述抗體的表達(dá)水平。
可將任何合適的細(xì)菌宿主細(xì)胞用于表達(dá)由本發(fā)明的雙順?lè)醋有畔⒕幋a的特定抗體分子的重鏈和輕鏈。優(yōu)選細(xì)菌宿主分子是革蘭陰性的，包括但不限于沙門氏菌(Salmonella)、歐文氏菌(Erwinia)和大腸桿菌(E.coli)。優(yōu)選使用大腸桿菌。也可使用其他微生物系統(tǒng)。
可通過(guò)合適的信號(hào)序列將抗體分子分泌至細(xì)胞外部或靶向周質(zhì)?？蛇x擇地，可在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中積累抗體分子。依賴于產(chǎn)生的抗體和使用的方法，希望允許抗體分子重折疊或形成功能性構(gòu)象。使抗體分子重折疊的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的。
當(dāng)本發(fā)明的抗體分子在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生后，可使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法提取和純化所述抗體分子。合適的純化方法包括但不限于大小排阻層析、疏水相互作用層析、A、G或L蛋白親和層析以及離子交換。
可將由本發(fā)明的雙順?lè)醋有畔a(chǎn)生的抗體分子用于制造包含特定抗體和藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體的治療性或診斷性組合物。
抗體分子可以是治療性或診斷性組合物中的唯一的活性組分或可與一種或多種其他的活性組分(包括其他抗體例如抗T細(xì)胞抗體、抗IFNγ抗體或抗LPS抗體或非抗體組分例如黃嘌呤)一起存在。
根據(jù)其中使用由本發(fā)明產(chǎn)生的特定抗體分子的療法，可以以任何合適的形式和量施用所述抗體分子。
用于施用的合適的形式包括適合用于通過(guò)注射或輸注例如通過(guò)快速濃注或連續(xù)輸注進(jìn)行的腸胃外施用的形式。當(dāng)產(chǎn)物用于注射或輸注時(shí)，其可采用油性或水性媒介物中的懸浮液、溶液或乳液的形式以及其可包含配方試劑(formulatory agent)例如混懸劑、防腐劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。
可選擇地，抗體分子可以以無(wú)水形式存在，該形式在使用前用合適的無(wú)菌液體重建。
如果抗體分子適合用于口服施用，例如在抗體片段的情況下，制劑除了活性組分外還可包含在口服給藥的組合物的配制中使用的合適的添加劑。
治療性和診斷性組合物可以以單位劑型的形式存在，在該情況下，各單位劑量包含有效量的特定抗體分子。還可根據(jù)患者的年齡和狀況選擇劑量。
如果抗體分子具有較短的半衰期(例如2至10小時(shí))，那么每天提供一個(gè)或多個(gè)劑量可以是必需的?？蛇x擇地，如果抗體分子具有長(zhǎng)半衰期(例如2至15天)，只需要每天一次，每周一次或甚至每1或2個(gè)月一次給藥即可。
可在參考附圖的下列實(shí)施例中僅通過(guò)舉例說(shuō)明的方試來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，其中 圖1顯示用于本發(fā)明的抗體表達(dá)優(yōu)化序列(AEOS)。
圖2顯示包含抗體表達(dá)優(yōu)化序列的盒。
圖3顯示在搖瓶中進(jìn)行的Fab′表達(dá)時(shí)間曲線，在該曲線中將IGS7-14與之前描述的IGS1和IGS2進(jìn)行了比較。
圖4顯示在搖瓶中進(jìn)行的Fab′表達(dá)時(shí)間曲線，在該曲線中比較了都具有-1的基因間間隔的兩種IGS盒(IGS1和IGS7)。
圖5a顯示在搖瓶中進(jìn)行的Fab′表達(dá)時(shí)間曲線，在該曲線中比較了IGS2和IGS10。
圖5b顯示在搖瓶中進(jìn)行的Fab′表達(dá)時(shí)間曲線，在該曲線中比較了IGS2和IGS11。
圖5c顯示在搖瓶中進(jìn)行的Fab′表達(dá)時(shí)間曲線，在該曲線中比較了IGS2和IGS12。
圖5d顯示在搖瓶中進(jìn)行的Fab′表達(dá)時(shí)間曲線，在該曲線中比較了IGS2和IGS13。
圖5e顯示在搖瓶中進(jìn)行的Fab′表達(dá)時(shí)間曲線，在該曲線中比較了IGS2和IGS14。
圖6顯示在搖瓶中進(jìn)行的Fab′表達(dá)時(shí)間曲線，在該曲線中比較了IGS10和IGS14。
圖7a顯示在1升使用IGS2、IGS10、IGS17和IGS18的發(fā)酵物中周質(zhì)Fab′和培養(yǎng)基上清液Fab′的Fab′累積時(shí)間曲線。
圖7b顯示在1升使用IGS2、IGS17和IGS18的發(fā)酵物中周質(zhì)Fab′和培養(yǎng)基上清液Fab′的Fab′累積時(shí)間曲線。
圖7c顯示在1升使用IGS2和IGS17的發(fā)酵物中周質(zhì)Fab′和培養(yǎng)基上清液Fab′的Fab′累積時(shí)間曲線。
圖8顯示抗TNFαFab′片段的輕鏈的氨基酸序列。
圖9顯示抗TNFαFab′片段的重鏈的氨基酸序列。
圖10顯示包含AEOS11和OmpA前導(dǎo)序列的抗TNFαFab′片段的完整編碼區(qū)。
圖11顯示包含AEOS11的抗TNFαFab′片段的完整的編碼區(qū)和翻譯序列。
實(shí)施例 一般方法 編碼抗TNFα抗體的雙順?lè)醋有畔? 本發(fā)明的雙順?lè)醋有畔⒂糜讷@得WO01/94585中描述的抗TNFαFab′片段的高水平表達(dá)。上游順?lè)醋泳幋a抗體的輕鏈(圖8)而下游順?lè)醋泳幋a抗體的重鏈(圖9)。將編碼OmpA信號(hào)肽的DNA序列融合至編碼各輕鏈和重鏈的DNA的5′末端，從而使得能夠有效分泌至周質(zhì)。
將編碼許多不同的抗體表達(dá)優(yōu)化序列(AEOS)的系列寡核苷酸盒(圖2)用于雙順?lè)醋有畔⒁愿淖冎劓湹谋磉_(dá)水平。不同AEOS的使用改變重鏈的翻譯起始率，從而導(dǎo)致多種翻譯的重鏈產(chǎn)物的積累率。
方法基本上和WO03/048208中描述的一樣。IGS1、2、3和4來(lái)自WO03/048208。
使用橫跨5′HindIII位點(diǎn)至OmpA的長(zhǎng)正向5′寡核苷酸產(chǎn)生構(gòu)建體。表達(dá)實(shí)驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入W3110，然后在21個(gè)燒瓶中進(jìn)行200ml LB 30℃的搖瓶實(shí)驗(yàn)，在OD600＝0.5時(shí)與200μM IPTG一起溫育。在于30℃下振蕩過(guò)夜之前，將時(shí)間點(diǎn)樣品在Tris/EDTA提取緩沖液(100mM/10mM pH7.4)中重懸浮至30 OD600/ml。通過(guò)assemblyELISA使用6045捕獲(抗CH1)和抗人κHRP綴合物(SouthernBiotech HP6062)顯示來(lái)測(cè)定Fab′的濃度。
表達(dá)時(shí)間曲線顯示IGS 7-14都能夠以等于或高于之前描述的IGS1和IGS2的水平表達(dá)Fab’(圖3)。與IGS2相比，即使它們?cè)诮K止和起始密碼子(+1)之間都具有相同的間隔，IGS9產(chǎn)生增加的產(chǎn)量；它們的不同之處在于HindIII位點(diǎn)的存在/不存在、間隔核苷酸A對(duì)T以及OmpAII的前兩個(gè)賴氨酸密碼子AAG AAG對(duì)AAA AAG。
圖4比較了都具有-1的基因間間隔的兩種IGS質(zhì)粒(IGS1和IGS7)。來(lái)自這些質(zhì)粒的Fab′的表達(dá)差異不顯著，表明HindIII位點(diǎn)的存在和OmpAII的兩個(gè)賴氨酸密碼子AAG AAG至AAA AAG的改變不導(dǎo)致表達(dá)水平的改變。因此當(dāng)在不同的IGS之間進(jìn)行比較時(shí)，也存在于其他IGS構(gòu)建體中的這兩種改變最可能可以被忽略。因此在下列實(shí)施例中，最重要的是AEO序列。
圖5a-eIGS2(+1的間隔)對(duì)IGS10-13(+2、+3、+4和+5的間隔)的比較證明高于IGS2的產(chǎn)量的產(chǎn)量的提高是由兩個(gè)因素導(dǎo)致的GAGGAG SD序列而非IGS2中使用的GAGGGG序列的使用和具有SD與ATG起始密碼子之間的最佳距離。數(shù)據(jù)表明+2和+3的間隔對(duì)于該Fab′是最佳的，對(duì)于+4和+5的間隔具有朝向產(chǎn)量穩(wěn)定減少的傾向。IGS14(+6)的產(chǎn)量的進(jìn)一步減少支持該傾向，從而如圖5e中所示，其與IGS2(+1)具有大致相同的產(chǎn)量。
圖6確認(rèn)了其中兩個(gè)構(gòu)建體之間的差異只在于終止密碼子與ATG之間的間隔的兩種質(zhì)粒之間存在顯著差異。IGS10(+2)和IGS14(+6)具有相同的HindIII、SD序列、TAA終止密碼子和為AAA AAG的OmpAII密碼子。該數(shù)據(jù)確認(rèn)IGS中的SD-ATG間隔的長(zhǎng)度可精細(xì)地調(diào)節(jié)多順?lè)醋又械牡诙虻谋磉_(dá)水平，從而多順?lè)醋又械牡诙虻谋磉_(dá)水平依賴于IGS盒中的AEO序列。
檢測(cè)新的IGS盒7-14的生長(zhǎng)譜并將其與IGS1和IGS2進(jìn)行比較。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到0.5的OD600時(shí)誘導(dǎo)培其，然后再進(jìn)行另外4小時(shí)。觀察到大部培養(yǎng)物與兩個(gè)顯著的例外相似。編碼IGS9(+1)的質(zhì)粒能夠使細(xì)胞培養(yǎng)至更高的OD600并且在誘導(dǎo)后與其他IGS盒相比展示持續(xù)更好地生長(zhǎng)。第二好的生長(zhǎng)譜是編碼IGS2(+1)的質(zhì)粒。這兩種IGS具有的唯一的共同特征是為+1個(gè)殘基的間隔空隙。IGS2和9分別地是±HindIII、GAGGGG對(duì)GAGGAG，在TAA和ATG之間具有A對(duì)T以及具有AAG AAG對(duì)AAA AAG的賴氨酸密碼子。因?yàn)镮GS9的產(chǎn)量比IGS2稍高，因而該生長(zhǎng)有利方面不可能歸因于由于產(chǎn)生較少的蛋白質(zhì)產(chǎn)物導(dǎo)致的減少的應(yīng)激。因此，這些數(shù)據(jù)表明在為+1的終止密碼子-ATG間隔中存在因有益于轉(zhuǎn)錄/翻譯機(jī)器而賦予的生物有利方面。
IGS2對(duì)IGS10、17和18的不同的1升發(fā)酵試驗(yàn)表達(dá)比較的生長(zhǎng)譜顯示新的IGS在Fab′誘導(dǎo)前或誘導(dǎo)后對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)不具有有害效應(yīng)。圖7a、b和c顯示周質(zhì)材料(通過(guò)G蛋白HPLC測(cè)定法測(cè)量的)和培養(yǎng)基上清液材料(通過(guò)Fab′夾心ELISA測(cè)量的)的Fab’累積譜。數(shù)據(jù)顯示當(dāng)與IGS2相比，IGS17和18的Fab′產(chǎn)量不減少。發(fā)酵數(shù)據(jù)必然易于受到由取樣和測(cè)定變化引起的噪聲的影響，但三組發(fā)酵數(shù)據(jù)一起表明了IGS17具有提高大約10-20％的Fab產(chǎn)量。
圖10提供了編碼包含IGS17的抗TNFα抗體Fab′片段的雙順?lè)醋有畔ⅲ撔蛄械姆g產(chǎn)物示于圖11。
序列表
<110>UCB SA
Humphreys，David
Ellis，Mark
<120>使用抗體表達(dá)優(yōu)化序列的表達(dá)控制
<130>G0015
<160>26
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>AEOS 1
<400>1
aggggagagt gttaaatgca taatcatcaa agggactagt gctcttcggt cgagttctag60
ataacgaggc gtaaaaaatg80
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>AEOS 2
<400>2
agaggagagt gttaaatg 18
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>AEOS 3
<400>3
agaggagagt gttaatatg 19
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>AEOS 4
<400>4
agaggagagt gttaataatg20
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>AEOS 5
<400>5
agaggagagt gttaataaat g 21
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>AEOS 6
<400>6
agaggagagt gttaataaaa tg 22
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>AEOS 7
<400>7
agaggagagt gttaataaaa atg23
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>AEOS 8
<400>8
agaggagagt gttaataaaa aatg 24
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>AEOS 9
<400>9
agaggagagt gttaataata aatg24
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>AEOS 10
<400>10
agaggagagt gttaaaaaaa aatg24
<210>11
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>AEOS 11
<400>11
agaggagagt gttaaaatg 19
<210>12
<211>112
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IGS5
<400>12
aagctttaat aggggagagt gttaaatgca taatcatcaa agggactagt gctcttcggt60
cgagttctag ataacgaggc gtaaaaaatg aaaaagactg ctatagcaat tg 112
<210>13
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IGS8
<400>13
aagctttaat agaggagagt gttaaatgaa aaagactgct atagcaattg 50
<210>14
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IGS9
<400>14
aagctttaat agaggagagt gttaatatga aaaagactgc tatagcaatt g51
<210>15
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IGS10
<400>15
aagctttaat agaggagagt gttaataatg aaaaagactg ctatagcaat tg 52
<210>16
<211>53
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IGS11
<400>16
aagctttaat agaggagagt gttaataaatgaaaaagact gctatagcaa ttg 53
<210>17
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IGS12
<400>17
aagctttaat agaggagagt gttaataaaa tgaaaaagac tgctatagca attg 54
<210>18
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IGS13
<400>18
aagctttaat agaggagagt gttaataaaa atgaaaaaga ctgctatagc aattg55
<210>19
<211>56
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IGS14
<400>19
aagctttaat agaggagagt gttaataaaa aatgaaaaag actgctatag caattg56
<210>20
<211>56
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IGS15
<400>20
aagctttaat agaggagagt gttaataata aatgaaaaag actgctatag caattg56
<210>21
<211>56
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IGS16
<400>21
aagctttaat agaggagagt gttaaaaaaa aatgaaaaag actgctatag caattg56
<210>22
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IGS17
<400>22
aagctttaat agaggagagt gttaaaatga agaaaactgc tatagcaatt g 51
<210>23
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IGS18
<400>23
aagctttaat agaggagagt gttaataatg aagaaaactg ctatagcaat tg 52
<210>24
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>輕鏈
<400>24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>25
<211>229
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重鏈
<400>25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Ala Ala
225
<210>26
<211>1465
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有AEOS11的雙順?lè)醋有畔?br> <400>26
atgaaaaaga cagctatcgc aattgcagtg gccttggctg gtttcgctac cgtagcgcaa 60
gctgacattc aaatgaccca gagcccatcc agcctgagcg catctgtagg agaccgggtc 120
accatcactt gtaaagccag tcagaacgta ggtactaacg tagcctggta tcagcaaaaa 180
ccaggtaaag ccccaaaagc cctcatctac agtgcctctt tcctctatag tggtgtacca 240
tacaggttca gcggatccgg tagtggtact gatttcaccc tcacgatcag tagcctccag 300
ccagaagatt tcgccactta ttactgtcaa cagtataaca tctacccact cacattcggt 360
cagggtacta aagtagaaat caaacgtacg gtagcggccc catctgtctt catcttcccg 420
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660
ggcctgagct caccagtaac aaaaagcttt aatagaggag agtgttaaaa tgaagaaaac 720
tgctatagca attgcagtgg cgctagctgg tttcgccacc gtggcgcaag ctgaggttca 780
gctggtcgag tcaggaggcg gtctcgtgca gcctggcgga tcactgagat tgtcctgtgc 840
tgcatctggt tacgtcttca cagactatgg aatgaattgg gttagacagg ccccgggaaa 900
gggcctggaa tggatgggtt ggattaatac ttacattgga gagcctattt atgctgacag 960
cgtcaagggc agattcacgt tctctctaga cacatccaag tcaacagcat acctccaaat1020
gaatagcctg agagcagagg acaccgcagt gtactattgt gctagaggat acagatctta1080
tgccatggac tactggggcc agggtaccct agtcacagtc tcctcagctt ccaccaaggg1140
cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct1200
gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc1260
cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct1320
cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt1380
gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtcga caagaaagtt gagcccaaat cttgtgacaa1440
aactcacaca tgcgccgcgt gatga 146權(quán)利要求
1. 用于產(chǎn)生抗體分子的雙順?lè)醋有畔?，其中上游順?lè)醋影幋a抗體的輕鏈的DNA，下游順?lè)醋影幋a相應(yīng)的重鏈的DNA，其特征在于雙順?lè)醋有畔x自AEOS1(SEQ ID NO1)、AEOS2(SEQ ID NO2)、AEOS3(SEQ ID NO3)、AEOS4(SEQ ID NO4)、AEOS5(SEQ ID NO5)、AEOS6(SEQ ID NO6)、AEOS7(SEQ ID NO7)、AEOS8(SEQ ID NO8)、AEOS9(SEQ ID NO9)、AEOS10(SEQ ID NO10)和AEOS 11(SEQ ID NO11)的序列。
2. 用于產(chǎn)生抗體分子的雙順?lè)醋有畔?，其中上游順?lè)醋影幋a抗體的輕鏈的DNA，下游順?lè)醋影幋a相應(yīng)的重鏈的DNA，其特征在于雙順?lè)醋有畔x自IGS5(SEQ ID NO12)、IGS8(SEQ ID NO13)、IGS9(SEQ ID NO14)、IGS10(SEQ ID NO15)、IGS11(SEQ ID NO16)、IGS12(SEQ ID NO17)、IGS13(SEQ ID NO18)、IGS14(SEQ ID NO19)、IGS15(SEQ ID NO20)、IGS16(SEQ ID NO21)、IGS17(SEQ ID NO22)和IGS18(SEQ ID NO23)的序列。
3. 權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的雙順?lè)醋有畔?，其中由所述信息編碼的抗體分子的輕鏈包含SEQ ID NO24中所示的序列，由所述信息編碼的抗體分子的重鏈包含SEQ ID NO25中所示的序列。
4. 權(quán)利要求3的雙順?lè)醋有畔?，其中信息包含SEQ ID NO26中所示的序列。
5. 包含權(quán)利要求1、2、3或4中任一項(xiàng)的雙順?lè)醋有畔⒌谋磉_(dá)載體。
6. 權(quán)利要求5的表達(dá)載體，其中表達(dá)載體是pTTO-1或pTTOD。
7. 已用權(quán)利要求5或權(quán)利要求6的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8. 權(quán)利要求7的宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
9. 用于產(chǎn)生抗體分子的方法，其包括培養(yǎng)權(quán)利要求7或權(quán)利要求8的宿主細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生抗體分子的雙順?lè)醋有畔?，其中上游順?lè)醋影幋a抗體的輕鏈的DNA，下游順?lè)醋影幋a相應(yīng)的重鏈的DNA，其特征在于雙順?lè)醋有畔x自AEOS1(SEQ ID NO1)、AEOS2(SEQ IDNO2)、AEOS3(SEQ ID NO3)、AEOS4(SEQ ID NO4)、AEOS5(SEQ ID NO5)、AEOS6(SEQ ID NO6)、AEOS7(SEQ ID NO7)、AEOS8(SEQ ID NO8)、AEOS9(SEQ ID NO9)、AEOS10(SEQ ID NO10)和AEOS11(SEQ ID NO11)的序列。
文檔編號(hào)C07K16/24GK101277975SQ200680036780
公開日2008年10月1日 申請(qǐng)日期2006年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月4日
發(fā)明者D·P·胡姆費(fèi)雷斯, M·埃利斯 申請(qǐng)人:Ucb醫(yī)藥有限公司