專利名稱：修飾細(xì)胞色素p450酶的編碼核酸和其應(yīng)用方法
修飾細(xì)胞色素P450酶的編碼核酸和其應(yīng)用方法交叉參考本申請要求2005年10月7日提交的美國臨時專利申請?zhí)?0/724,525和 2006年1月27日提交的美國臨時專利申請?zhí)?0/762,700的優(yōu)先權(quán)，將這些申 請全文納入本文作參考。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及類異戊烯(isoprenoid)化合物生產(chǎn)領(lǐng)域，具體是用類異戊烯前體 修飾酶的編碼核酸遺傳修飾的宿主細(xì)胞。發(fā)明背景類異戊烯構(gòu)成了極大并且多樣的天然產(chǎn)物類型，它們具有相同的生物合成 來源，即一種代謝前體二磷酸異戊-l-烯酯(isopentenyl diphosphate, IPP)。類異 戊烯化合物也稱為"萜"或"類萜"。已經(jīng)描述了超過40,000種類異戊烯。由 定義可以看出，類異戊烯由所謂的異戊烯(isoprene)(C5)單元組成。類異戊烯中 存在的C原子的數(shù)量一般可被5整除(C5、 C10、 C15、 C20、 C25、 C30和C40)， 但也報道了不規(guī)則的類異戊烯和多萜。類異戊烯化合物也稱為"萜"或"類萜"。 類異戊烯的重要成員包括類胡蘿卜素、倍半萜類、雙萜類和半萜。類胡蘿卜素 包括例如番茄紅素，卩-胡蘿卜素等許多用作抗氧化劑的物質(zhì)。倍半萜類包括 例如 一種具有抗瘧活性的化合物青蒿素。雙萜類包括例如 一種癌癥化療藥 紫杉醇。類異戊烯包括種類最多并結(jié)構(gòu)各異的天然產(chǎn)物家族。在這個家族中，分離 自植物和其它天然來源的萜類化合物用作商品調(diào)味劑和香料化合物，以及抗瘧 藥和抗癌藥。目前使用的大多數(shù)萜類化合物是天然產(chǎn)物或其衍生物。許多這些 天然產(chǎn)物所來源的生物體(如樹、海洋無脊椎動物)既無法進(jìn)行大規(guī)模培育以生 產(chǎn)商業(yè)適合數(shù)量(的產(chǎn)物)，也不適合遺傳操作以提高這些化合物的產(chǎn)量或?qū)@些化合物進(jìn)行衍生。因此，必須由類似物半合成、或用常規(guī)化學(xué)合成方法合成 這些天然產(chǎn)物。而且，許多天然產(chǎn)物具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)，因此，目前合成這些天然 產(chǎn)物是不經(jīng)濟(jì)或不可能的。這些天然產(chǎn)物必須從天然來源如樹、海綿、珊瑚和 海洋微生物中提??；或由更豐富的前體合成或半合成產(chǎn)生。由天然來源提取天 然產(chǎn)物受限于天然來源的可用性；合成或半合成生產(chǎn)天然產(chǎn)物可能遇到低產(chǎn)率 和/或高成本的困擾。這些生產(chǎn)問題和天然來源的局限性可限制這種產(chǎn)物的商業(yè) 和臨床開發(fā)。在工程改造(遺傳修飾)的宿主細(xì)胞中體外(如在發(fā)酵系統(tǒng)中)或體內(nèi)(如在 遺傳修飾的多細(xì)胞生物體中)生物合成類異戊烯天然產(chǎn)物可激發(fā)出這些天然來 源未能實現(xiàn)的商業(yè)或治療潛能，并生產(chǎn)出較便宜和更廣泛使用的精細(xì)化學(xué)品和 藥物。在遺傳修飾宿主中產(chǎn)生類異戊烯或類異戊烯前體化合物的一個障礙是有 效生產(chǎn)能修飾類異戊烯化合物的聚異戊烯前體、或修飾類異戊烯前體的酶。在許多天然產(chǎn)物耙點(diǎn)的生化轉(zhuǎn)化中最重要的一類酶是細(xì)胞色素P450(P450) 超家族，它參與了極廣泛的各種代謝反應(yīng)。在一個驚人的例子中，在由前體焦 磷酸櫳牛兒基櫳牛兒基酯生物合成紫杉醇的約20個步驟中，P450能催化其中 8個步驟。本領(lǐng)域需要改進(jìn)的產(chǎn)生類異戊烯或產(chǎn)生類異戊烯前體的宿主細(xì)胞，以便高 水平產(chǎn)生類異戊烯化合物。本發(fā)明解決了這種需求并提供了相關(guān)優(yōu)點(diǎn)。 參考文獻(xiàn)美國專利公開號2004/005678;美國專利公開號2003/0148479; Martin等 (2003) A^. Bfofec/z. 21(7):796-802; Polakowski等(1998)Af!'cro&o/. Biotechnol. 49: 67-71; Wilding等(2000) /麵feWo/ 182(15): 4319-27;美國 專利公開號2004/0194162 ; Donald等 (1997) jp; /. ￡"v. M/cw&W. 63:3341-3344; Jackson等(2003) Oga".5:1629-1632;美國專利公開號 2004/0072323;美國專利公開號2004/0029239;美國專利公開號2004/0110259; 美國專利公開號2004/0063182;美國專利號5,460,949;美國專利公開號 2004/0077039;美國專利號6,531,303;美國專利號6,689,593; Hamano等(2001) S/otec/mo/. _6/oc/zem. 65:1627-1635 ; T. Kuzuyama. (2004) B/osr/. 所她cA"o/. 5foc/z亂68(4》931-934; T. Kazuhiko. (2004)26: 1487-1491; Brock等(2004) ￡w丄271: 3227-3241; Choi等 (1999) ^ / /. ￡"w>ow. Mz'ox^/o. 65 4363-4368; Parke等(2004) ^ ; /. ￡"w>o". M/cra6/o. 70: 2974-2983; Subrahmanyam等(1998)5a". 180: 4596-4602; Murli等(2003) /. /"A M/craWo/. 5/ofec/z"o/. 30: 500-509; Starai等(2005) 5^/. C/zew. 280:26200-26205;和Starai等(2004) Mo/.所o/. 340:1005-1012; Jennewein等CAem. 2004， 11， 379—387; Sowden等Og. CVzem. 2005， 3， 57-64; Luo等P/aW 2001， 2S， 95-104; Carter等尸/^toc/zem. 2003 , 64 ， 425~433 ; Craft等 ^ ; /.五"v/ra". M/croWo/. 2003 ， 69 ， 5983—5991; Barnes等iVoc. A^/. 1991，朋，5597-5601;Schoch等尸/a"i1尸—W. 2003， "3， 1198-1208; Roosild等腸置2005， 307， 1317-1321。發(fā)明概述本發(fā)明提供了含有編碼修飾細(xì)胞色素P450酶的核苷酸序列的核酸；以及 包含該核酸的重組載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了在用含有編碼修飾細(xì)胞色 素P450酶的核苷酸序列的核酸遺傳修飾的宿主細(xì)胞中，產(chǎn)生官能化化合物的 方法。附圖簡要說明

圖1是在大腸桿菌OE.⑦//)中生物合成8-羥基-8-杜松烯的示意圖。圖2是由表達(dá)CadOH生物合成途徑的大腸桿菌中提取的有機(jī)層的氣相色 譜-質(zhì)譜(GC-MS)圖。圖3是由飼喂甲羥戊酸的表達(dá)CadOH生物合成途徑以及一部分甲羥戊酸 途徑(pMBIS)的大腸桿菌中提取的有機(jī)層的GC-MS圖。圖4A和4B描述了對CadH進(jìn)行的各種N末端修飾(圖4A);用各種CadH 構(gòu)建物遺傳修飾的大腸桿菌產(chǎn)生CadOH的時程圖。圖5描述了米司迪蛋白(mistic)的氨基酸序列。圖6描述了苧烯羥化酶的氨基酸序列。圖7描述了馬兜鈴堿(aristolochene)二羥化酶的氨基酸序列。圖8A-D描述了含有天然跨膜結(jié)構(gòu)域(下劃線)的杜松烯羥化酶(圖8A);含有異源跨膜結(jié)構(gòu)域(粗體)的杜松烯羥化酶(圖8B);含有增溶結(jié)構(gòu)域(粗體)的杜 松烯羥化酶(圖8C);和含有分泌結(jié)構(gòu)域和異源跨膜結(jié)構(gòu)域(粗體)的杜松烯羥化酶(圖8D)的氨基酸序列。圖9A和9B描述了紫杉二烯(taxadiene)羥化酶的氨基酸序列。 圖IO描述了 e"f-貝殼杉烯氧化酶的氨基酸序列。圖11A描述了編碼杜松烯羥化酶的核苷酸序列(用粗體表示起始atg);圖 IIB描述了根據(jù)在原核細(xì)胞中表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化的編碼杜松烯羥化酶的變異 核苷酸序列。圖12A描述了來自東北紅豆杉(rax船cwj^Wflto)的細(xì)胞色素P450還原酶 (CPR)的氨基酸序列；圖12B描述了來自熱帶念珠菌(Ca^^fl^^'cafc)的CPR 的氨基酸序列；圖12C描述了來自擬南芥(Jra6Wop^ AWa"a)的CPR(ATR1) 的氨基酸序列；圖12D描述了來自擬南芥的CPR(ATR2)的氨基酸序列；圖 12E描述了缺少葉綠體靶向序列的變異ATR2氨基酸序列。圖13是兩種血紅素生物合成途徑的示意圖。圖14是生物合成示范性類異戊烯產(chǎn)物紫杉醇、青蒿素和薄荷醇的示意圖。 圖15是產(chǎn)生示范性類異戊烯化合物的反應(yīng)方案的示意圖。 圖16是類異戊烯代謝途徑的示意圖，該代謝途徑由二磷酸異戊-l-烯酯 (IPP)和二磷酸二甲基烯丙酯(DMAPP)生產(chǎn)類異戊烯生物合成途徑中間體二磷 酸多異戊烯酯(polyprenyl diphosphate), 二磷酸櫳牛兒基酯(GPP)、 二磷酸法呢 酯(FPP)和二磷酸牴牛兒基牴牛兒基酯(GGPPP)。圖17是產(chǎn)生IPP的甲羥戊酸(MEV)途徑的示意圖。圖18是用于產(chǎn)生IPP和焦磷酸二甲基烯丙酯(DMAPP)的DXP途徑的示意圖。圖19A-C描述了各種修飾生物堿途徑中間體的P450酶的氨基酸序列。 圖20A-C描述了各種修飾苯丙酸類途徑中間體的P450酶的氨基酸序列。 圖21A和21B描述了各種修飾聚酮化合物途徑中間體的P450酶的氨基酸 序列。圖22是各種紫穗槐二烯氧化酶(AMO)構(gòu)建物的示意圖。(l)nAMO，分離自黃花蒿(A^e然L^ ^"^)的天然AMO序列；2) sAMO，根據(jù)大腸桿菌表達(dá)進(jìn) 行密碼子優(yōu)化的合成AMO基因；3) A13-AMO，用熱帶念珠菌(C. ^^/cfl/Z力 的A13 N末端序列取代了野生型跨膜序列的合成AMO基因；4) A17-AMO， 用熱帶念珠菌(C &0/7/^//力的A17 N末端序列取代了野生型跨膜序列的合成 AMO基因；5)Bov-AMO，用牛微粒體N末端序列取代了野生型跨膜序列的合 成AMO基因。圖23A和B描述了在大腸桿菌中通過各種AMO構(gòu)建物氧化紫穗槐二烯。圖24A和B描述了編碼野生型AMO的核苷酸序列。圖25描述了圖24所示核苷酸序列的氨基酸序列翻譯圖。圖26和27分別描述了編碼A13-AMO和氨基酸序列翻譯圖的核苷酸序列。圖28和29分別描述了編碼A17-AMO和氨基酸序列翻譯圖的核苷酸序列。圖30和31分別描述了編碼牛-AMO和氨基酸序列翻譯圖的核苷酸序列。圖32描述了在除含有編碼CadOH、 CPR和CadS的核苷酸序列外，還含 有全部甲羥戊酸途徑的大腸桿菌中產(chǎn)生的CadOH。圖33是比較在表達(dá)全部紫穗槐二烯途徑并含有 pDUET-ctAACPR-A13AMO質(zhì)?；騪CWori-A17AMO-ctAACPR質(zhì)粒的大腸桿 菌中產(chǎn)生的青蒿酸的GC-MS氣相譜和質(zhì)譜圖。圖34描述了在用編碼甲羥戊酸途徑酶和紫穗槐二烯合酶的核酸、和 pCWori-A17AMO-ctAACPR質(zhì)粒遺傳修飾的大腸桿菌中，將青蒿醇氧化成青蒿 醛的GC-MS氣相譜圖。圖35A和35B描述了編碼乙酰乙酰-CoA硫解酶("atoB")、 HMGS和截短 的HMGR(tHMGR)的核苷酸序列。圖36A-D描述了 pMBIS的核苷酸序列。定義術(shù)語"類異戊烯"、"類異戊烯化合物"、"萜"、"萜化合物"、"類萜"和"類萜 化合物"可互換使用。類異戊烯化合物由不同數(shù)量的所謂的異戊烯(C5)單位組成。類異戊烯中存在的碳原子數(shù)目一般可被5整除(如C5、 C10、 C15、 C20、 C25、 C30和C40)。曾報道過不規(guī)則的類異戊烯和多萜，它們也包括在"類異戊 烯"的定義中。類異戊烯化合物包括但不限于單萜、倍半萜、三萜、多萜和二萜。本文所用術(shù)語"二磷酸異戊烯酯(prenyl diphosphate)"與"焦磷酸異戊烯酯 (prenyl pyrophosphate)"可互換使用，包括含有一個異戊烯基的二磷酸單異戊烯 酯(如IPP和DMAPP)，以及含有兩個或多個異戊烯基的二磷酸多異戊烯酯。 二磷酸單異戊烯酯包括焦磷酸異戊-l-烯酯(IPP)和其異構(gòu)體焦磷酸二甲基烯丙 酯(DMAPP)。本文所用術(shù)語"萜合酶"指能酶學(xué)修飾IPP、 DMAPP或焦磷酸多異戊烯酯， 以便產(chǎn)生萜類前體化合物的任何酶。術(shù)語"萜合酶"包括能催化二磷酸異戊烯酯 轉(zhuǎn)化為類異戊烯或類異戊烯前體的酶。在本文中，術(shù)語"焦磷酸"可與"二磷酸"互換使用。因此，例如，術(shù)語"二 磷酸異戊烯酯"和"焦磷酸異戊烯酯"可互換；術(shù)語"焦磷酸異戊-l-烯酯"和"二磷 酸異戊-l-烯酯"可互換；術(shù)語"二磷酸法呢酯"和"焦磷酸法呢酯"可互換；等等。本文所用術(shù)語"甲羥戊酸途徑"或"MEV途徑"指將乙酰-CoA轉(zhuǎn)變?yōu)镮PP的 生物合成途徑。甲羥戊酸途徑包括催化以下步驟的酶(a)使兩個乙酰-CoA分 子縮合成乙酰乙酰CoA; (b)使乙酰乙酰CoA與乙酰CoA縮合形成HMG-CoA; (c)將HMG-CoA轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸；(d)將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸5-磷酸；(e) 將甲羥戊酸5-磷酸轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸5-焦磷酸；和(f)將甲羥戊酸5-焦磷酸轉(zhuǎn)化為 焦磷酸異戊-l-烯酯。圖17示意性說明了甲羥戊酸途徑。甲羥戊酸途徑的"上半 部分"指負(fù)責(zé)通過MEV途徑中間體將乙酰-CoA轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢u戊酸的酶。本文所用術(shù)語"l-脫氧-D-木酮糖5-二磷酸途徑"或"DXP途徑"指通過DXP 途徑中間體將甘油醛-3-磷酸和丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)镮PP和DMAPP的途徑，其中DXP 途徑包括催化圖18示意性說明的反應(yīng)的酶。本文所用術(shù)語"異戊烯基轉(zhuǎn)移酶"與術(shù)語"二磷酸異戊烯酯合酶"和"多異戊 烯基合酶"(如"GPP合酶"、"FPP合酶"、"OPP合酶"等)可互換使用，指能催化 二磷酸異戊-l-烯酯與烯丙基初始底物(primer substrate)的連續(xù)l'-4縮合，導(dǎo)致 形成各種鏈長度的二磷酸異戊烯酯的酶。術(shù)語"多核苷酸"和"核酸"在本文中可互換使用，指聚合形式的任何長度的 核苷酸，包括核糖核苷酸或脫氧核苷酸。因此，該術(shù)語包括但不限于單鏈、雙鏈或多鏈DNA或RNA，基因組DNA， cDNA， DNA-RNA雜交體，或含有 嘌呤和噴啶堿基或其它天然的、化學(xué)或生化修飾的非天然的、或衍生的核苷酸 堿基的聚合物。術(shù)語"肽"、"多肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中可互換使用，指聚合形式的任何長 度的氨基酸，可包括編碼和非編碼的氨基酸，化學(xué)或生化修飾或衍生的氨基酸， 以及含有修飾的肽主鏈的多肽。本文所用術(shù)語"天然產(chǎn)生"可應(yīng)用于核酸、細(xì)胞或生物體，指在天然情況下 發(fā)現(xiàn)的核酸、細(xì)胞或生物體。例如，可由天然來源分離并且未經(jīng)實驗室人員有 意修飾的生物體(包括病毒)中存在的多肽或多核苷酸序列是天然產(chǎn)生的。本文所用術(shù)語"分離"指與多核苷酸、多肽或細(xì)胞天然存在環(huán)境不同的環(huán)境 中的多核苷酸、多肽或細(xì)胞。分離的遺傳修飾的宿主細(xì)胞可存在于遺傳修飾的 宿主細(xì)胞的混合群體中。本文所用術(shù)語"外源性核酸"指通?；蛱烊磺闆r下沒有在給定的天然細(xì)菌、 生物體或細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)和/或產(chǎn)生的核酸。本文所用術(shù)語"內(nèi)源性核酸"指通常在給 定的天然細(xì)菌、生物體或細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)和/或產(chǎn)生的核酸。"內(nèi)源性核酸"也稱為"天 然核酸"或?qū)τ诮o定的細(xì)菌、生物體或細(xì)胞"天然"的核酸。例如，編碼HMGS、 甲羥戊酸激酶和磷酸甲羥戊酸激酶的核酸代表大腸桿菌(K co/0的外源性核酸。 由釀酒酵母OSacc/zram;;cM cem^'^)克隆這些甲羥戊酸途徑核酸。在釀酒酵母 中，染色體上編碼HMGS、 MK和PMK的基因序列為"內(nèi)源性"核酸。本文所用術(shù)語"異源核酸"指至少滿足以下一種條件的核酸"a)核酸是給定 的宿主微生物或宿主細(xì)胞以外的("外源性")(即不是天然發(fā)現(xiàn)的)；(b)核酸包含 在給定宿主微生物或宿主細(xì)胞中天然發(fā)現(xiàn)的(如"內(nèi)源性")核苷酸序列(如核酸 包含宿主微生物或宿主細(xì)胞內(nèi)源性核苷酸序列)，但該核酸在細(xì)胞中的產(chǎn)量是 非天然量(如大于預(yù)期產(chǎn)量或大于天然情況下的產(chǎn)量)；或者該核酸的序列與內(nèi) 源性核苷酸序列不同，以致在細(xì)胞中產(chǎn)生非天然量(如大于預(yù)期產(chǎn)量或大于天 然情況下的產(chǎn)量)的內(nèi)源發(fā)現(xiàn)的同一編碼蛋白(氨基酸序列相同或基本相同)；(c) 核酸包含在天然情況下相互關(guān)系不同的兩種或多種核苷酸序列或節(jié)段，如核酸是重組核酸。本文所用術(shù)語"異源多肽"指天然情況下與給定多肽無關(guān)的多肽。例如，含 有"異源跨膜結(jié)構(gòu)域"的類異戊烯前體修飾酶指含有天然情況下與類異戊烯前 體修飾酶通常無關(guān)(如通常不毗鄰；通常不在同一多肽鏈中發(fā)現(xiàn))的跨膜結(jié)構(gòu)域 的類異戊烯前體修飾酶。類似地，含有一個或多個"異源分泌結(jié)構(gòu)域"、"異源 膜插入多肽"和"異源增溶結(jié)構(gòu)域"的類異戊烯前體修飾酶是含有一個或多個天 然情況下與類異戊烯前體修飾酶通常無關(guān)(如通常不毗鄰；通常不在同一多肽 鏈中發(fā)現(xiàn))的分泌結(jié)構(gòu)域、膜插入多肽和增溶結(jié)構(gòu)域的類異戊烯前體修飾酶。本文所用術(shù)語"重組"指具體核酸(DNA或RNA)是克隆、限制性酶切和/或 連接步驟的各種組合的產(chǎn)物，這些組合產(chǎn)生具有可與天然系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性 核酸區(qū)別開的結(jié)構(gòu)性編碼或非編碼序列的構(gòu)建物。通常，編碼結(jié)構(gòu)性編碼序列 的DNA序列可由cDNA片段和短寡核苷酸接頭、或由一系列合成寡核苷酸組 裝，以提供能夠由細(xì)胞或無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)所含的重組轉(zhuǎn)錄單元表達(dá)的合 成核酸?？梢圆槐粌?nèi)部非翻譯序列或內(nèi)含子(一般存在于真核基因中)中斷的開 放閱讀框的形式提供這種序列。包含相關(guān)序列的基因組DNA也可用于形成重 組基因或轉(zhuǎn)錄單元。非翻譯DNA序列可以存在于開放閱讀框的5'或3'端，這 些序列不干擾編碼區(qū)的操作或表達(dá)，并且實際上可用于以各種機(jī)制調(diào)節(jié)所需產(chǎn) 物的產(chǎn)生(參見下面的"DNA調(diào)控序列")。因此，例如，術(shù)語"重組"多核苷酸或"重組"核酸指不是天然產(chǎn)生的，例如 通過人類介入人工組合兩種分離的序列節(jié)段制備的多核苷酸或核酸。常常通過 化學(xué)合成方法或通過人工操作分離的核酸節(jié)段(如遺傳工程技術(shù))實現(xiàn)此人工組 合。通常這樣做是為了用編碼相同或保守性氨基酸的冗余密碼子取代密碼子， 一般引入或去除序列識別位點(diǎn)。或者，進(jìn)行該方法以連接具有所需功能的核酸 節(jié)段，產(chǎn)生所需的功能組合。常常通過化學(xué)合成方法或通過人工操作分離的核 酸節(jié)段(如遺傳工程技術(shù))實現(xiàn)此人工組合。類似地，術(shù)語"重組"多肽指不是天然產(chǎn)生的，而是(例如)通過人工介入人 為地組合兩個分離的氨基酸序列節(jié)段而制備的多肽。因此，例如，含有異源氨 基酸序列的多肽是重組多肽。"構(gòu)建物"或"載體"指重組核酸，通常是重組DNA，產(chǎn)生重組DNA的目的是表達(dá)和/或增殖特定的核苷酸序列，或用其構(gòu)建其它重組核苷酸序列。本文所用術(shù)語"操縱子"和"單轉(zhuǎn)錄單元"可互換使用，指受一個或多個控制 元件(如啟動子)協(xié)同調(diào)節(jié)的兩個或多個毗連編碼區(qū)(編碼基因產(chǎn)物如RNA或蛋白質(zhì)的核苷酸序列)。本文所用術(shù)語"基因產(chǎn)物"指DNA編碼的RNA(反之亦然) 或者RNA或DNA編碼的蛋白質(zhì)，其中基因一般包含編碼蛋白質(zhì)的一種或多種 核苷酸序列，也可包括內(nèi)含子和其它非編碼核苷酸序列。本文中術(shù)語"DNA調(diào)控序列"、"控制元件"和"調(diào)控元件"可互換使用，指轉(zhuǎn) 錄或翻譯控制序列，如啟動子、增強(qiáng)子、聚腺苷酸化信號、終止子、蛋白降解 信號等，它們提供和/或調(diào)控宿主細(xì)胞中編碼序列的表達(dá)和/或編碼多肽的產(chǎn)生。本文中術(shù)語"轉(zhuǎn)化"與"遺傳修飾"可互換使用，指引入新核酸(即細(xì)胞外源性 DNA)后永久或瞬時誘導(dǎo)的細(xì)胞遺傳改變?？赏ㄟ^將新DNA摻入宿主細(xì)胞基因 組，或通過將新DNA瞬時或穩(wěn)定地維持為外遺元件實現(xiàn)遺傳改變("修飾")。當(dāng) 細(xì)胞是真核細(xì)胞時，通常通過將DNA引入細(xì)胞基因組實現(xiàn)永久遺傳改變。在 原核細(xì)胞中，可將永久改變引入染色體或通過染色體外元件如質(zhì)粒和表達(dá)載體 引入，染色體外元件可包含一個或多個可選擇標(biāo)記以幫助將它們維持在重組宿 主細(xì)胞中。遺傳修飾的合適方法包括病毒感染、轉(zhuǎn)染、接合、原生質(zhì)體融合、 電穿孔、基因槍技術(shù)、磷酸鈣沉淀、直接顯微注射等。對方法的選擇通常取決 于待轉(zhuǎn)化的細(xì)胞類型和發(fā)生轉(zhuǎn)化的環(huán)境(即體外、離體或體內(nèi))。對這些方法的 總體討論可參見Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology(分子生物學(xué)簡 單方法)，第3版，維森出版集團(tuán)(Wiley and Sons), 1995。"操作性連接"指并列，其中所述組件的相互關(guān)系允許它們以所需方式起作 用。例如，如果啟動子影響某編碼序列轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，那么該啟動子操作性連接 于該編碼序列。本文所用術(shù)語"異源啟動子"和"異源控制區(qū)"指正常情況下不與 天然具體核酸相連的啟動子和其它控制區(qū)。例如，"與編碼區(qū)異源的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)"是正常情況下不與天然編碼區(qū)相連的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)。本文所用"宿主細(xì)胞"指體內(nèi)或體外真核細(xì)胞、原核細(xì)胞或來自多細(xì)胞生物 體(如細(xì)胞系)但培養(yǎng)為單細(xì)胞實體的細(xì)胞，其中真核或原核細(xì)胞可用作或已用 作核酸受體(如包含編碼一種或多種生物合成途徑基因產(chǎn)物如甲羥戊酸途徑基 因產(chǎn)物的核苷酸序列的表達(dá)載體)，它包括已用核酸遺傳修飾的原始細(xì)胞的后代。應(yīng)理解，單個細(xì)胞的后代不一定與原始親本的形態(tài)或基因組DNA或整套DNA完全相同，因為有天然、偶然或有意突變。"重組宿主細(xì)胞"(也稱為"遺傳 修飾的宿主細(xì)胞")是引入了異源核酸如表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。例如，由于將異 源核酸引入合適的原核宿主細(xì)胞，所述原核宿主細(xì)胞是遺傳修飾的原核宿主細(xì) 胞(如細(xì)菌)，其中所述異源核酸是例如該原核宿主細(xì)胞以外(天然情況下未發(fā)現(xiàn)) 的外源性核酸，或通常未在該原核宿主細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的重組核酸；由于將異源核 酸引入了合適的真核宿主細(xì)胞，所述真核宿主細(xì)胞是遺傳修飾的真核宿主細(xì) 胞，其中異源核酸例如該真核宿主細(xì)胞以外的外源性核酸或通常未在該真核宿主細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的重組核酸。術(shù)語"保守性氨基酸取代"指蛋白質(zhì)中具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基可互 換。例如，具有脂族側(cè)鏈的一組氨基酸由甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨 酸和異亮氨酸組成；具有脂族-羥基側(cè)鏈的一組氨基酸由絲氨酸和蘇氨酸組 成；具有含酰胺側(cè)鏈的一組氨基酸由天冬酰胺和谷胺酰胺組成；具有芳族側(cè)鏈的一組氨基酸由苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸組成；具有堿性側(cè)鏈的一 組氨基酸由賴氨酸、精氨酸和組氨酸組成；具有含硫側(cè)鏈的一組氨基酸由 半胱氨酸和甲硫氨酸組成。示范性保守性氨基酸取代基是纈氨酸-亮氨酸 -異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸和天冬酰胺 -谷胺酰胺。"合成核酸"可由用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法化學(xué)合成的寡核苷酸 結(jié)構(gòu)塊(building block)組裝。連接和退火這些結(jié)構(gòu)塊，以形成基因節(jié)段， 之后用酶組裝這些節(jié)段構(gòu)建整個基因。提到DNA序列時，"化學(xué)合成"指 其組成氨基酸是在體外組裝的?？梢杂靡呀?jīng)建立的方法手工化學(xué)合成DNA， 或可用許多市售機(jī)器之一自動化學(xué)合成DNA?？尚揎椇怂岬暮塑账嵝蛄?， 以根據(jù)優(yōu)化核苷酸序列以反映宿主細(xì)胞的密碼子偏倚性(的原則)優(yōu)化表達(dá)。 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，如果密碼子使用偏向于適合宿主的密碼子，就能 提高成功表達(dá)的可能性?？筛鶕?jù)對獲自可獲得序列信息的宿主細(xì)胞的基因 研究，確定優(yōu)選密碼子。多核苷酸或多肽與另一種多核苷酸或多肽具有某百分?jǐn)?shù)的"序列相同性" 是指，當(dāng)比對時，此百分?jǐn)?shù)的堿基或氨基酸相同，以及在比較兩個序列時，此百分?jǐn)?shù)的堿基或氨基酸在相同的相對位置中?？捎迷S多不同方式測定序列相似 性。為了測定序列相同性，可用方法和計算機(jī)程序比對序列，計算機(jī)程序包括可由因特網(wǎng)址ncbi.nlm.nih.gov/BLAST獲得的BLAST。參見例如，Altschul等 (1990)， /Mo/. 215:403-10。另一種比對算法是FASTA，可從美國威斯康 星州麥迪遜的遺傳學(xué)計算組(GCG)包(牛津分子集團(tuán)公司(Oxford Molecular Group, Inc.)的全資子公司)獲得。其它比對技術(shù)參見《酶學(xué)方法》(Methods in Enzymology)，第266巻大分子序列分析的計算機(jī)方法(Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis)(1996) ， Doolittle編，學(xué)術(shù)出版社公司 (Academic Press, Inc.),哈布公司(Harcourt Brace & Co.)的分公司，美國加利福 尼亞州圣地亞哥。尤其感興趣的是允許序列有缺口的比對程序。 Smith-Waterman是允許序列比對中有缺口的一種算法類型。參見Me仇Mo/. B/o/. 70: 173-187 (1997)。同時，采用Needleman & Wunsch比對法的GAP程 序可用于比對序列。參見JM /. 5/o/. 48: 443-453(1970)。當(dāng)在溫度和溶液離子強(qiáng)度合適的條件下，核酸的單鏈形式可退火于另一核 酸時，該核酸與另一核酸(如cDNA、基因組DNA或RNA)"可雜交"。雜交 和洗滌條件是熟知的，參見例如Sambrook， J.， Fritsch， E.F.和Maniatis， T.《分子克隆實驗室手冊》(Mo/ecw/arC/o"/"g,. JZa6oratoo;Mam^/)，第二版，冷 泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),冷泉港(1989)，特別 是其中第11章和表11.1;和Sambrook, J.和Russell, W.，《分子克隆實驗 室手冊》(Mo/ec"/flrC/om'"g, ^i^6oratoo;Mfl"wa/)，第三版，冷泉港實驗室出 版社，冷泉港(2001)。溫度和離子強(qiáng)度條件決定了雜交的"嚴(yán)謹(jǐn)性"?？烧{(diào)節(jié) 嚴(yán)謹(jǐn)性條件以篩選中等類似的片段如相關(guān)性較少的生物體的同源序列，至高度 相似的片段如復(fù)制密切相關(guān)生物體的功能酶的基因。雜交條件和雜交后洗滌可 用于獲得所需的雜交決定性嚴(yán)謹(jǐn)條件。 一組說明性雜交后洗滌是一系列洗滌， 開始是6XSSC(SSC是0.15 MNaCl和15 mM檸檬酸鹽緩沖液)，0.5% SDS， 室溫下15分鐘，然后用2XSSC， 0.5%SDS， 45。C重復(fù)洗滌30分鐘，然后用 0.2XSSC， 0.5%SDS， 50。C洗滌30分鐘，重復(fù)兩次。用較高溫度獲得其它嚴(yán) 謹(jǐn)條件，其中洗滌與上述洗滌相同，除了最后兩次用0.2XSSC， 0.5。/。SDS洗 滌30分鐘的溫度提高到60°C。另一組高度嚴(yán)謹(jǐn)條件最后兩次洗滌采用O.lxSSC， 0.1%SDS， 65°C。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的另一個例子是在5(TC或更高溫度 下和0.1xSSC(15 mM氯化鈉/1.5 mM檸檬酸鈉)中雜交。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的另一 個例子是在溶液中42'C孵育過夜，所用溶液是50%甲酰胺、5xSSC(150mM NaCl、 15mM檸檬酸三鈉)、50 mM磷酸鈉(pH 7.6)、 5xDenhardt溶液、10%硫 酸葡聚糖和20 |ng/ml變性剪切的鮭精DNA，然后用O.lxSSC在約65t洗滌濾 器。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件和雜交后洗滌條件是至少與上述代表性條件同樣嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交 條件和雜交后洗滌條件。雜交需要兩種核酸含有互補(bǔ)序列，但根據(jù)雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性，可能有堿基錯配。 核酸雜交的合適嚴(yán)謹(jǐn)性取決于核酸長度和互補(bǔ)程度，它們是本領(lǐng)域熟知的變 量。兩個核苷酸序列之間的相似性或同源性程度越大，具有這些序列的核酸雜 交體的解鏈溫度(Tm)越高。核酸雜交的相對穩(wěn)定性(對應(yīng)于較高Tm)按以下順 序依次降低RNA:RNA、 DNA:RNA、 DNA:DNA。對于長度大于100個核苷 酸的雜交體，產(chǎn)生了計算Tm的等式(參見Sambrook等，同上，9.50-9.51)。對 于較短核酸即寡核苷酸的雜交，錯配位置變得更重要，寡核苷酸的長度決定其 特異性(參見Sambrook等，同上，11.7-11.8)。 一般地，可雜交核酸的長度至少 約為10個核苷酸?？呻s交核酸的示范性最小長度為至少約15個核苷酸；至 少約20個核苷酸；至少約30個核苷酸。而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，可根據(jù) 諸如探針長度等因素調(diào)節(jié)溫度和洗滌溶液鹽濃度。在進(jìn)一步描述本發(fā)明之前，應(yīng)理解，本發(fā)明不僅限于所述的具體實施 方式，當(dāng)然它們也可以改變。也應(yīng)理解，本文所用術(shù)語僅僅為了描述具體 實施方式，不旨在限制，因此，本發(fā)明范圍僅受所附權(quán)利要求書的限制。當(dāng)提供值的范圍時，應(yīng)理解，本發(fā)明包括該范圍上下限之間以下限單位十 分之一為間隔的各居中值(除非文中明確指出不是這樣)以及任何其它指出值或 指出范圍中的居中值。這些較小范圍的上下限可獨(dú)立地包括在較小范圍內(nèi)，并 且也屬于本發(fā)明，還可在指出范圍中特別排除限值。當(dāng)所述范圍包括一個或兩 個限值時，本發(fā)明也包括排除一個或兩個限值的范圍。除非另有說明，本文所用的所有科技術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù) 人員通常理解的含義相同。雖然實施或測試本發(fā)明也可采用類似或等效于 本文所述內(nèi)容的任何方法和材料，但現(xiàn)在描述了優(yōu)選的方法和材料。將本文所述所有發(fā)表物納入本文作參考，以便連同引用的發(fā)表物公開和描述方 法和/或材料。必須注意，本文和所附權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式"一"、"一種" 以及"這種"包括復(fù)數(shù)含義，除非文中明確指出不是這樣。因此，例如，提到"一種細(xì)胞色素P450酶"包括多種這類酶，提到"一種細(xì)胞色素P450還原 酶"包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一種或多種細(xì)胞色素P450還原酶和其等同 物等。還需注意，可以使權(quán)利要求書排除任何任選元件。因此，此聲明旨 在用作排除性術(shù)語如"單獨(dú)"、"僅僅"等與權(quán)利要求部分聯(lián)用的前提基礎(chǔ)，或 采用"負(fù)"限制。提供本文所述發(fā)表物僅僅是因為它們在本申請的申請日之前公開。不應(yīng)理 解為承認(rèn)由于在先發(fā)明而使本發(fā)明不具資格先于這種出版物。而且，提供的公 開日可能與實際
公開日不同，可能需要單獨(dú)確認(rèn)。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了含有編碼修飾細(xì)胞色素P450酶的核苷酸序列的核酸；以及包含該核酸的重組載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了在用含有編碼修飾細(xì)胞色素P450酶的核苷酸序列的核酸遺傳修飾的宿主細(xì)胞中，產(chǎn)生官能化化合物的 方法。本發(fā)明還提供了含有編碼類異戊烯前體修飾酶的核苷酸序列的核酸；以及 包含該核酸的重組載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明提供了在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生有酶活性 的類異戊烯前體修飾酶的方法。本發(fā)明還提供了在用含有編碼類異戊烯前體修 飾酶的核苷酸序列的核酸遺傳修飾的宿主細(xì)胞中，產(chǎn)生類異戊烯化合物的方 法。核酸、載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明提供了含有編碼修飾細(xì)胞色素P450酶的核苷酸序列的核酸；以及包含該核酸的重組載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明提供了含有編碼類異戊烯前體修飾酶的核苷酸序列的核酸；以及包含該核酸的重組載體和宿主細(xì)胞。本文所用術(shù)語"修飾細(xì)胞色素P450酶"指修飾(如"官能化")生物合成途徑 的中間體的酶。本發(fā)明核酸編碼的修飾細(xì)胞色素P450酶能催化以下一種或多種反應(yīng)羥化、氧化、環(huán)氧化、脫水、脫氫、脫卣、異構(gòu)化、醇氧化、醛氧化、 脫烷基化和C-C鍵斷裂反應(yīng)。在本文中將這類反應(yīng)總稱為"生物合成途徑中間體修飾反應(yīng)"。這些反應(yīng)參見例如，Sono等((1996) CA亂i ev. 96:2841-2887; 參見例如，Sono等的圖3，這類反應(yīng)的示意圖)。在一些實施方式中，修飾細(xì)胞色素P450酶是類異戊烯前體修飾酶。本文 所用術(shù)語"類異戊烯前體修飾酶"與"類異戊烯修飾酶"可互換使用，它們指修飾 類異戊烯前體化合物，例如用類異戊烯前體化合物作底物的酶，所述類異戊烯 前體修飾酶能催化以下一種或多種反應(yīng)羥化、環(huán)氧化、氧化、脫水、脫氫、 脫鹵、異構(gòu)化、醇氧化、醛氧化、脫垸基化和C-C鍵斷裂反應(yīng)。在本文中將這 類反應(yīng)總稱為"類異戊烯前體修飾反應(yīng)"。這些反應(yīng)參見例如，Sono等((1996) 同上；參見例如，Sono等的圖3，這類反應(yīng)的示意圖)。在許多實施方式中， 類異戊烯前體修飾酶是細(xì)胞色素P450酶。參見例如，Sono等(1996)同上。修飾細(xì)胞色素P450酶的底物如上所述，修飾細(xì)胞色素P450酶的底物是生物合成途徑的中間體。示范性中間體包括但不限于類異戊烯前體；生物堿前體；苯丙酸類前體；類黃酮 前體；類固醇前體；聚酮化合物前體；大環(huán)內(nèi)酯前體；糖醇前體；酚類化合物 前體等。參見例如，Hwang等((2003)々少/.五"Wra".Afen 6/0/. 69:2699-2706; Facchini等((2004) 7T^HVZ)S P/aW &〖.9:116。感興趣的生物合成途徑產(chǎn)物包括但不限于類異戊烯化合物、生物堿化合 物、苯丙酸類化合物、類黃酮化合物、類固醇化合物、聚酮化合物化合物、大 環(huán)內(nèi)酯化合物、糖醇、酚類化合物等。生物堿化合物是在約20%植物種類中發(fā)現(xiàn)的一大類多樣化的天然產(chǎn)物。它們的定義通常是氧化狀態(tài)下雜環(huán)中存在氮原子。生物堿化合物包括芐基異喹啉 生物堿化合物、吲哚生物堿化合物、異喹啉生物堿化合物等。生物堿化合物包 括單環(huán)生物堿化合物、雙環(huán)生物堿化合物、三環(huán)生物堿化合物、四環(huán)生物堿化合物以及具有籠形結(jié)構(gòu)的生物堿化合物。生物堿化合物包括l)吡啶類胡椒 堿、毒芹堿、葫蘆巴堿、檳榔啶、四氫煙酸、匹魯卡品、野靛堿、金雀花堿、 石榴堿；2)吡咯垸類古豆堿、煙堿、紅古豆堿；3)托品堿類阿托品、可卡 因、芽子堿、石榴堿、東莨菪堿；4)喹啉類奎寧、二氫奎寧、奎尼丁、 二氫奎尼丁、番木鱉鹼、二甲馬錢子堿和藜蘆生物堿(如藜蘆堿、西法丁)； 5)異喹 啉類嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可汀、那碎因、白毛茛堿和黃連素； 6)苯乙胺類去氧麻黃堿、墨斯卡靈、麻黃堿；7)吲哚類色胺類(如二甲色胺、 西洛西賓、5-羥色胺)、麥角靈類(如麥堿、麥角胺、麥角酸等)和卩-咔啉類(如哈 爾堿、育亨賓、利血平、吐根堿)；8)嘌呤類黃嘌呤(如咖啡因、可可堿、茶 堿)；9)萜類烏頭生物堿(如烏頭堿)和類固醇(如茄堿、蠑螈堿)；IO)甜菜堿類 (季銨化合物如毒蠅堿、膽堿、神經(jīng)堿)；以及l(fā)l)吡唑類吡唑、甲吡唑。示 范性生物堿化合物是嗎啡、黃連素、長春堿、長春新堿、可卡因、東莨菪堿、 咖啡因、煙堿、阿托品、罌粟堿、吐根堿、奎寧、利血平、可待因、5-羥色胺等。參見例如，F(xiàn)acchini等((2004) 7>e"&尸/朋/5We"ce 9:116)。類異戊烯修飾酶底物術(shù)語"類異戊烯前體化合物"與"類異戊烯前體底物"可互換使用，它們指作 為萜合酶在二磷酸多異戊烯酯上反應(yīng)產(chǎn)物的化合物。萜合酶(也稱為"萜環(huán)化酶") 反應(yīng)產(chǎn)物是所謂的"萜骨架"。在一些實施方式中，類異戊烯修飾酶催化修飾萜 骨架，或其下游產(chǎn)物。因此，在一些實施方式中，類異戊烯前體是萜骨架。類異戊烯前體修飾酶的類異戊烯前體底物包括單萜、二萜、三萜和倍半萜。本發(fā)明核酸編碼的類異戊烯修飾酶的單萜底物包括但不限于產(chǎn)生的氧化 產(chǎn)物是單萜化合物或者是產(chǎn)生單萜化合物的生物合成途徑的中間體的任何單萜底物。示范性單萜底物包括但不限于屬于以下家族的單萜底物無環(huán)單萜、 二甲基辛烷、薄荷烷、不規(guī)則的類單萜、桉油醇、莰烷、異莰垸、單環(huán)單萜、蒎垸、葑垸、苧烷、蒈垸、紫羅酮、虹彩垸(Iridanes)和大麻(Ca皿abanoids)。示 范性單萜底物、中間體和產(chǎn)物包括但不限于竽烯、香茅醇(citranellol)、櫳牛 兒醇、薄荷醇、紫蘇子醇、芳樟醇和寧酮。本發(fā)明核酸編碼的類異戊烯修飾酶的二萜底物包括但不限于產(chǎn)生的氧化 產(chǎn)物是二萜化合物或者是產(chǎn)生二萜化合物的生物合成途徑的中間體的任何二萜底物。示范性二萜底物包括但不限于屬于以下家族的二萜底物無環(huán)雙萜類、雙環(huán)雙萜類、單環(huán)雙萜類、半日花烷(Labdanes)、克羅登垸(Clerodanes)、 紫杉烷、三環(huán)雙萜類、四環(huán)雙萜類、貝殼杉烯、貝葉烷(Beyerenes)、吖地烯 (Atiserenes)、魅腸霉素(Aphidicolins)、木藜盧毒素、赤霉素、大環(huán)二路和伊麗莎白三烷(Elizabethatrianes)。示范性二萜底物、中間體和產(chǎn)物包括但不限于 篦麻素、艾榴塞洛素(eleutherobin)、紫杉醇、蔓生素(prostratin)和假蕨素。本發(fā)明核酸編碼的類異戊烯修飾酶的三萜底物包括但不限于產(chǎn)生的氧化 產(chǎn)物是三萜化合物或者是產(chǎn)生三萜化合物的生物合成途徑的中間體的任何三 萜底物。示范性三萜底物、中間體和產(chǎn)物包括但不限于阿布糖苷E(arbmside E)、鴉膽丁(bruceantin)、睪酮、孕酮、可的松和洋地黃毒苷。本發(fā)明核酸編碼的類異戊烯修飾酶的倍半萜底物包括但不限于產(chǎn)生的氧 化產(chǎn)物是倍半萜化合物或者是產(chǎn)生倍半萜化合物的生物合成途徑的中間體的 任何倍半萜底物。示范性倍半萜底物包括但不限于屬于以下家族的倍半萜底物法呢烷、單環(huán)法呢烷、單環(huán)倍半萜、雙環(huán)倍半萜、雙環(huán)法呢垸、雙波烷(Bisbolanes)、檀香烷、卡波烷(Cupranes)、剪葉苔烷(Herbertanes)、瓣苔烷 (Gymnomitranes)、單端孢霉垸、花柏烷(Chamigranes)、胡蘿卜垸、菖蒲垸、安 提薩汀(Antisatins)、杜松烷、倍半萜酮右旋日本剌參萜酮(Oplopananes)、胡椒 垸(Copaanes)、苦毒垸(Picrotoxanes)、雪松垸、長葉蒎烷、長葉環(huán)垸 (Longicyclanes)、 丁香烷、莫得烷(Modhephanes)、斯非葉烷(Siphiperfolanes)、 萚草垸、全葉垸(Intergrifolianes)、麗皮葉垸(Lippifolianes)、原伊魯烷 (Protoilludanes)、隱環(huán)傘烷(Illudanes)、多毛烷(Hirsutanes)、乳燕烷(Lactaranes)、 斯蒂波烷(Sterpuranes)、富麻烷(Fomannosanes)、馬拉烷(Marasmanes)、大根香 葉垸、欖香烷、桉葉烷、貝克垸(Bakkanes)、綺羅垸(Chilosyphanes)、愈創(chuàng)木垸、 假愈創(chuàng)木垸、三環(huán)倍半萜、廣霍香垸、三嗯垸(Trixanes)、香木蘭垸 (Aromadendranes)、 高各烷(Gorgonanes)、 納多烷(Nardosinanes)、 巴西烷 (Brasilanes)、 綠苔烷(Pinguisanes)、 倍半旅烷(Sequipinane)、 倍半莰烷 (Sequicamphane)、斧柏烷、雙環(huán)萚草烷、蔥烷(Alliacanes)、斯蒂波烷(Ste卬uranes)、 乳菇烷、亞夫麗垸(Africanes)、全葉垸、原伊魯垸(Protoilludanes)、 土青木香烷 和紐蘭烷(Neolemnanes)。示范性倍半萜底物包括但不限于紫穗槐二烯、異長 葉烯(alloisolongifolene)、 (-)-a-反式-香檸檬烯(bergamotene)、 (-)-|3-欖香烯、(+)-大根香葉烯A、大根香葉烯B、 (+)-y-古蕓烯、(+)-喇叭烯、十氫二甲基甲乙烯 基萘酚(neointermedeol)、 (+)-|3-蛇床烯和(+)-朱欒倍半萜。本發(fā)明核酸含有編碼修飾細(xì)胞色素P450酶的核苷酸序列，在許多實施方 式中，本發(fā)明核酸編碼的修飾細(xì)胞色素P450酶含有非天然(非野生型，或非天 然產(chǎn)生的，或變異的)氨基酸序列。編碼的修飾細(xì)胞色素P450酶含有能提高用 本發(fā)明核酸遺傳修飾的宿主細(xì)胞中修飾細(xì)胞色素P450酶的活性水平和/或提高 用本發(fā)明核酸遺傳修飾的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的生物合成途徑的給定產(chǎn)物水平的一 種或多種氨基酸序列修飾(缺失、加入、插入、取代)。在一些實施方式中，本發(fā)明核酸含有編碼修飾類異戊烯前體修飾酶的核苷 酸序列，在許多實施方式中，本發(fā)明核酸編碼的類異戊烯前體修飾酶含有非天 然(非野生型，或非天然產(chǎn)生的，或變異的)氨基酸序列。編碼的類異戊烯前體 修飾酶將含有能提高用本發(fā)明核酸遺傳修飾的宿主細(xì)胞中類異戊烯前體修飾 酶的活性水平和/或提高用本發(fā)明核酸遺傳修飾的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的給定類異戊 烯化合物水平一個或多個氨基酸序列修飾(缺失、加入、插入、取代)。在一些 實施方式中，相對于野生型類異戊烯前體修飾酶，編碼的類異戊烯前體修飾酶 將包含一個或多個以下修飾a)用非天然跨膜結(jié)構(gòu)域取代天然跨膜結(jié)構(gòu)域；b) 用分泌信號結(jié)構(gòu)域取代天然跨膜結(jié)構(gòu)域;C)用增溶結(jié)構(gòu)域取代天然跨膜結(jié)構(gòu)域； d)用膜插入域取代天然跨膜結(jié)構(gòu)域；e)截短天然跨膜結(jié)構(gòu)域；和f)改變天然跨 膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。在許多實施方式中，以5'至3'的順序，本發(fā)明核酸包含操作性連接的編 碼第一結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列和編碼修飾P450酶(如類異戊烯前體修飾酶)的催 化域的核苷酸序列，所述第一結(jié)構(gòu)域選自跨膜結(jié)構(gòu)域、分泌結(jié)構(gòu)域、增溶結(jié)構(gòu) 域或膜插入蛋白；所述第一結(jié)構(gòu)域與所述催化域異源。在一些實施方式中，所 述第一結(jié)構(gòu)域包含分泌信號和跨膜結(jié)構(gòu)域。求天鰣腐祭鄉(xiāng)在一些實施方式中，編碼的修飾細(xì)胞色素P450酶(如類異戊烯前體修飾酶) 將包含非天然(如異源)跨膜結(jié)構(gòu)域。合適的非天然跨膜結(jié)構(gòu)域通常選自在給定 宿主細(xì)胞中有功能的跨膜結(jié)構(gòu)域。在一些實施方式中，非天然跨膜結(jié)構(gòu)域是在 原核宿主細(xì)胞中有功能的跨膜結(jié)構(gòu)域。在其它實施方式中，非天然跨膜結(jié)構(gòu)域 是在真核宿主細(xì)胞中有功能的跨膜結(jié)構(gòu)域。例如，在許多實施方式中，為了在大腸桿菌中表達(dá)，非天然跨膜結(jié)構(gòu)域包 含以下氨基酸序列之一NH2-MWLLLIAVFLLTLAYLFWP-COOH (SEQ ID NO:l); NH2-MALLLAVFLGLSCLLLLSLW-COOH (SEQ ID NO:2); NH2-MAILAAIFALVVATATRV-COOH (SEQ ID NO:3); NH2-MDASLLLSVALAVVLIPLSLALLN-COOH (SEQ ID NO:4);和 NH2-M正QLLEYWYWVPVLYIIKQLLAYTK陽COOH (SEQ ID NO:5)。 分泌信號在一些實施方式中，編碼的修飾細(xì)胞色素P450酶(如類異戊烯前體修飾酶) 將包含能夠使細(xì)胞分泌融合蛋白的非天然氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解這 類分泌信號序列。適用于細(xì)菌的分泌信號包括但不限于大腸桿菌、粘質(zhì)沙雷 菌(S. marc^cem)、解淀粉歐文菌(五.amy/o卵ra)、摩氏摩根菌(M. worgam7)和奇 異變形桿菌(尸.附/ 6///力的布朗(8^1111，3)脂蛋白的分泌信號，大腸桿菌和沙門菌(Sa/mo"e〃a)的TraT蛋白；地衣芽孢桿菌(5. "c/ze"i/b，/力和蠟狀芽孢桿菌CB. ce"w力和金黃色葡萄球菌(S. m^—的青霉素酶(PenP)蛋白；肺炎克雷伯菌 (ST/eZw'e〃af ; wewmom'ae)禾卩產(chǎn)氣克雷伯菌(A7e657'e〃fl aeragewese)的支鏈淀粉酶蛋 白；大腸桿菌脂蛋白lpp-28、 Pal、 RplA、 RplB、 OsmB、 NIpB和Orll7;哈 維氏弧菌(K. /2a/^力)的幾丁質(zhì)酶蛋白；茄科假單胞菌CPse"^mo"oy so/a"acearwm)的卩-l,4-葡聚糖內(nèi)切酶蛋白，流感嗜血桿菌(//. Z"y7we"zae)的Pal 和Pep蛋白；銅綠假單胞菌(尸.aen^力ow)的Oprl蛋白；肺炎鏈球菌(S. / "ewmo"/ae)的MalX禾B AmiA蛋白；蒼白密螺旋體(7Vepo"ema pa〃Wwm)的34 kda抗原和TpmA蛋白；豬鼻支原體(Mycop/osmfl /^or/n'mX)的P37蛋白；解淀 粉芽孢桿菌(5ac/〃ws am少/o/^we/ac/era)的中性蛋白酶；立克立克次體(i /cA:eto/a n'cfeto/Z)的17kda抗原；malE麥芽糖結(jié)合蛋白；rbsB核糖結(jié)合蛋白；phoA堿 性磷酸酶；和OmpA分泌信號(參見例如，Tanji等(1991) / 5a"en'o/. 173(6):1997-2005)。本領(lǐng)域已知適用于酵母的分泌信號序列，可采用這種序列。 參見例如，美國專利號5,712,113。 rbsB、 malE和phoA分泌信號參見例如， Collier (1994) 5acfe〃'o/. 176:3013。在一些實施方式中，例如，為了在原核宿主細(xì)胞如大腸桿菌中表達(dá)，分泌信號將含有以下氨基酸序列之一NH2-MKKTAIAIAVALAGFATVAQA-COOH (SEQ ID NO:6); NH2-MKKTAIAIVVALAGFATVAQA-COOH (SEQ ID NO:7); NH2-MKKTALALAVALAGFATVAQA-COOH (SEQ ID NO:8); NH2-MKIKTGARILALSALTTMMFSASALA-COOH (SEQ ID NO:9); NH2-MNMKKLATLVSAVALSATVSANAMA-COOH (SEQ ID NO:10);和NH2-MKQSTIALALLPLLFTPVTKA-COOH (SEQ ID NO: 11)。在一些實施方式中，編碼的修飾細(xì)胞色素P450酶(如類異戊烯前體修飾酶) 將包含非天然分泌信號序列和異源跨膜結(jié)構(gòu)域。可采用分泌信號序列和異源跨 膜結(jié)構(gòu)域的任何組合。作為一個非限制性例子，在一些實施方式中，含有非天然分泌信號序列和異源跨膜結(jié)構(gòu)域的異源結(jié)構(gòu)域具有以下氨基酸序列麗,-MKKTAIAIAVALAGFATVAOALLEYWYVVVPVLYIIKOLLAYTK-COO H(SEQIDNO:12)，其中用下劃線表示跨膜結(jié)構(gòu)域，分泌信號位于跨膜結(jié)構(gòu)域 的N末端一側(cè)。 潛麟姆在一些實施方式中，編碼的修飾細(xì)胞色素P450酶(如類異戊烯前體修飾酶)將包含使蛋白質(zhì)增溶的非天然結(jié)構(gòu)域。在一些實施方式中，增溶結(jié)構(gòu)域?qū)⒑幸韵掳被嵝蛄兄?NH2-EELLKQALQQAQQLLQQAQELAKK-COOH (SEQ ID NO :13);和 NH2-MTVHDIIATYFTKWYVIVPLALIAYRVLDYFY-COOH (SEQ IDNO:14);NH2-GLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYGGGKK-COOH (SEQ ID NO: 15);和NH2-MAKKTSSKG-COOH (SEQ ID NO :16)。在一些實施方式中，編碼的修飾細(xì)胞色素P450酶(如類異戊烯前體修飾酶) 將包含能使其插入膜中的非天然氨基酸序列。在一些實施方式中，編碼的修飾細(xì)胞色素P450酶是含有框內(nèi)融合于氨基端或羧基端的異源融合伙伴(如除細(xì)胞色素P450酶以外的蛋白)的融合多肽，該融合伙伴能使該融合蛋白插入生物膜中。在一些實施方式中，該融合伙伴是米司迪蛋白(mistic)，如含有圖5所示 氨基酸序列(GenBank登錄號AY874162)的蛋白。GenBank登錄號AY874162 下提供了編碼該米司迪蛋白的核苷酸序列。本領(lǐng)域所知能夠插入生物膜中的其 它多肽，參見例如，PsbW Woolhead等(■/. 5/o/. Ozem. 276 (18): 14607)，描述 了 bW;和Kuhn (FEMS Microbiology Reviews 17 (1992i) 285)，描述了 M12普 洛克特(procoat)蛋白和Pf3普洛克特蛋白。細(xì)胞色素P450酶在許多實施方式中，編碼的類異戊烯前體修飾酶是細(xì)胞色素P450酶。編 碼的細(xì)胞色素P450酶將進(jìn)行以下一種或多種反應(yīng)羥化、環(huán)氧化、氧化、脫 水、脫氫、脫鹵、異構(gòu)化、醇氧化、醛氧化、脫垸基化和C-C鍵斷裂反應(yīng)。在 本文中將這類反應(yīng)總稱為"生物合成途徑中間體修飾反應(yīng)"，或者在具體實施方 式中稱為"類異戊烯前體修飾反應(yīng)"。這些反應(yīng)參見例如，Sono等((1996)同上； 參見例如，Sono等的圖3，這類反應(yīng)的示意圖)。如上所述，在許多實施方式 中，編碼的修飾細(xì)胞色素P450酶(如類異戊烯前體修飾酶)是細(xì)胞色素P450單 加氧酶、細(xì)胞色素P450羥化酶、細(xì)胞色素P450環(huán)氧化酶或細(xì)胞色素P450脫 氫酶。本領(lǐng)域了解各種細(xì)胞色素P450單加氧酶、羥化酶，環(huán)氧化酶和脫氫酶(總 稱為"P450酶")，可按照本發(fā)明修飾任何已知P450酶或其變體的氨基酸序列。含有編碼細(xì)胞色素P450酶的核苷酸序列的核酸的合適來源包括但不限 于六界，如細(xì)菌界(如真細(xì)菌)；古細(xì)菌界；原生生物界；真菌界；植物界； 和動物界中任一界的細(xì)胞或生物體。外源核酸的合適來源包括原生生物界中類 似于植物的成員，包括但不限于藻類(如綠藻、紅藻、灰胞藻(glaucophytes)， 藍(lán)藻)；原生生物界中類似于真菌的成員，如粘菌、水霉等；原生生物界中類 似于動物的成員，如鞭毛蟲(如眼蟲藻)、變形蟲(如阿米巴)、孢子蟲(如頂復(fù)蟲 (Apicomplexa)、粘原蟲、微孢子蟲)和纖毛蟲(如草履蟲)。外源核酸的合適來源 包括真菌界的成員，包括但不限于以下任何門的成員擔(dān)子菌門(珊瑚菌；如傘菌屬、天狗菌屬、牛肝菌屬、雞油菌屬(Cantherellus)的成員等)；子囊菌門 (子囊菌，包括(如)酵母)；菌藻門(地衣)；接合菌門(接合真菌)；和不完全菌門。 外源核酸的合適來源包括植物界成員，包括但不限于以下任何門的成員苔 蘚植物門(如蘚類)、角苔植物門(如金魚藻)、苔類植物門(Hepaticophyta)(如苔 類)、石松植物門(如石松類)、楔葉植物門(如木賊類)、裸蕨植物門(如葉蕨)、 瓶爾小草門、蕨門(如蕨類)、蘇鐵門、銀杏門、松柏門、買麻藤門和木蘭門(如顯花植物)。外源核酸的合適來源包括動物界成員，包括但不限于以下任何 門的成員多孔動物門(海綿動物)；扁盤動物門；直泳蟲門(海洋無脊椎動物的 寄生物)；菱形蟲門；刺胞動物門(珊瑚，?？?，海蜇，海筆，海腎，立方水母); 櫛水母門(卞節(jié)水母)；扁蟲動物門(葉狀軟體蝸蟲)；紐形動物門(紐蟲)；顎胃動物 門(Ngathostomulida)(有顎蠕蟲)；腹毛動物門；輪蟲動物門；曳鰓動物門；動 吻動物門；鎧甲動物門；棘頭動物門；內(nèi)肛亞門；線蟲動物門；線形動物門； 環(huán)口動物門；軟體動物門(軟體動物)；星蟲動物門(方格星蟲(peanut worms)); 環(huán)節(jié)動物門(環(huán)節(jié)蠕蟲)；緩步動物門(緩步動物)；有爪動物門(櫛蠶)；節(jié)肢動物 門(包括以下亞門有螯肢亞門，多足亞門，六足亞門和甲殼亞門，其中有螯 肢亞門包括例如，蛛形綱，肢口綱和海蜘蛛綱，多足亞門包括例如，唇足綱(唇 足類)、倍足綱(多足類)、少足綱(Paropoda)和綜合綱，六足亞門包括昆蟲綱， 甲殼亞門包括蝦、磷蝦、藤壺等；帚蟲動物門；外肛動物門(苔蘚動物)；腕足 動物門；棘皮動物門(如海星、海雛菊、毛頭星、海膽、海參、海蛇尾、脆籃(brittlebasketS)等)；毛顎動物門(箭蟲)；半索動物門(玉鉤蟲)；和脊索動物門。脊索動物門的合適成員包括以下亞門的任何成員尾索動物亞門(海鞘綱；包括海鞘 目、樽海鞘目和幼形目)；頭索亞門(文昌魚)；盲鰻綱(盲鰻)；和脊椎動物亞門， 其中脊椎動物亞門成員包括以下成員，例如，鰓鰻綱(七鰓類)，軟骨魚綱(軟骨 魚)，輻鰭魚綱(輻鰭魚)，腔棘魚綱(腔棘魚)，肺魚綱(肺魚)，爬行綱(爬行動物， 如蛇、短吻鱷、鱷魚、蜥蜴等)，鳥綱(鳥)；和哺乳綱(哺乳動物)。合適的植物 包括單子葉植物和雙子葉植物。因此，例如，合適來源包括來自以下生物體的細(xì)胞，所述生物體包括但不 限于原生動物、植物、真菌、藻類、酵母、爬行動物、兩棲動物、哺乳動物、 海洋微生物、海洋無脊椎動物、節(jié)肢動物、等足類動物、昆蟲、蛛形綱動物、古細(xì)菌和真細(xì)菌。合適的原核來源包括細(xì)菌(如真細(xì)菌)和古細(xì)菌。合適的古細(xì)菌來源包括產(chǎn) 甲垸菌、極度嗜鹽菌、極度嗜熱菌等。合適的古細(xì)菌來源包括但不限于以下類 別的任何成員泉古菌門(如硫磺礦硫化葉菌0^//0/0^^0/々 '0 )、運(yùn)動硫還 原球菌(Z)e/w^wracoccM51 mo6//^)、隱蔽熱網(wǎng)菌CP3^0d/c"wm occw/似m)、依賴熱絲 菌(77zermq/ /Mw/ e"cfera)、特耐熱變形菌(77zermo/ rofew"ewax))、廣古菌門(如速 生熱球菌(T7zer腳cocc"j ce/e。、 無機(jī)營養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌(M"/ a"ococcw51 ^2ermo/"/20化op/H'cws)、詹氏產(chǎn)甲烷菌(A/e決a"ococc^s乂a"wosc/n力、熱自養(yǎng)甲烷桿 菌CMeAa"o6flcter/w附^ze/777oaw^^ro/ /z/cww)、 甲酸甲焼桿菌(A/e//zawo6acfen.ww yb，/c/c扁)、熾熱甲烷嗜熱菌(M"/2朋o^ eA"應(yīng)s々rv油力、閃爍古生球菌 (y4rc/zaeog/o6"s /w/g/fifws)、嗜酸熱原體(77zermo/ Azyma ac/t/o/ A//wm)、 富饒鹽菌 (他/。y^rax vo/ca朋/)、巴氏甲院八疊球菌(^^/7朋01 ^"'"<3 6a由n')、 MeZ/wf"araeto co"c/〃/ 、 洪氏甲烷螺菌(A/e/Zzawc^pnW/wm /mwg^e〖)、運(yùn)動甲烷微菌 (MeAa"om/craZ^m moMe)和初古菌門。合適的真細(xì)菌來源包括但不限于以下 類別的任何成員產(chǎn)氫桿菌、熱袍菌、綠色非硫細(xì)菌、異常球菌、藍(lán)細(xì)菌、紫 色細(xì)菌、浮霉菌、螺旋原蟲、綠色硫細(xì)菌、噬細(xì)胞菌和革蘭陽性菌(如分支桿 菌(綺co6a"m'謂sp.)、微球斷M/m)coccws sp.)、鏈球斷Sf"tom少ces sp.)、學(xué)L 酸桿菌(Zacto6a"7/i^ sp.)、螺桿菌(股//￡;060￡^/謂sp.)、梭菌(C/o欲/血m sp.)、 支原體(Afycop/a細(xì)a sp.)、芽孢桿菌(5ac/腸sp.)等)。在一些實施方式中，由取自生物體的組織；分離自生物體的特定細(xì)胞或細(xì) 胞群等分離P450酶編碼核酸。例如，在一些實施方式中，當(dāng)有機(jī)體是植物時， 由木質(zhì)部、韌皮部、形成層、葉、根等分離核酸。在一些實施方式中，當(dāng)有機(jī) 體是動物時，由特定組織(如肺、肝、心、腎、腦、脾、皮膚、胎兒組織等或 特定細(xì)胞類型(如神經(jīng)元細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、星形細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、 膠質(zhì)細(xì)胞、島細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等)分離核酸。在一些實施方式中，本發(fā)明核酸包含編碼P450酶的核苷酸序列，所述序 列不同于編碼P450酶的野生型或天然產(chǎn)生的核苷酸序列，例如，本發(fā)明核酸 包含編碼變異P450酶的核苷酸序列。在一些實施方式中，與天然產(chǎn)生的母體 P450酶的氨基酸序列相比，變異P450酶的氨基酸序列中有一個氨基酸、兩個氨基酸、三個氨基酸、四個氨基酸、五個氨基酸、六個氨基酸、七個氨基酸、 八個氨基酸、九個氨基酸或十個氨基酸或更多個氨基酸不同。在一些實施方式中，與天然產(chǎn)生的母體P450酶的氨基酸序列相比，變異P450酶的氨基酸序列 中有約10-15個氨基酸、約15-20個氨基酸、約20-25個氨基酸、約25-30個 氨基酸、約30-35個氨基酸、約35-40個氨基酸、約40-50個氨基酸或約50-60 個氨基酸、或更多個氨基酸不同。在許多實施方式中，如上所述，編碼的修飾細(xì)胞色素P450酶包含母體(如 野生型或天然產(chǎn)生或天然的序列)N末端的修飾，如，跨膜結(jié)構(gòu)域和/或跨膜結(jié) 構(gòu)域N末端的氨基酸序列中的修飾。在一些實施方式中，與野生型細(xì)胞色素 P450酶的氨基酸序列相比，編碼的修飾細(xì)胞色素P450酶的酶催化部分中還包 括一個或多個氨基酸序列修飾。含有編碼變異的(如修飾的)P450酶的核苷酸序列的核酸是合成核酸。在一 些實施方式中，含有編碼變異P450酶的核苷酸序列的合成核酸是在合適雜交 條件下能與含有編碼天然產(chǎn)生的P450酶的核苷酸序列的核酸雜交的核酸。在 一些實施方式中，含有編碼變異P450酶的核苷酸序列的合成核酸是在嚴(yán)謹(jǐn)雜 交條件下能與含有編碼天然產(chǎn)生的P450酶的核苷酸序列的核酸雜交的核酸。 在一些實施方式中，含有編碼變異P450酶的核苷酸序列的合成核酸包含的編 碼變異P450酶的核苷酸序列與編碼天然產(chǎn)生P450酶的核苷酸序列的核苷酸序 列相同性小于約95%，例如，編碼變異P450酶的核苷酸序列與編碼天然產(chǎn)生 P450酶的核苷酸序列的核苷酸序列相同性不大于約90%-95%、約85%-90%、 約80%-85%、約75%-80%、約70%-75%、約65%-70%、約60%-65%、約55%-60% 或約50%-55%。在一些實施方式中，編碼變異P450酶的核苷酸序列編碼的P450酶與天然 產(chǎn)生P450酶的氨基酸序列相同性為約50%-55%、約55%-60%、約60%-65%、 約65%-70%、約70%-75%、約75%-80%、約80%-85%、約85%-90%或約 90%-95%。本領(lǐng)域已知許多P450酶的氨基酸序列?？捎杀景l(fā)明核酸中所含核苷酸序列修飾和編碼的合適的P450酶包括但不 限于苧烯-6-羥化酶(參見例如，圖6; GenBank登錄號AY281025和AF124815); 5-表-馬兜鈴堿二羥化酶(參見例如，圖7; GenBank登錄號AF368376); S-杜松烯-8-羥化酶(參見例如，圖8A; GenBank登錄號AF332974);紫杉二烯-5a-羥 化酶(參見例如，圖9A和9B; GenBank登錄號AY289209， AY959320,和 AY364469); eW-貝殼杉烯氧化酶(參見例如，圖10; GenBank登錄號AF047719; 參見例如，Helliwell等(1998)7V加/. Am . f/W 95:9019-9024)。圖8B-D描述了示范性P450變體。圖8B描述了含有異源跨膜結(jié)構(gòu)域的杜 松烯羥化酶；圖8C描述了含有增溶結(jié)構(gòu)域的杜松烯羥化酶；圖8C描述了含 有分泌結(jié)構(gòu)域和異源跨膜結(jié)構(gòu)域的杜松烯羥化酶。圖22描述了其它示范性 P450變體，包括含有各種N末端序列的紫穗槐二烯氧化酶。本領(lǐng)域已知修飾生物堿途徑中間體的細(xì)胞色素P450酶。參見例如， Facchini等(2004)同上；Pauli和Kutchan ((1998)尸/a"/ /. 13:793-801; Collu 等((2001)尸五^S丄e". 508:215-220; Schroder等((1999) 458:97-102。 也參見圖19A-C。本領(lǐng)域己知修飾苯丙酸類途徑中間體的細(xì)胞色素P450酶。參見例如， Mizutani等((1997)尸/朋f113:755-763;和Gang等((2002)尸/a^尸/ ;wo/. 130:1536-1544。也參見圖20A-C。圖21A和21B描述了示范性的修飾聚酮化合物途徑中間體的細(xì)胞色素 P450酶。也參見Ikeda等((1999)尸麼.編.^c^/. "&4 96:9509-9514;和 Ward等((2004)爿""m〖cra6. ^ge"b C/zemW/zer. 48:4703-4712。編碼的修飾細(xì)胞色素P450酶(如類異戊烯前體修飾酶)有酶活性，例如， 修飾細(xì)胞色素P450酶(如類異戊烯前體修飾酶)具有以下活性中的一種或多種 a)通過以下一種或多種反應(yīng)修飾生物合成途徑中間體氧化、羥化、環(huán)氧化、 脫水、脫氫、脫鹵、異構(gòu)化、醇氧化、醛氧化、脫垸基化或鍵斷裂反應(yīng)；b)通 過以下一種或多種反應(yīng)修飾類異戊烯前體氧化、羥化、環(huán)氧化、脫水、脫氫、 脫鹵、異構(gòu)化、醇氧化、酸氧化、脫烷基化或鍵斷裂反應(yīng)。通過檢測P450酶 對底物的反應(yīng)產(chǎn)物和/或檢測P450酶對底物反應(yīng)的下游產(chǎn)物，不難確定本發(fā)明 核酸是否編碼有酶活性的細(xì)胞色素P450酶。例如，不難采用合適底物、根據(jù) 這些酶活性的標(biāo)準(zhǔn)試驗確定本發(fā)明核酸是否編碼有酶活性的萜氧化酶或萜羥 化酶。通常通過色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析酶修飾的產(chǎn)物。例如，不難用這些酶活性 的標(biāo)準(zhǔn)試驗確定本發(fā)明核酸是否編碼倍半萜氧化酶或倍半萜羥化酶。參見例如，美國專利公開號20050019882。在一些實施方式中，修飾編碼修飾細(xì)胞色素P450酶(如修飾的類異戊烯前 體修飾酶)的核苷酸序列，以反映出具體宿主細(xì)胞優(yōu)選的密碼子。例如，在一 些實施方式中，根據(jù)酵母優(yōu)選的密碼子修飾該核苷酸序列。參見例如，Bennetzen 和Hall (1982) >/. C/ze/n. 257(6): 3026-3031。在其它實施方式中，另一個 非限制性例子是，根據(jù)大腸桿菌優(yōu)選的密碼子修飾該核苷酸序列。參見例如， Gouy禾卩Gautier(1982)W"c/e/c^c^y^i 10(22):7055-7074; Eyre-Walker (1996) Mo/. 13(6):864-872。也參見Nakamura等(2000) A^c/e/c」c/& i "28(1):292。 一個非限制性例子是，圖11A描述了編碼杜松烯羥化酶的野生型核 苷酸序列(用粗體表示atg起始密碼子)；圖IIB描述了圖IIA所示序列的密碼 子優(yōu)化變體，其中根據(jù)在原核細(xì)胞如大腸桿菌中表達(dá)優(yōu)化密碼子。細(xì)胞色素P450還原酶NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶(CPR， EC 1.6.2.4)是許多P450-單加氧酶的氧化還原伙伴。在一些實施方式中，本發(fā)明核酸還包含編碼細(xì)胞色素P450 還原酶(CPR)的核苷酸序列。含有編碼CPR的核苷酸序列的本發(fā)明核酸稱為 "CPR核酸"。主題CPR核酸編碼的CPR將電子由NADPH傳遞給細(xì)胞色素 P450。例如，在一些實施方式中，主題CPR核酸編碼的CPR將電子由NADPH 傳遞給主題類異戊烯修飾酶編碼核酸編碼的類異戊烯修飾酶，如倍半萜氧化 酶。在一些實施方式中，本發(fā)明核酸包含編碼修飾細(xì)胞色素P450酶(如修飾的 類異戊烯前體修飾酶)和CPR的核苷酸序列。在一些實施方式中，本發(fā)明核酸 包含編碼一融合蛋白的核苷酸序列，該融合蛋白包含具有類異戊烯前體修飾活 性的修飾細(xì)胞色素P450酶(如修飾的類異戊烯前體修飾酶)(如上所述)和融合的 CPR多肽的氨基酸序列。在一些實施方式中，編碼的融合蛋白具有式 NH2-A-X-B-COOH，其中A是修飾細(xì)胞色素P450酶，X是任選接頭，B是CPR 多肽。在一些實施方式中，編碼的融合蛋白具有式NH2-A-X-B-COOH，其中A 是CPR多肽，X是任選接頭，B是修飾細(xì)胞色素P450酶。接頭肽可含有各種氨基酸序列。蛋白質(zhì)通過通常有彈性的間隔肽連接， 但也不排除其它化學(xué)連接。該接頭可以是可切割接頭。合適的接頭序列長度通常為約5-50個氨基酸，或約6-25個氨基酸。通常采用具有一定彈性程 度的肽接頭。連接肽基本上可以含有任何氨基酸序列，需要注意優(yōu)選接頭 的序列應(yīng)產(chǎn)生總體彈性肽。采用小氨基酸如甘氨酸和丙氨酸，可用于產(chǎn)生 彈性肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員通常能夠創(chuàng)造這類序列。可購得各種不同接頭， 認(rèn)為它們也適用于本發(fā)明。合適的接頭肽常常包含富含丙氨酸和脯氨酸殘基的氨基酸序列，已知這兩 種殘基能賦予蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以彈性。示范性接頭含有甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和 甲硫氨酸殘基的組合，如AAAGGM (SEQ ID N0:17); AAAGGMPPAAAGGM (SEQ ID NO:18); AAAGGM (SEQ ID NO:19);和PPAAAGGM (SEQ ID NO:20)。 其它示范性接頭肽包含IEGR (SEQ ID NO:21);和GGKGGK (SEQ ID NO:22)。 然而，可采用長度通常約為5-50個氨基酸的任何彈性接頭。接頭基本上可含 有能產(chǎn)生總體彈性肽的任何序列，包括上述類型的富含丙氨酸-脯氨酸的序列。在一些實施方式中，本發(fā)明核酸包含編碼CPR多肽的核苷酸序列，所述 CPR多肽與己知或天然產(chǎn)生的CPR多肽的氨基酸序列相同性為至少約45%、 至少約50%、至少約55%、至少約57%、至少約60%、至少約65%、至少約 70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至 少約98%或至少約99%。本領(lǐng)域知道CPR多肽以及CPR多肽的編碼核酸，任何CPR編碼核酸或 其變體均可用于本發(fā)明。合適的CPR編碼核酸包括編碼植物中發(fā)現(xiàn)的CPR的 核酸。合適的CPR編碼核酸包括編碼真菌中發(fā)現(xiàn)CPR的核酸。合適的CPR編 碼核酸的例子包括GenBank登錄號AJ303373 (普通小麥(7W"cMm ae^vwm) CPR); GenBank登錄號AY959320 (紅豆杉(7b;cz^ c/n'"e"^) CPR); GenBank登 錄號AY532374 (大阿米04mm/ mfl)w力CPR); GenBank登錄號AG211221 (水稻 (O^yzfl ^"Va) CPR);禾P GenBank登錄號AF024635 (鈹葉歐存(尸",0^//""柳 cT/spwm) CPR);熱帶念珠菌(Cawfe/a fro戸'ca/!X)細(xì)胞色素P450還原酶(GenBank 登錄號M35199);擬南芥04^6/^>; /15 ^a"a"a)細(xì)胞色素P450還原酶ATR1 (GenBank登錄號X66016);和擬南芥細(xì)胞色素P450還原酶ATR2 (GenBank登 錄號X66017);和假單孢氧還蛋白還原酶和假單胞氧還蛋白(GenBank登錄號 J05406)。在一些實施方式中，本發(fā)明核酸包含編碼給定P450酶的特異性CPR多肽 的核苷酸序列。 一個非限制性例子是，本發(fā)明核酸包含編碼東北紅豆杉CPR 的核苷酸序列(圖12A; GenBankAY571340)。另一個非限制性例子是，本發(fā)明 核酸包含編碼熱帶念珠菌CPR的核苷酸序列(圖12B)。在其它實施方式中，本 發(fā)明核酸包含編碼可用作兩種或多種不同P450酶的氧化還原伙伴的CPR多肽 的核苷酸序列。圖12C描述了一種這類CPR(擬南芥細(xì)胞色素P450還原酶 ATR1)。圖12D描述了另一種這類CPR(擬南芥細(xì)胞色素P450還原酶ATR2)。 如圖12D所示的修飾或變異的ATR2也是合適的，變異的ATR2缺少葉綠體靶 向序列。在一些實施方式中，編碼的CPR包含異源氨基酸序列或變異氨基酸序列 (如取代、缺失、插入、加入)。在一些實施方式中，相對于野生型CPR編碼的 CPR包含以下一種或多種修飾a)用非天然跨膜結(jié)構(gòu)域取代天然跨膜結(jié)構(gòu)域； b)用分泌信號結(jié)構(gòu)域取代天然跨膜結(jié)構(gòu)域；c)用增溶結(jié)構(gòu)域取代天然跨膜結(jié)構(gòu) 域；d)用膜插入域取代天然跨膜結(jié)構(gòu)域；e)截短天然跨膜結(jié)構(gòu)域；和f)改變天然跨膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。在一些實施方式中，修飾編碼CPR多肽的核苷酸序列，以反映出具體宿 主細(xì)胞優(yōu)選的密碼子。例如，在一些實施方式中，根據(jù)酵母優(yōu)選的密碼子修飾 核苷酸序列。參見例如，Bennetzen和Hall (1982) / 5/o/. 257(6): 3026-3031。在其它實施方式中，另一個非限制性例子是，根據(jù)大腸桿菌優(yōu)選 的密碼子修飾核苷酸序列。參見例如，Gouy和Gautier (1982) M/c/e/c爿c/dy及m. 10(22):7055-7074; Eyre-Walker (1996) Mo/.所o/.五w/. 13(6):864-872。也參見 Nakamura等(2000) 7Vwc/e/c及m. 28(1):292。構(gòu)建物本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明核酸的重組載體("構(gòu)建物")。在一些實施方式 中，本發(fā)明重組載體能夠擴(kuò)增本發(fā)明核酸。在一些實施方式中，本發(fā)明重組載 體能夠在真核細(xì)胞、原核細(xì)胞或無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中產(chǎn)生編碼的類異戊烯修 飾酶或編碼的CPR。合適的表達(dá)載體包括但不限于桿狀病毒載體、噬菌體載 體、質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒、F粘粒(fosmid)、細(xì)菌人工染色體、病毒載體(如基于牛痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、SV40、單純皰疹病毒等 的病毒載體)、基于P1的人工染色體、酵母質(zhì)粒、酵母人工染色體和對感興趣 的特定宿主(如大腸桿菌(五.CO")、酵母和植物細(xì)胞)特異的任何其它載體。在一些實施方式中，本發(fā)明重組載體包含本發(fā)明的修飾的細(xì)胞色素P450 編碼核酸和本發(fā)明的CPR編碼核酸。在一些實施方式中，本發(fā)明重組載體是 能在真核細(xì)胞、原核細(xì)胞或無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中產(chǎn)生編碼的修飾細(xì)胞色素 P450酶(如修飾的類異戊烯修飾酶)和編碼的CPR的表達(dá)載體。某些載體類型能夠擴(kuò)增本發(fā)明表達(dá)盒。將本發(fā)明核酸有效引入細(xì)胞和引入 后的表達(dá)需要其它載體類型。能夠接受本發(fā)明核酸的任何載體均可考慮用作本 發(fā)明的重組載體。載體可以是整合到宿主基因組中或保持附加體形式的環(huán)狀或 線性DNA。載體可能需要附加操作或具體條件才能有效摻入宿主細(xì)胞中(如許 多表達(dá)質(zhì)粒)，或者可以是自身整合的細(xì)胞特異性系統(tǒng)的一部分(如重組病毒)。 在一些實施方式中，載體在原核細(xì)胞中有功能，這種載體用于增殖重組載體和 /或表達(dá)本發(fā)明核酸。在一些實施方式中，載體在真核細(xì)胞中有功能，在許多情 況下這種載體是表達(dá)載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知許多合適的表達(dá)載體，許多可從市場上購得。以舉例 方式提供以下載體；用于細(xì)菌宿主細(xì)胞pBluescript(加州圣地亞哥的司査塔基 公司(Stratagene))、 pQE載體(凱杰公司(Qiagen))、 pBluescript質(zhì)粒、pNH載體、 入-ZAP載體(司查塔基公司)；pTrc(Amann等、Gene、69:301-315(1988)); pTrc99a、 pKK223-3、 pDR540和pRIT2T(法瑪西亞公司(Pharmacia));用于真核宿主細(xì)胞 pXTl、 pSG5(司查塔基公司)、pSVK3、 pBPV、 pMSG和pSVLSV40(法瑪西亞 公司)。然而，可采用任何其它質(zhì)?；蚱渌d體，只要它與宿主細(xì)胞相容。在具體實施方式
中，用質(zhì)粒載體pSP19glOL在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)。在其它具體 實施方式中，用質(zhì)粒載體pCWori在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)。pSP19glOL和pCWori 的描述參見例如，Barnes ((1996) MeAo^ Enz^mo/. 272:1 -14)。在許多實施方式中，本發(fā)明核酸包含編碼類異戊烯修飾酶的核苷酸序列， 其中編碼類異戊烯修飾酶的核苷酸序列操作性連接于一種或多種轉(zhuǎn)錄和/或翻 譯控制元件。在許多實施方式中，本發(fā)明核酸包含編碼CPR的核苷酸序列， 其中編碼CPR的核苷酸序列操作性連接于一種或多種轉(zhuǎn)錄和/或翻譯控制元件。在一些實施方式中，如上所述，本發(fā)明重組載體包含本發(fā)明類異戊烯修飾 酶-編碼核酸和本發(fā)明CPR-編碼核酸。在一些實施方式中，編碼的類異戊烯修 飾酶核苷酸序列和編碼CPR的核苷酸序列操作性連接于不同的轉(zhuǎn)錄控制元件。在其它實施方式中，編碼類異戊烯修飾酶的核苷酸序列和編碼CPR的核苷酸序列操作性連接于同一個轉(zhuǎn)錄控制元件。在一些實施方式中，編碼類異戊烯修飾酶的核苷酸序列和編碼CPR的核苷酸序列均操作性連接于同一個誘導(dǎo)型啟 動子。在一些實施方式中，編碼類異戊烯修飾酶的核苷酸序列和編碼CPR的 核苷酸序列均操作性連接于同一個組成型啟動子。適用于原核宿主細(xì)胞的啟動子包括但不限于噬菌體T7RNA聚合酶啟動 子；trp啟動子；lac操縱子啟動子；雜合啟動子，如lac/tac雜合啟動子、tac/trc 雜合啟動子、trp/lac啟動子、T7/lac啟動子；trc啟動子；tac啟動子等；araBAD 啟動子；體內(nèi)調(diào)節(jié)啟動子，如^aG啟動子或相關(guān)啟動子(參見例如，美國專利
發(fā)明者D·-K·羅, J·D·基斯林, M·C·-Y·常, R·伊切斯, 吉國靖雄 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會