專利名稱：用于治療增生性病癥的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療增生性病癥、特別是免疫增生性病癥如NK型 LDGL的方法以及生產(chǎn)在醫(yī)療方案中用于治療這些病癥的4元體的方 法。總體上，這些方法涉及〗吏用抗體，這些抗體特異地結(jié)合造成這 些病癥的增生細(xì)胞表面上所存在的受體。
背景技術(shù)：
自然殺滅(NK)細(xì)胞是一個(gè)與非常規(guī)免疫相關(guān)的淋巴細(xì)胞亞 群。NK細(xì)胞的特點(diǎn)和生物學(xué)屬性包括表面抗原例如CD16、 CD56 和/或CD57的表達(dá)，以及表達(dá)在細(xì)胞表面上的ot/P或y/5TCR復(fù) 合體的缺失；通過(guò)激活特異性細(xì)胞溶解酶而結(jié)合并殺滅不表達(dá)"自 身，，MHC/HLA抗原的細(xì)胞的能力；殺滅表達(dá)NK激活的受體-配體 的腫瘤細(xì)胞或其他疾病細(xì)胞的能力；以及釋放刺激或抑制免疫反應(yīng) 的蛋白分子(即所謂的細(xì)胞因子)的能力。
NK細(xì)胞的活性是通過(guò)一種既包括激活又包括抑制信號(hào)的復(fù)雜 機(jī)制進(jìn)行調(diào)節(jié)。已經(jīng)鑒定了多種不同種類的NK特異性受體，這些 受體在NK細(xì)胞介導(dǎo)的HLA I類缺乏的靶細(xì)胞的識(shí)別和殺滅中發(fā)揮 重要作用。其中一種該類受體，NCR (自然細(xì)胞毒性受體)，包括 NKp30 、 NKp46和NKp44 、 Ig超家》矣的所有成員。它們之間由特 異性mAb導(dǎo)致的交聯(lián)強(qiáng)烈激活NK細(xì)胞，引起細(xì)胞內(nèi)Ca"水平升 高、觸發(fā)細(xì)胞毒性并釋放淋巴素。另外兩個(gè)NK細(xì)胞受體家族是KIR受體(Killer Cell Immunoglobulin-like區(qū)eceptors )和CD94/NKG2。這兩個(gè)家力矣各自既 包括激活性又包括抑制性受體。KIR基因代表了表達(dá)在NK細(xì)胞上 并具有兩種或三種細(xì)月包外Ig沖羊結(jié)構(gòu)i或的一組多沖羊的、多態(tài)'性的Ig 超家力矣成員。該家力矣水P制')"生成員(包括KIR2DL1、 KIR2DL2、 KIR2DL3 、 KIR2DL5A 、 KIR2DL5B 、 KIR3DL1 、 KIR3DL2和 KIR3DL3 )的胞質(zhì)域均包含ITIM序列，這與經(jīng)常包含帶電殘基的 ;敫活寸生成員(例長(zhǎng)口 KIR2DS1、 KIR2DS2、 KIR2DS3、 KIR2DS4、 KIR2DS5和KIR3DS1 )的胞質(zhì)域相反。KIR家族的抑制性成員介 導(dǎo)對(duì)HLA I類分子的抑制效應(yīng)。在KIR受體家族內(nèi)7見(jiàn)察到的多態(tài) 性是個(gè)體之間遺傳變異以及體內(nèi)特定的NK細(xì)月包克隆性擴(kuò)增的結(jié) 果。綜述參見(jiàn)，例舌口 Trowsdale and Parham (2004) Eur J Immunol 34(1):7畫17; ^^awata et aL (2002) Grit Rev Immunol 22(5—6):463畫82; Hsu et al. (2002) Immunol Rev 190:40-52; Middleton et al. (2002) Transpl Immunol 10(2-3): 147-64; Vilches et al. (2002) Annu Rev Immunol 20:217-51。
CD94和NKG2蛋白是C型凝集素超家族的成員。CD94優(yōu)先 在NK細(xì)胞上表達(dá)，并與NKG2家族成員例如NKG2A形成異源二 聚體，該NKG2A自身在全部NK細(xì)胞的至少50%上表達(dá)。NKG2A 包含2個(gè)ITIM域，并與CD94 —起形成抑制性異源二聚體受體， 該受體結(jié)合非經(jīng)典MHC I類分子HLA-E(人類；在小鼠中為Qa-lb) (參見(jiàn)，例如OMIM 602894; Braud et al. (1998) Nature 391:795-799; Chang et al. (1995) Europ丄Immun 25:2433-2437; Lazetic et al. (1996) Immun 157:4741-4745; Rodriguez et al. (1998) Immunogenetics 47:305-309.)。
NK-LDGL (顆粒淋巴細(xì)胞的NK型淋巴細(xì)胞增生性疾病；另 外稱為NK-LGL )指一類由NK細(xì)胞或NK樣細(xì)胞的克隆性擴(kuò)增引 起的增生性病癥，即大顆粒淋巴細(xì)胞表現(xiàn)出表面抗原表達(dá)的一個(gè)特;f正性組合(例如CD3-、CD56+、CD16+等；參見(jiàn)，例如Loughran (1993) Blood82:l)。這些病癥中涉及的細(xì)月包增生可具有不同的歲丈應(yīng)，/人某 些患者中觀察到的輕微癥狀到嚴(yán)重的，常常為致命形式的稱為 NK-LDGL白血病的疾病。這種類型的病癥的癥狀可包4舌發(fā)熱、輕 微的中性粒細(xì)胞減少癥、血小板減少癥、貧血、淋巴細(xì)胞增多、脾 大、肝大、淋巴結(jié)病、骨髓浸潤(rùn)等(參見(jiàn)，例如Zambello et al. (2003) Blood 102:1797; Loughran (1993) Blood 82:1; Epling-Burnette et al. (2004) Blood-2003-02-400 )。用于NK-LDGL白血病的治療常常為攻 擊性的，包括化療，由于涉及凝血障礙和多器官衰竭該疾病常常為 致命性的，并且包4舌多種器官的LGL浸入。LDGL中的自身免疫性 病癥也較顯著，且可觀察到多種病癥包括早期類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，且 已經(jīng)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的血液或滑膜液中發(fā)現(xiàn)具有LDGL白 血病表型的細(xì)胞數(shù)量增多。這些擴(kuò)增的細(xì)胞中有些是具有LGL的 功能和表型特征的CD28陰性T細(xì)胞。在LDGL患者中還觀察到了 特發(fā)性血小板減少性紫癜UTP)和再生障礙性貧血。因此，在 NK-LDGL和LDGL的治療中有用的療法通常^皮認(rèn)為在免疫增生性 和自身免疫性病癥的治療中也有用，特別是那些涉及NK細(xì)胞的病 癥。
總之，對(duì)于確立的免疫病癥的治療，極少存在有效的治療。例 如，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，一旦觸發(fā)，免疫反應(yīng)就會(huì)引起滑膜炎癥。 早期和中期的炎癥分子介質(zhì)包括腫瘤壞死因子cc (TNF-ot)、白介 素IL-1、 IL-6、 IL-8和IL-15、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子p、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因 子和血小板衍生的生長(zhǎng)因子。RA的現(xiàn)代藥物治療針對(duì)這些介質(zhì)但 并不去除作為根源的細(xì)胞，特別是當(dāng)所涉及的細(xì)胞為NK細(xì)胞時(shí)。 一旦確立了炎癥反應(yīng)，則滑膜增厚，軟骨與下面的骨頭開始分離， 并出現(xiàn)關(guān)節(jié)石皮壞的跡象?？紤]到相對(duì)缺乏對(duì)免疫增生性病癥的有效 治療，很顯然，本領(lǐng)域中非常需要新穎的且首創(chuàng)的方案以便限制并逆轉(zhuǎn)那些構(gòu)成這些病癥的纟艮源的免疫細(xì)力包的;敫活和/或增生。本發(fā)明 致力于解決這些以及其他的需求。

發(fā)明內(nèi)容
迄今為止，對(duì)于表達(dá)在NK細(xì)胞上且旨在用于減量調(diào)節(jié)NK細(xì) 胞活性的受體特異的抗體已普遍調(diào)節(jié)了受體的功能或受體的表達(dá)。 也就是說(shuō)，抗體已阻斷了活化性受體發(fā)揮作用，或已激活了 NK細(xì) 胞上的抑制性受體。其他抗體是針對(duì)減量調(diào)節(jié)活化受體?，F(xiàn)已證實(shí)， 針對(duì)表達(dá)在NK細(xì)胞上的受體的抗體可用來(lái)井C竭(或殺滅)表達(dá)了 所關(guān)注受體的NK纟田月包。而且，這種NK細(xì)^^的4毛竭可通過(guò)未用毒 性部分(moieties)功能化的"凈果"抗體來(lái)介導(dǎo)。特別優(yōu)選具有可結(jié) 合Fc受體的效應(yīng)區(qū)的抗體，特別是CD16。
諸位發(fā)明人也已證實(shí)，這些耗竭性抗體可以清除體內(nèi)的、在所 有被檢測(cè)的器官內(nèi)的以及骨髓內(nèi)的細(xì)胞。這是一個(gè)重要的特征，因 為它表明這些抗體可用來(lái)治療包括位于器官內(nèi)的NK細(xì)胞(而不是 僅僅循環(huán)中的NK細(xì)胞)的免疫增生性病癥，而且因?yàn)檫@表明這些 耗竭性抗體可用來(lái)治療已確立的免疫增生性病癥，例如，其中自體 反應(yīng)性NK細(xì)月包已出現(xiàn)且已牽涉到病理學(xué)中。因?yàn)槊庖咴錾圆“Y 一旦充分確立就常常被i貪斷出，重要的是庫(kù)€竭NK細(xì)胞而非抑制它 們活性或防止進(jìn)一 步的增生。
本發(fā)明提供了多種抗體以及用于制備抗體的多種方法，它們對(duì) 于增生性病癥的治療尤其是免疫增生性病癥例如NK型LDGL和其 他一皮認(rèn)為涉及NK細(xì)胞的病癥的治療是有用的。已才艮道了 NK細(xì)胞 與免疫增生性病癥例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和^f唐尿病有關(guān)。因此，本發(fā) 明的抗體預(yù)期對(duì)治療以下疾病是有用的，例如哮喘，關(guān)節(jié)炎，包括「 骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和脊推關(guān)節(jié)病，胃腸道炎癥，克羅恩病 和潰瘍性結(jié)腸炎，神經(jīng)'I"生炎癥以及自身免疫性病癥例如I型沖唐尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘙、皮肌炎、4艮屑癬、干燥綜
合;^正、紅斑《良癡、脫髓鞘病、多發(fā)性石更4匕癥、重癥月幾無(wú)力、萊特爾氏 綜合征、格雷夫斯病、多發(fā)性肌炎、格-巴二氏綜合征、韋格納肉芽腫 病、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、風(fēng)濕性多肌病、顳動(dòng)脈炎、貝切特氏病、丘 -施二氏綜合4i、高安(Takayasu)動(dòng)月永炎和其^f也的疾病。在一個(gè)實(shí) 施方案中，這些免疫增生性病癥明確地^非除了 NK型LDGL和 T-LDGL。利用本發(fā)明的方法制備的抗體能特異地耙向于造成這些 病癥的擴(kuò)增的細(xì)力包，例如在NK型LDGL中擴(kuò)增的NK細(xì)月包或者免 疫增生性特別是諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和I型糖尿病的自身免疫性 病癥中擴(kuò)增的T或NK細(xì)力包。這些抗體可以限制細(xì)力包增生的病理歲支 果，例如通過(guò)耙向這些細(xì)胞而由免疫系統(tǒng)進(jìn)行;皮壞，或通過(guò)使這些 細(xì)胞接觸一種細(xì)胞毒性劑諸如放射性同位素、毒素或藥物而直接殺 滅它們。本發(fā)明也提供了多種方法來(lái)利用所述抗體治療多種增生性 病癥中任何一種，并提供了包括本文所述抗體以及它們的使用說(shuō)明 的試劑盒。
因此，本發(fā)明4是供一種治療患有涉及NK細(xì)月包的免疫增生性病 癥患者的方法，所述方法包括將與NK受體特異結(jié)合的抗體給予該 患者。本發(fā)明還包括在某一個(gè)體的體內(nèi)減弱炎癥的一種方法，或者 一種消除、殺滅或4C竭某一個(gè)體體內(nèi)NK或T細(xì)月包的方法。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了 一種包含抗體的組合物在制 備用于治療免疫增生增生性病癥的藥物中的應(yīng)用，該抗體特異^k^結(jié) 合一個(gè)NK受體，并且當(dāng)結(jié)合至人的NK細(xì)胞上的所述NK受體時(shí)， 致4吏所述NK細(xì)胞纟皮耗竭。
另一方面，本發(fā)明提供了一種耗竭NK細(xì)胞的方法、 一種耗竭 活4匕的NK細(xì)月包的方法、 一種用于減弱炎癥的方法、或者一種用于
該方法包括使所述NK細(xì)胞接觸包含一種抗體的組合物，該抗體可特異地結(jié)合 一種NK受體。
另一方面，本發(fā)明^是供一種用于^C竭哺乳動(dòng)物體內(nèi)NK和/或T 細(xì)月包的方法，該方法包i舌給予該哺乳動(dòng)物包含一種纟元體的組合物， 該抗體可特異地結(jié)合一種NK受體。
另一方面，本發(fā)明^是供了在一個(gè)哺乳動(dòng)物體內(nèi)或一個(gè)生物才羊本 內(nèi)用于減弱炎癥、降#^敫活的NK細(xì)月包凄史量或減少促炎癥反應(yīng)細(xì)月包 因子的一種方法，該方法包括耗竭表達(dá)NKG2A的NK細(xì)胞和/或表 達(dá)NKG2C的細(xì)月包。4尤選地，肆€竭了表達(dá)NKG2A的NK細(xì)月包和表 達(dá)NKG2C的細(xì)月包。優(yōu)選地，庫(kù)€竭NK或T細(xì)月包包括4吏所述NK細(xì) 胞與一種組合物進(jìn)行接觸，該組合物包含特異地結(jié)合NKG2A和/ 或NKG2C的一種抗體。
在一個(gè)實(shí)例中，所述進(jìn)行接觸的步驟發(fā)生在包含細(xì)胞效應(yīng)器的 細(xì)胞培養(yǎng)基中，可任選地，所述培養(yǎng)基包含PBMC或總外周血淋巴 細(xì)胞。另一方面，所述進(jìn)^^妾觸的步驟發(fā)生在哺乳動(dòng)物體內(nèi)。
另一方面，本發(fā)明4是供一種用于治療個(gè)體的方法，包括a) 診斷免疫增生性病癥的存在(例如癥狀和/或NK細(xì)胞的存在和/或 表達(dá)NK細(xì)胞受體的細(xì)胞的存在)，b)用本發(fā)明的抗體進(jìn)行治療。 一方面，該診斷步驟包括i貪斷已確立的炎癥或自身免疫性病癥，可 4壬選;也，其中已確立的病癥的特4正在于《且織石皮壞或損傷或其癥^l犬和 /或持續(xù)超過(guò)3、 6、 9、 12、 24或36個(gè)月的一種病癥。
本發(fā)明還4是供一種治療免疫增生性病癥患者的方法，該方法包 括a)確定患者體內(nèi)NK細(xì)胞的NK受體狀態(tài)，以及b)給予患者一 種抗體，該抗體特異地結(jié)合在NK細(xì)胞內(nèi)顯著表達(dá)的一種NK受體。本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施例中，該NK受體是一種;敫活性受體。 在另一個(gè)實(shí)施例中，該受體選自KIR2DL1、 KIR2DS1、 KIR2DL2、 KIR2DL3、 KIR2DS4、 NKG2C、 NKG2D、 NKG2E、 NKG2F、 CD94 和NKG2A所組成的組。在另一個(gè)實(shí)施例中，該受體是NCR，例如 NKp30、 NKp44或NKp46。在另一個(gè)實(shí)施例中，該抗體特異地結(jié)合 一種單一的NK受體。在另一個(gè)實(shí)施例中，該NK受體的狀態(tài)是利 用免疫測(cè)試確定的。在另一個(gè)實(shí)施例中，該NK受體的狀態(tài)是利用 功能測(cè)i式確定的，該功能測(cè)試用于確定存在于該NK細(xì)力包上的NK 受體的活性。在另一個(gè)實(shí)施例中，該NK受體的狀態(tài)是利用基因分 型測(cè)i式確定的。在另一個(gè)實(shí)施例中，該NK受體的一犬態(tài)是利用才企測(cè) 細(xì)胞內(nèi)編碼NK受體的mRNA的測(cè)試確定的。在另一個(gè)實(shí)施例中， 該受體可才企出地存在于至少50%的NK細(xì)胞上。在另一個(gè)實(shí)施例中，該抗體是一種細(xì)胞毒性抗體。另一方面， 這些抗體殺滅表達(dá)該單個(gè)或多個(gè)受體的細(xì)胞，例如通過(guò)將ADCC (抗體依賴的細(xì)胞毒性)或CDC (補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性)導(dǎo)向這些 細(xì)胞(例如，人IgGl或IgG3型抗體)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該抗體是能夠招募細(xì)胞效應(yīng)器的"棵" 抗體。本發(fā)明的該單克隆棵抗體及其片段的功能總體上取決于它們 結(jié)合Fc受體的能力。Fc受體例如Fc Y受體,皮表達(dá)在白細(xì)胞表面上。 這些受體結(jié)合免疫球蛋白(Ig )的Fc部分，例如Fc Y受體結(jié)合IgG 的Fc部分。這種結(jié)合通過(guò)將由抗體進(jìn)行的抗原識(shí)別與基于細(xì)胞的 效應(yīng)器4幾制相聯(lián)系而有助于對(duì)免疫功能作出貢獻(xiàn)。不同的免疫^(guò)求蛋 白類型通過(guò)免疫球蛋白Fc區(qū)與免疫細(xì)胞上的特異性Fc受體(FcRs) 的差異性相互作用而觸發(fā)不同的效應(yīng)器4幾制?；罨腇c Y受體包^舌 FcyRI、 FcyRIIA、 Fc y RIIC以及Fc y RIIIA。 FcyRIIB凈皮i人為 是一種4中制寸生Fc Y受體。(綜述參見(jiàn)，例》口 Woof et al. (2004) Nat Rev Immunol. 4(2):89-99; Baumann et al. (2003) Arch Immunol TherExp(Warsz) 51(6):399-406; Pan et al. (2003) Chin Med J (Engl) 116(4):487-94; Takai et al. (1994) Cell 76:519-529; Ravetch et al. (2001) Annu Rev Immunol 19:275-290,每個(gè)的全4卩內(nèi)容均通過(guò)引用 結(jié)合于此)。不受理論的束縛，本發(fā)明的諸位發(fā)明人認(rèn)為，在本發(fā) 明的抗體中Fc受體結(jié)合區(qū)的存在導(dǎo)致了本發(fā)明的抗體所結(jié)合的細(xì) 胞的4€竭。在一個(gè)優(yōu)選的方面，該抗體包含人IgGl或IgG3型的 Fc區(qū)，而不包含毒性或》丈射性部分。在另一個(gè)實(shí)施例中，該Fc區(qū) 是結(jié)合人Fc受體的人IgG2或IgG4，且該Fc區(qū)^皮可任選地^皮改變 而進(jìn)4于或增加與人Fc受體的結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施例中，該細(xì)胞毒性抗體包含一種成分，該成分選 自》文射性同位素、毒性肽和毒性小分子所組成的組。在另一個(gè)實(shí)施 例中，該抗體是一種抗體片4殳。在另一個(gè)實(shí)施例中，該抗體是人源 化的或嵌合的。在另一個(gè)實(shí)施例中，將該;改射性同位素、毒性肽或 毒性小分子直接連接于該抗體。在另一個(gè)實(shí)施例中，該抗體結(jié)合至 所述NK受體的一個(gè)小鼠或靈長(zhǎng)類的同系物。在另 一個(gè)實(shí)施例中， 該抗體結(jié)合至多種KIR受體。在另一個(gè)實(shí)施例中，該細(xì)胞毒性抗體 衍生于在免疫測(cè)試中用來(lái)確定所述NK受體狀態(tài)的相同抗體。另一方面，本發(fā)明提供制備適用于治療免疫增生性病癥的抗體 的一種方法，所述方法包括i)提供多種特異地結(jié)合一種或多種 NK細(xì)胞受體的抗體；ii) 4全測(cè)每一種抗體結(jié)合NK細(xì)胞的能力，這 些NK細(xì)胞取自一個(gè)或多個(gè)患免疫增生性病癥的患者；iii)從該多 種抗體中選4奪可結(jié)合至少50%的NK細(xì)月包的一種抗體，該NK細(xì)月包 耳又自一個(gè)或多個(gè)患者；以及iv) -使得該抗體適于對(duì)人類給藥。在一個(gè)實(shí)施例中，該抗體特異地結(jié)合至一種活化性NK細(xì)月包受 體。在另一個(gè)實(shí)施例中，該抗體特異地結(jié)合一種受體，該受體選自 KIR2DL1、 KIR2DS1、 KIR2DL2、 KIR2DL3 、 KIR2DS4、 CD94、 NKG2D、 NKG2E、 NKG2F、 NKG2C和NKG2A所組成的組。在另一個(gè)實(shí)施例中，該抗體特異;也結(jié)合一種NCR例如NKp30、 NKp44 或NKp46。在另一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)將該抗體人源化或嵌合化而4吏 其適于對(duì)人類給藥。在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括一個(gè)將細(xì)胞毒性劑連接 于該抗體的步驟。在另一個(gè)實(shí)施例中，該細(xì)胞毒性劑是一種放射性 同位素、 一種毒性多肽或毒性小分子。在另一個(gè)實(shí)施例中，該細(xì)月包 毒性劑直4妻連4I:于該抗體。在另一個(gè)實(shí)施例中，該抗體是一個(gè)抗體 片段。在另一個(gè)實(shí)施例中，該抗體結(jié)合至少60%的取自一個(gè)或多個(gè) 患者的NK細(xì)胞。在另 一個(gè)實(shí)施例中，該抗體結(jié)合至少70%的取自 一個(gè)或多個(gè)患者的NK細(xì)月包。在另一個(gè)實(shí)施例中，該法元體結(jié)合至少 80%的取自 一個(gè)或多個(gè)患者的NK細(xì)月包。另 一方面，本發(fā)明纟是供治療患有免疫增生性病癥的患者的一種 方法，該方法包4舌a)確定所述患者體內(nèi)T細(xì)月包或NK細(xì)月包的NK 細(xì)胞受體狀態(tài)，以及b )對(duì)所述患者給予一種特異結(jié)合NK細(xì)胞受 體的抗體，該NK細(xì)胞受體由T細(xì)胞或NK細(xì)胞顯著地表達(dá)，其中 所述受體選自KIR2DL1 、KIR2DS1 、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DS4、 CD94、 NKG2A、 NKG2C、 NKG2D、 NKG2E、 NKG2F、 NKp30、 NKp44和NKp46所組成的組。本發(fā)明還提供治療患有免疫增生性 病癥的患者的一種方法，該方法包4舌a)確定所述患者體內(nèi)T細(xì)胞 或NK細(xì)胞的NK受體狀態(tài)，以及b )通過(guò)使來(lái)自患者的NK或T 細(xì)胞與包含一種抗體的組合物進(jìn)行接觸而耗竭患者的NK或T細(xì) 胞，該抗體特異地結(jié)合所述T細(xì)胞或NK細(xì)胞所顯著表達(dá)的NK受 體，其中該抗體致使它與之結(jié)合的所述T或NK細(xì)胞#1耗竭。另一方面，本發(fā)明^是供治療患有免疫增生性病癥的患者的一種 方法或減弱某一個(gè)體的體內(nèi)炎癥的一種方法或消除、殺滅或^^竭某 一個(gè)體的體內(nèi)NK或T細(xì)月包的一種方法，該方法包括"寸該患者癥合予 一種特異地結(jié)合NK細(xì)胞受體的抗體，該受體選自KIR2DL1、KIR2DS1 、 KIR2DL2 、 KIR2DL3 、 KIR2DS4 、 CD94 、 NKG2 A 、 NKG2C 、 NKG2D、 NKG2E、 NKG2F、 NKp30、 NKp44和NKp46所組成的組。在本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施例中，該NK受體是一種活4匕性受 體。在另 一個(gè)實(shí)施例中，該受體選自KIR2DL1 、 KIR2DS1 、 KIR2DL2 、 KIR2DL3、 KIR2DS4和CD94所組成的組。在另一個(gè)實(shí)施例中，該 受體是一種NCR例如NKp30、 NKp44或NKp46。在另一個(gè)實(shí)施例 中，該受體是一種抑制性受體，優(yōu)選一種NKG2蛋白例如NKG2D、 NKG2E、 NKG2F、 NKG2C和NKG2A。在另一個(gè)實(shí)施例中，該抗 體特異地結(jié)合一個(gè)單一的NK細(xì)胞受體。在另一個(gè)實(shí)施例中，NK 受體狀態(tài)是利用一種免疫測(cè)i式確定的。在另一個(gè)實(shí)施例中，該NK 受體狀態(tài)是利用 一種功能測(cè)試確定的，該功能測(cè)試用于確定存在于 這些T或NK (或其他)細(xì)胞上的NK受體的活性。在另一個(gè)實(shí)施 例中，NK受體狀態(tài)是利用一種基因分型測(cè)試確定的。在另一個(gè)實(shí) 施例中，該NK受體的狀態(tài)是利用才企測(cè)細(xì)月包內(nèi)編碼NK受體的mRNA 的一種測(cè)試來(lái)確定的。在另一個(gè)實(shí)施例中，該受體可沖全出地存在于 至少50%的特定群的T細(xì)胞或NK (或其他)細(xì)胞上。在另一個(gè)實(shí)施例中，該抗體是一個(gè)抗體片^殳。優(yōu)選地，該抗體 是一種細(xì)胞毒性抗體，并且該抗體導(dǎo)致殺滅表達(dá)該單個(gè)或多個(gè)受體 的細(xì)胞，例如通過(guò)將ADCC導(dǎo)向這些細(xì)胞(例如，IgGl或IgG3型 抗體)。在另一個(gè)實(shí)施例中，該細(xì)胞毒性抗體包含一種成分，該成 分選自放射性同位素、毒性肽和毒性小分子所組成的組。 一方面， 該抗體還另外阻斷受體的功能(例如配體的結(jié)合或信號(hào)傳導(dǎo))，和/ 或引起受體的內(nèi)化。在另一個(gè)實(shí)施例中，該抗體為人源化或嵌合的。 在另一個(gè)實(shí)施例中，將該;改射性同位素、毒性肽或毒性小分子直接 連接于該抗體。在另一個(gè)實(shí)施例中，該抗體結(jié)合所述T或NK受體 的一個(gè)小鼠或靈長(zhǎng)類同系物。在另一個(gè)實(shí)施例中，該抗體結(jié)合多種KIR受體。在另一個(gè)實(shí)施例中，該細(xì)胞毒性:阮體書f生于在免疫測(cè)試中用來(lái)確定所述T或NK受體狀態(tài)的同種抗體。另 一方面，本發(fā)明提供制備適用于治療免疫增生性病癥的抗體 的一種方法，所述方法包括i)提供特異地結(jié)合一種或多種NK受 體的多種抗體；ii)才僉測(cè)每一種抗體結(jié)合NK或T細(xì)胞的能力，其 中這些NK或T細(xì)胞取自一個(gè)或多個(gè)免疫增生性病癥的患者；iii) 從該多種抗體中選擇一種結(jié)合至少50%的NK或T細(xì)胞的抗體，這 些NK或T細(xì)胞取自 一個(gè)或多個(gè)該患者；以及iv )使得該抗體適于 對(duì)人類給藥。在一個(gè)實(shí)施例中，該抗體特異地結(jié)合活化性受體。在另一個(gè)實(shí) 施例中，該抗體特異地結(jié)合一種受體，該受體選自KIR2DL1、 KIR2DS1 、 KIR2DL2 、 KIR2DL3 、 KIR2DS4 、 CD94 、 NKG2D 、 NKG2E 、 NKG2F、 NKG2C和NKG2A所組成的組。在另一個(gè)實(shí)施例中，該 抗體特異地結(jié)合一種NCR例如NKp30、 NKp44或NKp46、 NKG2C 或NKG2D。在另一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)l吏該抗體人源化或嵌合化而 適于對(duì)人類給藥。在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括將一種細(xì) 胞毒性劑連接于該抗體的步驟。在另一個(gè)實(shí)施例中，該細(xì)胞毒性劑 是一種方欠射性同位素、 一種毒性多肽或一種毒性小分子。在另一個(gè) 實(shí)施例中，該細(xì)月包毒性劑直4妄連4I:于該抗體。在另 一個(gè)實(shí)施例中， 該抗體是一種抗體片,殳。在另一個(gè)實(shí)施例中，該抗體結(jié)合至少60% 的取自一個(gè)或多個(gè)患者的NK或T細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施例中，該抗 體結(jié)合至少70%的取自一個(gè)或多個(gè)該患者的NK或T細(xì)月包。在另一 個(gè)實(shí)施例中，該抗體結(jié)合至少80%的耳又自 一個(gè)或多個(gè)該患者的NK 或T細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明的單克隆抗體的特;f正在于特異;也結(jié)合一種NK細(xì)月包受體，該受體選自KIR2DL1、 KIR2DS1 、 KIR2DL2 、 KIR2DL3 、 KIR2DS4 、 CD94 、 NKG2A 、 NKG2C 、 NKG2D、 NKG2E、 NKG2F、 NKp30、 NKp44和NKp46所組成的 組；
結(jié)合Fc受體；以及
當(dāng)結(jié)合人類NK細(xì)胞上的所述NK細(xì)胞受體時(shí)，引起所述NK 細(xì)胞耗竭。優(yōu)選地，所述抗體為人源化的或嵌合的。
優(yōu)選地，所述抗體特異地結(jié)合NKp46、 NKG2A和NKG2C。 可任選地，所述抗體特異地結(jié)合NKG2A和NKG2C,或可任選地， 所述抗體特異地結(jié)合NKG2A、 NKGC和NKG2E。在一個(gè)實(shí)施例中， 該抗體與zi99或Z270竟?fàn)幗Y(jié)合NKG2A,和/或包含來(lái)自NKG2A 的互補(bǔ)性決定區(qū)。優(yōu)選地，所述抗體包含G1或G3同種型的Fc區(qū)。
在本文任一實(shí)施例的某些方面，該免疫增生性病癥是一種自身 免疫性病癥，該病癥選自下《且，該癥且包4舌變態(tài)反應(yīng)，譯喘，關(guān)節(jié) 炎，包括骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和脊推關(guān)節(jié)病，胃腸道炎癥、 克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎、神經(jīng)炎性病癥、橋本曱狀腺炎、惡性貧 血、艾迪生病、I型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、 皮肌炎、4艮屑癬、千燥綜合征、紅斑狼瘡、脫髓鞘病、多發(fā)性硬化 癥、重癥肌無(wú)力、萊特爾氏綜合征、格雷夫斯氏病、多發(fā)性肌炎、格 -巴二氏綜合征、韋格納肉芽腫病、乳糜瀉、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、風(fēng)濕 性多月幾病、顳動(dòng)月永炎、貝切特氏病、丘-施二氏綜合4正和高安動(dòng)月永炎。 優(yōu)選地，該免疫增生性病癥是NK-LDGL或T-LDGL、類風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎、I型糖尿病、或選自ITP、多發(fā)性硬化癥、韋格納肉芽腫病 和干燥綜合4i所組成的組的病癥。在用于治療免疫增生性病癥的方 法的某些方面中，所述細(xì)胞是T細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，該T細(xì)胞 是CD3+,可任選地為CD4+CD28—或CD8+,這些細(xì)胞也已經(jīng)4皮才艮道用于表達(dá)NK細(xì)胞受體。在多個(gè)示例性的方面，該抗體結(jié)合NKG2A， 而且與以下的一種抗體結(jié)合基本相同的表位(抗原決定部位)，該 抗體選自Z199和Z270所組成的組。在另 一個(gè)示例性方面，該抗體 結(jié)合NKp46，而且與以下的一種抗體結(jié)合基本相同的表位(抗原決 定部位)，該抗體選自BAT281所組成的組。在另一個(gè)示例性方面， 該抗體結(jié)合KIR2DL1、 KIR2DL2和/或KIR2DL3，而且與PCT專 利7>開號(hào)WO 2005/003172和WO 06/003179中所描述的抗體 DF200、 NKVSF或l-7F9結(jié)合基本相同的表位，它們4皮露的內(nèi)容均 通過(guò)引用結(jié)合于此，而且與以下的一種抗體結(jié)合基本相同的表位 (抗原決定部4立)，該抗體選自Z199和Z270所組成的組。在多個(gè) 示例性的方面中，該抗體結(jié)合NKG2D ，而且與以下的 一種抗體結(jié) 合基本相同的表位(抗原決定部位)，該抗體選自BAT221 、 ECM217 和ON72所組成的組。
在此描述的任一實(shí)施例的另一方面，該免疫增生性病癥，包括 炎癥性或自身免疫性病癥，是一種已確立的疾病。優(yōu)選地，才艮據(jù)醫(yī) 療標(biāo)準(zhǔn)(例如ACR)，該疾病的特征在于由免疫細(xì)胞介導(dǎo)的身體癥 狀(例如組織損傷、破壞、胂脹等)，并且/或者在一個(gè)確定的時(shí)間 4殳(例^口3、 6、 9、 12、 24或36個(gè)月)內(nèi)不消退。
在此描述的任一實(shí)施例的其他諸方面中，本發(fā)明提供了利用在 此描述的任一方法制備的抗體。本發(fā)明還包括具有基本相同的抗原 特異性和活性(例如，其結(jié)合與親代抗體相同的抗原)的抗體片賴: 和衍生物。這種片段包括但不限于Fab片段、Fab， 2片段、CDR 和ScFv。
在其他諸方面，本發(fā)明提供了多個(gè)試劑盒，它們包括本發(fā)明所 述的抗體中4壬4可一種或多種。在一個(gè)實(shí)施例中，該試劑盒包4舌至少 一種it斷性抗體和至少一種治療(例如細(xì)/f包毒性的)抗體。在另一 個(gè)實(shí)施例中，該診斷抗體和該治療抗體特異地結(jié)合同一 NK細(xì)胞受體。在另一個(gè)實(shí)施例中，該試劑盒還包括根據(jù)本發(fā)明方法使用這些
4元體的"i兌明。
本發(fā)明還包括藥物組合物，這些藥物組合物包括一種或多種本 發(fā)明的抗體或者其中的 一個(gè)片^殳或書f生物以及一種藥學(xué)上可接受 的載體或i3武形劑。


圖1。人A^:尸"基因組序列可用來(lái)對(duì)小鼠NK細(xì)胞進(jìn)行基因標(biāo) 記(a)用于轉(zhuǎn)基因的人基因組片段示意圖。A^/M6外顯子以黑色 方塊表示。(b)將從huNKp46轉(zhuǎn)基因小鼠得到的脾細(xì)胞懸液針對(duì) NK1.1 、人NKp46和其他細(xì)月包表面分子的表達(dá)進(jìn)4亍染色。所標(biāo)明的 細(xì)胞類型如實(shí)驗(yàn)步驟中描述的進(jìn)行鑒定。(c )將huNKp46轉(zhuǎn)基因小 鼠的骨髓細(xì)胞針對(duì)CD3、 CD122、 DX5、 NK1.1和人NKp46的表達(dá) 進(jìn)行染色。并鑒定NK前體細(xì)胞(NKp)、未成熟和成熟NK細(xì)胞。
(d)將從huNKp46轉(zhuǎn)基因小鼠得到的淋巴結(jié)(腹股溝)、肝、肺 和外周血細(xì)胞懸液針對(duì)CD3、 NK1.1和人NKp46的表達(dá)進(jìn)行染色。 在(b-d)中的結(jié)果示出了人NKp46 (空白分布圖，粗線)或同種 型對(duì)照(灰色分布圖，細(xì)線)在指定亞群或門控CD3-NKl.l+細(xì)胞
(c )中的表達(dá)。(e )對(duì)照與指定抗體一起孵育的Daudi纟田月包，進(jìn)行 起源于B6(C57BL/6)或huNKp46 Tg ( Tg )脾細(xì)月包的LAK細(xì)月包的 重新指向的細(xì)胞溶解測(cè)試。從B6和huNKp46 Tg小鼠制備的LAK 細(xì)胞的溶細(xì)胞功能是可比的。圖1中的結(jié)果代表三個(gè)實(shí)驗(yàn)。
圖2。通過(guò)注射抗人NKp46抗體可特異性庫(kù)毛竭h(yuǎn)uNKp46轉(zhuǎn)基 因小鼠的NK細(xì)胞。多組hu-NKp46轉(zhuǎn)基因小鼠按方法中的描述靜 月永注射PBS (對(duì)照)或三種抗人NKp46的mAb的組合。(a )注射 后，測(cè)定不同時(shí)間血液中NKl.l+CD3-細(xì)月包的百分率。(b)注射后 48小時(shí)犧牲小鼠，并測(cè)定脾、夕卜周血、肝和肺中NK細(xì)胞、TCRy5 +T細(xì)胞及CD 1 d限制性NKT細(xì)胞的百分率。結(jié)果以注射后指定 細(xì)胞亞群相對(duì)于對(duì)照小鼠的百分率來(lái)表示。
圖3。與包含CD94/NKG2A和-C的表達(dá)細(xì)胞(黑色方塊)相 比，耗竭了 CD94/NKG2A和-C表達(dá)細(xì)胞(白色方塊)的淋巴細(xì)胞 在與THP-1細(xì)"包一起培養(yǎng)時(shí)，i秀導(dǎo)生成的TNF-a減少。'淋巴細(xì)月包 或THP-1細(xì)月包單獨(dú);咅養(yǎng)時(shí)，未乂見(jiàn)察到TNF- oc的生成(見(jiàn)圖注)。相 反，INF-a的生成未受影響，表明淋巴細(xì)胞在與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng) 時(shí)被激活。
具體實(shí)施例方式
引言
本發(fā)明提供了用于制備及使用適于治療增生性病癥特別是免 疫增生性病癥如NK型顆粒淋巴細(xì)胞增生性疾病(NK-LDGL )的抗 體的新方法。本發(fā)明還包括利用本文描述的方法制備的抗體、抗體 書亍生物或抗體片,殳以及利用該抗體治療患者的方法。具體地i兌， 本發(fā)明的方法包括將與這些病癥相關(guān)的增生性NK或NK樣細(xì)胞分 型，以確定增生性細(xì)月包上顯著存在的一種或多種NK細(xì)力包受體，然 后利用特異地結(jié)合該相同的一個(gè)或多個(gè)受體的抗體來(lái)治療患者。
NK-LDGL和其他免疫增生性病癥的特征常常在于 一種或少凄t 幾種NK或NK樣細(xì)胞的克隆性擴(kuò)增。因此，由于各個(gè)NK細(xì)胞通 常僅表達(dá)NK細(xì)胞受體的一個(gè)亞群，與造成這些病癥的相當(dāng)一部分 過(guò)度增生細(xì)月包常常表達(dá)少^:NK細(xì)月包受體。因此本發(fā)明t是供一種治 療這些病癥的方法，它通過(guò)鑒定在^會(huì)定患者體內(nèi)增生性細(xì)月包內(nèi)表達(dá) 的特定受體，然后利用細(xì)胞毒性抗體特異性靶向那些表達(dá)該受體的 細(xì)月包。這才羊，可特異性減少過(guò)度增生的細(xì)力包的凄t量，同時(shí)并不影響 其他免疫和非免疫細(xì)月包。總體上，本發(fā)明的方法涉及到一組單克隆抗體的用途，每一種
單克隆抗體均特異結(jié)合一種或少1史幾種NK細(xì)胞受體，例如KIR受 體、CD94、NKG2受體之一或者NCR(例如NKp30、NKp44、NKp46 )。 常常使用兩組抗體。 一組包含直接或間接標(biāo)記的抗體在性質(zhì)上為i貪 斷的并用來(lái)確定明卩種4爭(zhēng)定NK細(xì)月包受體在纟合定患者的NK細(xì)力包上表 達(dá)。用于治療的第二組對(duì)應(yīng)于單克隆抗體，它通常在非人動(dòng)物體內(nèi) 產(chǎn)生4旦已經(jīng)通過(guò)例如人源化或嵌合而4吏其適于用于人類。 一方面， 這些抗體阻斷受體功能(例如配體結(jié)合或信號(hào)傳導(dǎo))，和/或引起受 體的內(nèi)化。另一方面，這些抗體殺滅表達(dá)該受體的細(xì)胞，例如通過(guò) 將ADCC導(dǎo)向該細(xì)胞(例如IgGl或IgG3型抗體)。在某些實(shí)施例 中，這些抗體進(jìn)一步利用細(xì)胞毒性劑直接或間接進(jìn)行衍生，使其殺 滅表達(dá)該受體的細(xì)胞。例如，可將這些抗體連接于放射性同位素、 細(xì)胞毒性多肽或細(xì)胞毒性小分子。
定義
如在此所使用，"NK"細(xì)胞是指在非常規(guī)免疫中所包括的淋巴 細(xì)胞的一個(gè)亞群。NK細(xì)胞可根據(jù)某些特點(diǎn)和生物學(xué)屬性進(jìn)行鑒定， 例如特異性表面抗原包括CD16、 CD56和/或CD57的表達(dá)、細(xì)胞 表面上a/ P或y / 5 tcr復(fù)合體的在夾失、通過(guò)激活特異性細(xì)胞溶解 酶而結(jié)合并殺滅不表達(dá)"自身"MHC/HLA抗原的細(xì)胞的能力、殺 滅表達(dá)針對(duì)NK活化受體的配體的胂瘤細(xì)胞或其他疾病細(xì)胞的能 力、以及釋放那些刺激或抑制免疫反應(yīng)的蛋白分子(即所謂的細(xì)胞 因子)的能力。利用本領(lǐng)域中熟知的方法，這些特點(diǎn)和活性中的任 ^f可一種均可用來(lái)鑒定NK纟田月包。
術(shù)語(yǔ)"NK細(xì)胞受體"是指任何始終存在于所有或部分NK細(xì) 胞上的細(xì)胞表面分子。優(yōu)選地，該NK細(xì)胞受體只表達(dá)在NK細(xì)胞(靜息的或激活的)上，盡管該術(shù)語(yǔ)也包括還能在其他細(xì)胞類型上
表達(dá)的受體。NK細(xì)胞受體的實(shí)例包括KIR受體家族的成員、CD94、 NKG2受體、NCR受體例如NKp30、 NKp44和NKp46、 LIR-1等 (參見(jiàn)，例3口 Trowsdale and Parham (2004) Eur J Immunol 34(1):7-17; Yawata et al. (2002) Crit Rev Immunol 22(5-6):463-82; Hsu et al. (2002) Immunol Rev 190:40-52; Middleton et al. (2002) Transpl Immunol 10(2-3): 147-64; Vilches et al. (2002) Annu Rev Immunol 20:217-51; OMIM 602894; Braud et al. (1998) Nature 391:795-799; Chang et al. (1995) Europ. J. Immun 25:2433-2437; Lazetic et al. (1996) Immun 157:4741-4745; Rodriguez et al. (1998) Immunogenetics 47:305-309; OMIM 161555; Houchins et al. (1991) J. Exp. Med 173:1017-1020; Adamkiewicz et al. (1994) Immunogenetics 39:218; Renedo et al. (1997) Immunogenetics 46:307-311; Ravetch et al. (2000) Science 290:84-89; PCT WO 01/36630; Vitale et al. (1998) J. Exp. Med. 187:2065-2072; Si雨i et al. (1997) J. Exp. Med. 186:1129-1136; Pessino et al. (1998) J. Exp. Med. 188:953-960;它們各自披露的內(nèi)容 均通過(guò)引用結(jié)合于此)。
如在此所使用，"NK受體狀態(tài)"是指對(duì)表達(dá)在取自某一個(gè)體例 如免疫增生性病癥的一個(gè)患者的NK或其他細(xì)胞上的不同NK細(xì)胞 受體的身份和顯著性。例如，檢查取自一個(gè)患者的NK細(xì)胞可能發(fā) 現(xiàn)特定NK纟田胞受體如KIR2DS2在70%的細(xì)胞中得到表達(dá)，而另 一種受體例如KIR2DL1在40%的細(xì)胞中得到表達(dá)，另一種受體例 如CD94在80。/。的細(xì)胞上得到表達(dá)，等等。這些信息對(duì)于確定在本 發(fā)明的方法中采用哪種細(xì)胞毒性抗體是有用的。應(yīng)該理解，盡管獲 得有關(guān)多種NK細(xì)胞受體的表達(dá)信息明顯有用，但NK受體狀態(tài)還 可以指單一種受體例如KIR2DS2或少凄t受體例如KIR2DL2/3以及 KIR2DS2的表達(dá)水平或顯著性。
"LGL"或"大顆粒淋巴細(xì)胞"指一群形態(tài)獨(dú)特的淋巴細(xì)胞， LGL構(gòu)成外周血單核細(xì)月包的10-15%。 LGL可包4舌NK細(xì)月包和T細(xì)月包(參見(jiàn)，例如Loughran (1993) Blood 82:1-14),它們可通過(guò)特定 標(biāo)志物而區(qū)分，例如CD3的表達(dá)(NK細(xì)月包為CD3、 T細(xì)月包為CD3+ )。 優(yōu)選地，為了本發(fā)明的目的，LGL細(xì)胞為CD3\然而，在本發(fā)明 的某些實(shí)施例中，將從一個(gè)患者中取得PBL,并檢測(cè)以發(fā)現(xiàn)是否有 任何細(xì)胞類型被擴(kuò)增，優(yōu)選LGL,特別是CD31GL?？偟膩?lái)說(shuō)， 可檢測(cè)任何被擴(kuò)增的細(xì)胞類型，以確定在它們的表面上是否顯著地 表達(dá)了特殊的NK細(xì)胞受體。
"顯著表達(dá)"是指NK細(xì)胞受體表達(dá)在取自特定患者的大量指 定類型的細(xì)胞(例如NK細(xì)胞，T細(xì)胞)內(nèi)。然而該術(shù)語(yǔ)"顯著表 達(dá)"不限于精確的百分率值，多數(shù)情況下，稱為"顯著表達(dá)，，的受 體存在于至少30%、 40%, 4尤選50%、 60%、 70%、 80%或更多的 取自患者的NK細(xì)胞、T細(xì)胞或其他過(guò)度增生的細(xì)胞上。
如在此所使用，術(shù)語(yǔ)"抗體，，是指多克隆和單克隆抗體。根據(jù) 重鏈恒定區(qū)的類型，可將抗體歸入以下五種主要類別之一IgA、 IgD、 IgE、 IgG和IgM。這些類別中有幾種凈皮進(jìn)一步分為亞類或同 種型，例如IgGl、 IgG2、 IgG3和IgG4等。 一個(gè)示例性免疫J求蛋白 (抗體)的結(jié)構(gòu)單位包4舌一個(gè)四聚體。每個(gè)四聚體由兩對(duì)相同的多 肽鏈構(gòu)成，每對(duì)包括一條"輕，，鏈(約25 kDa )和一條"重，，鏈(約 50-70 kDa)。每條鏈的N末端限定一個(gè)具有約100至110或更多個(gè) 氨基酸的可變區(qū)，主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別。術(shù)i吾可變輕鏈(VL)和可變 重鏈(Vn)分別指這些輕鏈和重鏈。對(duì)應(yīng)于不同類別免疫球蛋白的 重鏈恒定區(qū)分別命名為"a"、 "5"、 "s"、 "y"和"ju"。不同 類別免疫J求蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型已經(jīng)為人熟知。IgG和/ 或IgM是本發(fā)明中優(yōu)選使用的抗體類別，特別優(yōu)選IgG，因?yàn)樗鼈?是生理狀況下最常見(jiàn)的抗體且在實(shí)驗(yàn)室條件下最容易制備。優(yōu)選 地，本發(fā)明的抗體是單克隆抗體。特別優(yōu)選的是人源化的、嵌合的、人的或其他適合人的抗體。"抗體"還包括在此描述的任一抗體的 任一片,殳或衍生物。
術(shù)語(yǔ)"特異地結(jié)合于，，意思為抗體在竟?fàn)幗Y(jié)合試驗(yàn)中可優(yōu)先結(jié)
合至結(jié)合配對(duì)體，例如一個(gè)NK細(xì)胞受體如激活性KIR受體，它的 評(píng)估是利用這些蛋白的重組形式、其抗原表^f立或存在于分離的NK 或相關(guān)靶細(xì)胞表面上的天然蛋白。下文將進(jìn)一步闡述竟?fàn)幗Y(jié)合試-瞼 以及其^也用于確定特異地結(jié)合的方法，這些在本領(lǐng)域中已經(jīng)為人熟 知。
在一種抗體識(shí)別一個(gè)NK細(xì)月包受體(例如NKG2A、 NKp46 ) 的效應(yīng)的背景下，術(shù)語(yǔ)"耗竭"或"使耗竭"是指表達(dá)該NK受體 的細(xì)力包(例如表達(dá)NKG2A或NKp46的細(xì)力包)的減少或消除。
"適合人類"的抗體指任何可安全用于人類用于例如本文描述 的治療方法的抗體、衍生抗體或抗體片段。適合人類的抗體包括所 有類別的人源化、嵌合或完全的人抗體，或者任何至少一部分來(lái)自 人類或以其他方式進(jìn)4刊奮飾以避免該免疫反應(yīng)的抗體，該免疫反應(yīng) 通常在使用天然的非人抗體時(shí)被激勵(lì)。
"毒性"或"細(xì)胞毒性"肽或小分子包括任意此種化合物，該 化合物可以按任何可檢出的方式減慢、停止或逆轉(zhuǎn)細(xì)胞增生、降低 它們的活性(例如NK細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性)，或者直接/間接殺滅 它們。優(yōu)選地，毒性或細(xì)胞毒性化合物通過(guò)直接殺滅細(xì)胞、刺激凋 亡或以其他方式發(fā)揮作用。如在此所使用，毒性"肽"可包括任何 此類的肽、多肽或衍生物，包括帶有非天然氨基酸或修飾鍵的肽或 多肽衍生物。毒性"小分子"可包括任何毒性化合物或成分，優(yōu)選 尺寸小于10kD、 5kD、 1 kD、 750 D、 600 D、 500 D、 400 D、 300 D或更小。"免疫原片段"在本文中是指任何能夠引起以下免疫反應(yīng)的多 肽或肽片段，例如(i)生成結(jié)合所述片段和/或結(jié)合包含所述片段 的任何形式的分子的抗體，包括膜結(jié)合受體及由其衍生的突變體，
(ii)刺激T細(xì)胞反應(yīng)，包括T細(xì)胞對(duì)雙分子復(fù)合物發(fā)生反應(yīng)，而 該雙分子復(fù)合物包括任何MHC分子和衍生自所述片,殳的肽，(iii ) 結(jié)合轉(zhuǎn)染的載體，例如表達(dá)編碼哺乳動(dòng)物免疫球蛋白的基因的噬菌 體或細(xì)菌。作為替代， 一個(gè)免疫原片段也指任何能引起以上所限定 的免疫反應(yīng)的結(jié)構(gòu)，例如通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)輒合于載體蛋白的肽片段、 它的氨基酸序列中包含所述肽片段的嵌合性重組多肽結(jié)構(gòu)，并且明 確地包括用cDNA (其序列包括對(duì)所述片段編碼的一個(gè)部分)轉(zhuǎn)染 的細(xì)月包。
為了本發(fā)明的目的， 一種"人源化"抗體是指一種抗體，其中 一種或多種人免疫5求蛋白的恒定和可變框架區(qū)與 一種動(dòng)物免疫J求 蛋白的結(jié)合區(qū)例如CDR相融合。這種人源化抗體被設(shè)計(jì)來(lái)保持非 人抗體(該結(jié)合區(qū)域由此衍生)的結(jié)合特異性，但要避免對(duì)非人抗 體的免疫反應(yīng)。
一種"嵌合抗體"是一種抗體分子，其中(a)對(duì)恒定區(qū)或其 一部分進(jìn)4亍改變、置才奐或交4灸，乂人而將抗體結(jié)合^f立點(diǎn)(可變區(qū))4皮 連接于類別、效應(yīng)器功能和/或種屬不同(或已改變的)的一個(gè)恒定 區(qū)，或是一種完全不同的分子，該分子對(duì)該嵌合抗體J3武予新的屬性， 例如酶、毒素、激素、生長(zhǎng)因子、藥物等；或者(b)將該可變區(qū) 或其一部分用具有不同或已經(jīng)改變的抗原特異〗生的一個(gè)可變區(qū)進(jìn)
行改變、置換或交換。
"人"抗體是一種從轉(zhuǎn)基因小鼠或其他動(dòng)物獲得的抗體，該轉(zhuǎn) 基因小鼠或其他動(dòng)物經(jīng)"工程化(engineered)"以1更響應(yīng)于抗原激 發(fā)(antigenic challenge )而產(chǎn)生凈爭(zhēng)異'1"生人類4元體(參見(jiàn)，例長(zhǎng)口 Green et al. (1994) Nature Genet 7:13; Lonberg et al. (1994) Nature 368:856;Taylor et al. (1994) Int Immun 6:579，其全部?jī)?nèi)容均通過(guò)引用結(jié)合于 此)。完全的人抗體也可通過(guò)基因或染色體轉(zhuǎn)染法以及噬菌體展示 才支術(shù)而構(gòu)建，這些技術(shù)在本領(lǐng)域中已知(參見(jiàn)，例如McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-553 )。人抗體還可以由體外激活的B細(xì)胞生 成(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利號(hào)5,567,610和5，229,275，其全部?jī)?nèi)容均 通過(guò)引用結(jié)合于此)。
在本發(fā)明的背景中，"活性"或"激活的"NK細(xì)胞表示生物活 性的NK細(xì)胞，更具體的是指具有溶解靶細(xì)胞的能力的NK細(xì)胞。 例如， 一個(gè)"活性，，NK細(xì)胞能夠殺滅表達(dá)一個(gè)NK激活受體-酉己體 而不表達(dá)"自身，，MHC/HLA抗原的NK細(xì)胞(KIR-不相容的細(xì)胞)。 用于重導(dǎo)向殺滅測(cè)試的適宜靶細(xì)胞的實(shí)例是P815和K562纟田月包，4旦 可采用多種細(xì)胞類型中的任何一種并且這在本領(lǐng)域中是熟知的(參 見(jiàn)，例如Sivori et al. (1997) J. Exp. Med. 186:1129-1136; Vitale et al. (1998) J. Exp. Med. 187:2065-2072; Pessino et al. (1998) J. Exp. Med. 188:953-960; Neri et al. (2001) Clin. Diag. Lab. Immun. 8:1131-1135)。"活性"或"激活的，，細(xì)胞還可以通過(guò)本領(lǐng)域中任何 其他與NK活性相關(guān)的屬性或活性來(lái)鑒定，例如細(xì)胞內(nèi)游離4丐水平 升高產(chǎn)生的細(xì)月包因子(例:^IFN國(guó)Y和TNF-oc )。
如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)NK-LDGL是指任何特征如下的增生性 病癥NK細(xì)胞或NK樣細(xì)胞的克隆性擴(kuò)增，例如具有一組特征性 表面抗原(例如CD3-、 CD56+、 CD16+)的大顆粒淋巴細(xì)胞，(參 見(jiàn)，例如Zambello et al. (2003) Blood 102:1797; Loughran (1993) Blood 82:1; Epling-Bumette et al. (2004) Blood-2003-02-400 )或表達(dá) 任何NK細(xì)胞受體，如本文中所定義的。NK-LDGL的癥狀可以包 括，除其他之外，發(fā)熱、輕纟效的中性粒細(xì)胞減少癥、血小板減少癥、 貧血、淋巴細(xì)胞增多、脾大、肝大、淋巴結(jié)病和骨髓浸潤(rùn)(參見(jiàn)， 例如Zambello et al. (2003) Blood 102:1797; Loughran (1993) Blood 82:l;Epling畫B腦ette et al. (2004) Blood-2003-02-400 )。術(shù)語(yǔ)"分離的"、"提純的"或"生物純的"是指大體上或基本 上沒(méi)有在天然狀態(tài)下通常與其相伴隨組分的物質(zhì)。通常利用測(cè)試化
學(xué)的l支術(shù)如聚丙蹄酰胺凝"交電泳或高歲文液相色i脊來(lái)確定純度和同 質(zhì)性。制備物中存在的優(yōu)勢(shì)種類的蛋白基本上被提純。
如在此使用的術(shù)語(yǔ)"生物樣品"包括但不限于生物學(xué)流體(例 如血清、淋巴液、血液)、細(xì)胞樣品或組織樣品(例如骨髓)。
術(shù)語(yǔ)"多肽"、"肽"和"蛋白，，在本文中可以互換使用，指氨 基酸殘基的聚合物。這些術(shù)語(yǔ)適用于這樣的氨基酸聚合物，其中一 個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是對(duì)應(yīng)于天然存在的氨基酸以及天然存在的 氨基酸聚合物的人工化學(xué)模擬物和非天然存在的氨基酸聚合物。
當(dāng)提及例如細(xì)胞或核酸、蛋白或載體時(shí)使用術(shù)語(yǔ)"重組"是指 該細(xì)胞、核酸、蛋白或載體已經(jīng)通過(guò)引入異源性核酸或蛋白或通過(guò) 改變天然核酸或蛋白而一皮^f奮飾，或者表示該細(xì)胞來(lái)源于如此修飾的 纟田月包。因此，例如重組細(xì)胞表達(dá)不存在于該天然形式的細(xì)胞內(nèi)的基 因，或者表達(dá)那些以其他異常方式表達(dá)、低表達(dá)或根本不表達(dá)的天 然基因。
制備對(duì)NK細(xì)胞受體特異的單克隆抗體
本發(fā)明涉及適用于人且靶向一種或少數(shù)幾種NK細(xì)胞受體的抗 體、抗體片段或抗體衍生物的制備和應(yīng)用。本發(fā)明的抗體可通過(guò)本 領(lǐng)域中已知的多種技術(shù)中的任何一種而制備。典型地，它們使用存 在于NK細(xì)胞表面上的包含受體的免疫原通過(guò)非人動(dòng)物(優(yōu)選小鼠) 的免疫作用進(jìn)行制備。該受體可包括全部NK細(xì)胞或細(xì)胞膜、 一種 NK細(xì)胞受體的全長(zhǎng)序列，或者任何NK細(xì)胞受體的片,殳或衍生物， 通典型地是免疫原片^:,即多肽的一部分，而該多肽包含暴露于細(xì) 胞表面上的表達(dá)該受體的表位。這種片段通常包含成熟多肽序列中至少7個(gè)連續(xù)的氨基酸，甚至更優(yōu)選其中至少IO個(gè)連續(xù)的氨基酸。 它們主要衍生于該受體的胞外結(jié)構(gòu)域。應(yīng)該理解，在部分或全部患 者體內(nèi)、有時(shí)或一直存在于全部或部分NK細(xì)月包表面上的4壬4可受體 或任<可其<也受體均可用于產(chǎn)生抗體。在優(yōu)選的實(shí)施例中，用來(lái)產(chǎn)生 抗體的該激活性NK細(xì)胞受體是一種人受體。
在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施例中，該免疫原包含在脂質(zhì)月莫內(nèi)(典型地， 在細(xì)胞表面)的野生型人NK受體多肽。在一個(gè)特殊實(shí)施例中，該 免疫原包含完整的NK細(xì)胞，尤其是完整的人NK細(xì)胞，可任選地 經(jīng)過(guò)處理或溶解。這些抗體可針對(duì)NK細(xì)胞表面上存在的<壬<可蛋白 質(zhì)或分子而進(jìn)4于制備，優(yōu)選一種NK細(xì)"包受體，更優(yōu)選選自下組的 NK細(xì)月包受體，該組包括KIR受體、LIR受體(諸如LIR-1、 Ly49、 CD94/NKG2A)、 NCR"者如Nkp30、 Nkp44和Nkp46 )，并且最優(yōu) 選一種5敫活性NK細(xì)月包受體，例J口KIR2DS1、 KIR2DS2、 KIR2DS3、 KIR2DS4、 KIR2DS5和KIR3DS1 (參見(jiàn)，例如Trowsdale and Parham (2004) Eur J Immunol 34(1):7畫17; Yawata et al. (2002) Crit Rev Immunol 22(5-6):463-82; Hsu et al. (2002) Immunol Rev 190:40-52; Middleton et al. (2002) Transpl Immunol 10(2-3): 147-64; Vilches et al. (2002 Annu Rev Immunol 20:217-51;它們所4皮露的全部?jī)?nèi)容均通過(guò) 引用結(jié)合于此)；或NKG2D， 一種激活性細(xì)胞表面分子，其始終存 在于全部或部分的各種類型的免疫細(xì)胞上，特別是NK細(xì)胞、CD8+T 纟田月包、部分cd4+t細(xì)月包以及y / 5 t細(xì)月包。nkg2d也稱殺滅細(xì)月包凝 集素才羊受體、C亞家族、成員4或KLRC4(參見(jiàn)，例如OMIM 602893， 它所披露的全部?jī)?nèi)容均通過(guò)引用結(jié)合于此)。如在此使用的，NKG2D 是指4壬4可NKG2D異構(gòu)體，例如在Diefenbach et al. (2002) Nat Immunol. 3(12): 1142-9中描述的異構(gòu)體。在NK和T細(xì)胞中，NKG2D 可以與諸如DAP10 (參見(jiàn)，例如OMIM 604089 )或DAP12 (參見(jiàn)， 例如OMIM 604142)的蛋白形成異源二聚體。應(yīng)該理解，在此對(duì) NKG2D提及的任何活性例如細(xì)胞活化、抗體識(shí)別等，也可適用于含NKG2D的復(fù)合體例如NKG2D-DAP10或NKG2D-DAP12異源二聚體。
在一個(gè)實(shí)施例中，該抗體4汙生于可識(shí)別 一種或多種NK細(xì)月包受 體的 一種或多種已存在的單克隆抗體。恰當(dāng)抗體的實(shí)例如下文所示。
一個(gè)第一個(gè)4尤選實(shí)例是識(shí)別NKG2A的一種抗體，例如稱為 3S9、 20d5、 Z270或Z199的4元體或其書f生4勿。3S9 4苗述于美國(guó)專矛J />開案20030095965中，它4皮露的內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合于此。3S9結(jié) 合NKG2C和NKG2E以及NKG2A。 20d5是一種可商購(gòu)的抗體(BD Biosciences Pharmingen, Catalog No. 550518， USA )。 20d5結(jié)合小鼠 NKG2A和NKG2E以及NKG2C。 Z199是一種可商購(gòu)的抗體 (Beckman Coulter, Inc., Product No. IM2750, USA )。 Z270描述于共 同未決的PCT專利公開號(hào)WO 06/070286中，其4皮露的全部?jī)?nèi)容通 過(guò)引用結(jié)合于此。Z270于2005年12月22日保藏到法國(guó)微生物保 藏中心(CNCM)， Institute Pasteur, 25， Rue du Docteur Roux， F-75725 Paris, France, 4呆藏號(hào)是1-3549。 Z270特異結(jié)合人NKG2A,而不結(jié) 合人NKG2C或NKG2E。在其他實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體特異性排 除Z270。
其他優(yōu)選的實(shí)例包括EB6b (識(shí)另'J KIR2DL1、 KIR2DS1 )、 GL183 ( KIR2DL2/3 、 KIR2DS2 ) 、 FES172(KIR2DS4) 、 Z27 (KIR3DL1、 KIR3DS1 )、 Q66 ( KIR3DL2 )、 XA185(CD94)、 Z199 (NKG2A)、 F278(LIR-1)、 BAB281 (NKp46)、以CNCM登i己號(hào) 1-2576保藏的AZ20(NKp30)、 Z231(NKp44)或1D11、 BAT221、 ECM217和ON72(NKG2D)參見(jiàn)，例如Zambello et al. (2003) Blood 102:1797-1805; Groh et al. (2003) PNAS 100:9452-57; Andre et al. (2004) Eur. J. Immunol. 34:1-11 ，前述三個(gè)參考文獻(xiàn)所4皮露的全部?jī)?nèi) 容均通過(guò)引用結(jié)合于此。這些抗體可直接或間接進(jìn)行標(biāo)記(即，與標(biāo)記的第二抗體一起^f吏用)，作為"^斷性抗體用于本文描述的分型
步驟以確定患者的NK受體狀態(tài)。此外，這些抗體可制成適于對(duì)人 類給藥以及，可任選地，如本文所述制備成有毒的用于本發(fā)明的治 療方法中的細(xì)胞毒性抗體。
本發(fā)明的i貪斷性或治療性(例如細(xì)胞毒性)抗體可以是全長(zhǎng)抗 體或抗體片段或衍生物?？贵w片段的實(shí)例包括Fab、 Fab， 、 Fab，-SH、 F(ab，)2和Fv片l殳；？又體(diabodies);單鏈Fv ( scFv )分子；單鏈 多肽，僅含一個(gè)輕鏈可變區(qū)或其中的一個(gè)片H該片4史包含該輕鏈 可變區(qū)的三個(gè)CDR,而無(wú)相關(guān)的重鏈部分；單鏈多肽，僅含一個(gè)重 鏈可變區(qū)或其中的一個(gè)片,史，該片,爻包含該重鏈可變區(qū)的三個(gè) CDR，而無(wú)相關(guān)的輕鏈部分；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。 這些片段和衍生物以及制備它們的方法在本領(lǐng)域中是熟知的。例 如，胃蛋白酶可用來(lái)在4交鏈區(qū)中的二硫鍵下消化抗體而生成 F(ab)'2，本身是一條輕鏈的Fab的二聚體通過(guò)二硫鍵連接于VH-CH1。 F(ab)，2可在溫和條件下還原，打斷在4交鏈區(qū)的二硫4建，乂人而將該 F(ab)，2 二聚體4爭(zhēng)4匕成Fab，單體，該Fab，單體實(shí)質(zhì)上是具有部分 4交鏈區(qū)的 Fab (參見(jiàn)Fundamental Immunology (Paul ed.， 3d ed. 1993))。盡管多種抗體片段均根據(jù)完整抗體的消化而定義，本領(lǐng)域
而乂人頭合成。
單克隆或多克隆抗體的制備在本領(lǐng)域中為人熟知，可采用大量 可用#支術(shù)中的4壬4可 一 種(參見(jiàn)，例如Kohler&Milstein， Nature 256:495-497(1975); Kozbor et al.， Immunology Today 4:72(1983》 Cole et al., pp. 77-96 in monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985))。用于生成單鏈抗體的^支術(shù)(美國(guó)專利號(hào)4,946,778)可適 合于生產(chǎn)4十對(duì)所希望的多肽的抗體，例如，NK細(xì)力包受體如 KIR2DS1、 KIR2DS2、 KIR2DS3、 KIR2DS4、 KIR2DS5和KIR3DS1。 另外，轉(zhuǎn)基因小鼠或其他有機(jī)體如其他哺乳動(dòng)物，可用來(lái)表達(dá)人源化的、嵌合的或經(jīng)類似修飾的抗體。作為替代，噬菌體展示技術(shù)可
用來(lái)鑒定特異地結(jié)合至所選抗原的抗體和異源性Fab片,爻(參見(jiàn)， 例如McCafferty et al.， Nature 348:552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992))。在一個(gè)實(shí)施例中，該方法包i舌從 文庫(kù)或表達(dá)i普中選l奪的與至少一種NK受體發(fā)生交叉反應(yīng)的一個(gè)單 克隆抗體或其片^殳或衍生物。例如，該表達(dá)i普可為抗體或其片賴二任 意的(重組)表達(dá)語(yǔ)，可任選地，可由任何恰當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)(例如噬菌 體、細(xì)菌、合成復(fù)合物等)展示。
用抗原使非人哺乳動(dòng)物免疫的步驟可以按本領(lǐng)域中熟知的任 寸可方式進(jìn)^亍(參見(jiàn)，侈'J長(zhǎng)口 E. Harlow and D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998))。通常，免疫原懸浮于或溶解于緩沖液中，可任 選地與佐劑例如完全福氏佐劑一起懸浮或溶解。用于確定免疫原用 量、緩沖液的類型以及佐劑用量的方法為本領(lǐng)域中普通沖支術(shù)人員所 熟知，并且不以4壬4可方式限制本發(fā)明。
類4以i也，足以刺^U元體產(chǎn)生的免疫作用的部^f立和頻率在本4頁(yè):t或 中也為人熟知。在一個(gè)典型的免疫接種試驗(yàn)中，第1天給非人動(dòng)物 腹膜內(nèi)注射抗原，約1周后再注射一次。隨后在第20天左右進(jìn)行 抗原的回憶注射(recall injection),可4壬選;也，與佐劑例3o不完全 福氏佐劑一起注射。該記憶注射為靜月永內(nèi)注射，且可在連續(xù)幾天內(nèi) 重復(fù)。第40天時(shí)進(jìn)行加強(qiáng)免疫注射一^爭(zhēng)脈內(nèi)或腹膜內(nèi)，通常不用 佐劑。約40天后，該方案可引起產(chǎn)生抗原特異性抗體的B細(xì)胞的 生成。也可采用其他方案，只要它們能導(dǎo)致表達(dá)針對(duì)免疫接種中所 采用抗原的抗體的B細(xì)胞生成。
在另一個(gè)實(shí)施例中，將未免疫非人哺乳動(dòng)物的淋巴細(xì)胞分離、 體外培養(yǎng)并暴露于細(xì)胞培養(yǎng)基中的免疫原。隨后收集淋巴細(xì)胞，并
進(jìn)行下文所描述的融合步驟。對(duì)于優(yōu)選用于本發(fā)明目的的單克隆抗體，下一個(gè)步驟是,人未免
疫的非人哺乳動(dòng)物中分離細(xì)月包，例如淋巴細(xì)月包、脾細(xì)月包或B細(xì)月包， 隨后將那些脾細(xì)胞或B細(xì)胞或淋巴細(xì)胞與永生化細(xì)胞融合以形成 產(chǎn)生抗體的雜交瘤。因此，如在此^f吏用的術(shù)i吾"乂人凈皮免疫動(dòng)物中制 備抗體"包括從被免疫動(dòng)物得到B細(xì)胞/脾細(xì)胞/淋巴細(xì)胞并利用那 些細(xì)胞生成表達(dá)抗體的雜交瘤以及從^皮免疫動(dòng)物的血清中直4妻獲 得抗體。例如從非人哺乳動(dòng)物中分離脾細(xì)胞在本領(lǐng)域中是為人熟知 的，例如，包括從麻醉的非人哺乳動(dòng)物中取出脾、切成小塊并從脾 包膜中擠出脾細(xì)胞并通過(guò)細(xì)胞濾器的尼龍過(guò)濾網(wǎng)擠進(jìn)恰當(dāng)?shù)木彌_ 液中而4尋到單種細(xì)月包懸液。洗滌細(xì)月包、離心并重懸于《爰沖液中，該 纟爰沖液可;容解4壬4可紅細(xì)月包。將該溶液再次離心，最后將小王求中剩余 的淋巴細(xì)胞重懸于新鮮緩沖液中。
一旦被分離且存在于單細(xì)胞懸液中，這些產(chǎn)生抗體的細(xì)胞就融 合于永生化細(xì)胞系中。這典型地為小鼠骨髓瘤細(xì)胞系，盡管本領(lǐng)域 中已知還有多種對(duì)于生成雜交瘤有用的其他永生化細(xì)胞系。優(yōu)選的 小鼠骨骨逸瘤細(xì)"包系包括4旦不限于那些起源于MOPC-21和MPC-ll 小鼠月中瘤(可從Salk institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. U.S.A.得到)的細(xì)胞系、X63 Ag8653和SP-2細(xì)胞(可從 American Type Culture Collection, Rockville, Maryland U.S.A.4尋Sl])。 該融合是利用聚乙二醇或類似物實(shí)現(xiàn)的。隨后將得到的雜交瘤在選 擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含有一種或多種抑制非融合親代骨髓
瘤細(xì)月包生長(zhǎng)或生存的物質(zhì)。例如，如果親^骨骨逸瘤細(xì)月包在夾乏次黃嘌 呤鳥噪呤碌酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培 養(yǎng)基通常將包括次黃噤呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些 物質(zhì)抑制HGPRT缺陷細(xì)胞的生長(zhǎng)。
雜交瘤細(xì)胞可以生長(zhǎng)在巨嗟細(xì)胞滋養(yǎng)層上。巨噬細(xì)胞優(yōu)選來(lái)自 用來(lái)分離脾細(xì)胞的同窩非人哺乳動(dòng)物，且通常在接種雜交瘤細(xì)胞之前幾天用不完全福氏佐劑或類似物進(jìn)行預(yù)處理。融合方法4皮露在例
如Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice," pp. 59-103 (Academic Press, 1986)中，它所4皮露的內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合于 此。
允許這些細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)足夠時(shí)間，用于形成克隆和 產(chǎn)生抗體。這通常在7到14天之間。隨后對(duì)雜交瘤克隆測(cè)試產(chǎn)生 特異性識(shí)別預(yù)期底物(例如，諸如KIR2DS2的NK細(xì)胞受體抗體) 的抗體生成。該測(cè)試通常是比色ELISA型測(cè)試，盡管可采用任何適 于雜交瘤在其中生長(zhǎng)的孔的測(cè)試。其他測(cè)試包括免疫沉淀和》文射免 疫測(cè)試。測(cè)定對(duì)預(yù)期抗體產(chǎn)生表現(xiàn)為陽(yáng)性的孔，以確定存在一個(gè)還 是多個(gè)不同的克隆。如果存在一個(gè)以上的克隆，可將細(xì)胞重新克隆 并i咅養(yǎng)，以確^f呆〗又有單個(gè)細(xì)力包形成可產(chǎn)生預(yù)期^i體的克隆。具有單
個(gè)明顯克隆的陽(yáng)性孔通常重新克隆并重新測(cè)試，以確{呆正在4企測(cè)并 在生成〗又一個(gè)單克隆^t體。
隨后將確定能生成本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤以較大量在 恰當(dāng)培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，例如DMEM或RPMI-1640。作為^^4氣， 該雜交瘤細(xì)月包可在動(dòng)物體內(nèi)4乍為腹7jc瘤i咅養(yǎng)。
經(jīng)過(guò)充分培養(yǎng)而產(chǎn)生預(yù)期單克隆抗體后，將含單克隆抗體(或 腹水)的培養(yǎng)基與這些細(xì)胞分離，并提純其中存在的單克隆抗體。 典型i也，可通過(guò);疑月交電泳、透4斤、利用蛋白A或蛋白G-S印harose 的層析，或者連接于固態(tài)底物如瓊脂糖或瓊脂糖凝膠珠子的抗小鼠 Ig而實(shí)5見(jiàn)純^匕(所有這些均在例:^ Antibody Purification Handbook, Amersham Biosciences, publication No. 18-1037-46， Edition AC中4苗 述，其所披露的內(nèi)容均通過(guò)引用結(jié)合于此)。通常利用低pH緩沖液 (pH3.0或更低的甘氨酸或醋酸緩沖液)，通過(guò)立即中和含抗體的組 分而從蛋白A或蛋白G的柱洗脫所結(jié)合的抗體。收集這些組分、 透析并4姿需要進(jìn)4于濃縮。在優(yōu)選的實(shí)施例中，將對(duì)結(jié)合存在于NK細(xì)胞受體上的抗原決 定基的一種抗體進(jìn)4亍編碼的DNA ,人雜交瘤中分離出來(lái)、置于恰當(dāng) 的表達(dá)載體中用于轉(zhuǎn)染入'除當(dāng)?shù)乃拗髦小ｋS后該宿主用于重組生成 該抗體、其變異體、其活性片段或包含該抗體的抗原識(shí)別部分的人 源化的或嵌合的抗體。優(yōu)選地，用于該實(shí)施例中的DNA編碼一種 抗體，該抗體識(shí)別一種存在于一種或多種人NK受體上的抗原決定 基，特別是在來(lái)自4艮大一部分NK-LDGL患者的LGL細(xì)胞中顯著存 在的NK受體上的抗原決定基。
對(duì)本發(fā)明該單克隆抗體進(jìn)行編碼的DNA可利用常規(guī)步驟容易 地進(jìn)行分離并測(cè)序(例如，通過(guò)利用能夠特異地結(jié)合編碼小鼠抗體 重鏈和輕鏈的那些基因的寡核苷酸探針)。 一旦分離出，可將該DNA 置入表達(dá)載體中，然后將該載體轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞例如E.coli細(xì)胞、 猿猴COS細(xì)胞、中華倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞中(這 些細(xì)胞在其他情況下并不產(chǎn)生免疫5求蛋白)，以實(shí)現(xiàn)單克隆抗體在 重組的宿主細(xì)月包內(nèi)的合成。對(duì)該抗體編碼的DNA在細(xì)菌內(nèi)的重組 表達(dá)在本領(lǐng)域中已經(jīng)為人熟知(參見(jiàn)，例如Skerm et al. (1993) Cmr. Op. Immunol. 5:526; 以及 Pluckthun (1992) Immunol. Revs. 130:151)?？贵w還可通過(guò)篩選免疫球蛋白的組合文庫(kù)而產(chǎn)生，如在 Wald et al. (1989) Nature 341:544中所披露的。
在一個(gè)凈爭(zhēng)定的實(shí)施例中，4元體與以下一種單克隆抗體結(jié)合本質(zhì) 上相同的表位或抗原決定基，這些單克隆抗體有EB6b、 GL183、 FES 172、 Z27、 Q66、 XA185、 Z270 (CNCM Ref.3549)、 Z199 (Beckman Coulter, AZ20(CNCM Ref. 1-2576)、 Bab281 、 KL247或產(chǎn)品Ref. 195314 (R&D Systems, Minneapolis)或F278 (參見(jiàn)，例3口 Zambello et al. (2003) Blood 102:1797)或者以下單克隆抗體中的一種1D11、 BAT221、 ECM217和ON72 (參見(jiàn)，例如Groh et al. (2003) PANS 100:9452-57; Andre et al. (2004) Eur. J. Immunol. 34:1-11,前述三個(gè).膝日v -王、邱r j務(wù)叼xa ix "川殆？ 丁化；。術(shù)語(yǔ)與單克隆
抗體X "結(jié)合本質(zhì)上相同的表位或抗原決定基"的含意為一種抗體
可以與x"竟?fàn)?，其中x是EB6b等。與所討i侖的單克隆抗體結(jié)合 本質(zhì)上相同的表位的 一種或多種抗體的鑒定，可利用多種實(shí) -驗(yàn)抗體 竟?fàn)幍拿庖邔W(xué)篩查試-瞼中的任何一種而容易地確定。這種測(cè)試在本 領(lǐng)域中是常規(guī)的(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利號(hào)5,660,827，它通過(guò)引用結(jié) 合于此)。應(yīng)該理解，實(shí)際上，為了鑒定出一種抗體與所討i侖的單 克隆抗體結(jié)合在相同或基本上相同的表位上并不要求確定該抗體 所結(jié)合的表位。
有不同的Ig同種型的情況，可采用簡(jiǎn)單的竟?fàn)帨y(cè)試，其中將對(duì)照(例 如GL183)和實(shí)-瞼抗體進(jìn)行混合(或預(yù)吸附)，并且應(yīng)用到含有帶 表位蛋白的一個(gè)樣品上，例如，在GL183的情況下為KIR2DS2。 基于ELISA、；故射免疫測(cè)試、Western印跡以及采用BIACORE (如 在實(shí)施例中描述的)的多種方案適用于這種簡(jiǎn)單竟?fàn)幍难芯?，并?在本4頁(yè)i或中為人熟知。
在某些實(shí)施例中，將對(duì)照抗體(例如GL183)與不同量的實(shí)-驗(yàn) 抗體(例如1:10或1:100)預(yù)混合一段時(shí)間，隨后加到含抗原(例 如KIR2DS2表位)的才羊品中。在其他實(shí)施例中，對(duì)照和不同量的 實(shí)驗(yàn)抗體可以在暴露于抗原樣品的過(guò)程中筒單混合。只要能夠區(qū)分 結(jié)合抗體與游離抗體(例如通過(guò)分離或洗滌才支術(shù)而清除非結(jié)合抗 體)以及區(qū)分對(duì)照抗體與實(shí)馬全抗體(例如通過(guò)利用種屬特異或同種 型特異的第二抗體，或通過(guò)用可檢測(cè)性標(biāo)記物特異標(biāo)記的對(duì)照抗 體)，即能夠確定該實(shí)-驗(yàn)抗體是否減少對(duì)照抗體與抗原的結(jié)合，表 明該實(shí)—瞼抗體與對(duì)照抗體識(shí)別基本上相同的表位。在不存在完全無(wú) 關(guān)抗體的情況下，(標(biāo)記的)對(duì)照抗體的結(jié)合將為對(duì)照高值。對(duì)照 低值是通過(guò)將該標(biāo)記的對(duì)照抗體(例如GL183)與完全相同型別的未標(biāo)記抗體(例如GL183) —起孵育而獲得，其中將出現(xiàn)竟?fàn)幉p 少標(biāo)記抗體的結(jié)合。在一個(gè)實(shí)-瞼測(cè)試中，在實(shí)—驗(yàn)抗體存在的情況下， 標(biāo)記抗體反應(yīng)性的顯著降〗氐可以指示那種識(shí)別相同表位的實(shí)— 驗(yàn)抗 體，即，與該標(biāo)記的對(duì)照抗體發(fā)生"交叉反應(yīng)"的那種抗體。在約 1:10和約1:100之間的任何對(duì)照實(shí)-瞼抗體比率下，將標(biāo)記的對(duì)照與 每一種抗原的結(jié)合降低至少50%或優(yōu)選70%的任何實(shí)-驗(yàn)抗體均認(rèn) 為它是與對(duì)照結(jié)合基本相同的表位或抗原決定基的抗體。優(yōu)選地， 這種實(shí)驗(yàn)抗體可將對(duì)照與抗原的結(jié)合降低至少90%。
在一個(gè)實(shí)施例中，可通過(guò)流式細(xì)胞^f義測(cè)試來(lái)評(píng)估竟?fàn)帯Ｊ紫葘?含給定激活性受體的細(xì)胞與已知特異地結(jié)合至該受體(例如，表達(dá) KIR2DL2的NK纟田月包，和GL183抗體)的對(duì)照抗體一起孵育，隨 后與已經(jīng)標(biāo)記了例如熒光染料或生物素的實(shí)-驗(yàn)抗體一起孵育。如果 通過(guò)與飽和量的對(duì)照抗體預(yù)孵育獲得的結(jié)合是該抗體未與對(duì)照預(yù) 孵育所獲4尋結(jié)合(熒光均4直)的80%、 4尤選50%、 40%或更少，則 稱該實(shí)一驗(yàn)抗體與該對(duì)照竟?fàn)?。作為一K戈，如果通過(guò)將細(xì)力包上的標(biāo)記 對(duì)照(通過(guò)熒光染料或生物素)與飽和量的待測(cè)抗體預(yù)孵育獲得的 結(jié)合是未與該抗體預(yù)孵育所獲得結(jié)合的80%、優(yōu)選50%、 40%或更 少，則稱實(shí)-驗(yàn)抗體與該對(duì)照竟?fàn)帯?br> 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)例中，可采用筒單的竟?fàn)帨y(cè)試，其中實(shí)驗(yàn)抗體 #皮預(yù)吸收，并在々包和濃度下施加到一個(gè)上面固定有用于結(jié)合抗體 (例如KIR2D2S蛋白或其含表位部分，已知該抗體可由GL183結(jié) 合)的底物的表面上。該表面優(yōu)選是一個(gè)BIACORE芯片。隨后使 該對(duì)照抗體(例如GL183 )在底物々包和濃度下與該表面4妻觸，并測(cè) 定該底物表面與該對(duì)照抗體的結(jié)合。將該對(duì)照抗體的這種結(jié)合，與 該對(duì)照抗體在沒(méi)有實(shí)-驗(yàn)抗體時(shí)對(duì)含底物表面的結(jié)合相比較。在一個(gè) 實(shí)驗(yàn)測(cè)試中，在一種存在實(shí)驗(yàn)抗體的情況下，含底物表面與該對(duì)照 抗體的結(jié)合顯著減少，預(yù)示著識(shí)別相同表位的實(shí)-驗(yàn)抗體，即，與該對(duì)照抗體"交叉反應(yīng)"的那種抗體?？蓪?duì)照抗體與含抗原底物的
結(jié)合降低至少30%或優(yōu)選40%的任何實(shí)一瞼抗體認(rèn)為是與該對(duì)照抗 體結(jié)合基本相同表位或抗原決定基的抗體。優(yōu)選地，這種實(shí)驗(yàn)抗體 可^夸該^"照纟元體與底物的結(jié)合降^f氐至少50%。應(yīng)該3里解，7于照和實(shí) 驗(yàn)抗體的次序可以顛倒，即首先將對(duì)照抗體結(jié)合于該表面，隨后使 實(shí)驗(yàn)抗體與該表面相接觸。優(yōu)選地，首先將對(duì)該底物抗原具有較高 親和力的抗體結(jié)合于含底物的表面，因?yàn)轭A(yù)期觀察到對(duì)于第二抗體 結(jié)合的降^氐(布l定該抗體是交叉反應(yīng)的)幅度4交大。在實(shí)施例部分 以及Saunal et al. (1995) J. Immunol. Meth 183:33-41中提供這種測(cè)試 的其4也實(shí)例，它們4皮露的內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合于it匕。
在一個(gè)實(shí)施例中，可以獲4尋能夠與NK細(xì)月包表面上多種受體相 互作用的多種抗體，特別是在確保這些抗體不表現(xiàn)出與其他非相關(guān) 蛋白的過(guò)度交叉反應(yīng)性的情況下，其中這些受體，例如兩種或多種 NK細(xì)月包受體3口 KIR受體(KIR2DL1、 KIR2DS1 、 KIR2DL2 、 KIR2DL3、 KIR2DS2、 KIR2DS4、 KIR3DL1、 KIR3DS1或KIR3DL2, 或任何包括這些受體中一種或多種的組合)或NKG2受體(NKG2A、 NKG2C、 NKG2D、 NKG2E、 NKG2F或4壬4可包4舌這些受體中一種 或多種的組合)以及任何其他NK細(xì)胞受體的任何組合。優(yōu)選地， 人人NK細(xì)月包受體識(shí)別表位(例如KIR2DL2表位)的多種單克隆抗 體將與相當(dāng)百分比的NK細(xì)胞(特別是來(lái)自患者的NK細(xì)胞)上存 在的表位發(fā)生交叉反應(yīng)，但不與CD3+T細(xì)胞、CD20+B細(xì)胞或其他 免疫或非免疫細(xì)胞發(fā)生顯著性反應(yīng)。在多個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該抗 體還與單沖亥細(xì)月包、4立細(xì)"包、血小斧反和紅細(xì)月包之間不反應(yīng)。在多個(gè)^f尤 選的實(shí)施例中，這些抗體將〗又識(shí)別單種細(xì)胞受體，/人而盡可能將治 療性(例如細(xì)胞毒性)抗體的效應(yīng)限制于與病癥相關(guān)的過(guò)度增生性 細(xì)胞。一旦鑒定出可特異識(shí)別NK細(xì)胞(優(yōu)選人NK細(xì)胞)上一個(gè)或 可能少數(shù)受體的一種抗體，即可試驗(yàn)其結(jié)合取自免疫增生性病癥患 者的免疫細(xì)胞(優(yōu)選NK細(xì)胞)的能力。
典型情況下，這些抗體可以在試 -瞼其結(jié)合耳又自免疫增生性病癥 患者NK細(xì)胞的能力的一種免疫測(cè)試中得到證實(shí)。例如，外周血淋 巴細(xì)胞(PBL)取自多個(gè)患者，并利用針對(duì)NK細(xì)胞上存在的受體 的抗體例如CD56 乂人PBL富集NK細(xì)月包(參見(jiàn)，例如Zambello et al. (2003) Blood 102:1297)。隨后，利用本領(lǐng)域中才支術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn) 方法來(lái)評(píng)估一個(gè)給定抗體結(jié)合該NK細(xì)月包的能力。在一個(gè)實(shí)施例中， 將每一個(gè)樣品的細(xì)胞與不同抗體單獨(dú)孵育，其中這些不同的抗體各 自特異于某一種NK細(xì)胞受體。被發(fā)現(xiàn)結(jié)合來(lái)自顯著百分比患者(例 如5%、 10%、 20%、 30%、 40%、 50%或更多)的4交大比例(侈'B口 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%或更多)的NK纟田月包的 抗體適用于本發(fā)明，它們可在本文所述NK受體狀態(tài)分型步艱《中用 作i貪斷目的，或者用于本文所述的治療方法中，例如用于書f生化而 形成適于人類的細(xì)胞毒性抗體。為了評(píng)估這些抗體與細(xì)胞的結(jié)合， 可將這些抗體進(jìn)4亍直才妾或間才妄標(biāo)i己。當(dāng)間4妾標(biāo)i己時(shí)，通常加入第二 種凈皮標(biāo)記的抗體。隨后可利用例如細(xì)月包熒光測(cè)定測(cè)試(例如 FACScan )(參見(jiàn)，例如Zambello et al. (2003) Blood 102:1297 )或任 何其他標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)^r測(cè)該抗體與細(xì)胞的結(jié)合。應(yīng)該理解，還可類似 地用T細(xì)胞與T細(xì)胞受體來(lái)實(shí)施該過(guò)程；這可以利用來(lái)自患有一種 免疫增生性病癥(例如T細(xì)胞LDGL、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等)的患者 的T細(xì)胞來(lái)實(shí)施，并且該T細(xì)月包可以是CD3+，可4壬選是CD4+CD28-或CD8+。
子貞期一個(gè)小凄t目(例3口1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20)的抗體就足以沖企測(cè)并靶 向患有i者如NK-LDGL、自身免疫性或炎癥性疾病等病癥的絕大多數(shù)患者的絕大多數(shù)的過(guò)度增生的細(xì)胞(例如NK)。因此，它將有可 能4文集(assemble)多個(gè)小纟且(small panels)的i貪斷性(直4妄或間 接標(biāo)記的)和治療性(適于人類，任選毒性的)抗體，它們將總體 上足以用本發(fā)明的方法來(lái)分型并治療幾乎所有的患者(利用單種抗 體或少凄t抗體的組合)。這些組最終可制成試劑盒而供4吏用，優(yōu)選 配上使用這些抗體的說(shuō)明。
因此，根據(jù)本發(fā)明生成的這些抗體組將包括那些特異于一種或 少凄t幾種NK受體類型的抗體。此外，在某些實(shí)施例中，將制備針 對(duì)一個(gè)^會(huì)定受體的多種抗體，以確保在所有患者體內(nèi)最大限度地靭i 向于表達(dá)受體的細(xì)胞，并且還確保在最大數(shù)量的患者體內(nèi)有效地耙 向多態(tài)受體。
在其^也實(shí)施例中，應(yīng)該理解，用于本發(fā)明的it斷性(直^妾或間 才妄標(biāo)記)和治療性(適于人類，可選的為毒性的)實(shí)施例中的一種 抗體有可能識(shí)別多種NK受體(例如2、 3、 4或更多NK受體)。例 如該抗體可識(shí)別多種NCR或KIR (例如KIR2DL1、 KIR2DL2/3 等)，或多種KIR活化性受體或KIR抑制性受體。而且，將有可能 利用多種抗體(例如至少2、 3、 4等)，而至少一種識(shí)別多種NK 受體。在PCT 7>開號(hào)WO 2005/0031172 (Innate Pharma )中才是供了 識(shí)別多種NK受體的抗體的多個(gè)實(shí)例，它4皮露的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用 結(jié)合于此。
制備適用于人類的抗體
一旦(通常在非人動(dòng)物中)生成那些可特異結(jié)合通常存在于 NK-LDGL患者的LGL (例如NK )細(xì)胞上的一種或多種NK受體 的單克隆抗體，通常將對(duì)這些抗體加以修飾以4吏其適于人體內(nèi)的治 療應(yīng)用。例如，其可利用本領(lǐng)域中熟知的方法對(duì)它們進(jìn)行人源化、 嵌合化或從人抗體文庫(kù)中對(duì)它們進(jìn)行選擇。這種適用于人類的抗體可直接用于本發(fā)明的治療方法中，或者如本文中所述可進(jìn)一步衍生 為細(xì)月包毒性抗體，用于這些方法中。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，產(chǎn)生本發(fā)明抗體例如GL183樣抗體的 一個(gè)雜交瘤的DNA可在插入表達(dá)載體前進(jìn)行》務(wù)飾，例如通過(guò)將用 于編碼人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列用同源性非人序列加以取 (例如Morrison et al. (1984) /MJVS 81:6851 )或通過(guò)將非免疫J求蛋 白多肽的全部或部分編碼序列共價(jià)地連接于免疫球蛋白編碼序列。 以該方式，可制備"嵌合，，或"雜合，，抗體，它們具有初始抗體 的結(jié)合特異性的抗體。典型地，這種非免疫球蛋白多肽可被取代以 用于本發(fā)明的4元體的恒定區(qū)。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體是人源化的。才艮據(jù) 本發(fā)明的"人源化，，形式的抗體是特異性嵌合的免疫球蛋白、免疫 球蛋白鏈或其片段(例如Fv、 Fab、 Fab， 、 F(ab，)2或其他結(jié)合抗原 的抗體亞序列)，它們含有來(lái)自鼠或其他非人免疫J求蛋白的最小序 列。對(duì)于絕大多數(shù)來(lái)說(shuō)，人源化抗體是人免疫球蛋白(接受性抗體)， 其中該4妄受性抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基用初始抗體(供者 抗體)的CDR中的殘基取代，同時(shí)保持初始抗體的所希望的特異 性、親和力和能力。在某些情況下，人免疫3求蛋白的Fv片匡架殘基 可由相應(yīng)的非人殘基而取代。此外，人源化抗體可包括既不存在于 接受性抗體也不存在于引入的CDR或框架序列中的殘基。進(jìn)行這 些修飾是為了進(jìn)一步提煉并優(yōu)化抗體性能。通常，人源化受體將包 括至少一個(gè)，典型地兩個(gè)可變區(qū)的基本上全部區(qū)域，其中全部或者 基本上全部CDR區(qū)域?qū)?yīng)于初始抗體的CDR區(qū)i或，而全部或基本 上全部的FR區(qū)域是人免疫J求蛋白通用序列的FR區(qū)域。進(jìn)一步詳 纟田4苗述可參見(jiàn)Jones et al. (1986) Nature 321:522; Reichmann et al. (1988) Nature 332:323' Vehoeyen et al. (1988) Science 239:1534(1988); Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593;每個(gè)的全部?jī)?nèi)容均 通過(guò)引用結(jié)合于此。
選擇用于制備人源化抗體的人輕鏈和重鏈可變區(qū)，對(duì)于降低抗 原性非常重要。才艮據(jù)所謂的"最佳適配"法，本發(fā)明的一個(gè)抗體的 可變區(qū)的序列可對(duì)照已知人可變區(qū)序列的整個(gè)文庫(kù)而篩選。隨后，
(FR) (Sims et al. (1993) J. Immun.， 151:2296; Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901 )。另 一種方法采用來(lái)自具有特殊亞組輕 鏈或重鏈的所有人抗體通用序列的特殊框架區(qū)。該相同的框架區(qū)可 用于幾種不同的人源化抗體(Carter et al. (1992) PNAS 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol. 51:1993 )。
進(jìn)一步重要的是將抗體人源化的同時(shí)保持其對(duì)一種或多種NK 細(xì)胞受體優(yōu)選人受體的高親和力以及其他有利的生物屬性。為了實(shí) 現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)，才艮據(jù)一個(gè)優(yōu)選的方法，可通過(guò)利用親4戈和人源化序列
制備人源化抗體。通常三維免疫球蛋白模型可供使用，這對(duì)本領(lǐng)域 中的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟悉的。計(jì)算機(jī)程序也可供使用，它們展 示并顯示選定的候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)。檢查這 些顯示結(jié)果能夠分析候選免疫球蛋白序列在發(fā)揮作用過(guò)程中殘基 的可能作用，即測(cè)試那些影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原能力的殘 基。以這種方式，可/人/^H人和引入的序列中選才奪FR殘基并力口以合 并，/人而獲得預(yù)期的抗體特性，例如對(duì)耙抗原纟是高的親和性。總之， CDR殘基直接且最大程度地涉及到影響抗原的結(jié)合。
還可以按照不同的其他技術(shù)制備人抗體，例如通過(guò)利用其他已
中，將人重鏈和輕鏈位點(diǎn)的單元引入具有內(nèi)源性重鏈和輕鏈座位的 草巴向石皮壞的小鼠或其^f也動(dòng)物中(參見(jiàn)，例如Jakobovitz et al. (1993)Nature 362:255; Green et al. (1994) Nature Genet. 7:13; Lonberg et al. (1994) Nature 368:856; Taylor et al. (1994) Int. Immun. 6:579，它們?nèi)?br> 部4皮露的內(nèi)容均通過(guò)引用結(jié)合于此)。可替^地，人抗體可通過(guò)基 因或染色體轉(zhuǎn)染法或通過(guò)利用噬菌體展示法篩選抗體表達(dá)譜而構(gòu) 建。在該技術(shù)中，將抗體可變區(qū)基因克隆入絲狀噬菌體主要或次要 包膜蛋白的基因中，并以功能性抗體片段展示于該噬菌體顆粒的表 面上。因?yàn)樵摻z狀顆粒包含一個(gè)單《連噬菌體基因組拷貝，基于抗體 功能屬性的篩選可以篩選編碼表現(xiàn)這些屬性的抗體的基因。以這種 方式，噬菌體才莫擬了 B細(xì)胞的某些屬性(參見(jiàn)，例如Johnson etal. (1993) Curr Op Struct Biol 3:5564-571; MaCafferty et al. (1990) Nature 348:552-553,它們4皮露的全部?jī)?nèi)容均通過(guò)引用結(jié)合于此)。 人抗體還可由體外激活的B細(xì)月包產(chǎn)生(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利號(hào) 5,567,610和5,229,275 ，它們4皮露的全部?jī)?nèi)容均通過(guò)引用結(jié)合于此)。
在一個(gè)實(shí)施例中，"人源化"單克隆抗體通過(guò)利用諸如 XenoMouse (Abgenix, Fremont, CA)的動(dòng)4勿進(jìn)4亍免疫4妻種而命J備。 XenoMouse是一種鼠宿主，它的免疫^(guò)求蛋白基因由功能性人免疫球 蛋白基因取代。因此，由該小鼠或從該小鼠的B細(xì)胞制備的雜交瘤 中產(chǎn)生的抗體已經(jīng)一皮人源化。XenoMouse在美國(guó)專利號(hào)6,162,963 中已描述，它的全部?jī)?nèi)容均通過(guò)引用結(jié)合于此。利用 HuMAb-MouseTM ( Medarex )可實(shí)玉見(jiàn)一種類々乂的方法。
本發(fā)明的抗體還可衍生化為"嵌合"抗體(免疫球蛋白)，其 中重鏈和/或輕鏈的一部分等同于或同源于初始抗體中的相應(yīng)序列， 而該鏈?zhǔn)Ｓ嗖糠值韧诨蛲从趤?lái)自另 一個(gè)種屬或?qū)儆诹?一個(gè)抗 體類別或亞類的抗體的相應(yīng)序列，以及這些抗體的片^殳中的相應(yīng)序 列，只要它們表現(xiàn)出所需的生物學(xué)活性(參見(jiàn)，例如Morrison et al. (1984) PNAS 81:6851; U.S. Pat. No. 4,816,567 )。盡管未衍化(例如"棵"抗體)或未修飾形式的抗體，特別是
IgGl或IgG3型，預(yù)期能抑制過(guò)度增生NK細(xì)力包的增生，或?qū)^(guò)度 增生或不需要的NK細(xì)胞(例如在NK-LDGL或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患 者中的那些細(xì)胞)有細(xì)胞毒性作用，它還有可能制備衍生化抗體使 其具有細(xì)月包毒性。在一個(gè)實(shí)施例中， 一旦NK細(xì)月包受體特異性抗體 被分離并使之適用于人類，它們將被衍生化以便對(duì)細(xì)胞有毒。以這 種方式，給予患者這種抗體將導(dǎo)致抗體與過(guò)度增生NK細(xì)胞的相對(duì) 特異地結(jié)合，從而直4妾?dú)缁蛞种婆c該病癥相關(guān)的細(xì)胞。由于治療 的特異性，機(jī)體的其他非過(guò)度增生細(xì)胞，包括大多數(shù)其他NK細(xì)胞， 以及免疫系統(tǒng)的其他細(xì)胞，將最小程度受該治療的影響。
大量毒性部分(moiety)或方案中的《壬^f可一種均可用來(lái)產(chǎn)生這 種抗體。在某些優(yōu)選的實(shí)施例中，抗體可用力文射性同位素或其他毒 性化合物直接進(jìn)行衍生化。在這種情況下，可將標(biāo)記的單特異性抗 體注射入患者體內(nèi)，在患者體內(nèi)可以結(jié)合并殺滅表達(dá)耙抗原的細(xì) 胞，而未結(jié)合抗體則簡(jiǎn)單地從人體內(nèi)清除。還可以采用間接方法， 例如"親和力增強(qiáng)系統(tǒng)"(AES)(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利號(hào)5,256,395; Barbet et al. (1999) Cancer Biother Radiopharm 14:153-155;它披露 的全部?jī)?nèi)容均通過(guò)引用結(jié)合于此)。該特殊途徑涉及到使用放射標(biāo) 記的半抗原以及既識(shí)別NK細(xì)胞受體又識(shí)別力文射性半抗原的抗體。 在這種情況下，首先將該抗體注射入患者體內(nèi)，使其結(jié)合靶細(xì)胞， 隨后一旦允許未結(jié)合抗體從血流清除，則給予放射標(biāo)記的半抗原。 該半抗原結(jié)合過(guò)度增生的細(xì)胞或不需要的細(xì)胞(例如NK或T細(xì)胞) 上的抗體-抗原復(fù)合物，,人而將其殺滅，而未結(jié)合的半抗原乂人體內(nèi)清 除。
具有細(xì)力包毒性或細(xì)力包抑制效應(yīng)的4壬4可類型的部分(moiety)均 可與本發(fā)明的抗體聯(lián)合使用，以抑制或殺滅特異性表達(dá)NK受體的 細(xì)胞，包括;改射性同位素、毒性蛋白、毒性小分子例如藥物、毒素、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、激素拮抗劑、酶、寡核苷酸、酶抑制劑、治療 用》文射性核素、血管生成抑制劑、化療藥物、長(zhǎng)春花生物石咸、蒽環(huán)
類抗生素、表葉霉素、紫杉烷、抗代謝藥、烷化劑、抗生素、COX-2 抑制劑、SN-38、抗有絲分裂物質(zhì)、抗血管生成和細(xì)胞凋亡藥，特 別是阿霉素、曱氨蝶呤、紫杉醇、CPT-ll、喜樹堿、氮芥、吉西他 濱、烷基^黃S臾鹽、亞硝基脲、三氮烯、葉酸類似物、嘧，定類似物、 嘌呤類似物、鉑配位絡(luò)合物、 -假單胞菌外毒素、蓖麻毒蛋白、相思 豆毒素、5-氟尿香、核糖核酸酶(RNase) 、 DNase I 、葡萄J求菌腸 毒素A、美洲商陸(pokeweed):阮病毒蛋白、白初t毒素、白口侯毒素、 假單胞菌外毒素和假單胞菌內(nèi)毒素等(參見(jiàn)，例如Remington' s Pharmacertical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995》 Goodman and Gilman，s The Pharmacological Basis of Therapeutics (McGraw Hill, 2001); Pastan et al. (1986) Cell 47:641; Goldenberg (1994) Cancer Journal for Clinicians 44:43;美國(guó)專矛J號(hào)6,077,499;它 們4皮露的全部?jī)?nèi)容均通過(guò)引用結(jié)合于此)。應(yīng)該理解，毒素可以為 動(dòng)物、植物、真菌或微生物來(lái)源，或者可由化學(xué)合成而從頭生成。
利用大量現(xiàn)存方法中任何一種，可將毒素或其他化合物直4妻或 間4妻連接于抗體。例如，利用交聯(lián)劑如N-琥珀酰-3-2-聯(lián)石危基吡啶-丙酸鹽(SPDP)通過(guò)形成二石克4建，或通過(guò)抗體Fc區(qū)中的碳水化物 部分，可將一種試劑連接在還原的抗體組分的4交鏈區(qū)(參見(jiàn)，例如 see, e.g., Yu et al. (1994) Int. J. Cancer 56: 244; Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking (CRC Press 1991); Upeslacis et al" "Modification of Antibodies by Chemical Methods," in Monoclonal antibodies: principles and applications, Birch et al. (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995》 Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in Monoclonal antibodies: Production, engineering and clinical application, Ritter et al. (eds.)， pages 60-84 (Cambridge University Press 1995), Cattel et al. (1989) Chemistry today 7:51-58, Delprino et al. (1993) J. Pharm. Sci 82:699-704; Arpicco et al. (1997) BioconjugateChemistry 8:3; Reisfeld et al. (1989) Antihody, Immunicon. Radiopharrn. 2:217; 每一篇文獻(xiàn)4皮露的全部?jī)?nèi)容均通過(guò)引用結(jié)合 于此)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，用放射性同位素如1-131將抗體衍生 化?？刹捎枚喾N恰當(dāng)?shù)姆派湫酝凰刂械娜魏我环N，包括但不限于 銦-111、鐠-171、鉍-212、鉍畫213、石艾-211、銅-62、銅隱64、銅-67、 ^乙-90、石典-125、石典-131、磷-32、磷-33、鈧-47、 4艮-111、鎵-67、鐠 -142、釤-153、鋱-161、鏑-166、鈥-166、錸陽(yáng)186、錸-188、錸畫189、 4§-212、 4雷-223、鄰-225、 4失-59、石西-75、石申-77、 4愁-89、 4目-99、銠 -105、 4巴-109、 4普-143、 4叵-149、斜-169、銀畫194、金-198、金一199 和鉛-211?？傊?，放射性核素優(yōu)選具有20-6000 keV之間的衰變能， 對(duì)Auger發(fā)射體優(yōu)選在60-200 keV之間，對(duì)(3發(fā)射體在100-2500 keV之間，oc發(fā)射體在4000-6000 keV之間。還優(yōu)選那些隨a并立子 的生成而充分衰變的》丈射性核素。
在選4奪本發(fā)明的方法中包括的細(xì)胞毒性部分時(shí)，所希望的是， 確4呆該部分不表現(xiàn)出顯著的針對(duì)維持生命的正常組織的體內(nèi)副作 用，這些正常組織例如， 一種或多種選自心臟、腎、腦、肝、骨髓、 結(jié)腸、乳腺、前列腺、胸腺、膽嚢、肺、腎上腺、肌肉、神經(jīng)纖維、 胰腺、皮膚或其他維持生命的人體內(nèi)器官或組織的組織。如在此使 用的，術(shù)語(yǔ)"顯著的副作用"是指一種抗體、配體或抗體軛合物在 體內(nèi)1"吏用時(shí)，將〗又產(chǎn)生可忽略的或臨床可處理的副作用，例如那些 在化療過(guò)程中常常遇到的副作用。
檢測(cè)細(xì)胞毒性抗體的結(jié)合和細(xì)胞毒活性
一旦獲得了抗體，即已知特異地結(jié)合至免疫增生性病癥的患者 細(xì)胞上的NK細(xì)月包受體、且已經(jīng)使其適用于人體、并可任選地經(jīng)過(guò) 衍生而包括毒性部分的抗體，通常要評(píng)估它們與把細(xì)胞相互作用、影響其活性和/或殺滅靶細(xì)胞的能力。通常，上述用于沖企測(cè)抗體與
NK細(xì)胞或NK細(xì)胞受體結(jié)合的測(cè)試，包括基于竟?fàn)幍臏y(cè)試、ELISA、 》丈射免疫測(cè)試、Western印跡、基于BIACORE的測(cè)試以及流式細(xì) 胞儀測(cè)試，可同樣用于檢測(cè)人源化的、嵌合的或其他適于人類的、 NK細(xì)力包抗體(例如細(xì)胞毒性抗體)與它們耙細(xì)力包的相互作用。典 型地，耙細(xì)胞將是取患有一種自免疫增生性病癥的患者的NK細(xì)胞。
在這些測(cè)試中，將人源化或適于人類的治療性(例如細(xì)胞毒性) 抗體結(jié)合靶細(xì)胞或人NK細(xì)胞受體的能力與對(duì)照蛋白，例如針對(duì)結(jié) 構(gòu)上不相關(guān)抗原而產(chǎn)生的 一種抗體，或者非Ig肽或蛋白結(jié)合相同耙 標(biāo)的能力進(jìn)行比較。利用任何恰當(dāng)測(cè)試，相對(duì)于對(duì)照蛋白，如果結(jié) 合輩巴細(xì)胞或NK細(xì)胞受體的抗體或片段的親和力增高25%、 50%、 100%、 200%、 1000%或更多，則稱之為"特異地結(jié)合于"靶標(biāo)或 與該輩巴標(biāo)"特異性相互作用'，，并優(yōu)選用于以下所述的治療方法中。
能力。在一個(gè)實(shí)施例中，將表達(dá)一個(gè)或多個(gè)相關(guān)受體的人NK細(xì)胞， 例如取自NK-LDGL患者的LGL或NK細(xì)月包，置入多個(gè)孔4反(例如 96孔4反)內(nèi)并暴露于不同量的相關(guān)抗體。通過(guò)加入活性染料，即， 可由完整纟田月包吸4欠的染泮牛，侈'H口 AlamarBlue(BioSource International, Camarillo, CA)并洗滌以去除過(guò)量染^K存活細(xì)力包的lt量可^f昔助于 光學(xué)密度而測(cè)定(抗體殺滅的細(xì)胞越多，則光學(xué)密度越低)。(參 見(jiàn)，例如Connolly et al. (2001) J Pharm Exp Ther 298:25-33 ，它所披 露的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用結(jié)合于此)?？赏瑯邮褂萌魏纹渌‘?dāng)?shù)捏w 外細(xì)胞毒性測(cè)試、測(cè)定細(xì)胞增生或生存的測(cè)試或#企測(cè)NK細(xì)胞活性 的測(cè)試，可同樣使用體內(nèi)測(cè)試，例如將抗體給予含表達(dá)相關(guān)受體的 人NK細(xì)胞的動(dòng)物才莫型如小鼠，并檢測(cè)抗體給藥對(duì)人NK細(xì)胞的生 存或活性隨時(shí)間變化的效應(yīng)。而且，在該抗體與非人受體，如靈長(zhǎng) 類NK細(xì)胞受體，發(fā)生交叉反應(yīng)的情況下，可以在體外或體內(nèi)使用這些治療性抗體，以評(píng)估該抗體結(jié)合和/或殺滅來(lái)自表達(dá)相關(guān)受體的
動(dòng)物的NK細(xì)"包的能力。
本發(fā)明的方法中可使用能在體外或體內(nèi)可檢測(cè)地減慢、終止或 逆轉(zhuǎn)過(guò)度增生NK細(xì)胞的增生的任何一種抗體，優(yōu)選一種適于人類 的抗體，例如細(xì)胞毒性抗體。優(yōu)選地，該抗體能夠終止增生(例如， 阻止體外或體內(nèi)表達(dá)革巴NK細(xì)胞受體的NK細(xì)胞數(shù)量增加)，最優(yōu) 選地，該抗體可逆轉(zhuǎn)增生，引起這些細(xì)胞總數(shù)下降。在某些實(shí)施例 中，抗體能夠引起表達(dá)靶受體的NK細(xì)胞的數(shù)量下降10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%。
因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種用于制備適于 治療免疫增生病癥的抗體的方法，該方法包括下列步驟a)提供 多種特異地結(jié)合存在于NK細(xì)胞表面的受體的抗體；b)檢測(cè)這些 抗體結(jié)合NK細(xì)胞的能力，這些NK細(xì)胞取自一個(gè)或多個(gè)患 NK-LDGL的患者；c) 乂人所述多種抗體中選才奪可結(jié)合相當(dāng)凄t量的:f又 自患有免疫增生性病癥的一個(gè)或多個(gè)所述患者的NK細(xì)月包的一種抗 體；并且d)使所述抗體適于對(duì)人類給藥。在一個(gè)實(shí)施例中，該方 法進(jìn)一步包括一個(gè)步-驟，其中將細(xì)胞毒性劑連4妻于所述抗體的。在 這些方法中，"相當(dāng)凄t量"可表示例如30%、 40%、 50%,優(yōu)選60%、 70%、 80%、 90%或一個(gè)更高百分比的細(xì)月包。
本發(fā)明還^是供一種相關(guān)方法，包括下列步驟a)^是供一種特 異地結(jié)合NK細(xì)力包的抗體，這些NK細(xì)力包耳又自患有NK-LDGL的一 個(gè)或多個(gè)患者；b) ^r測(cè)該抗體結(jié)合取自患有NK-LDGL的一個(gè)或 多個(gè)患者的NK細(xì)胞的能力；并且c)如果該抗體結(jié)合取自一個(gè)或 多個(gè)該患者的相當(dāng)數(shù)量的NK細(xì)胞，則使該抗體適于對(duì)人類給藥。 在一個(gè)實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括一個(gè)步-驟，其中將細(xì)月包毒性劑 連接于該抗體。應(yīng)該理解，這些方法以及在本發(fā)明其他部分描述的方法，包括前一,殳中的方法，可利用除NK細(xì)月包之外的細(xì)月包例如T 細(xì)胞、LGL細(xì)胞而同樣實(shí)施，并用于治療除NK-LDGL之外的病癥 如T細(xì)胞LDGL或其他免疫增生性病癥。
應(yīng)該理解，可用同等的方法制備適于治療動(dòng)物或適于在動(dòng)物模 型中進(jìn)行試驗(yàn)的抗體。在該情況下，要確保這些抗體能特異性識(shí)別 來(lái)自相關(guān)動(dòng)物的NK細(xì)胞受體，并且在涉及NK或其他細(xì)胞克隆性 增生的動(dòng)物病癥中有優(yōu)勢(shì)。類似地，抗體將進(jìn)行#"飾以<更適合于在 該凈爭(zhēng)定動(dòng)物體內(nèi)*會(huì)藥。
才企測(cè)體內(nèi)炎癥的沖莫型
可在小鼠才莫型內(nèi)評(píng)估耗竭表達(dá)CD94/NKG2A和/或C的細(xì)胞對(duì) 于體內(nèi)炎癥的4元炎效應(yīng)?？笴D94/NKG2A和/或C (例如小鼠 CD94/NKG2A、 -C和-E輩巴向性兔mAb 20D5的肆毛竭性抗體)#:用 來(lái)耗竭小鼠體內(nèi)的特異性淋巴細(xì)胞群，例如在用作慢性炎癥的鼠模 型中。這些模型的例子包括膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)模型，這是 一種研究類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的體內(nèi)模型，或?qū)嶒?yàn)性自身免疫性腦脊髓 炎(EAE)，這是一種用作人多發(fā)性硬化癥的小鼠模型。在這些模 型中，可在炎癥發(fā)作前、發(fā)作過(guò)程中或發(fā)作后注射耗竭 CD94/NKG2A和-C細(xì)月包的mAb,而炎癥的減弱可通過(guò)本領(lǐng)域中已 知的技術(shù)加以評(píng)估，以測(cè)定這些模型中的炎癥強(qiáng)度(例如，生理性 或通過(guò)免疫組織化學(xué))。
用于治療方法的抗體纟會(huì)藥
利用本發(fā)明方法制備的抗體在治療增生性病癥特別是免疫增 生性病癥時(shí)特別有效?？傮w上，本發(fā)明方法可用來(lái)治療任何由于表 達(dá)一種或少數(shù)幾種NK細(xì)胞受體的任何細(xì)胞的存在或過(guò)量而引起的體的細(xì)胞而有效地得到治療。其他適用的病癥包括T細(xì)胞型LDGL、
惡性病癥，這些相關(guān)細(xì)胞包括T細(xì)胞，這些T細(xì)胞為CD3+，可任 選地為CD4+CD28—或CD8+。"免疫增生性病癥"是指任何病癥、 癥狀或疾病，其特4i在于(或引發(fā)自)過(guò)度或失控的炎癥，或炎癥 的任何方面，例如發(fā)紅、腫脹、發(fā)熱、疼痛等，并確切地包括炎癥 性疾病和自身免疫性病癥。炎癥性疾病包括變態(tài)反應(yīng)(包括過(guò)壽丈性 鼻炎/鼻竇炎)、皮膚過(guò)敏反應(yīng)如蕁麻滲、血管性水腫、特應(yīng)性皮炎、 食物過(guò)壽文、藥物過(guò)每丈、昆蟲過(guò)壽丈以及過(guò)壽丈性病癥，例如月巴大細(xì)月包增 生性哮喘、嗜喘，關(guān)節(jié)炎，包括骨關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和脊推關(guān) 節(jié)病，胃腸道炎癥、克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎、神經(jīng)炎性病癥以及 自身免疫性病癥。
"自身免疫，，病癥包括a壬^r病癥、癥一大或疾病，其中由于區(qū)分 自身和非自身能力下降或其他原因，免疫系統(tǒng)發(fā)起了抗自身細(xì)胞或 組織的反應(yīng)。自身免疫性病癥的例子包括橋本氏曱狀腺炎、惡性貧 血、艾迪生病、i型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、 皮肌炎、銀屑癬、干燥綜合征、紅斑狼瘡、脫髓鞘病、多發(fā)性硬化 癥、重癥肌無(wú)力、萊特爾氏綜合征、格雷夫斯氏病、多發(fā)性肌炎、格 -巴二氏綜合征、韋才各納肉芽腫病、乳糜瀉、結(jié)節(jié)性多動(dòng)月永炎、風(fēng)濕 性多肌病、顳動(dòng)脈炎、貝切特氏病、丘-施二氏綜合征、高安動(dòng)脈炎 等。自身免疫性病癥可涉及免疫系統(tǒng)的^f壬何部分，并針對(duì)體內(nèi)^壬《可 細(xì)月包或纟且織類型。
如在本文中^吏用的，術(shù)語(yǔ)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎指任^r涉及關(guān)節(jié)炎癥 的病癥，且包括如下特征，如關(guān)節(jié)腐蝕、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜增生、
成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞核巨噬細(xì)胞的急性增生和/或T或NK細(xì)胞的 存在(例如CD56+的NK細(xì)月包；CD3+的T細(xì)月包，可任選地為 CD4+CD28—或CD8+的T細(xì)月包)，還可以為KIR2DL1十、KIR2DL2+、
54KIR2DL3+、 KIR2DL5A+、 KIR2DL5B+、 KIR3DLl+、 KIR3DL2+、 KIR3DL3+ 、 KIR2DS1+ 、 KIR2DS2+ 、 KIR2DS3+ 、 KIR2DS4+ 、 KIR2DS5+、 KIR3DSl+、 CD94+、 NKG2A+、 NKG2C+、 NKG2D+、 NKG2E+、 NKG2F+、 NKG2G+、 NKp30+、 NKp44+和NKp46+中的一 個(gè)或多個(gè)。特別地，當(dāng)存在的細(xì)胞類型是T細(xì)胞時(shí)，由本發(fā)明抗體 所耙向的T或NK細(xì)胞受體是NKG2蛋白，優(yōu)選NKG2D。通常， 在已確診的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，滑膜增厚，軟骨與下面的骨頭開始 分離，并出現(xiàn)關(guān)節(jié)石皮壞的征象。
在一個(gè)實(shí)施例中，才艮據(jù)本發(fā)明所治療的病癥是一種已確立的免 疫增生性病癥，特征通常為組織損傷或破壞和/或至少3、 6、 9、 12、 24、 36個(gè)月的持續(xù)性疾病(例如炎癥、癥狀或組織損傷)。
在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明治療方法的 一部分是一個(gè)分型步驟， 其中對(duì)患者體內(nèi)擴(kuò)增的NK或其他細(xì)胞上的優(yōu)勢(shì)受體進(jìn)行鑒定。通 常，在該步驟中，從患者中取出NK細(xì)胞或其他細(xì)胞(例如T細(xì)胞、 LGL細(xì)胞)樣品，并利用例如免疫測(cè)試進(jìn)行4企測(cè)，確定細(xì)胞上多種 NK細(xì)胞受體的相對(duì)顯著性。盡管優(yōu)選NK細(xì)胞用于該方法，應(yīng)該 理解可采用表達(dá)NK細(xì)胞受體的任何細(xì)胞類型(例如T細(xì)胞，它們 是CD3+,可任選地為CD4+CD28—或CD8+)。理想地，該步驟利用 含一組抗體的試劑盒來(lái)實(shí)施，該抗體組^皮直4妄或間4妄標(biāo)記，共同識(shí) 別免疫增生性病癥的增生性NK細(xì)胞中最常存在的多種NK細(xì)胞受 體。經(jīng)常，將會(huì)發(fā)現(xiàn)一種或少lt幾種受體存在于相當(dāng)數(shù)量的例如 30%、 40%、 50%的細(xì)月包中， <尤選60%、 70%、 80%、 90%或更高。 在該情況下，可以給予單一的或少數(shù)幾種治療性(例如纟田胞毒性) 抗體，即那些特異性對(duì)抗所;險(xiǎn)測(cè)受體的抗體。以該方式，可特異地 耙向于過(guò)度增生的或不需要的細(xì)胞。
除了上述免疫測(cè)試，其他方法也可用來(lái)確定耳又自患者的NK細(xì) 月包受體或NK細(xì)"包的身〗分和相對(duì)表達(dá)水平。例如，基于RNA的方法，例如RT-PCR或Northern印跡，可用來(lái)4企測(cè)取自患者的細(xì)月包中 多種NK細(xì)胞受體的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。在很多情況下，單種或少數(shù)幾 種受體特異性轉(zhuǎn)錄體將占優(yōu)勢(shì)，從而實(shí)現(xiàn)利用特異于該轉(zhuǎn)錄體編碼 的特殊受體的細(xì)胞毒性抗體來(lái)治療患者。
在另 一個(gè)實(shí)施例中，可通過(guò)基因分型來(lái)獲得患者體內(nèi)增生性免 疫細(xì)月包(例如NK細(xì)月包)上表達(dá)的NK細(xì)月包受體身^f分的內(nèi)情。例如， 已經(jīng)鑒定了20種或更多種不同的KIR單體型以及至少40種不同的 基因型(參見(jiàn)，例如Hsu et al. (2002) Immunol Rev. 190:40-52，它的 全部?jī)?nèi)容均通過(guò)引用結(jié)合于此)。這些單體型和基因型中的某些與 激活性或抑制性KIR受體表達(dá)相關(guān)。因此，確定患者具有某種單體 型或某種基因型，常常預(yù)示那些受體最可能在患者的NK細(xì)胞內(nèi)被 表達(dá)。在某些情況下，患者體內(nèi)的某些單體型或基因型可能與NK 受體狀態(tài)的特殊表達(dá)模式可靠性相關(guān)，從而允許篩選特殊的治療性 (例如細(xì)胞毒性)抗體用于本發(fā)明的治療方法中。
在另 一個(gè)實(shí)施例中，將采用功能測(cè)試來(lái)評(píng)估患者體內(nèi)免疫增生 性(伊O選NK)細(xì)月包的活性，該測(cè)試可以單獨(dú)進(jìn)4亍，或與其〗也方法 if關(guān)用，例如免疫學(xué)、基于RNA或基因分型方法。由于一種或多種 激活性NK細(xì)胞受體可能在很多患者體內(nèi)占優(yōu)勢(shì)，那么發(fā)現(xiàn)取自一 個(gè)給定患者的細(xì)胞是特別活化的(如利用任何標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試?yán)缂?xì)胞溶 解測(cè)試、細(xì)胞因子產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)游離4丐等所確定的)將提供關(guān)于哪 些受體可在增生性細(xì)胞中被表達(dá)的重要信息。這種信息，特別是結(jié)
合其他結(jié)果時(shí)，可用來(lái)決定采用哪種或哪些細(xì)胞毒性抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)最 特異的治療策略。例如，發(fā)現(xiàn)取自給定NK-LDGL患者的NK細(xì)胞 中大多凄tNK細(xì)月包可由GL183抗體(它既識(shí)別抑制性KIR2DL2和 KIR2DL3受體，又識(shí)別激活性KIR2DS2受體)特異性識(shí)別，結(jié)合 一個(gè)發(fā)現(xiàn)即大多數(shù)NK細(xì)胞也是活化的，這些發(fā)現(xiàn)可用來(lái)推斷理 想的治療將涉及特異于NKR2DS2而非KIR2DL2和KIR2DL3的單種細(xì)力包毒性抗體。理想情況下，這些治療方法利用最小凄t量的治療
性抗體靶向于最大比例的過(guò)度增生的NK或NK樣細(xì)胞。
理想情況下，在研發(fā)本發(fā)明的抗體、4吏用它們的方法和試劑盒 的過(guò)程時(shí)，將用針對(duì)不同NK細(xì)胞受體的多個(gè)不同抗體篩選多個(gè)患 者。以該方式，可組合一個(gè)診斷性和治療性(例如細(xì)胞毒性)抗體 組，它將覆蓋絕大多數(shù)患者中的大多數(shù)擴(kuò)增的NK細(xì)胞。例如，如 果已確定其中一種KIR受體(例如KIR2DS2)在相當(dāng)百分比(例 如25%、 50%或更高)的NK-LDGL患者的至少50%膨脹的細(xì)胞 中表達(dá)，則根據(jù)本發(fā)明制備的試劑盒通常包括至少一種抗該受體的 診斷性抗體以及一種或多種抗該受體的治療性抗體。如果該受體特 異于NK細(xì)胞，即它不在任何其他細(xì)胞類型上表達(dá)，這尤其正確， 盡管還可以包括也表達(dá)在其他細(xì)胞類型上的受體。特別地，可采用 特異地結(jié)合非NK細(xì)胞特異性受體的治療性抗體，如果它是耙向于 患者體內(nèi)相當(dāng)比例NK細(xì)月包的唯一途徑。取決于所涉及的非NK細(xì) 胞類型的種類，治療性抗體的給藥形式和時(shí)間安排可以具體設(shè)計(jì)為 使其與NK細(xì)胞的相互作用最大化而與非NK細(xì)胞類型的相互作用 最小化(例如，如果該受體還在未成熟B或T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，則以4吏 抗體與骨髓或胸腺的4妻觸達(dá)到最小化的方式而給予該抗體)。
本發(fā)明試劑盒可包括任何數(shù)量的it斷性和/或治療性抗體，例如 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、
18、 19、 20、 25、 30種或任何其他數(shù)量的診斷性和/或治療性抗體。 在這些試劑盒中，常常直4妄或間-接(例如，利用第二抗體)標(biāo)記這 些診斷性抗體l。治療性抗體可未經(jīng)修飾，即無(wú)任何相連接的細(xì)胞毒 性的或其他的部分，僅通過(guò)例如結(jié)合于耙細(xì)胞而將其滅活、觸發(fā)細(xì) 胞死亡或?qū)λ鼈儤?biāo)記以1更被免疫系統(tǒng)破壞。在其他實(shí)施例中，可將 這些治療性抗體連接于一種或多種細(xì)胞毒性部分。應(yīng)該理解，對(duì)試 劑盒內(nèi)容物的描述在任何方面均無(wú)限制性。例如，對(duì)于這些治療性抗體，該試劑盒還包含未經(jīng)修飾抗體或細(xì)胞毒性基團(tuán)的任何組合。 另外，該試劑盒還包含其他類型的治療性化合物，例如化療性或抗 增生藥物。優(yōu)選地，該試劑盒還包4舌該抗體的4吏用i兌明，例如詳細(xì)
說(shuō)明本文用于將患者體內(nèi)NK受體狀態(tài)進(jìn)行分型以及相應(yīng)地給予治 療性抗體的方法。
還應(yīng)該理解，治療性抗體的給藥可涉及纟合予1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 IO種或任何數(shù)量抗單種或多種NK細(xì)胞受體的不同抗體， 如以上說(shuō)明的分型步驟盡可能恰當(dāng)?shù)拇_定其種類，特別是根據(jù)NK 受體^l犬態(tài)而確定。#4居例如該抗體中每一種的相乂十毒性、患者的 NK受體狀態(tài)或其他因素，可一起或單獨(dú)癥會(huì)予多個(gè)抗體的此類組合。
此外，治療可涉及多輪治療性(例如細(xì)胞毒性)抗體給藥。例 如，在第一車侖抗體#會(huì)藥后，通常將重新測(cè)定患者體內(nèi)的NK或LGL 細(xì)胞的總數(shù)，如果仍然升高，則可進(jìn)行另外一輪NK受體狀態(tài)分型， 隨后進(jìn)行另一輪治療性抗體給藥。應(yīng)該理解，在另一輪給藥中所給 予的細(xì)胞毒性抗體不一定與第一輪中使用的抗體相同，而將主要依 賴于另一輪分型步驟的結(jié)果。以此方式，可進(jìn)行多輪NK受體狀態(tài) 分型及治療性抗體纟合藥，例如直到LGL或NK細(xì)胞增生得到控制。
本發(fā)明還4是供多種組合物，例如藥物組合物，它們包含本發(fā)明 的任何一種抗體，包括其片段和衍生物，存在于任何恰當(dāng)載體中， 其量值足以抑制患者體內(nèi)那些表達(dá)耙NK細(xì)胞受體的細(xì)胞的增生或 活性或?qū)⑵錃?。該組合物通常還包括一種藥用載體。應(yīng)該理解， 本發(fā)明將抗體和組合物給予患者的方法還可用來(lái)治療動(dòng)物，或用來(lái) 測(cè)試在此描述的方法或組合物用于人類疾病的動(dòng)物才莫型中的效力。
可用于這些組合物中的藥用載體包括但不限于離子交換劑、氧 化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白例如人血清白蛋白、緩沖物質(zhì) 例如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨S臾鉀、飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、鹽或電解質(zhì)例如碌u酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、 石粦酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠體二氧化^圭、三^圭酸4美、聚乙烯吡咯 烷酮、纖維素基物質(zhì)、聚乙二醇、羧曱基纖維素鈉、聚丙烯酸鹽(酯)、 蠟類、聚乙烯-聚氧化丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
本發(fā)明的這些組合物可口服、胃腸外、通過(guò)吸入噴霧、局部、 經(jīng)直腸、經(jīng)鼻、含服、經(jīng)陰道或通過(guò)植入式儲(chǔ)藥器而給藥。如在本 文中使用的，術(shù)語(yǔ)"胃腸外"包括皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、 滑膜腔內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘膜內(nèi)、肝內(nèi)、損傷區(qū)內(nèi)、顱內(nèi)注射或灌注技 術(shù)。優(yōu)選地，組合物可經(jīng)口服、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥。
本發(fā)明的這些組合物的無(wú)菌可注射形式可為水性或油狀懸浮 液。這些懸浮液可以按照本領(lǐng)域中已知的技術(shù)利用恰當(dāng)?shù)姆稚⒒驖?潤(rùn)劑以及懸浮劑而配制。這些無(wú)菌可注射制備物還可以為無(wú)菌可注 射溶液或懸浮在非毒性胃腸外可接受性稀釋劑或溶劑中的懸浮液，
例如溶于1，3-丁二醇中的溶液?？刹捎玫暮线m載體和溶劑包括水、
林格氏液以及等滲氯化鈉溶液。此外，無(wú)菌不揮發(fā)油常規(guī)用作溶劑 或懸浮介質(zhì)。為了這個(gè)目的，任-f可溫和的不4軍發(fā)油均可采用，包括 合成的甘油一酯或甘油二酯。脂肪酸例如油酸及其甘油酯衍生物在 可注射物的制備中非常有用，天然藥用油例如橄欖油或蓖麻油也非 常有用，特別是它的聚氧乙醇4汙生物。這些油溶液或懸浮液還可包 含長(zhǎng)鏈醇稀釋劑或分散劑，例如羧甲基纖維素或類似分散劑，其通 常用于制備藥用劑型包括乳液和懸浮液。其他常用的表面活性劑，
例如通常用于制備藥用固體、液體或其他劑型的Tween、 Span和其 他乳化劑或生物利用度增強(qiáng)劑，也可以用于配制目的。
本發(fā)明的這些組合物可以任何適于口服的劑型給藥，包括但不 限于膠嚢、片劑、含水懸浮液或溶液。在用于口服的片劑中，最常 用的載體包括乳糖和玉米淀4分。通常還加入潤(rùn)滑劑例如硬脂酸鎂。 為了以膠嚢形式口服給藥，有用的稀釋劑包括乳糖和干玉米淀粉。如果需要含水懸浮液用于口力良，將活性成分與乳化和懸浮劑混合。 如果需要，還可以加入甜口未劑、調(diào)，味劑或著色劑。
作為替代，本發(fā)明的組合物還可以栓劑形式用于直腸給藥。這 些組合物還可以通過(guò)將該試劑與恰當(dāng)?shù)姆谴碳ば再x形劑混合而制 備，貝武形劑室溫下是固態(tài)而在直腸溫度下為液態(tài)，因此將在直腸內(nèi) 溶解而釋放藥物。這些材料包括可可脂、蜂蠟和聚乙二醇。該發(fā)明 的組合物還可局部、目艮內(nèi)、通過(guò)氣霧劑或吸入而給藥。這些組合物 可按照藥物制劑領(lǐng)域中熟知的技術(shù)制備。
在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的這些抗體還可以單獨(dú)或與另一種用 于草巴向遞送至患者或動(dòng)物的物質(zhì)一起摻入脂質(zhì)體內(nèi)("免疫脂質(zhì) 體")。這些其他物質(zhì)可包括核酸，用于遞送用于基因治療的基因
或者用于遞送反義RNA、RNAi或siRNA以4中制NK細(xì)月包內(nèi)的基因， 或者包括毒素或藥物用于通過(guò)其他方式激活NK細(xì)胞，或包括在此 所述的對(duì)于激活NK細(xì)胞或靶向于腫瘤或感染細(xì)胞非常有用的其他 任何試劑。
在另 一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體可經(jīng)^奮飾而改善其生物可利 用度、體內(nèi)半衰期等。例如，可利用大量聚乙二醇形式中任何一種 以及本領(lǐng)域中已知的連4妻方法而將抗體聚乙二醇化(參見(jiàn)，例如Lee et al. (2003) Bioconjug Chem. 14(3):546-53; Harris et al. (2003) Nat Rev Drug Discov. 2(3):214-21; Deckert et al. (2000) Int J Cancer. 87(3):382-90)。
已經(jīng)i正實(shí)幾種單克隆抗體在臨床情形中比4交有效，例如利妥昔
(Rituxan)(利妥昔單抗)、赫賽汀(曲妥單抗)、Xolair (奧馬佐單 抗)、Bexxar (托西莫單抗)、坎帕斯(阿侖單抗)、澤娃靈(Zevalin )、 Oncolym以及類似給藥方案(即劑型和/或劑量和/或給藥方法)， 這些可以與本發(fā)明抗體一起^f吏用。纟會(huì)藥計(jì)劃和劑量可按照這些產(chǎn)品的已4口方法確定，例力口利用生產(chǎn)商的i兌明書。例力o,單克隆4元體可
以4安10mg/mL的濃度在100mg ( 10mL )或500mg ( 50mL )單次佳_ 用的小瓶中提供。將該產(chǎn)品配制于9.0mg/mL氯化鈉、7.35mg/mL 二水4寧碎蒙酸鈉、0.7mg/mL聚山梨醇酯80和無(wú)菌水中，用于IV紹^ 藥，將pH調(diào)為6.5。用于本發(fā)明抗體的示例性恰當(dāng)劑量范圍可在約 10mg/m2和500mg/m2之間。然而，應(yīng)該理解，這些計(jì)劃是示例性的， 且最優(yōu)計(jì)劃和方案可加以調(diào)整，將抗體親和性以及在臨床試-驗(yàn)中必 須確定的抗體可耐受性考慮在內(nèi)。在確定針對(duì)那些々包和NK細(xì)胞的 NK細(xì)胞受體的24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)或一周或一個(gè)月抗體注 射用量和日程時(shí)，要考慮抗體親和性以及其藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
才艮才居另 一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明的抗體組合物進(jìn)一步包含一種或多 種其4也治療試劑，包4舌通常用于具體治療目的(該纟元體是為了該目 的而給藥)的試劑。其他治療試劑通常以用于待治療特殊疾病或癥 狀的單次治療所釆用的量而存在于組合物中。這些治療試劑包括^f旦 不限于癌癥治療中〗吏用的治療試劑、用來(lái)治療炎癥性或自身免疫性 病癥、傳染性病癥的治療i式劑、用于其4也免疫治療中的治療i式劑、 細(xì)胞因子(例如IL-2或IL-15)、其他抗體以及其他抗體的片段。 只要已知特殊治療途徑對(duì)患者癥狀本身不是有害的，且不顯著性抵 消基于NK細(xì)胞受體的抗體的治療，即可考慮將其與本發(fā)明加以組 合。
由于常常用4匕療來(lái)治療增生性病癥例如NK-LDGL,特別是 NK-LDGL白血病，本發(fā)明的NK細(xì)月包受體的抗體的治療性組合物 可以與其4tM匕學(xué)治療或〖敫素治療劑Jf關(guān)合纟會(huì)藥。多種;敫素治療和4匕學(xué) 治療劑可用于在此披露的聯(lián)合治療法?？紤]為示例性的化學(xué)治療劑 包括烷化劑、抗代謝藥、細(xì)胞毒性抗生素、長(zhǎng)春花生物^咸、例如阿 霉素、更生霉素、絲裂霉素、洋紅霉素、柔紅霉素、阿霉素、他莫 昔芬、紫杉醇、泰索帝、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春瑞濱、依托泊苷(VP-16)、 5-氟尿嘧啶(5FU)、阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺、塞替派、 甲氨喋呤、喜樹堿、放線菌素-D、絲裂霉素C、順柏(CDDP)、氨 基蝶呤、考布他汀及其衍生物和藥物前體。激素劑包括例如，LHRH 激動(dòng)劑例如亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲普瑞4木和布舍瑞林；抗雌激素， 例如他莫昔芬和托瑞米芬；抗雄激素，例如氟他胺、尼魯米特、環(huán) 丙孕酮和比卡魯胺；芳香酶抑制劑，例如阿那曲峻、依西美坦、來(lái) 曲哇和法倔哇；以及孕激素，例如曱羥孕酮(medroxy)、氯地孕 酮和曱地孕酮。其他有用的藥劑包括干擾DNA復(fù)制、有絲分裂和 染色體分離的化合物，還可采用能破壞多核苷酸前體合成和保真性 (精確度)的試劑。用于綜合療法的多種示例性化學(xué)治療劑在美國(guó)專 利號(hào)6,524,583的表C中列出，它所4皮露的試劑和適應(yīng)癥通過(guò)引用 結(jié)合于此。所列出的每一種試劑均是示例性而非限制性的。另一個(gè) 有用的來(lái)源是"Remington's Pharmaceutical Sciences"第15片反第33 章，具體是624-652頁(yè)。根據(jù)待治療癥狀可能對(duì)劑量做一些變化。 實(shí)施治療的內(nèi)科醫(yī)生將能夠確定用于某一個(gè)體患者的恰當(dāng)劑量。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)重要實(shí)施例，NK細(xì)胞受體抗體的治療性 組合物可聯(lián)合一種或多種其他治療劑 一起給藥，其中該其他治療劑 通常用于特定的治療性炎性的或自身免疫適應(yīng)癥，其中為這些適應(yīng) 癥將該抗體或化合物與一些治療劑一起給藥，這些治療劑例如，用 于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療劑；用于治療韋格納肉芽肺病的治療 劑；用于治療干燥綜合征的治療劑；用于治療胰島素依賴的糖尿病 的治療劑；細(xì)胞因子，例如IL-10以及可抵消那些驅(qū)動(dòng)免疫細(xì)胞激 活和增生的細(xì)胞因子和其他分子的化合物(例如抗TNF-oc抗體和 其他化合物以及抗IL-15的抗體和其他化合物)。
本發(fā)明可與經(jīng)典方法例如手術(shù)等聯(lián)合使用。當(dāng)一種或多種藥劑 或方法與本發(fā)明的療法聯(lián)合使用時(shí)，不要求綜合結(jié)果是單獨(dú)開展每 種治療時(shí)觀察到的效應(yīng)的累加。盡管起碼至少累加效應(yīng)是所希望的，但NK細(xì)胞數(shù)量的減少、細(xì)胞因子生成或相對(duì)于單一療法中每 一種的其他有益效應(yīng)均屬有益的。此外，對(duì)于該綜合治療一定要表 現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)并無(wú)特殊要求，盡管這確實(shí)是可能的且是有益的。該 NK細(xì)月包受體的抗體治療組合物療法可以在另 一種療法之前或之 后，間隔從幾分鐘至幾周和幾個(gè)月。人們?cè)O(shè)想還可以利用NK細(xì)胞 受體的抗體治療組合物或另 一種試劑的多于一次的用藥。這些藥劑 可隔天或隔周交換:纟會(huì)藥；或纟會(huì)予一4侖NK細(xì)力包受體的抗體治療組合 物療法，隨后是一4侖另一種藥物療法。在任何情況下，無(wú)i侖給藥時(shí) 間如何，所需的只是以可表現(xiàn)出有效治療效應(yīng)的組合量遞送兩種試 劑。
在其他方面，免疫調(diào)節(jié)化合物或方案可與本發(fā)明聯(lián)合實(shí)施。優(yōu) 選的例子包括與細(xì)胞因子的療法，在這些綜合途徑中可采用多種細(xì) 胞因子。細(xì)胞因子的例子包括IL-la、 IL-1 P 、 IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL陽(yáng)8、 IL國(guó)9、 IL-IO、 IL-ll、 IL-12、 IL畫13、 IL-15、 IL-21、 TGF-P、 GM-CSF、 M-CSF、 G-CSF、 TNF-a 、 TNF畫(3 、 LAF、 TCGF、 BCGF、 TRF、 BAF、 BDG、 MP、 LIF、 OSM、 TMF、 PDGF、 IFN- a 、 IFN- |3 、 IFN- y或抑制這些細(xì)月包因子中任4可一種的 化合物(例如，結(jié)合這些細(xì)胞因子的抗體或可溶性受體)?？?t要照 標(biāo)準(zhǔn)方案而給予細(xì)胞因子或其抑制劑，這與臨床指征，例如患者的 癥狀以及細(xì)胞因子的相對(duì)毒性一致。
本發(fā)明方法還可與豐f助4t合物聯(lián)合應(yīng)用，作為舉例，豐t助4匕合 物包括例如5-羥色胺拮抗劑的抗催吐藥和例如吩噻。秦、取代的苯曱 酰胺、抗組織胺、丁酰苯、皮質(zhì)類固醇、苯并二氮類和大麻素的療 法；二膦酸鹽(酯)如唾來(lái)膦酸和帕米膦酉交；造血生長(zhǎng)因子如促紅 細(xì)月包生成素和G-CSF,例如非才各司亭、來(lái)才各司亭和達(dá)貝泊汀 (darbepoietin )。本發(fā)明的其他方面和優(yōu)勢(shì)將在下面的實(shí)^r部分4皮 露，該實(shí)驗(yàn)部分應(yīng)認(rèn)為是說(shuō)明性的而非限制本申請(qǐng)的范圍。實(shí)例1 -生成對(duì)NK細(xì)胞受體特異的mAb
通過(guò)用激活的多克隆或單克隆NK細(xì)胞系對(duì)5周齡的Balb C小 鼠進(jìn)4亍免疫而生成單克隆抗體，如Moretta et al. (1990) J Exp Med. 172(6):1589-98中所述的。不同細(xì)胞融合后，首先針對(duì)mAb特異性 識(shí)別一種或多種NK細(xì)月包受體的能力進(jìn)4亍mAb篩選，這些NK細(xì)月包 受體為例如KIR2DL1 、 KIR2DL2 、 KIR2DL3 、 KIR2DL5A 、 KIR2DL5B、 KIR3DL1、 KIR3DL2、 KIR3DL3、 KIR2DS1、 KIR2DS2、 KIR2DS3 、 KIR2DS4 、 KIR2DS5 、 KIR3DS1 、 CD94 、 NKG2A 、 NKG2C 、 NKG2D、 NKG2E、 NKG2F、 NKp30、 NKp44、 NKp46等。進(jìn)一步 針對(duì)陽(yáng)性單克隆抗體特異地結(jié)合NK細(xì)月包的能力進(jìn)4于陽(yáng)性單克隆抗 體的篩選，該NK細(xì)胞取自免疫增生性病癥(例如NK-LDGL、類 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等)的患者。
實(shí)例2-純化外周血淋巴細(xì)胞(PBL)并生成多克隆或克隆性NK
細(xì)月包群
外周血淋巴細(xì)胞(PBL)來(lái)源于NK-LDGL患者或另外一種免 疫增生性病癥的患者或4吏用Ficoll-Hipaque梯度的并^^竭了貼壁細(xì) 胞(plastic-adherent cell)的健康供體。為了得到富集的NK細(xì)胞， 將PBL用抗CD3(JT3A)、抗CD4(HP2.6)和抗HLA-DR(D 1.12) mAb 孵育(30分鐘，4° C )，隨后用羊抗鼠包被的Dynabead (Dynal, Oslo, Norway)孵育(30分鐘，4°C )并用免疫石茲碑毛竭(Pende et al. (1998) Eur. J. Immunol. 28:2384-2394; Si曹i et al. (1997) J. Exp. Med. 186:1129-1136; Vitale et al. (1998) J. Exp. Med. 187:2065-2072)。 CD3—4T)R;細(xì)胞用于細(xì)月包；容解性測(cè)試中，或者在 100U/ml rlL-2(Proleukin, Chiron Corp., Emeryville, USA)和1.5ng/ml PHA (Gibco Ltd, Paisley, Scotland)存在的情況下，將其在受照射飼養(yǎng) 細(xì)胞中培養(yǎng)，以獲得多克隆NK細(xì)胞群，或限制性稀釋后獲得NK 細(xì)胞克隆(Moretta(1985) Eur. J. Immunol. 151:148-155 )。實(shí)例3 -流式細(xì)力包4義分才斤
患者細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞用特異于多種NK細(xì)胞受體的mAb進(jìn)行 染色，mAb或者被直接標(biāo)記或者隨后使用PE-或FITC-軛合的同種 型凈爭(zhēng)異寸生羊#元鼠第二 i式劑 (Southern Biotechnology Associated, Birmingham, Ala.)。沖羊品通過(guò)單色或乂又色細(xì)月包熒光分片斤(FACScan Becton Dickinson & Co, Mountain View, Calif.)進(jìn)行分析(參見(jiàn)，例 如Moretta et al. (1990) J.Exp.Med. 171:695-714 )。
實(shí)例4 -抗體-底物相互作用的Biacore分牙斤
重逸蛋^的J^^和遂^
重組蛋白在編碼NK細(xì)胞受體整個(gè)月包外結(jié)構(gòu)域的大腸桿菌 cDNA中生成，該cDNA利用標(biāo)準(zhǔn)方法通過(guò)PCR擴(kuò)增。將該核酸序 列克隆入pMLl表達(dá)載體中含編碼生物素化信號(hào)的序列的框架內(nèi) (Saulquin et al,2003 )。在BL21(DE3)纟田菌抹(Invitrogen )中表 達(dá)蛋白。將已轉(zhuǎn)染的細(xì)菌在補(bǔ)充了氨芐青霉素(100jug/ml)的培養(yǎng) 基中于37。C培養(yǎng)至OD6。o=0.6,并用1 mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)。在變 性條件下(8M尿素)從包涵體回收蛋白。室溫下，通過(guò)降低六步 透析中的尿素濃度(分別是4、 3、 2、 1、 0.5和0M尿素)，在含 L4青氨酸(400 mM， Sigma )和(3巰基乙醇(1 mM )的20 mM Tris， pH7.8， NaCl 150mM《爰沖液中實(shí)施該重組蛋白的重新折疊。在0.5 和0 M尿素透析步驟中，加入還原和氧化的谷光苷肽(分別是5 mM 和0.5 mM, Sigma)。最后， 一夸該蛋白在10 mM Tris,pH7.5，NaCl 150 mM緩沖液中廣泛透析。濃縮可溶性、重新折疊的蛋白，隨后在 Superdex 200大小4非阻片主(Pharmacia; AKTA系統(tǒng))上純4匕。在 Biacore 4義(Biacore )上進(jìn)4亍表面等離子共才展測(cè)量。在所有的Biacore 實(shí)驗(yàn)中，用0.05%表面活性劑P20補(bǔ)充的HBS緩沖液作為流動(dòng)緩沖 液。
65將按上述生成的重組底物蛋白共價(jià)固定于傳感器芯片CM5 (Biacore)上葡聚糖層內(nèi)的羧基基團(tuán)上。該傳感器芯片表面通過(guò) EDC/NHS (N-乙基-N，-(3-二曱氨丙基)羰基二亞胺鹽酸鹽和N-羥基 琥珀酰亞胺，Biacore )激活。注射〉容于偶if關(guān)IC沖液(10 mM乙酸， pH4.5)中的蛋白。用100 mM乙醇胺pH 8 (Biacore)滅活剩余的活 化基團(tuán)。
將不同濃度的可溶性抗體(1 x 10—7至4x 10-1G)涂敷到固定的 底物樣品上，用于動(dòng)力學(xué)測(cè)定。該測(cè)定在20jul/min的連續(xù)流速下 進(jìn)4亍。每一循環(huán)中，均通過(guò)注射5 ju 1的10mM NaOH pH 11而再生 傳感器芯片的表面。使用BIAlogue動(dòng)力學(xué)評(píng)估程序(BIAevaluation 3.1, Biacore )進(jìn)4亍凄史才居測(cè)試。^!尋可卩容性測(cè)試物(不同濃度下40 ju 1) 在HBS緩沖液中以20 ju 1/min的流速注射于葡聚糖層上，葡聚糖層 含有例如500反射單^f立(RU ),以及1000 RU的底物。
實(shí)例5 -用于耗竭表達(dá)人NK細(xì)胞受體的鼠NK細(xì)胞的體內(nèi)才莫型
由于缺乏選4奪性缺陷4莫型〗吏NK細(xì)胞生物學(xué)功能的測(cè)試復(fù)雜 化。為了研究抗體特別是棵抗體能否用來(lái)耗竭體內(nèi)的NK細(xì)胞，采 用一個(gè)選沖奪性缺陷才莫型來(lái)評(píng)估抗體能身毛竭小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞的程 度。已經(jīng)證實(shí)NKp46是一種特異性NK細(xì)胞標(biāo)記物，因此采用 NKp46調(diào)控序列創(chuàng)建這種才莫型。為了-驗(yàn)證該方法的可行性，生成了 一種轉(zhuǎn)基因載體(圖la),它包含位于7V^7M6相鄰基因和 7V^LP7之間的一個(gè)24kb的人基因區(qū)域。乂人轉(zhuǎn)基因初始物(稱為hu NKp46Tg),以孟德爾頻率獲得它的子代、發(fā)育正常且具有繁殖力。 不與小鼠NKp46發(fā)生交叉反應(yīng)的BAB281 (抗人NKp46)抗體，祐:用來(lái)評(píng)估人NKp46在這些小鼠體內(nèi)細(xì)胞表面的表達(dá)。人NKp46不 在斗立細(xì)月包、初于突狀細(xì)月包、B細(xì)月包、T細(xì)月包和CDld-oc-gal-cer四聚體 +NKT細(xì)胞上表達(dá)，但在所有NK細(xì)胞上以較高且均一水平表達(dá)(圖 lb)。而且，人NKp46開始在骨髓中NK細(xì)胞發(fā)育的不成熟階,殳表 達(dá)(圖lc)，且隨后保持以相同水平在所有分離自全部被測(cè)器官的 NK細(xì)胞上表達(dá)(圖ld)。很明顯，因此huNKp46Tg小鼠中人NKp46 的表達(dá)模式類似于親代小鼠中內(nèi)源性小鼠NKp46分子的表達(dá)模式。 因此，人NKp46的細(xì)胞表面表達(dá)確定huNKp46 Tg小鼠中的NK細(xì) 胞，表明人NKp46調(diào)控序列可用來(lái)驅(qū)動(dòng)NK特異性基因表達(dá)。 huNKp46 Tg小鼠中的NK細(xì)胞表現(xiàn)為正常計(jì)數(shù)、表型和效應(yīng)器功 能。重要的是，通過(guò)人NKp46誘導(dǎo)導(dǎo)向溶解(圖le)，表明人NKp46 分子在小鼠NK細(xì)胞中具有功能。
實(shí)例6-利用抗人NKp46耗竭小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞
HuNKp46 Tg小鼠用PBS或抗NKp46:BAB281(IgG1，100 ju g)、 KL247 (IgM, lOOiug)和195314 (IgG2b， R&D系纟克，50 n g )的 三種不同抗體的混合物在眼眶后給小鼠注射。注射后2天，I.v.纟會(huì) 予抗人NKp46的抗體引起血液和被測(cè)所有器官中的NK細(xì)胞幾乎完 全消失(圖2)。與之相反，NKT細(xì)胞和TCRy 5+T細(xì)胞計(jì)數(shù)未 受顯著影響(圖2)，表明huNKp46 Tg小鼠可用作NK細(xì)胞選擇 性耗竭的小鼠模型，且具有Fcgamma受體(例如CD16 )結(jié)合能力 的抗體(例如小鼠IgGl和IgG2b )可介導(dǎo)NK細(xì)胞的耗竭。因此， 利用結(jié)合CD16 (例如IgGl、 IgG3或經(jīng)寸奮飾可結(jié)合CD16的其他 Fc區(qū)如IgG2或IgG4 )的相應(yīng)的人效應(yīng)器區(qū)，可用于NK細(xì)月包的誄毛 竭，尤其也在骨髓和器官中，這是那些免疫增生病癥的一個(gè)重要特 征，其中不需要的NK細(xì)胞可能存在于給定的器官或組織中。
實(shí)例7 -用Z270耗竭表達(dá)NKG2A和-C的淋巴細(xì)胞可減少促炎性
細(xì)胞因子的分泌引言
已知IL-15在炎性部位;故增量調(diào)節(jié)且對(duì)'淋巴細(xì)胞如T和NK細(xì) 胞以及單核細(xì)胞源性細(xì)胞系具有免疫刺激效應(yīng)。CD94/NKG2A和-C 是HLA-E特異性受體，在慢性炎癥例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎炎性部位 的T和NK細(xì)胞上以高頻率存在。在這些指征中，促炎性細(xì)胞因子 TNF-oc是一種重要的炎癥馬區(qū)動(dòng)子，TNF-oc革巴向治療(例如英夫利 昔單抗或阿達(dá)木單抗)可減弱炎癥。TNF- a由巨噬細(xì)月包、NK細(xì)月包、 T細(xì)月包和B細(xì)月包產(chǎn)生。在幾個(gè)實(shí)-瞼中已經(jīng)表明 一方面NK或T細(xì) 月包之間的細(xì)月包-細(xì)月包4妄觸依賴性才幾制，另 一方面單核細(xì)月包源性細(xì)月包如 巨喧細(xì)胞，可誘導(dǎo)TNF-a強(qiáng)烈生成。在此，我們證實(shí)用單克隆抗 體庫(kù)毛竭CD94/NKG2A和-C陽(yáng)性NK和T細(xì)月包具有抗炎效應(yīng)。這一 點(diǎn)在體夕卜測(cè)試中力口以例i正，其中我們表明與未庫(kù)毛竭表達(dá) CD94/NKG2A和-C細(xì)胞的淋巴細(xì)胞相比，庫(kù)4竭淋巴細(xì)胞中表達(dá) CD94/NKG2A和畫C的細(xì)月包后，i秀導(dǎo)單核細(xì)月包系產(chǎn)生的TNF- ot豐交少。
一毛竭表達(dá)CD94/NKG2A和-C的淋巴細(xì)胞減弱了淋巴細(xì)胞激活單核 細(xì)胞的能力
從血液中碑毛竭CD94/NKG2A和-C陽(yáng)性細(xì)胞的抗炎效應(yīng)是在體 外i正實(shí)的。為此，利用含肝素的CPT采血管(BD Sciences)基本 按照生產(chǎn)商提供的方案從健康供者的新鮮血液中分離外周血單核 細(xì)月包(PBMC，s)。通過(guò)于Petri i咅養(yǎng)皿中^l奪PBMC，s在10ml含 Glutamax的RPMI 1640培養(yǎng)基(補(bǔ)充了 10% FCS和青霉素/鏈霉素， 下文指定的培養(yǎng)基)中培養(yǎng)1小時(shí)， -使單核細(xì)胞黏附于培養(yǎng)皿，而 將'淋巴細(xì)胞與單核細(xì)月包分離。洗滌'淋巴細(xì)月包一次。隨后，在6孔才反 內(nèi)將上清中的淋巴細(xì)胞在存在人IL-15 (BD Sciences, 50ng/ml)的 培養(yǎng)基中于37。C、 5。/。C02孵育約24小時(shí)，使用總體積5ml。通過(guò) MACS (Miltenyi Biotech)，基本按照生產(chǎn)商才是供的步驟而耗竭 CD94/NKG2A和-C陽(yáng)性細(xì)月包。簡(jiǎn)單地i兌，將細(xì)月包在含0.5% BSA的
68無(wú)菌PBS中洗滌一次。將其中1/2的細(xì)胞與抗NKG2A(Z199) ( BD Biosciences ) ( 2 ju g/ml )和抗NKG2C(克隆134522 ) ( R&D systems )
(2.5jug/ml)的組合物一起冰上孵育30分鐘。隨后，將細(xì)力包在無(wú) 菌PBS/0.5%BSA中洗滌兩次，并與20 pl羊抗鼠IgG樣吏珠
(MicroBeads )(加入80 (il細(xì)月包中) 一起冰上孵育30分鐘。然后 用PBS/0.5%BSA洗滌細(xì)胞。利用LD MACS柱耗竭CD94/NKG2A 和-C卩日性細(xì)月包。CD94/NKG2A和-C陽(yáng)性細(xì)月包的誄毛竭通常>95%, 這是通過(guò)在流式細(xì)月包4義(FACSarray )中測(cè)試抗-CD94 ( HP-3D9 ) (Pharmingen)著色的細(xì)胞而評(píng)估的(見(jiàn)圖3)。將流過(guò)的細(xì)胞在含 Glutamax的RPMI 1640培養(yǎng)基中洗滌1次，補(bǔ)充10% FCS和青霉 素/鏈霉素RPMI 1640 ( Gibco )，并在24孑14反中與THP-1細(xì)月包一起 培養(yǎng)24小時(shí)，淋巴細(xì)胞/THP-blO:l，體積為每孔lml培養(yǎng)基。利 用CBAThl/Th2細(xì)胞因子試劑盒II ，基本按照制造商的方案，通過(guò) 在FACSarray ( BD Biosciences )上測(cè)定組織i咅養(yǎng)基中TNF- oc 、 IFN國(guó) Y 、 IL-2、 -4、 -6和-10的分泌情況來(lái)測(cè)試由碑C竭CD94/NKG2A和 -C的淋巴細(xì)胞引起的THP-1細(xì)胞的激活。與未4毛竭的細(xì)胞相比， 在采用耗竭表達(dá)NKG2A和-C的淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)基中觀察到了 TNF- oc的生成顯著減少。因此，庫(kù)毛竭表達(dá)CD94/NKG2A和-C的'淋 巴細(xì)月包可減弱淋巴細(xì)力包的促炎性反應(yīng)能力。
本說(shuō)明書中引用的全部出版物和專利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容均通過(guò) 引用結(jié)合于此，如同每一個(gè)單獨(dú)的出版物和專利申請(qǐng)均確切地并單 獨(dú)表明是通過(guò)引用結(jié)合在此。
盡管為了清晰理解的目的，前文已經(jīng)通過(guò)描述和舉例的方式i羊 細(xì)地描述了上述發(fā)明，但很顯然，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言， 可根據(jù)本發(fā)明所傳授的內(nèi)容在不背離所附權(quán)利要求的精神或范圍 的前提下做某些變化和修改。
權(quán)利要求
1. 一種組合物在制備用于治療免疫增生性病癥的一種藥物中的用途，該組合物包含特異地結(jié)合一種NK受體的一種抗體，該NK受體選自KIR2DL1、KIR2DS1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DS4、CD94、NKG2A、NKG2C、NKG2D、NKG2E、NKG2F、NKp30、NKp44和NKp46所組成的組，并且當(dāng)該抗體結(jié)合在一個(gè)人的NK細(xì)胞上的所述NK受體時(shí)致使所述NK細(xì)胞被耗竭。
2. —種治療患免疫增生性病癥的患者的方法，該方法包括a)確 定所述患者體內(nèi)T細(xì)胞或NK細(xì)胞的NK受體狀態(tài)，以及b)將包含一種抗體的一個(gè)組合物給予所述患者，該抗體特異結(jié)合 至主要由所述T細(xì)月包或NK細(xì)月包表達(dá)的一個(gè)NK受體，其中該 抗體致使它與之結(jié)合的所述T細(xì)胞或NK細(xì)胞#:庫(kù)毛竭。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中所述受體選自KIR2DL1、 KIR2DS1、 KIR2DL2、 KIR2DL3、 KIR2DS4、 CD94、 NKG2A、 NKG2C、 NKG2D、 NKG2E、 NKG2F、 NKp30、 NKp44和NKp46所組成的組。
4. 權(quán)利要求2的方法，其中所述NK受體的狀態(tài)是利用一種免疫 測(cè)i式而確定的。
5. 4又利要求2的方法，其中所述NK受體的狀態(tài)是利用確定存在 于所述NK細(xì)胞上的所述NK受體的活性的 一 種功能測(cè)試而確定的。
6. 權(quán)利要求2的方法，其中所述NK受體的狀態(tài)是利用一種基因 分型測(cè)i式而確定的。
7. 權(quán)利要求2的方法，其中所述NK受體的狀態(tài)是利用檢測(cè)這些 細(xì)月包內(nèi)編石馬NK受體的mRNA的一種測(cè)i式而確定的。
8. 4又利要求2的方法，其中所述受體可片企出地存在于至少50% 的所述NK細(xì)胞上。
9. 上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途或方法，其中所述免疫增生性病 癥是一種自身免疫性病癥。
10. 上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途或方法，其中所述免疫增生性病 癥選自下組，該組包括自身免疫性溶血性貧血、惡性貧血、 結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、韋格納肉芽腫病、自身免 疫性肝炎、貝切特氏病、克羅恩病、原發(fā)性月旦汁性肝硬化、硬— 皮病、潰瘍性結(jié)腸炎、干燥綜合征、I型糖尿病、眼葡萄膜炎、 才各雷夫其斤氏病、甲^U^炎、I型4唐尿病、心月幾炎、風(fēng)濕熱、石更 皮病、強(qiáng)直性脊柱炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎小球性腎炎、肉樣 瘤病、皮肌炎、重癥肌無(wú)力、多發(fā)性肌炎、格-巴二氏綜合征、 多發(fā)性硬化癥、局限性脫發(fā)、天皰瘡/類天皰瘡、4艮屑癬和白 癜風(fēng)。
11. 上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途或方法，其中所述免疫增生性病 癥是NK型LDGL。
12. 上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途或方法，其中所述NK受體是一 種活化受體。
13. 上述4又利要求中任一項(xiàng)的用途或方法，其中所述抗體特異性識(shí) 別一種單一的NK受體。
14. 上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途或方法，其中所述抗體特異性識(shí) 別多種NK受體。
15. 上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途或方法，其中所述組合物包含多 種抗體的一個(gè)組合，每種抗體特異地識(shí)別一種單一的NK受體。
16. 上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途或方法，其中所述組合物包含多 種抗體的一個(gè)《且合，至少一種4元體特異:l也識(shí)別多種NK受體。
17. 上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途或方法，其中所述抗體結(jié)合至一 個(gè)Fc受體。
18. 權(quán)利要求17的用途或方法，其中所述抗體包含G1或G3同種 型的一個(gè)Fc區(qū)。
19. 權(quán)利要求18的用途或方法，其中所述抗體不包括選自下組的 一種成分，該組包括放射性同位素、毒性肽以及毒性小分子。
20. 上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途或方法，其中所述抗體是一個(gè)抗 體片段。
21. 權(quán)利要求1至18和20中任一項(xiàng)的用途或方法，其中所述抗體 包括選自下組的一種成分，該組包括；故射性同位素、毒性肽 和毒性小分子。
22. 上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途或方法，其中所述抗體為人源化 的或嵌合的。
23. 上述4又利要求中任一項(xiàng)的用途或方法，其中所述抗體結(jié)合至所 述NK受體的小鼠或靈長(zhǎng)類的同系物。
24. 權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)的用途或方法，其中所述抗體結(jié)合 多種KIR受體。
25. ^又利要求1至23中任一項(xiàng)的用途或方法，其中所述抗體結(jié)合 多種NKG2受體。
26. 權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)的用途或方法，其中所述抗體特異 地結(jié)合NKp46。
27. 4又利要求1至23中任一項(xiàng)的用途或方法，其中所述抗體特異 地結(jié)合NKG2A。
28. 4又利要求1至23中4壬一項(xiàng)的用途或方法，其中所述抗體特異 地結(jié)合NKG2C。
29. 權(quán)利要求27的用途或方法，其中所述抗體特異地結(jié)合NKG2A 和NKG2C。
30. 4又利要求27的用途或方法，其中所述抗體特異地結(jié)合 NKG2A、 NKGC和NKG2E。
31. 片又利要求27至30的用途或方法，其中所述抗體與Z199或 Z270竟?fàn)幰越Y(jié)合至NKG2A。
32. 4又利要求31的用途或方法，其中所述抗體包含來(lái)自一個(gè)抗 NKG2A抗體的至少一個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)。
33. —種單克隆抗體，其特4正為a. 特異i也結(jié)合至一種NK細(xì)胞受體，該受體選自 KIR2DL1、 KIR2DS1、 KIR2DL2、 KIR2DL3、 KIR2DS4、 CD94、 NKG2A、 NKG2C、 NKG2D、 NKp30、 NKp44和NKp46所組成的組；b. 結(jié)合至一種Fc受體；并且c. 當(dāng)結(jié)合至一個(gè)人的NK細(xì)月包上的所述NK細(xì)月包受體時(shí)， 致4吏所述NK細(xì)力包#^毛竭。
34. 根據(jù)權(quán)利要求33的單克隆抗體，其中所述抗體為人源化的或 嵌合的。
35. #4居權(quán)利要求33的單克隆抗體，其中所述抗體特異地結(jié)合 NKp46。
36. 根據(jù)權(quán)利要求33的單克隆抗體，其中所述抗體特異地結(jié)合 NKG2A。
37. 4艮據(jù)權(quán)利要求33的單克隆抗體，其中所述抗體特異地結(jié)合 NKG2C。
38. 根據(jù)權(quán)利要求33的單克隆抗體，其中所述抗體特異地結(jié)合 NKG2A和NKG2C。
39. 根據(jù)權(quán)利要求33的單克隆抗體，其中所述抗體特異地結(jié)合 NKG2A、 NKGC和NKG2E。
40. 根據(jù)權(quán)利要求36至39中任一項(xiàng)的單克隆抗體，其中所述抗體 與Z199或Z270竟?fàn)幰越Y(jié)合至NKG2A。
41. 才艮據(jù)4又利要求40的單克隆抗體，其中所述抗體包含來(lái)自 NKG2A的一個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)。
42. 才艮據(jù)沖又利要求33至41中任一項(xiàng)的單克隆抗體，其中所述抗體 包含G1或G3同種型的一個(gè)Fc區(qū)。
43. 生產(chǎn)適于治療免疫增生性病癥的一種抗體的一種方法，所述方 法包括i. 提供多種抗體，這些抗體特異地結(jié)合至存在于NK細(xì) 胞表面上的一種或多種受體；ii. 才企測(cè)所述抗體結(jié)合至NK細(xì)胞的能力，這些NK細(xì)胞 取自患有一種免疫增生性病癥的一個(gè)或多個(gè)患者；iii. 乂人所述多種抗體中選擇結(jié)合到至少50%的NK纟田月包的 一種抗體，這些NK細(xì)月包取自 一個(gè)或多個(gè)所述患者；并且iv. -使所述抗體適于對(duì)人類纟合藥。
44. 權(quán)利要求43的方法，其中該抗體致使它與之結(jié)合的所述NK 細(xì)月包纟皮4毛竭。
45. 權(quán)利要求43的方法，其中所述抗體結(jié)合至一種單一的受體， 該受體選自KIR2DL1、 KIR2DS1、 KIR2DL2、 KIR2DL3 、 KIR2DS4、 CD94、 NKG2A、 NKp30、 NKp44和NKp46所組成的組。
46. 權(quán)利要求43的方法，其中通過(guò)使人源化或嵌合而使所述抗體 適于對(duì)人類給藥。
47. 權(quán)利要求43的方法，進(jìn)一步包括將一種細(xì)胞毒性劑連接到所 述抗體的一個(gè)步驟。
48. 權(quán)利要求43的方法，其中所述細(xì)胞毒性劑是一種放射性同位 素、 一種毒性多肽、或一種毒性小分子。
49. ^L利要求43的方法，其中所述抗體結(jié)合到取自一個(gè)或多個(gè)所 述患者的至少60%的NK細(xì)力包上。
50. 權(quán)利要求43的方法，其中所述抗體結(jié)合到取自一個(gè)或多個(gè)所 述患者的至少70%的NK細(xì)力包上。
51. 權(quán)利要求43的方法，其中所述抗體結(jié)合到取自一個(gè)或多個(gè)所 述患者的至少80%的NK細(xì)力包上。
52. 權(quán)利要求43的方法，進(jìn)一步包括將一種細(xì)胞毒性劑連接到所 述抗體的一個(gè)步驟。
53. 權(quán)利要求43的方法，其中所述細(xì)胞毒性劑是一種放射性同位 素、 一種毒性多肽或一種毒性小分子。
54. ;t又利要求43的方法，其中所述抗體結(jié)合到取自一個(gè)或多個(gè)所 述患者的至少60%的NK細(xì)胞上。
55. 片又利要求43的方法，其中所述抗體結(jié)合到取自一個(gè)或多個(gè)所 述患者的至少70%的NK細(xì)力包上。
56. 權(quán)利要求43的方法，其中所述抗體結(jié)合到取自一個(gè)或多個(gè)所 述患者的至少80%的NK細(xì)力包上。
57. —種《且合物，包含利用4又利要求43至56中^壬一項(xiàng)的方法制備 的一種抗體。
58. 權(quán)利要求57的組合物，其中所述組合物包含多種抗體的一個(gè) 組合，其中至少一種抗體特異地識(shí)別多種NK受體。
59. —種藥物組合物，包含權(quán)利要求57至58中任一項(xiàng)的一種組合 物或片又利要求33至42中任一項(xiàng)的一種抗體，以及一種藥學(xué)上 可4妻受的載體。
60. —種試劑盒，包纟舌通過(guò)纟又利要求41或4又利要求44的方法制備 的 一種抗體，以及<吏用所述抗體治療 一種免疫增生性病癥的i兌 明書。
61. 用于庫(kù)毛竭一個(gè)哺乳動(dòng)物體內(nèi)NK細(xì)月包的一種方法，該方法包括-纟合予該哺乳動(dòng)物一種組合物，該組合物包含特異地結(jié)合至一種 NK受體的一種抗體，該NK受體選自KIR2DL1 、 KIR2DS1 、 KIR2DL2、 KIR2DL3、 KIR2DS4、 CD94、 NKG2A、 NKG2C、 NKG2D、 NKp30、 NKp44和NKp46戶斤纟且成的纟且。
62. 用于在一個(gè)哺乳動(dòng)物體內(nèi)減弱炎癥的一種方法，該方法包4舌消 除表達(dá)NKG2A的NK細(xì)胞和/或表達(dá)NKG2C的細(xì)月包。
63. 權(quán)利要求62的方法，其中消除了表達(dá)NKG2A的NK細(xì)胞和 表達(dá)NKG2C的細(xì)胞。
64. 4又利要求62的方法，其中消除NK或T細(xì)胞包括4吏所述NK 細(xì)胞接觸一種組合物，該組合物包含可特異地結(jié)合至一種NK 受體的一種抗體，該NK受體選自KIR2DL1、 KIR2DS1、 KIR2DL2、 KIR2DL3、 KIR2DS4、 CD94、 NKG2A、 NKG2C、 NKG2D、 NKp30、 NKp44和NKp46所組成的組。
65.斥又利要求61或62的方法，其中所述組合物包含4又利要求57 至58中任一項(xiàng)的一種組合物或權(quán)利要求33至42中任一項(xiàng)的 一種抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療增生性病癥、特別是免疫增生性和自身免疫性病癥的方法，并涉及生成與NK細(xì)胞受體結(jié)合的抗體的方法，這些抗體用于治療這些病癥的醫(yī)療方案，特別是用于耗竭與免疫增生病理相關(guān)的細(xì)胞。
文檔編號(hào)C07K16/28GK101300272SQ200680038141
公開日2008年11月5日 申請(qǐng)日期2006年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月14日
發(fā)明者烏爾里克·莫爾什, 弗朗索瓦·羅馬涅, 彼得魯斯·約翰內(nèi)斯·路易斯·斯佩, 阿萊斯山德羅·莫雷塔, 馬蒂厄·布萊里 申請(qǐng)人:依奈特制藥公司;熱那亞大學(xué);諾和諾德公司