專利名稱：Vegf活化的fas配體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療包括癌癥在內(nèi)的血管新生和/或血管生成失控相關(guān)性疾病 和失調(diào)的組合物和方法。更具體說，本發(fā)明提供了用于治療癌癥和諸如類風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎、黃斑變性和牛皮癬等疾病的含有VEGF受體胞外域和死亡配體的融合蛋白。
對聯(lián)邦資助下的研究和開發(fā)獲得的本發(fā)明的權(quán)利聲明 國防部前列腺癌研究計(jì)劃(DAMD17-02-1-0029)和乳腺癌研究計(jì)劃 (W81XWH-04-1-0745 BC032859)資助了本發(fā)明的工作。
背景技術(shù)：
血管新生是發(fā)生新血管的過程，包括原先己存在血管的毛細(xì)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、 遷移和組織浸潤。血管新生在包括胚胎發(fā)育、卵泡生長和傷口愈合等正常生理過程 中，以及包括腫瘤生長和非腫瘤疾病等病理狀況中至關(guān)重要，所述非腫瘤疾病包括 異常新血管形成，包括新生血管性青光眼(Folkman和Klagsbrun， Sc/e ce (1987)， 235:442-447)。
已經(jīng)確定血管新生和癌癥之間相關(guān)聯(lián)。新血管形成是從超常增生轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤過 程中的一個(gè)重要步驟，當(dāng)腫瘤直徑長到2-3以上和腫瘤轉(zhuǎn)移時(shí)必然發(fā)生新生血管形成 (Folkman， Nat Med (1995)， 1:27-30;綜述參見Bouck等，Adv in Cancer Res (1996)， 69:135-174)。在許多不同腫瘤類型(包括惡性膠質(zhì)瘤(Plate和Risau， GLIA (1995)， 15:339-347)以及乳腺癌(Horak等，Lancet (1992)， 340:1120-124)、膀胱癌(Dickinson 等，Br J Urol (1994)， 74:762-766)、結(jié)腸癌(Takahashi等，Cancer Res (1995)， 55:3964-3968)和子宮內(nèi)膜癌(Kirschner等，Am J Obstet Gynecol (1996)， 174: 1879-1882))中觀
察到微血管密度與疾病嚴(yán)重程度之間相關(guān)聯(lián)。
除癌癥以外，還有許多嚴(yán)重疾病與持續(xù)性血管新生失控有關(guān)。這些疾病受異常 的新血管形成控制。存在血管新生失控的疾病包括子宮內(nèi)膜異位，眼病(如黃斑變性)、
腰肌炎(psoiaris)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。關(guān)節(jié)炎是嚴(yán)重的衛(wèi)生保健問題。人類進(jìn)行性關(guān)節(jié) 炎可引起嚴(yán)重疼痛、關(guān)節(jié)活動(dòng)性受限和畸形以及總體生活質(zhì)量降低。在類風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎中，滑膜過度增殖(新血管輔助)并侵入而破壞軟骨。
抑制血管新生則能抑制新血管的形成，因此影響腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的產(chǎn)生。實(shí)際 上，估計(jì)消除一個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞可以抑制100個(gè)腫瘤細(xì)胞的生長(Thorpe等，Breast Cancer Research and Treatment (1995)， 36:237-251)。抑制新毛細(xì)血管形成可減輕類風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎中發(fā)生的關(guān)節(jié)破壞并中止疾病進(jìn)展。
迄今為止，已經(jīng)鑒定到數(shù)種血管新生因子(綜述參見Folkman， Nat Med (1995)， 1:27-30; Hanahan等，Cell (1996)， 86:353-364)，包括特別有效的血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF),也稱為VPF或血管營養(yǎng)素(vasculotropin)(綜述參見Ferrara， Trends Cardiovasc Med (1993), 3:244-250; Ferrara和Davis-Smyth, Endocrine Rev (1997)， 18:4-25)。不 像其它血管新生因子，在血管新生過程中VEGF的作用是內(nèi)皮細(xì)胞-特異性促分裂原 (Terman等，Biochem Biophys Res Commun (1992)， 187:1579-1586和Ferrara， Trends Cardiovasc Med (1993)， 3:244-250)。證明產(chǎn)生的抗VEGF抗體能抑制體內(nèi)腫瘤生長 (Kim等，Nature (1993)， 362:841-844)，這表明VEGF拮抗劑可能具有作為腫瘤誘導(dǎo) 血管新生的抑制劑的治療應(yīng)用。
許多人腫瘤細(xì)胞系在培養(yǎng)時(shí)都分泌VEGF，包括膠質(zhì)瘤(Tsai等，J Neurosurg (1995)， 82:864-867)、黑色素瘤(Claffey等，Cancer Res (1996)， 56:172-181)、胃癌細(xì) 胞(Zhang等，World J Gastroenterol (2002)， 8(6):994-8)、卡波西肉瘤和表皮狀癌細(xì)胞 (Myoken等，Proc Natl Acad Sci USA (1991)， 88:5819-5823)。更重要的是，對原代膠 質(zhì)瘤(Plate等，Lab Invest (1992)， 67:529-534; Plate等Int J Cancer (1994)， 59:520-529)、 成血管細(xì)胞瘤(Hatva等，Amer J Pathol (1996)， 148:763-775)以及乳腺癌(Toi等，Jpn. J Cancer Res (1994)， 85:1045-1049; Anan等，Surgery (1996)， 119:333-339; Yoshiji 等，Cancer Res (1996)， 56:2013-2016)、結(jié)腸癌(Brown等，Cancer Res (1993)， 53:4727-4735; Takahashi等，Cancer Res (1995)， 55:3964-3968)和腎細(xì)胞瘤(Takahashi等，Cancer Res (1994)， 54:4233-4237)的原位雜交或免疫組化已鑒定到VEGF的轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)。 在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中，在鄰近壞死區(qū)域的細(xì)胞中檢測到VEGF信使，這與缺氧時(shí)其上 調(diào)相一致(Shweiki等，Nature (1992)， 359， 843-845; Plate等，Lab Invest (1992)，
67:529-534)。有報(bào)道稱，垂體瘤(McCabe等，J Clin Endocrinol Metab (2002)， 87(9):4238-44)和黑色素瘤異種移植物(Graells等，J Invest Dermatol (2004)， 123(6): 1151-61)的VEGF mRNA和蛋白質(zhì)水平顯著升高。而且，癌癥患者的血清VEGF水 平顯著高于正常志愿者。在未經(jīng)治療的轉(zhuǎn)移性癌癥患者中觀察到VEGF濃度最高。
最初從濾泡星形細(xì)胞和各種腫瘤細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基中純化得到VEGF(Ferrara 等，BiochemBiophys Res Commun (1989)， 161:851-858; Plouet等，EMBOJ(1989)， 8:3801-3806)。 VEGF是一種同源二聚體糖蛋白，由兩個(gè)23kD亞基組成， 一般以二 聚多肽的形式結(jié)合其受體。編碼VEGF的人基因結(jié)構(gòu)由7個(gè)內(nèi)含子隔開的8個(gè)外顯 子組成。VEGF基因的mRNA交替剪接產(chǎn)生了五種不同的分子，其成熟單體含有121、 145、 165、 189或206個(gè)氨基酸殘基(Tisher等，J Biol Chem (1991)， 266: 11947-11954; Houck等，Mol Endocrinol (1991)， 5:1806-1814。只有缺少外顯子6編碼的殘基的 VEGF165是VEGF的成熟和活性形式。它結(jié)合于肝素和細(xì)胞表面肝素硫酸蛋白聚糖， 并可以表達(dá)成游離形式或細(xì)胞膜結(jié)合形式(Houck等，1992)。 VEGF206和VEGF 189 是膜結(jié)合形式。同時(shí)，近年來，已鑒定到許多VEGF結(jié)構(gòu)同源物VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D和胎盤生長因子(PlGF)(Klagsbrun和D'Amore, Cytokine Growth Factor Rev (1996)， 7:259-270;綜述參見Ferrara， J Mol Med (1999)， 77:527-543)。
已鑒定到VEGF用作高親和力配體的兩種酪氨酸激酶受體fims-樣酪氨酸激酶 -l(Flt-l或VEGFR-1)和激酶域受體(KDR/Flk-1或VEGFR-2)(Matthews等，Proc Natl Acad Sci USA (1991)， 88:9026-9030; Terman等，Biochem Bi叩hys Res Commun (1992)， 187:1579-1586; DeVries等，Science (1992)， 255:989-991; Millauer等，Cell (1993)， 72:835-846)。
雖然Flt-1結(jié)合VEGF的親和力比KDR高50倍(De Vries等，Science (1992)， 255:989-991)，但大多數(shù)VEGF的血管新生特性(促分裂性、趨化性和誘導(dǎo)形態(tài)改變) 是由與KDR相互作用所介導(dǎo)的(Waltenberger等，J Biol Chem (1994)， 269:26988-26995)。因此，最適合的是破壞VEGF與KDR之間的相互作用，以抑制 血管新生。
VEGF受體一般是III類受體型酪氨酸激酶，特征是其氨基末端胞外受體配體結(jié) 合域中含有數(shù)個(gè)，一般是5個(gè)或7個(gè)，免疫球蛋白樣環(huán)(Kaipainen等，JExpMed(1993)， 178:2077-2088)。另外兩個(gè)區(qū)域包括跨膜區(qū)和羧基末端胞內(nèi)催化域，它們之間插入了 不同長度的親水性激酶間序列，稱為激酶插入結(jié)構(gòu)域(Terman等，Oncogene(1991)， 6:1677-1683)。 此外，VEGF能結(jié)合于第三種受體一神經(jīng)氈蛋白-1。最初，神經(jīng)氈蛋白-l(NRP-l) 最初被描述為參與神經(jīng)元導(dǎo)向的協(xié)同受體，它能結(jié)合腦信號蛋白/腦衰蛋白家族成員 的神經(jīng)元。NRP-1也在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，相信它作為VEGFR-2的協(xié)同受體而促進(jìn)血 管新生(Gray等，Cancer Res. (2005)， 65(9):3664-70)。 NRP-1和VEGFR-2不直接相 互作用，而是通過一種VEGF同種型—VEGF165橋接而相互作用(Mac Gabhann和 Popel， Am J Physiol Heart Circ Physiol， (2005)， 288(6):H2851-60)。
因此，VEGF可能在多種癌癥，包括結(jié)腸癌、直腸癌、腎細(xì)胞(腎)癌、乳腺癌、 非小細(xì)胞肺癌和卵巢癌中具有廣泛作用。目前，阿瓦斯汀(AvastatinTM，貝伐單抗)已 被批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸或直腸癌患者，它是基因技術(shù)公司(Genetech)開發(fā)的一種 治療性抗體，設(shè)計(jì)用于抑制VEGF功能，從而干擾腫瘤的血供。其它阻斷血管新生 的方法采用VEGF受體的特異性單克隆抗體(如美國專利號5,955,331)、化合物如吲 哚啉酮(美國專利號6,846，839)或干擾VEGF而阻斷它與其相關(guān)受體相互作用的肽(如 美國專利號6,559,126)。
然而，目前的臨床試驗(yàn)治療方案以及本領(lǐng)域所知的通過防止VEGF結(jié)合腫瘤細(xì) 胞上其相關(guān)受體而阻斷腫瘤相關(guān)性新血管形成的治療方案都沒有嘗試殺傷腫瘤細(xì) 胞。這可能不是一項(xiàng)容易的任務(wù)，因?yàn)槌嗽谘苄律械闹饕饔猛?，VEGF還通 過干擾凋亡影響細(xì)胞存活(Bairey等，Leuk Res (2004)， 28(3):243-8)。
凋亡，或程序性細(xì)胞死亡，f多細(xì)胞生物體在發(fā)育和維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)過程中的重要 生理過程。凋亡至少部分由細(xì)胞表面受體蛋白Fas介導(dǎo)，該蛋白在免疫系統(tǒng)的發(fā)育和 功能中起到重要作用。已證明，F(xiàn)as系統(tǒng)功能障礙會(huì)引起淋巴增殖性疾病并加速自身 免疫病(Takahashi等，Cell (1994)， 76:969-976)。
Fas是分子量約為45 kD的I型膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體家族(Nagata 等，Science, 1995)， 267:1449)。 Fas作為細(xì)胞表面抗原將凋亡信號傳導(dǎo)給細(xì)胞。凋 亡性細(xì)胞死亡的特征是特征性的核和胞質(zhì)皺縮、膜出泡和染色體DNA降解，可區(qū)別 于因急性細(xì)胞損傷所致的壞死性細(xì)胞死亡。
許多組織和細(xì)胞系的Fas表達(dá)很弱，但發(fā)現(xiàn)心臟、肺、肝臟、卵巢和甲狀腺中 高水平表達(dá)(Watanabe-Fukunaga等，J Immunol (1992)， 148:1274)。 Fas與某些抗體如 APO-l(Trauth等，Science (1989)， 245:301)和抗-Fgs(Yonehara等，J Exp Med (1989),169:1747)或Fas的天然配體一Fas配體(FasL)結(jié)合而被觸發(fā)時(shí)，能傳導(dǎo)凋亡或 程序性細(xì)胞死亡的信號(Thompson， Science (1995)， 267:1456)。 Fas也在腫瘤細(xì)胞表 面表達(dá)。例如，用植入小鼠的實(shí)體瘤己在體內(nèi)證明抗-Fas抗體、FasL表達(dá)細(xì)胞或重
組FasL可有效誘導(dǎo)Fas-介導(dǎo)的腫瘤凋亡(Timmer等，J Pathol (2002)， 196(2):125-34)。 已克隆了人、大鼠和小鼠的FasL(Takahashi等，InternatImmunol (1994)， 6:1567; Suda等，Cell (1993)， 75:1169; Lynch等，Immunity (1994),1:131; Takahashi等, Ce〃(1994)， 76:969)。人FasL與大鼠FasL和小鼠FasL的胞外結(jié)構(gòu)域高度同源，人 FasL不僅能夠識別人Fas，而且能夠識別小鼠Fas和誘導(dǎo)凋亡。相似地，大鼠和小鼠 FasL能夠識別人Fas并誘導(dǎo)凋亡。FasL是II型膜蛋白，即具有胞外羧基末端結(jié)構(gòu)域 和胞內(nèi)氨基末端結(jié)構(gòu)域，屬于TNF蛋白家族，分子量約為40kD。(Suda等，Ce11(1993)， 75:1169)。 Fas配體在活化的淋巴細(xì)胞上、睪丸(Suda等，Cell (1993), 75:1169)和眼 中(GrifFlth等，Science (1995)， 270:1189)，以及一些細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞(CTL)細(xì)胞 系上(Rouvier等，J Exp Med (1993)， 177:195)強(qiáng)烈表達(dá)。
表達(dá)FasL的細(xì)胞以及純化的FasL蛋白(Suda和Nagata， J Exp Med(1994)， 179:873) 對表達(dá)Fas的細(xì)胞有細(xì)胞毒性。因此，F(xiàn)asL通過結(jié)合Fas傳導(dǎo)凋亡信號。另外，由 于與TNF相似，相信FasL可以用作三聚體，推測在各FasL單元的界面上結(jié)合1-3 個(gè)Fas分子。兩個(gè)或多個(gè)Fas分子與FasL三聚體結(jié)合應(yīng)引起Fas寡聚化，從而將凋 亡信號傳導(dǎo)給表達(dá)Fas的細(xì)胞。
總之，需要能夠產(chǎn)生具有以下聯(lián)合特性的可溶性化合物(i)VEGFR多肽的功能， 即結(jié)合VEGF多肽，(ii)中和VEGF介導(dǎo)的VEGFR活化的功能，從而防止腫瘤相關(guān) 性新血管形成和(iii)Fas配體與Fas受體相互作用的功能，即受體結(jié)合和/或激活受體 介導(dǎo)的途徑。這類化合物可用于殺傷分泌VEGF和表達(dá)F邱的癌細(xì)胞。然而，重組 蛋白技術(shù)的重大挑戰(zhàn)常常是以可溶性蛋白形式表達(dá)有生物活性的跨膜蛋白。本發(fā)明 克服了這些障礙，滿足了這些和其它需求。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了結(jié)合死亡受體的新型融合蛋白。本發(fā)明融合蛋白包含(i)結(jié)合血管 內(nèi)皮生長因子(VEGF)多肽的血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)多肽和(ii)包含寡聚結(jié) 構(gòu)域和死亡受體識別部分的死亡配體，其中VEGFR多肽的C末端連接于死亡配體 的N末端。
VEGFR-死亡配體融合蛋白可用于中和VEGF受體被VEGF活化的方法。這些 方法特別可用于誘導(dǎo)凋亡、在細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞毒效應(yīng)、治療癌癥和與血管新生和/或 血管生成失控相關(guān)性疾病或失調(diào)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，死亡受體是Fas，死亡配體是Fas配體。Fas配體
優(yōu)選為人Fas配體。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，該融合蛋白的VEGFR多肽包含VEGF受體-1 (VEGFR-1)的VEGF結(jié)合域或VEGF受體-2 (VEGFR-2)的VEGF結(jié)合域。VEGFR-1 和VEGFR-2優(yōu)選為人VEGFR-1和人VEGFR-2。 VEGFR-1和VEGFR-2還可來自小
鼠或大鼠。
本發(fā)明的優(yōu)選融合蛋白包含鼠VEGFR-2多肽和人Fas配體。優(yōu)選地，此融合蛋 白包含與SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23所示氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序 列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，該融合蛋白包含SEQIDNO:22或SEQIDNO:23 所示的氨基酸序列。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明融合蛋白還包含表位標(biāo)簽。優(yōu)選的表位標(biāo)簽是FLAG 樣標(biāo)簽或HA標(biāo)簽。優(yōu)選地，可切掉該表位標(biāo)簽。
可將幾種Fas配體多肽連接于VEGFR多肽。在優(yōu)選實(shí)施方式中，F(xiàn)as配體選自 (i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:ll的多肽；(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 12的多 肽；(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 13的多肽；和(iv)包含在(i)-(iii)中任一項(xiàng)氨基 酸序列中缺失、取代或添加一個(gè)至數(shù)個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的具有Fas結(jié)合活性 的多肽。
可將幾種VEGFR-1多肽連接于Fas配體。在優(yōu)選實(shí)施方式中，VEGFR-1多肽 選自(i)包含氨基酸序列SEQIDNO:20的多肽；(ii)包含SEQ ID NO: 19的氨基酸殘 基1-747的多肽；(iii)包含SEQ ID NO: 19的氨基酸殘基32-747的多肽；(iv)包含SEQ ID NO: 19的氨基酸殘基151-214的多肽；(v)包含SEQ ID NO:19的氨基酸殘基 230-327的多肽；(vi)包含VEGFR1的氨基酸129-230 (如

圖10所示的SDTG..NTII; 結(jié)構(gòu)域2(D2))的多肽和(vii)包含在(i)-(iv)中任一項(xiàng)氨基酸序列中缺失、取代或添加一 個(gè)至數(shù)個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的具有VEGF結(jié)合活性的多肽。
可將幾種VEGFR-2多肽連接于Fas配體。在優(yōu)選實(shí)施方式中，VEGFR-2多肽 選自(i)包含氨基酸序列SEQIDNO:l的多肽；(ii)包含氨基酸序列SEQIDNO:2的多 肽；(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的多肽；(iv)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的 多肽；(v)包含氨基酸序列SEQIDNO:5的多肽；(vi)包含氨基酸序列SEQ ID NO:6 的多肽；(vii)包含氨基酸序列SEQIDNO:l的氨基酸141-207的多肽；(iix)包含氨基 酸序列SEQ ID NO:l的氨基酸224-320的多肽；和(ix)包含在(i)-(iix)中任一項(xiàng)氨基 酸序列中缺失、取代或添加一個(gè)至數(shù)個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的具有VEGF結(jié)合 活性的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了編碼本發(fā)明融合蛋白的核酸。SEQIDNO: 14顯 示了優(yōu)選的核酸。另外，本發(fā)明提供了包含編碼本發(fā)明融合蛋白的核酸的載體。優(yōu) 選載體包含含有核苷酸序列SEQ ID NO: 14的核酸。
本發(fā)明還提供了調(diào)節(jié)死亡受體介導(dǎo)途徑的方法。該方法包括使表達(dá)死亡受體的 細(xì)胞與含有以下組分的融合蛋白相接觸的步驟(i)結(jié)合VEGF蛋白的VEGFR多肽； 和(ii)包含寡聚化結(jié)構(gòu)域和死亡受體識別部分的死亡配體；其中所述VEGFR多肽己 結(jié)合VEGF蛋白，所述融合蛋白的含量能有效調(diào)節(jié)死亡受體介導(dǎo)途徑。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，F(xiàn)as-介導(dǎo)途徑是凋亡。在這種方法中，融合蛋白的 含量能有效誘導(dǎo)凋亡。
可以在體外和體內(nèi)實(shí)施本發(fā)明方法。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，表達(dá)死亡受體的細(xì)胞是癌細(xì)胞，優(yōu)選過度表達(dá) VEGF的癌細(xì)胞。所述癌細(xì)胞選自乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤 或卵巢癌。
在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方式中，調(diào)節(jié)除癌癥外疾病中的Fas-介導(dǎo)途徑。優(yōu)選疾 病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬或黃斑變性。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，調(diào)節(jié)死亡受體-介導(dǎo)途徑的方法包括使表達(dá)死亡受 體的細(xì)胞與化療藥接觸的步驟。優(yōu)選的化療藥選自喜樹堿、依托泊甙、雙吲哚基 馬來酰亞胺VIII、順鉑、紫杉醇、多柔比星、替莫唑胺、硼替佐米、LY294002或丙 戊酸。
本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明融合蛋白和藥學(xué)上可接受的賦形劑、運(yùn)載體和/或稀 釋劑的藥物組合物。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種包含載體和藥學(xué)上可接受的賦形劑、運(yùn)載體和/ 或稀釋劑的組合物，其中所述載體包含具有SEQIDNO: 14所示核苷酸序列的核酸。
附圖簡要說明
圖1顯示了本發(fā)明融合蛋白的示意圖，如VEGFR-FasL。該圖顯示，(i)單體融 合蛋白，(ii)在沒有VEGF的情況下三聚體融合蛋白產(chǎn)生無功能的FasL，不能誘導(dǎo)顯 著的凋亡和(iii)VEGF-誘導(dǎo)融合蛋白寡聚化而產(chǎn)生有功能的FasL，它能夠誘導(dǎo)凋亡。 V:V表示兩個(gè)VEGF分子的結(jié)合。
圖2顯示了人(H)(GenBank登錄號P48023)、小鼠(M)(GenBank登錄號A53062) 和大鼠(R)(GenBank登錄號A49266)的FasL蛋白序列的比對結(jié)果。星號表示小鼠和
大鼠FasL與人FasL的相同氨基酸殘基。指出了胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、切割位 置、三聚體結(jié)構(gòu)域和受體結(jié)合域。FasL-Fas結(jié)合域的N末端邊界尚未闡明。
圖3顯示了人(GenBank登錄號NP-002244)、小鼠(GenBank登錄號P35918)和大 鼠(GenBank登錄號NPJ)37914)的VEGFR-2蛋白序列與人VEGFR-l(GenBank登錄 號NM—002019)的胞外和跨膜區(qū)的比對結(jié)果。星號表示小鼠和大鼠VEGFR-2與人 VEGFR-2的相同氨基酸殘基。指出了 VEGFR-2序列的信號序列、IgG-樣結(jié)構(gòu)域1-7 和跨膜結(jié)構(gòu)域。
圖4顯示了注釋的人神經(jīng)氈蛋白-1胞外結(jié)構(gòu)域的序列(Genbank AAC12921的一 部分)。指出了鑒定的各結(jié)構(gòu)域。B結(jié)構(gòu)域參與結(jié)合VEGF。
圖5描述了 VEGFR/FasL融合蛋白編碼核酸Flk(Dl-D3)+FasL(139-281)的構(gòu)建。
詳見實(shí)施例2。
圖6描述了 VEGFR/FasL融合蛋白編碼核酸FLAG/FlkhFasL(Dl-D3/139-28l)的 構(gòu)建。詳見實(shí)施例3。
圖7顯示了 FlkFasL的cDNA序列。下劃線表示Flk-l信號序列和胞外結(jié)構(gòu)域序 列的核苷酸序列；正常字體顯示接頭的核苷酸序列；粗體表示FasL的核苷酸序列。
圖8顯示了 FlkFasL的氨基酸序列。斜體字表示Flk-l信號肽的氨基酸序列；下 劃線表示Flk-l胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列；正常字體顯示接頭的氨基酸序列；粗體表 示FasL的核苷酸序列。
圖9顯示了 FLAG-標(biāo)記的Rl[D2]FasL的核酸序列。斜體為前胰蛋白酶原的先 導(dǎo)序列；下劃線為FLAG表位標(biāo)簽序列；下劃線和粗體為VEGFR1結(jié)構(gòu)域2;標(biāo)準(zhǔn) 字體為編碼ARGTS的接頭序列；粗體為FasL三聚化和Fas受體結(jié)合域。詳見實(shí)施 例3。
圖10顯示了Rl[D2]FasL的氨基酸序列，用單字母編碼表示氨基酸殘基。詳見 實(shí)施例3。
圖11A顯示了 Cos-7細(xì)胞中FlkFasL三聚體的表達(dá)。用DEAE-右旋糖苷法以對 照質(zhì)粒pSV/Neo(泳道A)或質(zhì)粒pBJ/FlkFasL(泳道B-D)轉(zhuǎn)染Cos-7細(xì)胞。在泳道B中， 用1嗎質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞30分鐘；在泳道C中，用3嗎質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染30分鐘； 泳道D，用3嗎質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染3小時(shí)。裂解轉(zhuǎn)染細(xì)胞44小時(shí)后，用PAGE電泳分 析裂解物，并用VEGFR-2胞外結(jié)構(gòu)域抗體進(jìn)行免疫印跡。圖11B顯示了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的 CHO細(xì)胞表達(dá)的R2FasL。 Western印跡法檢測了條件培養(yǎng)基中經(jīng)抗VEGFR2抗體借 助FLAG-標(biāo)簽純化后的R2FasL。詳見實(shí)施例4。
圖12顯示FlkFasL以VEGF-依賴性方式殺傷Jurkat細(xì)胞。將含有FlkFasL的不 同量的條件培養(yǎng)基加入Jurkat細(xì)胞中。數(shù)據(jù)表示為每個(gè)血球計(jì)視野中的平均細(xì)胞數(shù) ±SEM。就一些數(shù)據(jù)點(diǎn)而言，、SEM小于所用的圖標(biāo)。詳見實(shí)施例5。
圖13顯示FlkFasL殺傷Jurkat細(xì)胞取決于VEGF用量。將不同量的VEGF-165 加入Jurkat細(xì)胞中。數(shù)據(jù)表示為每個(gè)血球計(jì)視野中的平均細(xì)胞數(shù)士SEM。就一些數(shù)據(jù) 點(diǎn)而言，SEM小于所用的圖標(biāo)。詳見實(shí)施例6。
圖14顯示FlkFasL以VEGF-依賴性方式誘導(dǎo)凋亡。用對照條件培養(yǎng)基(C)或含 有FlkFasL的條件培養(yǎng)基(F)以所示的1 pL或5 體積培育Jurkat細(xì)胞。再用2 nM VEGF-165處理細(xì)胞(V)或不處理(-)60分鐘。用FACS分析膜聯(lián)蛋白V-陽性/碘化丙錠 陰性細(xì)胞，從而評估對凋亡的誘導(dǎo)。詳見實(shí)施例7。
圖15顯示在人乳腺癌細(xì)胞系中誘導(dǎo)凋亡。用25 ^L對照質(zhì)粒pSV/Neo(對照CM) 或質(zhì)粒FlkFasL(FlkFasL CM)轉(zhuǎn)染的Cos-7細(xì)胞的條件培養(yǎng)基處理T-47D人乳腺癌細(xì) 胞。在右圖中，再用2 nM VEGF-165處理細(xì)胞。處理后24小時(shí)，對細(xì)胞拍照。中圖 中顯示FlkFasL誘導(dǎo)很少的細(xì)胞死亡。右圖中細(xì)胞死亡顯著增加證明，F(xiàn)lkFasL凋亡 活性受VEGF的調(diào)控。詳見實(shí)施例8。
圖16顯示在人乳腺癌細(xì)胞系中用FlkFasL刺激的細(xì)胞毒性。用25 pL對照質(zhì)粒 pSV/Neo(B)或質(zhì)粒FlkFasL(C和D)轉(zhuǎn)染的Cos-7細(xì)胞的條件培養(yǎng)基處理T-47D人乳 腺癌細(xì)胞。還用2 nM VEGF-165處理D中的細(xì)胞。泳道A中沒有加入條件培養(yǎng)基。 處理后24小時(shí)，對細(xì)胞拍照。48小時(shí)后，通過定量釋放到細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的乳 酸脫氫酶(LDH)測定細(xì)胞毒應(yīng)答反應(yīng)。詳見實(shí)施例9。
圖17顯示，R2FasL在U87MG人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞和DU145人前列腺癌細(xì)胞 中誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性或凋亡，但在U373人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞中沒有這種作用。A. R2FasL在U87MG細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞毒性，VEGF(抗-VEGF Ab)或FasL (抗-FasL Ab) 的中和抗體能抑制這種作用。B. R2FasL在U87MG成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞死 亡，VEGF(抗-VEGFAb)或FasL(抗-FasLAb)的中和抗體能抑制這種作用。C. R2FasL 在DU145人前列腺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。CM，條件培養(yǎng)基。D. R2FasL在U373 成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞中不誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。詳見實(shí)施例10。
圖18描述了 Rl[D2]FasL的凋亡活性。A. Rl[D2]FasL以VEGF-依賴性方式誘 導(dǎo)凋亡。加入重組人VEGF (rhV165)，濃度為2 nM。對照中不加VEGF(無V)。 B.人 和小鼠VEGF-165;人VEGF-121、人VEGF:P1GF異源二聚體和人P1GF能激活 Rl[D2]FasL。 C. hVEGF-165對Rl[D2]FasL的ED50約為100 pM。詳見實(shí)施例11。
.圖19描述了化療藥能增強(qiáng)R2FasL活性。A. Bis VIII、喜樹堿和依托泊甙增強(qiáng) R2FasL對U87MG成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡活性。B. Bis VIII、喜樹堿和依托泊甙能 增強(qiáng)R2FasL對U87MG成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。詳見實(shí)施例12。
圖20A描述了在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中R2FasL+VEGF不誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。圖20B 描述了在牛腎上腺皮質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞(微血管內(nèi)皮細(xì)胞)中R2FasL+VEGF誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。 詳見實(shí)施例13。
圖21A描述了人和小鼠VEGF-165(分別是hVEGF和mVEGF)均能激活R2FasL。 圖21B顯示，VEGF-165的ED50為20-200 pM。詳見實(shí)施例14。
發(fā)明詳述
I.定義
除非另有說明，本文所用的所有科技術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員共同理
解的含義。以下參考文獻(xiàn)為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了許多本發(fā)明所用術(shù)語的通用定義
Singleton等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (微生物禾卩分子生物學(xué) 字典，第二版，1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (劍橋科技 字典，Walker等，1988); The Glossary of Genetics(遺傳學(xué)術(shù)語表)，第5版，R. Rieger 等(編)，Springer Verlag(施普林格出版社)(l991);以及Hale和Marham， The Harper Collins Dictionary of Biology(哈珀柯林斯生物學(xué)字典，1991)。本文所用的以下術(shù)語具 有其固有含義，除非另有說明。
術(shù)語"氨基酸"指天然產(chǎn)生和合成的氨基酸，以及功能類似于天然產(chǎn)生的氨基酸 的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然產(chǎn)生的氨基酸是遺傳密碼編碼的氨基酸，以 及隨后作了修飾的氨基酸，如羥基脯氨酸，Y-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。"氨基酸 類似物"指與天然產(chǎn)生的氨基酸基本化學(xué)結(jié)構(gòu)相同，如a碳結(jié)合于氫、羧基、氨基和 R基團(tuán)的化合物，如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這些 類似物可能含有修飾的R基團(tuán)(如正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但保留了與天然產(chǎn)生的 氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。"氨基酸模擬物"指其結(jié)構(gòu)與氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)不 同，但功能類似于天然產(chǎn)生的氨基酸的化合物。
本文中采用共知的三字母符或IUPAC-IUB生化命名委員會(huì)推薦的單字母符表示 氨基酸。同樣，采用共同接受的單字母編碼表示核苷酸。
本文所用的"生物學(xué)樣品"是含有核酸或多肽的生物組織或液體的樣品。這類樣 品一般來自人，但包括分離自非人靈長動(dòng)物或嚙齒動(dòng)物，如小鼠和大鼠的組織。生
物學(xué)樣品還包括組織切片，如活檢樣品或尸檢樣品，為組織學(xué)目的取得的冰凍切片， 血液、血漿、血清、痰液、糞便、眼淚、粘膜、毛發(fā)、皮膚等。生物學(xué)樣品也包括 衍生自患者組織的外植體和原代和/或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)物。"生物學(xué)樣品"也指動(dòng)物的 細(xì)胞或細(xì)胞群或者一定量的組織或液體。最常見的是，從動(dòng)物取得生物學(xué)樣品，但 術(shù)語"生物學(xué)樣品"也可指體內(nèi)分析的細(xì)胞或組織，即不從動(dòng)物(體內(nèi))取得的細(xì)胞或組 織。 一般地，"生物學(xué)樣品"含有動(dòng)物的細(xì)胞，但該術(shù)語也可指可用于測定癌癥相關(guān)性 多核苷酸或多肽水平的非細(xì)胞生物物質(zhì)，如血液、唾液或尿液的非細(xì)胞組分。本發(fā) 明可采用許多類型的生物學(xué)樣品，包括但不限于組織活檢樣品、血液樣品、血清 樣品或唾液樣品。本文所用的"組織活檢樣品"指從動(dòng)物(優(yōu)選人)取得、用于診斷分析 的一定量的組織。在癌癥患者中，可切取腫瘤組織，以分析腫瘤內(nèi)的細(xì)胞。"組織活 檢樣品"可指任何類型的活檢樣品，如穿剌活檢樣品、細(xì)針穿剌活檢樣品、手術(shù)活檢 樣品等。
"提供生物學(xué)樣品"指獲得用于本文所述方法的生物學(xué)樣品。最常見的是，從患 者取得細(xì)胞樣品完成這一過程，但也可采用以前分離(如由其他人分離、在其它時(shí)間 分離和/或因另一目的分離)的細(xì)胞來完成這一過程，或在體內(nèi)進(jìn)行本發(fā)明方法完成這 一過程。也可采用具有治療或療效歷史的保藏組織。
術(shù)語"細(xì)胞生長的改變"指細(xì)胞在體外或體內(nèi)的生長和增殖特性的任何改變，如 形成細(xì)胞灶、貼壁依賴性、半固體或軟瓊脂生長、接觸抑制和生長密度限度的改突、 丟失對生長因子或血清的需求、細(xì)胞形態(tài)的改變、獲得或失去永生化、獲得或失去 腫瘤特異性標(biāo)記、注射到合適的動(dòng)物宿主中時(shí)能夠形成或抑制腫瘤，和/或細(xì)胞的永
生化。參見例如，F(xiàn)reshney， Culture of Animal Cell a Manual of Basic Technique(動(dòng)物 細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)手冊)，第231-241頁(第3版，1994)。
"保守性修飾變體"適用于氨基酸和核酸序列。提到具體核酸序列時(shí)，保守性修 飾變體指編碼相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者該核酸不^碼氨基酸序列 時(shí)，指基本相同或相關(guān)(如天然毗連)的序列。由于遺傳密碼的簡并性，大量功能相同 的核酸編碼大多數(shù)蛋白質(zhì)。例如，密碼子GCA、 GCC、 GCG和GCU均編碼丙氨酸。 因此，對某密碼子所確定的每個(gè)位置丙氨酸，可將該密碼子改變成所述相應(yīng)密碼子 中的另一個(gè)，而不改變編碼的多肽。這類核酸變異是"沉默變異"，是保守性修飾變 異的一種形式。本文中編碼多肽的每個(gè)核酸序列也含有所述核酸的沉默變異。本領(lǐng) 域技術(shù)人員知道，在某些情況下，可修飾核酸中各密碼子(除AUG和TGG以夕卜，AUG 是甲硫氨酸的唯一密碼子，TGG是色氨酸的唯一密碼子)，而產(chǎn)生功能相同的分子。
因此，就表達(dá)產(chǎn)物而言，編碼多肽的核酸的沉默變異常常是暗含于所述序列中，但 對實(shí)際探針序列而言則并非如此。
至于氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到，改變、加入或缺失編碼序列中的 一個(gè)氨基酸或一小部分氨基酸的核酸，肽，多肽或蛋白質(zhì)序列中的單個(gè)取代、缺失 或添加是"保守性修飾的突變體"，其中所述改變導(dǎo)致用化學(xué)上相似的氨基酸取代另一 氨基酸。本領(lǐng)域熟知可提供功能相似的氨基酸保守取代表。這類保守性修飾變體是 額外的，不排除多態(tài)性突變體、種間同源物和本發(fā)明等位基因，它們一般互為保守 取代l)丙氨酸(A)、甘氨酸(G); 2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E); 3)天冬酰胺(N)、谷胺
酰胺(Q); 4)精氨酸(R)、賴氨酸(K); 5)異亮氨酸(1)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨 酸(V); 6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W); 7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);和8)半胱 氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(參見例如，Creighton， Proteins(1984))。
"癌細(xì)胞"、"轉(zhuǎn)化"細(xì)胞或在組織培養(yǎng)物中"轉(zhuǎn)化"指自發(fā)性或誘導(dǎo)性表型的改變， 不一定包括攝入新的遺傳物質(zhì)。雖然可通過轉(zhuǎn)化病毒的感染和新基因組DNA的摻 入，或攝入外源性DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化，但也可自發(fā)產(chǎn)生或接觸致癌物后內(nèi)源性基因發(fā)生 突變而產(chǎn)生。轉(zhuǎn)化伴有表型改變，例如細(xì)胞永生化、異常生長控制、非形態(tài)改變和/ 或變成惡性(參見Freshney， Culture of Animal Cell a Manual of Basic Technique (動(dòng)物 細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)手冊，第3版，1994))。
術(shù)語"死亡配體"指可結(jié)合死亡受體和結(jié)合后誘導(dǎo)細(xì)胞殺傷作用的哺乳動(dòng)物蛋白 家族。示范性死亡配體包括但不限于FasL、腫瘤壞死因子(TKF)、淋巴毒素(LT)和 腫瘤壞死因子-相關(guān)性凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)。死亡配體多肽通常包含寡聚化結(jié)構(gòu)域 和死亡受體識別部分。
術(shù)語"死亡受體"指哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面上表達(dá)的、可結(jié)合死亡配體并且在結(jié)合死 亡配體后寡聚化而誘導(dǎo)細(xì)胞殺傷作用的哺乳動(dòng)物蛋白家族。死亡受體多肽通常包含 寡聚化結(jié)構(gòu)域和死亡配體識別部分。8種死亡受體和死亡受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的綜述參見 Lavrik等，JCellSci， (2005)， 118(Pt2):265-7，全文納入本文作參考。示范性死亡受 體包括但不限于腫瘤壞死因子受體l(TNFRl;也稱為DR1、 CD120a、 p55和p60)、 CD95 (也稱為DR2、 APO-I和Fas)、 DR3 (也稱為APO-3、 LARD、 TRAMP和WSLl)、 TNF-相關(guān)性凋亡誘導(dǎo)配體受體l(TRAILRl;也稱為DR4和APO-2)、 TRAILR2(也稱 為DR5、 KILLER和TRICK2)、 DR6、外異蛋白(ectodysplasin)A受體(EDAR)和神經(jīng) 生長因子受體(NGFR)。它們的區(qū)別是稱為死亡結(jié)構(gòu)域(DD)的 80個(gè)殘基的胞質(zhì)區(qū)。 當(dāng)這些受體被相應(yīng)配體激發(fā)時(shí)，將許多分子征集到DD附近，隨后激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級
聯(lián)反應(yīng)。死亡配體還與不含有DD因此無法形成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物的引誘受體(DcR)相 互作用。迄今為止，已經(jīng)鑒定到四種引誘受體TRAILR3(也稱為DcRl)、 TRAILR4 (也 稱為DcR2)、 DcR3和護(hù)骨蛋白(OPG)。
術(shù)語"死亡受體識別部分"指死亡配體中作為與死亡受體結(jié)合充分所必需的亞域。
術(shù)語"測定功能作用"指測定化合物提高或降低間接或直接受本發(fā)明融合蛋白如 VEGFR-FasL影響的參數(shù)，如功能、酶學(xué)、物理和化學(xué)作用?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員 己知的任何方式測定這類功能作用，如光譜特征(如熒光、吸光度、折射率改變，蛋 白質(zhì)的水動(dòng)力學(xué)(如形狀)、色譜學(xué)或溶解性能的改變，測定誘導(dǎo)型標(biāo)記物或本發(fā)明融 合蛋白如VEGFR-FasL的轉(zhuǎn)錄激活；測定結(jié)合活性，如與死亡受體的結(jié)合，測定細(xì) 胞增殖，測定凋亡等等。也可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員己知試驗(yàn)，如體外試驗(yàn)測定化合 物對癌癥的功能作用，所述試驗(yàn)包括(例如)細(xì)胞在軟瓊脂上生長；貼壁依賴性；接觸 抑制和生長密度限度；細(xì)胞增殖；細(xì)胞轉(zhuǎn)化；生長因子或血清依賴性；腫瘤特異性 標(biāo)記物水平；侵入基質(zhì)膠；體內(nèi)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移；發(fā)生轉(zhuǎn)移的細(xì)胞中的mRNA和蛋 白質(zhì)表達(dá)以及癌細(xì)胞的其它特征?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的許多方法評估這 些功能作用，例如，定量或定性地測定形態(tài)特征改變的顯微鏡觀察法，測定RNA或 蛋白質(zhì)水平改變，測定RNA穩(wěn)定性，鑒定下游或報(bào)告基因的表達(dá)(CAT、熒光素酶、 (3-gal、 GFP等)，例如通過化學(xué)發(fā)光、熒光、比色反應(yīng)、抗體結(jié)合、誘導(dǎo)型標(biāo)記物和 配體結(jié)合試驗(yàn)進(jìn)行測定。"功能作用"包括體外、體內(nèi)和離體活性。
治療疾病的化合物的"有效量"是足以改善、或以某種方式減輕癥狀，或者中止 或逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)程的用量。通過給予具體藥物組合物改善具體疾病的癥狀，指可能相 關(guān)的任何減輕，無論是永久或暫時(shí)性、持續(xù)性或瞬時(shí)性減輕。
"表達(dá)載體"是重組或合成產(chǎn)生的含有一系列特殊核酸元件的核酸構(gòu)建物，這些 特殊元件能夠使該具體核酸在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。表達(dá)載體可以是質(zhì)粒、病毒或核酸 片段部分。表達(dá)載體通常包含要轉(zhuǎn)錄的操作性連接于啟動(dòng)子的核酸。
術(shù)語"FasL"或"Fas配體"指分離核酸，多肽和多態(tài)性變體、等位基因、突變體和 其種間同源物，進(jìn)一步描述如下(1)優(yōu)選在至少約50、 75、 100、 150、 200、 250或 281個(gè)氨基酸的區(qū)域上，其氨基酸序列與下述人FasL序列的氨基酸序列相同性大于 約600/。、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%，優(yōu)選91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%或更高；(2)它能結(jié)合于用含有下述氨基酸序列的免疫原產(chǎn)生 的抗體(如多克隆抗體)或其保守性修飾變體；(3)它能結(jié)合FasL結(jié)合蛋白；(4)它能與
天然產(chǎn)生的Fas配體競爭結(jié)合Fas配體結(jié)合蛋白；(5)它能在含有膜結(jié)合性FasL結(jié)合 蛋白的細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡；(6)它能在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下特異性雜交于下述核酸序列，或 其保守修飾變體；(7)優(yōu)選在至少約100、 200、 300、 400或更多個(gè)核苷酸的區(qū)域上， 其核酸序列與SEQ ID NO: 16(人FasL)的核苷酸序列相同性約為90。/。，優(yōu)選大于約 96%、 97%、 98%、 99%或更高；和/或(8)它含有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO: ll(人 FasL)的至少25個(gè)，常常是50、 75、 100、 125或143個(gè)毗連氨基酸殘基。FasL多肽 可具有本文所述的寡聚結(jié)構(gòu)域和死亡受體識別結(jié)構(gòu)域。
FasL多核苷酸或多肽序列一般來自人，但也可來自其它哺乳動(dòng)物，例如但不限 于非人靈長動(dòng)物，嚙齒動(dòng)物如大鼠、小鼠或倉鼠；牛、豬、馬、綿羊或其它哺乳動(dòng) 物。因此，在一些實(shí)施方式中，本文所述的FasL多肽和FasL亞域多肽可包含對應(yīng) 于人FasL序列的序列。因此，本文提供了示范性FasL，它們是本領(lǐng)域已知的。例如， 人FasL多肽的GenBank登錄號是P48023。小鼠FasL多肽的GenBank登錄號是(例 如)A53062;大鼠FasL的GenBank登錄號是A49266。
術(shù)語"FasL結(jié)合蛋白"指能與FasL結(jié)合的多肽。
FasL"同源物"或VEGFR"同源物"指包含類似于FasL或VEGFR的氨基酸序列、 但不一定具有與FasL或VEGFR相似或相同功能的多肽。
FasL"同種型"或VEGFR"同種型"分別指由同一基因編碼，但pi或MW或二者 皆不同的FasL或VEGFR的變體。這類同種型的氨基酸組成可能不同(例如，由于交 替剪接或有限水解所致)，此外或或者，可能由不同的翻譯后修飾(如糖基化、?；?或磷酸化)產(chǎn)生。
本文所用的FasL"直向同源物"或VEGFR"直向同源物"指(i)包含類似于人FasL 或VEGFR的氨基酸序列和(ii)具有與人FasL或VEGFR相似或相同功能的非人多肽。
本文所用的FasL"相關(guān)"多肽指FasL同源物、FasL同種型或FasL直向同源物。 本文所用的VEGFR"相關(guān)"多肽指VEGFR同源物、VEGFR同種型或VEGFR直向同 源物。
"宿主細(xì)胞"是含有表達(dá)載體并能支持該表達(dá)載體復(fù)制或表達(dá)的天然產(chǎn)生的細(xì)胞 或轉(zhuǎn)化細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是培養(yǎng)的細(xì)胞、外植體、體內(nèi)的細(xì)胞等。宿主細(xì)胞可以 是原核細(xì)胞如大腸桿菌(E. co/f)或真核細(xì)胞如酵母、昆蟲細(xì)胞、兩棲動(dòng)物細(xì)胞或哺乳 動(dòng)物細(xì)胞，如Cos細(xì)胞(如Cos-7)、 CHO、 293、 3T3、 HeLa等細(xì)胞(參見例如，American Type Culture Collection(美國典型培養(yǎng)物保藏中心))。
提到兩種或多種核酸或多肽序列時(shí)，術(shù)語"相同"或"相同性"百分?jǐn)?shù)指采用BLAST或BLAST 2.0序列比較算法(默認(rèn)參數(shù)如下)或通過手工比對和目測測定，兩 種或多種序列或子序列的特定區(qū)域相同，或區(qū)域中一定百分?jǐn)?shù)的氨基酸殘基或核苷 酸相同(即，對比較窗口或指定區(qū)域作比較和比對的最大對應(yīng)性，約60%相同，優(yōu)選 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或更多相同)(參見例如，NCBI網(wǎng)站http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/等)。稱 這類序列"基本相同"。此定義還指，或可應(yīng)用于測試序列的互補(bǔ)性。該定義還包括含 有缺失和/或添加的序列，以及含有取代的序列，以及天然產(chǎn)生的(如)多態(tài)性或等位 基因變體和人造變體。下述的優(yōu)選算法可計(jì)算缺口等。優(yōu)選地，在長度為至少約25 個(gè)氨基酸或核苷酸的區(qū)域上，或更優(yōu)選在長度為50-100個(gè)氨基酸或核苷酸的區(qū)域上 存在相同性。
在序列比較中， 一般將一種序列用作參比序列，將測試序列與其作比較。采用 序列比較算法時(shí)，將測試和參比序列輸入計(jì)算機(jī)，如果需要，指定子序列的坐標(biāo)， 并指定序列算法程序參數(shù)。優(yōu)選采用默認(rèn)的程序參數(shù)，或者可指定其它參數(shù)。然后， 、用該序列比較算法根據(jù)程序參數(shù)計(jì)算測試序列相對于參比序列的序列相同性百分 數(shù)。
本文所用的"比較窗口 "包括一般選自約20-600、通常約50-200、更通常約100-150 個(gè)毗連位置中的一段序列，其中在兩種序列最優(yōu)比對后將測試序列與毗連位置數(shù)相 同的參比序列作比較。本領(lǐng)域熟知用于比較的序列比對方法?？赏ㄟ^(例如)Smith和 Waterman, AdvApplMath 2:482 (1981)的局部同源性算法；Needleman和Wunsch， J Mol Bio. 48:443 (1970)的同源比對算法；Pearson和Lipman， Proc Nat'l Acad Sci. USA 85:2444(1988)的相似性搜索法；這些算法的計(jì)算機(jī)執(zhí)行(威斯康星遺傳學(xué)軟件包 (Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、 BESTFLT、 FASTA和TFASTA，遺 傳學(xué)計(jì)算組(Genetics Computer Group), 575 Science Dr.，威斯康星州麥迪遜)或手動(dòng)比 對和目觀!l(參見例如，Current Protocols in Molecular Biology(新編分子生物學(xué)方 法)(Ausubel等編，1995增刊))進(jìn)行最優(yōu)序列比對，以便進(jìn)行比較。
適合測定序列相同性和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法的優(yōu)選例子包括BLAST和 BLAST 2.0算法，參見Altschul等，Nucl Acids Res 25:3389-3402 (1977)和Altschul等， J Mol Biol 215:403-410 (1990)。采用BLAST和BLAST 2.0和本文所述參數(shù)來測定本 發(fā)明核酸和蛋白質(zhì)的序列相同性百分?jǐn)?shù)。公眾可以通過國家生物技術(shù)信息中心 (National Genter for Biotechnology Information)(http:〃www.ncbi.nhn.nih.gov/)獲f導(dǎo)進(jìn)《于 BLAST分析的軟件。這種算法包括首先通過鑒定查詢序列中長W的短字來鑒定用
同樣長度的字在數(shù)據(jù)庫序列中比對時(shí)能匹配或滿足某些陽性評價(jià)閾值評分T的高評
分序列對(HSP)。 T稱為相鄰字評分閾值(Altschul等，同上)。這些初始相鄰的字命中 可用作種子來啟動(dòng)搜索找到含有它們的較長HSP。字命中沿各序列在兩個(gè)方向上延 伸，直至提高累積的比對評分。就核苷酸序列而言，可采用(例如)參數(shù)M(—對匹配 殘基的獎(jiǎng)分；總是>0)和N(錯(cuò)配殘基的罰分；總是O)來計(jì)算累積評分。就氨基酸序
列而言，用評分矩陣計(jì)算累積評分。.當(dāng)累積比對評分由最大獲得值下降至X;由于
累積了一個(gè)或多個(gè)陰性比對殘基的評分，或達(dá)到任一序列的末端時(shí)，累積評分接近
零或零以下；中止字命中在二方向上的延伸。BLAST算法參數(shù)W、 T和X決定了比 對的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)所用的默認(rèn)參數(shù)為字長(W) 11， 預(yù)計(jì)值(E)IO， M=5， N^4和比較兩條鏈。就氨基酸序列而言，BLASTP程序所用的 默認(rèn)參數(shù)為字長3，預(yù)計(jì)值(E) 10， BLOSUM62評分矩陣(參見Henikoff和Henikoff， ProcNatlAcadSciUSA89:10915 (1989))比對(B) 50，預(yù)計(jì)值(E) 10， M=5, N;4和比 較兩條鏈。
BLAST算法也對二序列之間的相似性進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(參見例如，Karlin和 Altschul， Proc Natl Acad Sci USA 90:5873-5787 (1993))。 BLAST算法提供的一種相似 性測定方法是最小總和概率(P(N))，它說明兩種核苷酸或氨基酸序列之間偶然發(fā)生匹 配的概率。例如，如果將某測試核酸與參比核酸作比較時(shí)最小的總和概率小于約0.2， 更優(yōu)選小于約0.01，最優(yōu)選小于約0.001，則認(rèn)為該核酸類似于參比序列。對數(shù)值可 以是大負(fù)數(shù)，如5、 10、 20、 30、 40、 40、 70、 90、 110、 150、 170等。
如果第一種核酸編碼的多肽能夠與第二種核酸編碼的多肽的抗體發(fā)生免疫交叉 反應(yīng)，則表明這兩種核酸序列或多肽基本相同，如下所述。因此，例如，當(dāng)兩種肽 的區(qū)別僅僅在于保守取代時(shí)，該多肽與第二種多肽基本相同。當(dāng)兩種分子或其互補(bǔ) 物能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下互相雜交，則說明這兩種核酸序列基本相同，如下所述。另外， 如果可采用相同引物擴(kuò)增二種核酸序列，則說明這兩種核酸序列基本相同。
術(shù)語"抑制"包括VEGF和VEGF受體的相互作用；血管新生；血管新生相關(guān)性 疾病的癥狀，或VEGF可能介導(dǎo)的任何其它活性的任何可測定、可重現(xiàn)的降低。
術(shù)語"分離"、"純化"或"生物純"指某物質(zhì)基本不含在天然狀態(tài)下通常與其相伴的 組分。 一般用分析化學(xué)技術(shù)如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜測定純度和均一 性。作為制劑中存在的主要物質(zhì)的蛋白質(zhì)或核酸是基本純化的。具體說，分離核酸 不含有天然側(cè)接于該基因的編碼該基因編碼蛋白以外的蛋白質(zhì)的一些開放閱讀框。 在一些實(shí)施方式中，術(shù)語"純化"指核酸或蛋白質(zhì)在電泳凝膠中主要產(chǎn)生一條條帶。優(yōu)
選地，這意味著該核酸或蛋白質(zhì)的純度為至少85%，更優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少 99%。在其它實(shí)施方式中，"純度"或"純化"指去除該組合物中的至少一種污染物。從 這個(gè)意義上說，純化過程不需要使純化化合物均一，如100%純。
提到死亡受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，本文所用術(shù)語"調(diào)節(jié)"指化合物在體外和/或體內(nèi)改變 死亡受體功能的能力。化合物優(yōu)選激活死亡受體的活性，這取決于該化合物的濃度。
本文所用的"核酸"或"寡核苷酸"或"多核苷酸"或其語法等同形式指共價(jià)連接在 一起的至少兩個(gè)核苷酸。寡核苷酸的長度一般為約5、 6、 7、 8、 9、 10、 12、 15、 25、 30、 40、 50或更多個(gè)核苷酸，長度至多約100個(gè)核苷酸。核酸和多核苷酸是任何長 度的聚合物，包括較長的聚合物，如200、 300、 500、 1000、 2000、 3000、 5000、 7000、 10,000個(gè)核苷酸等。本發(fā)明核酸通常包含磷酸二酯鍵，但在一些情況下，所包含的
核酸類似物可以含有交替主鏈，包括例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸
酯或O-甲基亞磷酰胺連接(參見Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach(寡核苷酸和類似物實(shí)用方法)，牛津大學(xué)出版社)；以及肽核酸主鏈和連 接。其它類似核酸包括含有正電主鏈；非離子主鏈和非核糖主鏈的核酸，包括美國 專利5,235,033和5,034,506，以及ASC研討會(huì)叢書580的第6禾卩7章，Carbohydrate Modifications in Antisense Research(反義研究中的糖修飾)(Sanghui和Cook編)所述的 核酸。核酸定義中還包括含有一個(gè)或多個(gè)碳環(huán)糖的核酸?？赡芤蚋鞣N原因而修飾核 糖-磷酸主鏈，例如提高這類分子在生理環(huán)境中或作為探針在生物芯片上的穩(wěn)定性和 半衰期?？芍苽涮烊划a(chǎn)生的核酸和類似物的混合物；或者，可制備不同的核酸類似 物的混合物，以及天然產(chǎn)生的核酸和類似物的混合物。
各種參考文獻(xiàn)公開了這些核酸類似物，包括例如，氨基磷酸酯(Beaucage等， Tetrahedron 49(10): 1925(1993)和其中的參考文獻(xiàn)；Letsinger, J Org Chem 35:3800 (1970); Sprinzl等，Eur JBiochem 81: 579 (1977); Letsinger等，Nucl Acids Res 14:3487 (1986); Sawai等，Chem Lett 805 (1984)， Letsinger等，J Am Chem Soc 110:4470 (1988); 和Pauwels等，Chemica Scripta 26:141 91986))，硫代磷酸酯(Mag等，Nucl Acids Res 19:1437(1991);和美國專利號5,644,048)， 二硫代磷酸酯(Briu等，《/爿肌C/zem. Soc. 111:2321(1989)， 0甲基亞磷酰胺連接(參見Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach(寡核苷酸和類似物實(shí)用方法)，牛津大學(xué)出版社)和肽核酸主鏈 和連接(參見Egholm， J Am Chem Soc 114:1895 (1992); Meier等，Chem Int Ed Engl 31:1008 (1992); Nielsen, Nature 365:566 (1993); Carlsson等，Nature 380:207 (1996)， 將其納入本文作參考)。其它類似核酸包括含有正電主鏈(Denpcy等，Proc Natl Acad
Sci USA 92:6097 (1995);非離子主鏈(美國專利5,386,023、 5,637,684、 5,602,240、 5,216,141和4,469,863; Kiedrowshi等，Angew. Chem Intl英文版30:423 (1991); Letsinger等，J Am Chem Soc 110:4470 (1988); Letsinger等，Nucleoside & Nucleotide (核苷和核苷酸)13:1597 (1994); ASC研討會(huì)叢書580的第2和3章，Carbohydrate Modifications in Antisense Research(反義研究中的糖修飾)，Y.S. Sanghui和P. Dan Cook 編；Mesmaeker等，Bioorganic and Medicinal Chem. Lett 4:395 (1994); Jeffs等，J Biomolecular NMR 34:17 (1994); Tetrahedron Lett 31:743 (1996))和非核糖主鏈的核酸， 包括美國專利5,235,033和5,034,506以及ASC研討會(huì)叢書580的第6和7章， Carbohydrate Modifications in Antisense Research(反義研究中的糖修飾)，Y.S. Sanghui 和P. Dan Cook(編)所述的核酸。核酸定義中還包括含有一個(gè)或多個(gè)碳環(huán)糖的核酸(參 見Jenkins等，Chem Soc Rev第169 176頁(1995))。 Rawls， C和E News, 1997年6 月2日，第35頁描述了幾種核酸類似物。特別將所有這些參考文獻(xiàn)納入本文作參考。
其它類似物包括肽核酸(PNA),它是肽核酸類似物。與天然產(chǎn)生核酸的磷酸二酯 主鏈帶有大量電荷不同，在中性條件下這些主鏈基本上是非離子性的。這產(chǎn)生了兩 個(gè)優(yōu)點(diǎn)。首先，PNA主鏈具有改進(jìn)的雜交動(dòng)力學(xué)特性。與完美匹配的堿基對相比， 錯(cuò)配時(shí)PNA的解鏈溫度(Tm)改變較大。 一個(gè)內(nèi)部錯(cuò)配會(huì)使DNA和RNA的Tm降低 2-4°C。用非離子型PNA主鏈時(shí)，Tm降低接近7-9'C。相似地，由于它們的非離子 性屬性，連接于這些主鏈的堿基雜交時(shí)對鹽濃度相對不敏感。此外，PNA無法被細(xì) 胞酶降解，因此可能更穩(wěn)定。
如上所述，核酸可能是單鏈或雙鏈，或含有雙鏈或單鏈序列部分。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)理解，對單鏈的描述也確定了互補(bǔ)鏈的序列；因此本文所述序列也提供了該 序列的互補(bǔ)物。核酸可以是DNA(基因組DNA和cDNA)、 RNA或雜交體，其中核 酸可含有脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的組合，以及堿基組合，所述堿基包括尿嘧 啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞啼啶、鳥嘌呤、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶、 異鳥嘌呤等。"轉(zhuǎn)錄物"一般指天然產(chǎn)生的RNA，如前-mRNA、 hnRNA或mRNA。本 文所用術(shù)語"核苷"包括核苷酸以及核苷和核苷酸類似物，修飾核苷如氨基修飾的核 苷。此外，"核苷"包括非天然產(chǎn)生的類似結(jié)構(gòu)。因此，例如，各自含有一個(gè)堿基的單 個(gè)肽核酸單元在本文中稱為核苷。
"標(biāo)記"或"可檢測部分"是可通過光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、化學(xué)或其 它物理方法檢測的組合物。例如，有用的標(biāo)記包括"P、熒光染料、電子致密試劑、 酶(如通常用于ELISA)、生物素、地高辛或半抗原和可通過(例如)將放射性標(biāo)記摻入
肽使其可檢測或用于檢測與該肽發(fā)生特異性反應(yīng)的抗體的任何物質(zhì)?？蓪⒃摌?biāo)簽摻 入乳腺癌核酸、蛋白質(zhì)和抗體的任何位置。可采用本領(lǐng)域已知將所述抗體與此種標(biāo)
簽偶聯(lián)的任何方法，包括Hunter等，Nature 144:945 (1962); David等，Biochemistry 13:1014 (1974); Pain等，JImmunol Meth 40:219 (1981);和Nygren， J Histochem.和 Cytochem 30:407 (1982)所述的方法。
"標(biāo)記的核酸探針或寡核苷酸"是通過接頭或化學(xué)鍵共價(jià)結(jié)合，或通過離子鍵、 范德華力、靜電力或氫鍵非共價(jià)結(jié)合于標(biāo)記的探針，以便通過檢測結(jié)合于探針的標(biāo) 簽來檢測該探針是否存在?；蛘?，采用高親和力相互作用的方法可獲得相同結(jié)果， 結(jié)合對中的一種物質(zhì)結(jié)合于另一種物質(zhì)，如生物素與鏈霉親和素。
本文所用術(shù)語"核酸探針或寡核苷酸"定義為核酸能夠通過一種或多種類型的化 學(xué)鍵，通常通過互補(bǔ)堿基配對，通常通過氫鍵形成而結(jié)合于互補(bǔ)序列的靶核酸。本 文所用的探針可包括天然(即A、 G、 C或T)或修飾的堿基(7-脫氮鳥苷、肌苷等)。此 外，探針中的堿基例如通過除磷酸二酯鍵以外的連接鍵相連接，只要不會(huì)功能上干 擾雜交。因此，例如，探針可以是組成的堿基通過肽鍵而非磷酸二酯鍵連接的肽核 酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，探針可結(jié)合與探針序列不完全互補(bǔ)的耙序列，這取決 于雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性。探針優(yōu)選直接用同位素、生色團(tuán)、發(fā)光團(tuán)、色原直接標(biāo)記， 或用(例如)生物素間接標(biāo)記，隨后與鏈霉親和素結(jié)合形成復(fù)合物。通過檢測是否存在 探針，便可檢測是否存在選擇的序列或子序列。診斷或預(yù)后可根據(jù)基因組水平，或, RNA或蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
用于(例如)細(xì)胞或者核酸、蛋白質(zhì)或載體的術(shù)語"重組"指，通過引入異源核酸或 蛋白質(zhì)或改變天然核酸或蛋白質(zhì)修飾細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體，或者由如此修飾 的細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞。因此，例如，重組細(xì)胞表達(dá)在天然(非重組)形式的細(xì)胞中沒有發(fā) 現(xiàn)的基因或表達(dá)在其它情況下異常表達(dá)、低水平表達(dá)或根本不表達(dá)的天然基因。本 文所用術(shù)語"重組核酸"指最初(如)利用聚合酶和核酸內(nèi)切酶在體外操作核酸而形成 的天然情況下沒有發(fā)現(xiàn)的核酸。以此形式，獲得不同序列的操作性連接。因此，出 于本發(fā)明目的，線性形式的分離核酸或通過連接通常并不連接在一起的DNA分子在 體外形成的表達(dá)載體都被認(rèn)為是重組形式。應(yīng)理解， 一旦制備了重組核酸并將其重 新引入宿主細(xì)胞或生物體后，它能以非重組方式復(fù)制，即利用宿主細(xì)胞的體內(nèi)細(xì)胞 機(jī)器而非體外操作復(fù)制；然而，出于本發(fā)明目的， 一旦用重組方法產(chǎn)生這類核酸后， 雖然隨后以非重組方式復(fù)制，但仍應(yīng)認(rèn)為其是重組核酸。相似地，"重組蛋白"是用重 組技術(shù)，即通過表達(dá)上述重組核酸產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。用于核酸部分時(shí)，術(shù)語"異源"指某核酸包含在天然情況下通常沒有相互關(guān)系的 兩種或多種子序列。例如，核酸一般是重組產(chǎn)生的，含有兩種或多種序列，(例如) 來自無關(guān)基因用于制備新功能的核酸，如某一來源的啟動(dòng)子和另一來源的編碼區(qū)。 相似地，異源蛋白常指在天然情況下通常沒有相互關(guān)系的兩種或多種子序列(如融合 蛋白)。
本文所用術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語還應(yīng)用于 其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)天然產(chǎn)生氨基酸的人工化學(xué)模擬物的氨基酸聚合 物，含有修飾殘基的天然產(chǎn)生的氨基酸聚合物和非天然產(chǎn)生的氨基酸聚合物。本發(fā) 明的多肽和肽包括含有單個(gè)氨基酸殘基D-和L-同種型的氨基酸聚合物，以及其它氨 基酸變體?？赏ㄟ^組成肽分子一級結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基數(shù)目區(qū)分肽。出于本發(fā)明目的，
肽一般是由至多50個(gè)氨基酸殘基組成的氨基酸聚合物，多肽則包含50個(gè)以上的氨 基酸殘基。
"啟動(dòng)子"定義為指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的一種核酸控制序列的陣列。本文所用的啟動(dòng)子 包括在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的必須核酸序列，例如在聚合酶II型啟動(dòng)子、TATA元件的 情況下。啟動(dòng)子還任選包含遠(yuǎn)端增強(qiáng)子或阻抑元件，它們可距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)數(shù)千個(gè) 堿基對。
"組成型"啟動(dòng)子是在大多數(shù)環(huán)境和發(fā)育條件下有活性的啟動(dòng)子。"誘導(dǎo)型"啟動(dòng)子 是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)控下有活性的啟動(dòng)子。術(shù)語"操作性連接"指核酸表達(dá)控制序列(如 啟動(dòng)子，或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)陣列)與第二種核酸序列之間的功能連接，其中所述表 達(dá)控制序列指導(dǎo)對應(yīng)于第二種序列的核酸的轉(zhuǎn)錄。 、
本文所用術(shù)語"牛皮癬"指具有多基因遺傳性和波動(dòng)病程的常見的慢性鱗片狀皮 炎。本領(lǐng)域熟知其診斷方法。它是特征是表皮過度增殖、炎癥和血管新生的慢性皮 膚病。
本文所用術(shù)語"類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎"指慢性系統(tǒng)性疾病，主要涉及關(guān)節(jié)，通常是多 關(guān)節(jié)性疾病，其特征是滑膜和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的炎性改變，以及肌肉萎縮和骨稀薄化。類 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的形式包括但不限于青少年關(guān)節(jié)炎、慢性絨毛狀關(guān)節(jié)炎、環(huán)杓性關(guān) 節(jié)炎、變形性關(guān)節(jié)炎、退化性關(guān)節(jié)炎、毀形性關(guān)節(jié)炎和增殖性關(guān)節(jié)炎。
術(shù)語"選擇性(或特異性)雜交于"指當(dāng)某特定核苷酸序列存在于復(fù)雜混合物(如全 部細(xì)胞或者文庫DNA或RNA)中時(shí)，某分子只與該序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下結(jié)合、形 成雙鏈體或雜交。
術(shù)語"嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件"指探針與其靶子序列雜交(一般是在復(fù)雜的核酸混合物中的
耙子序列)，但不與其它序列雜交的條件。嚴(yán)謹(jǐn)條件是序列依賴性的，在不同環(huán)境下
不同。較長序列在較高溫度下特異性雜交。核酸雜交的廣泛指南參見Tijssen， Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes(生化和分子生物學(xué)—與核酸雜交)，"Overview of principles of hybridization和 the strategy of核酸assays(核酸實(shí)驗(yàn)的雜交原理和方案的概覽)"(1993)。通常選擇的 嚴(yán)謹(jǐn)條件在確定離子強(qiáng)度pH下，比具體序列的熱解鏈溫度(Tm)低約5-l(TC。 Tm是 50%互補(bǔ)探針與靶序列雜交達(dá)到平衡的溫度(在確定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度 下)(因?yàn)榘行蛄性赥m下過量存在，所以平衡時(shí)50%探針被占據(jù))。嚴(yán)謹(jǐn)條件是在 pH為7.0-8.3時(shí)鹽濃度低于約1.0 M鈉離子， 一般約為0.O1-1.0 M鈉離子濃度(或其 它鹽)，短探針(如10-50個(gè)核苷酸)溫度為至少約30。C和長探針(如50個(gè)核苷酸以上) 溫度為至少約60°C。也可通過加入去穩(wěn)定劑如甲酰胺獲得嚴(yán)謹(jǐn)條件。
在選擇性或特異性雜交中，陽性信號至少是背景的兩倍，優(yōu)選為背景雜交的IO 倍。示范性嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件可以是50%甲酰胺、5xSSC和1%SDS， 42'C培育，或者， 5xSSC， 1%SDS， 65。C培育，用0.2x SSC洗滌，以及0.1% SDS 65。C培育。在PCR 中，低嚴(yán)謹(jǐn)性擴(kuò)增的溫度一般為約36'C，但退火溫度可在約32X:-48'C之間變動(dòng)，這 取決于引物長度。在高嚴(yán)謹(jǐn)性PCR擴(kuò)增中，溫度一般為約62'C，但高嚴(yán)謹(jǐn)性退火溫 度可能約為5(TC-65'C，這取決于引物長度和特異性。高和低嚴(yán)謹(jǐn)性擴(kuò)增的典型循環(huán) 條件包括9(TC-95'C 30秒至2分鐘的變性階段，退火階段持續(xù)30秒至2分鐘，延伸 階段約為72°C 1-2.分鐘。低和高嚴(yán)謹(jǐn)性擴(kuò)增反應(yīng)的方案和指南參見(例如)I皿is等 (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications(PCR方案，方法和應(yīng)用指 南)，紐約的學(xué)術(shù)出版社公司(Academic Press, Inc.))。
如果二核酸編碼的多肽基本相同，即使在嚴(yán)謹(jǐn)條件下不相互雜交仍然認(rèn)為基本 相同。例如，用遺傳密碼允許的最大密碼子簡并性產(chǎn)生的核酸拷貝就是這樣。在這 種情況下，核酸一般在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下即能雜交。示范性的"中等嚴(yán)謹(jǐn)條件"包括在 40%甲酰胺、1 MNaC、 1% SDS的緩沖液中37。C雜交，用1 x SSC于45。C洗滌。陽 性雜交至少是背景的兩倍。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不難認(rèn)識到，替代的雜交和洗滌條 件可用于提供嚴(yán)謹(jǐn)性相似的條件。許多參考文獻(xiàn)中提供了測定雜交參數(shù)的其它指南， 例如Current Protocols in Molecular Biology(新編分子生物學(xué)方案)，Ausubel等編。
本文所用術(shù)語"治療"包括(l)預(yù)防疾病，如癌癥，即使易患疾病但尚未出現(xiàn)任 何疾病癥狀的對象不發(fā)生疾病的臨床癥狀；(2)抑制疾病，即阻滯或減緩疾病或其臨 床癥狀的發(fā)展；或(3)緩解疾病，即引起疾病或其臨床癥狀消退。治療指減輕或有益
地改變癥狀或病癥、失調(diào)或疾病的病理狀況的任何方式。治療也包括本發(fā)明組合物 的藥物應(yīng)用。需要治療的對象優(yōu)選是哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人。 "腫瘤細(xì)胞"指腫瘤中的癌前、癌癥和正常細(xì)胞。
"VEGF"指血管內(nèi)皮生長因子家族的任何成員，以及剪接變體和同種型。VEGF 可以是四種不同的剪接變體，稱為VEGFm(或VEGF-121)、 VEGF^(或VEGF-165)、 VEGF^(或VEGF-189)和VEGF2。6(或VEGF-206;數(shù)字指多肽中的氨基酸數(shù)量)。所 有四種同種型均為二硫鍵連接的同源二聚體。不同細(xì)胞類型的同種型分泌模式不同， 但VEGF165是觀察到的最常見同種型。近年來，在來自女性生殖道的三種人癌細(xì)胞 系中發(fā)現(xiàn)了第五種變體VEGF145(Poltorak等，J Biol Chem (1997) 272:7157-7158)。這 五種同種型以高親和力與兩種受體Flt-I和Flk-l/KDR結(jié)合，但它們對肝素和胞外基 質(zhì)的結(jié)合親和力不同。近年來，已鑒定到VEGF家族的三個(gè)新成員一VEGF-B、 VEGF國C和VEGF-D(Achen等，Proc Natl Acad Sci USA (1998)， 95(2):548-53)。己發(fā) 現(xiàn)了能刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長的VEGF-B的兩種剪接變體(Olofsson等，J Biol Chem (1996)， 271:19310-19317; Olofsson等,Proc Natl Acad Sci USA (1996)， 93:2576-2581)。
術(shù)語"VEGF結(jié)合活性"指VEGFR多肽與VEGF多肽結(jié)合的活性。用本文所述和 本領(lǐng)域已知的結(jié)合實(shí)驗(yàn)測定結(jié)合。
生物學(xué)樣品中的"VEGF mRNA水平"指細(xì)胞或生物學(xué)樣品中存在的由VEGF基 因轉(zhuǎn)錄的mRNA量。mRNA通常編碼有功能的VEGF多肽，但可能存在改變或消除 該編碼多肽的功能的突變。 一般地，定量測定"VEGFmRNA水平"，并與對照樣品的 水平或?qū)φ諛悠返念A(yù)計(jì)水平作比較。然而，可簡單地檢測"VEGFmRNA水平"，例如 由人進(jìn)行主觀目測，進(jìn)行或不進(jìn)行比較。
生物學(xué)樣品中的"VEGF多肽水平"指細(xì)胞或生物學(xué)樣品中存在的由VEGF mRNA翻譯的VEGF多肽量。該多肽可以或可以不具有VEGF多肽活性。 一般地， 定量測定"VEGF多肽水平"，并與對照樣品的水平或?qū)φ諛悠返念A(yù)計(jì)水平作比較。然 而，也可簡單地檢測"VEGF多肽水平"，例如由人進(jìn)行主觀的目測，進(jìn)行或不進(jìn)行比 較。
本文所用術(shù)語"VEGF表達(dá)上調(diào)"或"VEGF過度表達(dá)"和其語法等同形式指VEGF 多肽或VEGF多核苷酸高于預(yù)定的參比水平。因此，例如，按照本發(fā)明，正?；蚪?康對象中VEGF多肽或VEGF多核苷酸的參比水平被確定為截止值，高于該值時(shí)， VEGF多肽或VEGF多核苷酸的水平與癌癥顯著相關(guān)。 一般地，與正?；蚪】等说?VEGF水平相比，癌癥患者血清中的VEGF水平高出至少約為2倍，在某些癌癥如
卵巢癌中，通常高出至少約為5倍，更通常至少約IO倍(參見例如，Manenti等，Eur J Cancer (2003)， 39:1948-1956)。在本文中，術(shù)語"上調(diào)"和"過度表達(dá)"可互換使用。 本領(lǐng)域已知測定VEGF水平的方法，包括但不限于RT-PCR和使用抗-VEGF抗體。
"使含量相互關(guān)聯(lián)"指將一種樣品中測定的物質(zhì)、分子或標(biāo)記物(如VEGF)的含量 與另一樣品中測定的物質(zhì)、分子或標(biāo)記物的含量作比較。另一樣品中測定的同一物 質(zhì)、分子或標(biāo)記物的含量可能對某給定疾病或癌癥具有特異性。
本發(fā)明范圍內(nèi)考慮了術(shù)語"測定含量"的同義詞，包括但不限于檢測、測定、 檢驗(yàn)或確定分子如VEGF的存在、不存在、含量或濃度。
術(shù)語"VEGFR"或"VEGF受體"指結(jié)合VEGF或VEGF家族成員、剪接變體和同 種型的受體。酪氨酸激酶VEGF受體家族的特征是胞外結(jié)構(gòu)域和分離的酪氨酸激酶 結(jié)構(gòu)域中含有7個(gè)免疫球蛋白樣序列。VEGFR包括(i) Flt-l(fms樣酪氨酸激酶)， 也稱為VEGFR-l(Shibuya等，Oncogene (1990)， 5:519-524; De Vries等，Science (1992)， 255:989-991); (ii) Flk-l(胎肝激酶)、小鼠RTK(Quinn等，Proc Natl Acad Sci USA (1993)， 90:7533-7537; Millauer等，Cell (1993)， 72:835-846)和其人同源物，KDR(含 有激酶插入結(jié)構(gòu)域的受體；Terman等，Biochem Biophys Res Comm (1992)， 187: 1579-1586);禾口(iii)Flt-4，淋巴內(nèi)皮上表達(dá)，但血管內(nèi)皮上不表達(dá)(Pajusola等，Cancer Res (1992)， 52:5738-43)。
術(shù)語"VEGFR-FasL"指包含以下部分的融合蛋白(i)VEGFR、 VEGFR片段、 VEGFR結(jié)構(gòu)域、VEGFR相關(guān)多肽或VEGFR相關(guān)多肽片段的氨基酸序列和(ii)FasL、 FasL片段、FasL相關(guān)多肽或FasL相關(guān)多肽片段的氨基酸序列。 一般用標(biāo)準(zhǔn)的分子 克隆技術(shù)將VEGFR、 VEGFR片段、VEGFR結(jié)構(gòu)域、VEGFR相關(guān)多肽或VEGFR 相關(guān)多肽片段的氨基酸序列融合于FasL、 FasL片段、FasL相關(guān)多肽或FasL相關(guān)多 肽片段的氨基酸序列的N末端。
術(shù)語"VEGFR多肽"或VEGFR核酸"指分離的核酸、多肽和它們的多態(tài)性變體、 等位基因、突變體和種間同源物，如本文以下的進(jìn)一步詳述(1)優(yōu)選在至少約50、 75、 100、 150、 200、 250、 300個(gè)或更多個(gè)氨基酸的區(qū)域上，其氨基酸序列與下述序 列的氨基酸序列相同性大于約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%，優(yōu)選91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%或更高，(i)以下所示血管內(nèi)皮生長 因子(VEGF)受體-1的胞外區(qū)序列；(ii)以下所示血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體-2的 胞外區(qū)序列；或(iii)以下所示血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體-3的胞外區(qū)序列；(2)能 結(jié)合用含有下述氨基酸序列的免疫原或其保守修飾變體產(chǎn)生的抗體(如多克隆抗體)；
(3)能結(jié)合VEGF多肽；(4)能與天然產(chǎn)生的VEGF受體-1、 VEGF受體-2或VEGF受 體-3蛋白競爭結(jié)合VEGF多肽；(5)能抑制VEGF與VEGF受體結(jié)合；(6)能在嚴(yán)謹(jǐn)雜 交條件下特異性雜交于以下所示核酸序列，或其保守修飾變體;(7)優(yōu)選在至少約100、 200、 300、 400、 500、 600、 700、 800、 900、 1,000個(gè)或更多個(gè)核苷酸的區(qū)域上，其 核酸序列與SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 18 (人VEGFR-2); SEQ ID NO.21 (人 VEGFR-l)的核苷酸序列相同性大于約90%，優(yōu)選大于約96%、 97%、 98%、 99%或 更高；和/或(8)含有SEQ ID NO:l或SEQ ID NO:4 (人VEGFR-2)或SEQ ID NO:19或 SEQ ID NO:20 (人VEGFR-l)或SEQ ID NO:24 (人神經(jīng)超蛋白-l)或SEQ ID NO:25 (人 VEGFR-3)的至少50個(gè)，常常是75、 100、 115、 150、 175、 200、 250或300個(gè)毗連 氨基酸殘基。
VEGFR多核苷酸或多肽序列一般來自人，但可能來自其它哺乳動(dòng)物，例如但不 限于非人靈長動(dòng)物，嚙齒動(dòng)物如大鼠、小鼠或倉鼠；牛、豬、馬、綿羊或其它哺 乳動(dòng)物。因此，在一些實(shí)施方式中，本文所述的VEGFR多肽和VEGFR亞域多肽可 包含對應(yīng)于人VEGFR序列的序列。因此，本文提供了示范性VEGFR，它是本領(lǐng)域 已知的。例如，人VEGFR-2多肽的GenBank登錄號是NP—002244和P35968。小鼠 VEGFR-2多肽的GenBank登錄號是(例如)P35918;大鼠VEGFR-2是008775。人 VEGFR-2 cDNA序列可參見GenBank NM一002253。人VEGFR-1多肽的GenBank登 錄號是NP—002010、 P17948、 AAC16449、 CAI17096禾卩CAll4846。小鼠VEGFR-1 多肽的GenBank登錄號是(例如)NP—034358;大鼠VEGFR-1是NP—062179和P53767。 人VEGFR-1 cDNA序列可參見GenBank NM—002019。
II. VEGFR-死亡配體融合蛋白
本發(fā)明提供了結(jié)合死亡受體的新型融合蛋白。本發(fā)明融合蛋白包含(i)結(jié)合血管 內(nèi)皮因子(VEGF)多肽的血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)多肽和(ii)含有寡聚化結(jié)構(gòu) 域和死亡受體識別部分的死亡配體，其中VEGFR多肽的C末端連接于死亡配體的N 末端。
A. VEGF受體多肽
用于制備本發(fā)明融合蛋白的VEGFR多肽可獲自數(shù)種VEGFR，如Flt-l(fms-樣酪 氨酸激酶；VEGFR-1)、 Flk-l(胎肝激酶；KDR; VEGFR-2)和Flt-4。出于本發(fā)明目的， 結(jié)合VEGF的VEGFR多肽一般包含VEGFR的胞外結(jié)構(gòu)域或其一部分。
優(yōu)選的VEGFR多肽包含VEGFR-1的胞外結(jié)構(gòu)域或其一部分。優(yōu)選的VEGFR-1 是人VEGFR-1。人VEGFR-1的氨基酸序列見SEQ ID NO:19。
可將幾種VEGFR-1多肽或VEGFR-1亞域多肽連接于Fas配體，以產(chǎn)生本發(fā)明 融合蛋白。在優(yōu)選實(shí)施方式中，VEGFR-1多肽或VEGFR-1亞域多肽選自(i)包含氨 基酸序列SEQ IDNO:20的多肽；(ii)包含SEQ IDNO:19的氨基酸殘基1-747的多肽； (iii)包含SEQ ID NO: 19的氨基酸殘基32-747的多肽；(iv)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19的氨基酸151-214的多肽;(v)包含氨基酸序列SEQ ID NO:'19的氨基酸230-327 的多肽；(vi)包含VEGFRl的氨基酸129-230(如圖IO所示的SDTG...NTII;結(jié)構(gòu)域2(D2)) 的多肽，和(vii)包含在(i)-(vi)中任一項(xiàng)氨基酸序列中缺失、取代或添加一個(gè)至數(shù)個(gè)氨 基酸M逝氨基酸序列的具有VEGF結(jié)合活性的多肽。
術(shù)語"在氨基酸序列中缺失、取代或添加一個(gè)至數(shù)個(gè)氨基酸殘基"指在氨基酸序 列中缺失、取代或添加一般少于25個(gè)，更一般少于20個(gè)，更一般少于15個(gè)，最一 般少于10個(gè)氨基酸殘基。
每個(gè)VEGFR-1亞域多肽包含至少一個(gè)IgG-樣結(jié)構(gòu)域。人VEGFR-1的IgG樣結(jié) 構(gòu)域包含SEQ ID NO: 19的氨基酸殘基1-747; SEQ ID NO: 19的氨基酸殘基32-747; SEQ ID NO:19的氨基酸殘基32-123; SEQ ID NO:19的氨基酸殘基151-214; SEQ ID NO:19的氨基酸殘基230-327; SEQ IDNO:19的氨基酸殘基335-4221; SEQ ID NO:19 的氨基酸殘基428-553; SEQ ID NO:19的氨基酸殘基556-654;或SEQIDNO:19的 氨基酸殘基661-747。
還優(yōu)選其它哺乳動(dòng)物VEGFR-1多肽，包括但不限于小鼠和大鼠VEGFR-1多 肽?？赏ㄟ^比對哺乳動(dòng)物VEGFR-1序列與人VEGFR-1氨基酸序列來鑒定其它哺乳 動(dòng)物的VEGFR-1亞域多肽。
另一種優(yōu)選的VEGFR多肽包含VEGFR-2的胞外結(jié)構(gòu)域或其一部分。VEGFR-2 優(yōu)選為人VGEFR-2。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，融合蛋白包含含有氨基酸序列SEQ ID NO: 1的VEGFR-2多肽。這種VEGFR-2多肽包含人VEGFR-2的信號肽。在本 發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，融合蛋白包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:4的 VEGFR-2多肽。這種VEGFR-2多肽不包含信號肽。
可將幾種VEGFR-2多肽或VEGFR-2亞域多肽連接于Fas配體，以產(chǎn)生本發(fā)明 融合蛋白。在優(yōu)選實(shí)施方式中，VEGFR-2多肽或VEGFR-2亞域多肽選自(i)含有氨 基酸序列SEQ ID NO:l的多肽；(ii)含有氨基酸序列SEQ ID NO:2的多肽；(iii)含有 氨基酸序列SEQIDNO:3的多肽；(iv)含有氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽；(v)含
有氨基酸序列SEQ ID NO:5的多肽；(vi)含有氨基酸序列SEQ ID NO:6的多肽；(iiv) 含有氨基酸序列SEQIDNO:l的氨基酸141-207的多肽；(iix)含有氨基酸序列SEQ IDNO:l的氨基酸224-320的多肽；和(ix)包含在(i)-(iix)中任一項(xiàng)氨基酸序列中缺失、 取代或添加一個(gè)至數(shù)個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的具有VEGF結(jié)合活性的多肽。
每個(gè)VEGFR-2亞域多肽包含至少一個(gè)IgG樣結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施 方式中，VEGFR-死亡配體融合蛋白包含人VEGFR-2的IgG樣結(jié)構(gòu)域，其含有氨基 酸序列SEQIDNO: 1的氨基酸殘基141-207。在另一實(shí)施方式中，人VEGFR-2的 IgG樣結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NO: 1的氨基酸殘基224-320。
本文所述的VEGFR亞域多肽可互相交換。因此，可設(shè)計(jì)一種VEGFR多肽，其 包含一個(gè)或多個(gè)VEGFR-1(優(yōu)選人VEGFR-1)的IgG樣結(jié)構(gòu)域和一個(gè)或多個(gè)人 VEGFR-2(優(yōu)選人VEGFR-2)的IgG樣結(jié)構(gòu)域。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，VEGFR是VEGFR同源物、VEGFR同種型、VEGFR 直向同源物或VEGFR相關(guān)多肽。
B. 死亡配體
本發(fā)明提供了包含上述VEGFR多肽和可結(jié)合死亡受體的死亡配體的新型融合 蛋白。連接于VEGFR多肽的死亡配體包含寡聚化結(jié)構(gòu)域和死亡受體識別部分。
用于制備本發(fā)明融合蛋白的死亡配體的綜述參見Lavrik等，J Cell Sci (2005)， 118:265-267 (全文納入本文作參考)，氨基酸序列和核苷酸序列可由GenBank獲得。 用于制備本發(fā)明融合蛋白的含有寡聚化結(jié)構(gòu)域和死亡受體識別部分的死亡配體可獲
自數(shù)種死亡配體，如Fas配體(FasL)、腫瘤壞死因子(TNF)或淋巴毒素(LT)。出于本發(fā) 明目的，結(jié)合死亡受體的含有寡聚化結(jié)構(gòu)域和死亡受體識別部分的死亡配體一般包 含死亡配體的胞外結(jié)構(gòu)域或其一部分。
C. FasL
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，該融合蛋白能結(jié)合Fas，該死亡配體是Fas配體 (FasL)。因此，本發(fā)明的優(yōu)選融合蛋白VEGFR-FasL包含含有寡聚化結(jié)構(gòu)域和死亡受 體識別部分的Fas配體。本發(fā)明VEGFR-FasL融合蛋白中的FasL含有至少一個(gè)對結(jié) 合Fas蛋白和傳遞凋亡信號所必需而有效的功能域或決定簇。這類FasL決定簇通常 僅含一部分胞外結(jié)構(gòu)域，然而，它們保持了完整FasL的結(jié)合特異性，并且可溶。
用于本發(fā)明的優(yōu)選FasL多肽包含F(xiàn)asL胞外結(jié)構(gòu)域或其一部分。該FasL優(yōu)選為 人FasL。含有三聚化結(jié)構(gòu)域和其受體(Fas)結(jié)合域的人FasL多肽的氨基酸序列參見 SEQIDNO:ll。因此，在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明融合蛋白包含含有SEQ IDNO:ll 所示氨基酸序列的FasL。
在其它優(yōu)選實(shí)施方式中，F(xiàn)asL是哺乳動(dòng)物FasL，包括但不限于小鼠或大鼠的 FasL。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明融合蛋白包含SEQIDNO: 12所示的鼠FasL 多肽。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明融合蛋白包含SEQ ID NO: 13所示的大鼠FasL 多肽。
用于本發(fā)明的另 一種FasL是包含在氨基酸序列SEQ ID NO: 11 、 SEQ ED NO: 12 或SEQ ID NO:13中缺失、取代或添加一個(gè)至數(shù)個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的具有 Fas結(jié)合活性的多肽。
死亡配體包含兩個(gè)亞域，即寡聚化結(jié)構(gòu)域和死亡受體識別部分。圖l是FasL的 三聚化結(jié)構(gòu)域(即寡聚化結(jié)構(gòu)域)和FasL的Fas-結(jié)合域(即死亡受體識別部分)的示意 圖。如本文進(jìn)一步所述，TNF顯示具有相似結(jié)構(gòu)。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，本文所述的死亡配體亞域可相互交換。因此，例如，可 設(shè)計(jì)一種FasL多肽，其包含F(xiàn)asL的Fas結(jié)合域和TNF三聚化結(jié)構(gòu)域，反之亦然。 本領(lǐng)域已知TNF結(jié)構(gòu)域和相應(yīng)氨基酸序列，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員無需進(jìn)行過多實(shí)驗(yàn) 即可鑒定相應(yīng)結(jié)構(gòu)域(見下)。
在另一方面，可設(shè)計(jì)嵌合FasL多肽，其包含(例如)人FasL的Fas識別部分和另 一種哺乳動(dòng)物如小鼠或大鼠的FasL三聚化結(jié)構(gòu)域。 '
用于人類患者時(shí)，優(yōu)選采用人Fas配體?？刹捎闷渌鼊?dòng)物的FasL在(例如)小鼠 和大鼠中進(jìn)行體外或體內(nèi)檢測。
FasL融合蛋白或FasL變體參見例如，美國專利6,451,759; 6,544,523; 6,348,334; 6,235,878; 6,046,310; 6,001,962;美國專利申請2004/0126859; 2004/0053249;和 2005/0013816中的描述，特別將所有參考文獻(xiàn)納入本文作參考。在本發(fā)明的某些實(shí) 施方式中，F(xiàn)asL是FasL同源物、FasL同種型、FasL直向同源物或FasL相關(guān)多肽。
D. VEGFR-死亡配體融合蛋白 如本文詳述，本發(fā)明的VEGFR-死亡配體融合蛋白與已經(jīng)開發(fā)或正在開發(fā)的靶 向VEGF或其受體的許多藥物不同。設(shè)計(jì)的所有這些藥物(包括中和抗體、可溶性 VEGF受體、RNA適體、RNAi、核酶、反義序列、小分子激酶抑制劑)均能抑制VEGF
或其受體的表達(dá)或活性。這些藥物都沒有引起VEGF過度表達(dá)而產(chǎn)生凋亡活性。本 發(fā)明提供的組合物，如VEGFR-死亡配體融合蛋白，可使(例如)腫瘤過度表達(dá)VEGF， 將腫瘤自身產(chǎn)生的武器用作死亡因子，即誘導(dǎo)表達(dá)死亡受體的腫瘤凋亡。
本發(fā)明提供了新型VEGFR-死亡配體融合蛋白。圖1圖解說明了本發(fā)明的優(yōu)選 實(shí)施方式。VEGFR多肽連接于FasL的這一實(shí)施方式稱為VEGFR-FasL。在此實(shí)施方 式中，VEGFR多肽的羧基末端連接于FasL的氨基末端。FasL優(yōu)選連接于VEGFR 多肽的羧基末端，但也可連接于其它地方。
VEGFR-死亡配體融合蛋白，具體是VEGFR-FasL融合蛋白(如本文中SEQ ID NO: 22和SEQIDNO:23所示的VEGFR-2-FasL)，是可溶性蛋白質(zhì)。這種可溶性蛋 白質(zhì)組合了 VEGFR胞外結(jié)構(gòu)域的VEGF結(jié)合域與死亡配體的三聚化結(jié)構(gòu)域和死亡受 體識別部分。
設(shè)計(jì)的本發(fā)明VEGFR-死亡配體融合蛋白，具體是VEGFR-FasL融合蛋白，使 得VEGF 二聚體將VEGFR-死亡配體三聚體聚集成簇，該簇可結(jié)合、簇集而激活死 亡受體，具體是Fas。圖l是這類實(shí)施方式的示意圖。
優(yōu)選的VEGFR-死亡配體融合蛋白見圖5-8。這些優(yōu)選的VEGFR-死亡配體融合 蛋白包含F(xiàn)lk的Dl、 D2禾BD3結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明另一種優(yōu)選的VEGFR-死亡配體融合蛋白見圖9和10。這種優(yōu)選的 VEGFR-死亡配體融合蛋白包含VEGFR1的結(jié)構(gòu)域2(D2)。
1. 信號肽
本發(fā)明提供了含有VEGFR多肽和死亡配體的新型融合蛋白。含有信號肽序列 的全長融合蛋白(例如參見SEQ ID NO:22)和不含信號肽的成熟全長融合蛋白(如SEQ IDNO:23)可用于實(shí)施本發(fā)明方法，并用作本發(fā)明藥物組合物和藥盒中的組合物。
因此，本發(fā)明融合蛋白可以或可以不包含信號肽序列，取決于其所需用途和生 產(chǎn)方式(具體見本文)。信號肽序列可以是同源信號肽序列，即通常見于分泌蛋白N末 端的信號肽(例如參見圖3)。或者，例如，鼠VEGFR信號序列可取代人VEGFR信 號序列，反之亦然，這取決于用于產(chǎn)生本發(fā)明融合蛋白的表達(dá)系統(tǒng)。
2. 接頭序列
任選地，VEGFR-FasL含有接頭。優(yōu)選制備連接C末端VEGFR與N末端FasL 的這類多肽接頭，以使VEGF多肽結(jié)合于VEGFR多肽和FasL的二聚化或三聚化以 及VEGFR-FasL結(jié)合于Fas。該接頭可含有l(wèi)-約100個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選5-50個(gè)。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，接頭序列包含5個(gè)氨基酸殘基，如SEQIDNO: 7所示?？刹迦?VEGFR多肽和死亡配體多肽之間的接頭序列不重要。其它優(yōu)選的接頭序列包括Gly 接頭或Gly/Ser接頭。
E. 其它生長因子/死亡配體蛋白
本發(fā)明的基本原理是將生長因子(如VEGF)的生長活性轉(zhuǎn)變?yōu)樗劳鲆蜃?，也可?該原理應(yīng)用于其它生長因子。在這些實(shí)施方式中，VEGFR多肽可被另一種生長因子， 如血小板衍生生長因子(PDGF)的結(jié)合域取代。因此，無需過多實(shí)驗(yàn)并且可以合理地 預(yù)料獲得成功，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員按照本發(fā)明和從公共數(shù)據(jù)庫如GenBank獲得涉 及生長因子序列或生長因子受體的相關(guān)信息，或者由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC) 獲得編碼這類生長因子或生長因子受體的克隆DNA。
F. 其它死亡受體/死亡配體蛋白
本發(fā)明融合蛋白能夠結(jié)合死亡受體，優(yōu)選結(jié)合表達(dá)死亡受體的細(xì)胞表面上的死 亡受體。用作本發(fā)明方法耙點(diǎn)的死亡受體一般屬于TNF受體超家族，包括p55和p75 腫瘤壞死因子受體(TNFR)和Fas (也稱為FAS/AP01)。腫瘤壞死因子(TNF-a)和淋巴 毒素(TNF-p)能結(jié)合p55和p75，從而啟動(dòng)導(dǎo)致(例如)表達(dá)p55或p75的腫瘤細(xì)胞死亡 的反應(yīng)。
因此，在本發(fā)明另一方面，VEGFR-死亡配體融合蛋白包含本文所述的VEGFR 多肽和結(jié)合TNFR的含有寡聚化結(jié)構(gòu)域和死亡受體識別部分的TNF多肽。在另一實(shí) 施方式中，VEGFR-死亡配體融合蛋白包含VEGFR多肽和含有寡聚化結(jié)構(gòu)域和結(jié)合 于TNFR的死亡受體識別部分的LT多肽。
G. 編碼VEGFR-FasL融合蛋白的核酸
在另一方面，本發(fā)明涉及編碼全部或一部分VEGFR-FasL融合蛋白的重組核酸。 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，編碼全部或一部分VEGFR-FasL融合蛋白的核酸 包含圖7所示核苷酸序列。編碼全部或一部分VEGFR-FasL融合蛋白的另一種優(yōu)選 核酸包含圖9所示核苷酸序列。編碼全部或一部分VEGFR-FasL融合蛋白的其它優(yōu) 選核酸是圖7和9所示核酸，但不包含編碼接頭序列或FLAG-標(biāo)簽的序列。本領(lǐng)域 技術(shù)人員可通過PCR和適當(dāng)設(shè)計(jì)的PCR引物產(chǎn)生這類核酸。
通常，通過探針雜交由cDNA和基因組DNA文庫克隆編碼VEGFR-死亡配體融
合蛋白的核酸序列和相關(guān)的核酸序列類似物，或采用寡核苷酸引物的擴(kuò)增技術(shù)分離 這些核酸序列或類似物。例如， 一般通過核酸探針雜交由哺乳動(dòng)物核酸(基因組或
cDNA)文庫分離這些序列。
也可采用引物擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增和分離DNA或RNA核酸?？捎帽绢I(lǐng)域熟知的原理 設(shè)計(jì)適合擴(kuò)增具體序列的引物(參見例如，Dieffenfach和Dveksler， PCR Primer: A Laboratory Manual(PCR引物實(shí)驗(yàn)室手冊)(1995))。可采用這些引物(例如)擴(kuò)增 VEGFR多肽或死亡配體的全長序列或片段。
也可采用合成寡核苷酸構(gòu)建VEGFR-死亡配體編碼基因，用作探針或用于表達(dá) 蛋白。用長度通常為40-120 bp的一系列重疊寡核苷酸(代表該基因的有義和無義鏈) 進(jìn)行該方法。然后退火、連接和克隆這些DNA片段?；蛘?，可采用精確引物的擴(kuò)增 技術(shù)擴(kuò)增該核酸的特定子序列。然后將特定子序列連接到表達(dá)載體中。
一般將編碼VEGFR-死亡配體融合蛋白的核酸克隆到中間載體中，然后轉(zhuǎn)化到 原核或真核細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和/或表達(dá)。這些中間載體一般是原核載體，如質(zhì)?；虼?梭載體。
任選地，可按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備含有VEGFR、死亡配體或其結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白的 編碼核酸。
H.表達(dá)VEGFR-死亡配體融合蛋白
為了獲得高水平表達(dá)VEGFR-死亡配體的核酸， 一般將VEGFR-死亡配體核酸亞 克隆到含有指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄/翻譯終止子和(如果用于編碼蛋白的核酸)啟 動(dòng)翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的表達(dá)載體中。合適的細(xì)菌啟動(dòng)子是本領(lǐng)域熟知的，參見 例如Sambrook和Russell， Molecular Cloning, A Laboratory Manual (《分子克隆，實(shí) 驗(yàn)室手冊》，第3版，2001)， Ausubel等(編)，Current Protocols in Molecular Biology(新 編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南)，約翰韋利和森思公司(John Wiley & Sons),紐約(1993);和 Kriegler， Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual(基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)，實(shí)驗(yàn) 室手冊)，Stockton Press(斯托克頓出版社)，紐約(1990)。用于表達(dá)VEGFR-死亡配體 蛋白的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)可獲自(如)大腸桿菌(五.co//)、芽孢桿菌CSa"7/w w.)和沙門菌 (Sa/畫函)(Palva等，Gene 22:229-235 (1983); Mosbach等，Nature 302:543-545 (1983)?？少彽糜糜谶@類表達(dá)系統(tǒng)的試劑盒。用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母和昆蟲細(xì)胞的 真核表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域眾所周知的，也可購得。在一個(gè)實(shí)施方式中，真核表達(dá)載體 是腺病毒載體、腺伴隨病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
用于指導(dǎo)異源核酸表達(dá)的啟動(dòng)子取決于具體應(yīng)用。任選地，啟動(dòng)子與異源轉(zhuǎn)錄 起始位點(diǎn)的距離與其在天然狀態(tài)下與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離大約相同。然而，正如本 領(lǐng)域所了解的那樣，此距離可允許有一些改變而不會(huì)丟失啟動(dòng)子功能。
除啟動(dòng)子外，表達(dá)載體一般還包含轉(zhuǎn)錄單元或表達(dá)盒，它們含有在宿主細(xì)胞中
表達(dá)VEGFR-死亡配體編碼核酸所需的所有其它元件。因此，表達(dá)盒一般含有操作性 連接于編碼VEGFR-死亡配體的核酸序列和有效聚腺苷酸化該轉(zhuǎn)錄物所需的信號的 啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和翻譯中止位點(diǎn)。編碼VEGFR-死亡配體的核酸序列一般連 接于可切割的信號肽序列，以促進(jìn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞分泌該編碼蛋白。這類信號肽包括組織 血纖維蛋白溶酶原激活物、胰島素和神經(jīng)元生長因子以及綠棉鈴蟲(//^^/^ v/w"e似)的保幼激素酯酶等的信號肽。表達(dá)盒的其它元件可包括增強(qiáng)子和(如果基因 組DNA用作結(jié)構(gòu)基因)含有功能性剪接供體和受體位點(diǎn)的內(nèi)含子。
除啟動(dòng)子序列外，此表達(dá)盒在結(jié)構(gòu)基因的下游還應(yīng)含有轉(zhuǎn)錄終止區(qū)而可有效終 止。此終止區(qū)可與啟動(dòng)子序列獲自同一基因，或可獲自不同基因。
用于將遺傳信息轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中的具體表達(dá)載體(類型)并不特別重要?？刹捎迷谡?核或原核細(xì)胞中表達(dá)所用的任何常規(guī)載體。標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌表達(dá)載體包括質(zhì)粒如基于 pBR322的質(zhì)粒、pSKF、 pET23D和融合表達(dá)系統(tǒng)如GST和LacZ。也可將表位標(biāo)簽 加入重組蛋白如c-myc中，以提供方便的分離方法。
真核表達(dá)載體一般采用含有真核病毒調(diào)控元件的表達(dá)載體，如SV40載體、乳 頭瘤病毒載體和衍生自EB病毒的載體。其它示范性真核載體包括能在SV40早期啟 動(dòng)子、SV40晚期啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子、鼠乳房腫瘤病毒啟動(dòng)子、勞氏肉瘤病 毒啟動(dòng)子、多角體蛋白啟動(dòng)子或能在真核細(xì)胞中有效表達(dá)的其它啟動(dòng)子的指導(dǎo)下表 達(dá)蛋白質(zhì)的pMSG、 pAV009/A+、 pMTO10/A+、 pMAMneo-5、桿狀病毒pDSVE和 任何其它載體。 .
一些表達(dá)系統(tǒng)含有可顯示基因擴(kuò)增的標(biāo)記物，例如胸苷激酶、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn) 移酶和二氫葉酸還原酶?；蛘撸话ɑ驍U(kuò)增的高產(chǎn)率表達(dá)系統(tǒng)也適用，例如在 昆蟲細(xì)胞中采用桿狀病毒載體，其中VEGFR-死亡配體編碼序列在多角體蛋白啟動(dòng) 子或其它強(qiáng)效桿狀病毒啟動(dòng)子的指導(dǎo)下。
表達(dá)載體中通常包含的元件也包括在大腸桿菌中具有功能的復(fù)制子、能夠選 擇攜帶重組質(zhì)粒的細(xì)菌的抗生素抗性編碼基因和能插入真核序列的質(zhì)粒非必需區(qū)中 的獨(dú)特限制性位點(diǎn)。所選擇的具體抗生素抗性基因并不重要，許多本領(lǐng)域已知的抗 性基因都適用。任選選擇原核序列，使它們不干擾DNA在真核細(xì)胞中的復(fù)制(如果
必要)。
用標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)染方法產(chǎn)生表達(dá)大量VEGFR-死亡配體蛋白的細(xì)菌、哺乳動(dòng)物、酵 母或昆蟲細(xì)胞系，然后用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化這些蛋白(參見例如，Colley等，Ao/. 264:17619-17622 (1989);蛋白質(zhì)純化指南(Guide to Protein Purification),《酶學(xué)方法》 (Methods in Enzymology)，第182巻(Deutscher編，1990))。按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)轉(zhuǎn)化真核和 原核細(xì)胞(參見例如，Morrison, ■/132:349-351 (1977); Clark-Curtiss和Curtiss, 《酶學(xué)方法》(Methods in Enzymology) 101:347-362 (Wu等編，1983)。
可采用將外來核苷酸序列引入宿主細(xì)胞的任何熟知方法。這些方法包括采用磷 酸鈣轉(zhuǎn)染、聚凝胺(polybrene)、原生質(zhì)體融合、電穿孔、脂質(zhì)體、顯微注射、血漿載 體(plasma vector)、病毒載體和將克隆的基因組DNA、 cDNA、合成DNA或其它外 來遺傳物質(zhì)引入宿主細(xì)胞的其它熟知方法(參見例如，Sambrook和Russell,同上)。 只要需要，采用具體的遺傳工程改造方法能夠成功地將至少一種基因引入能夠表達(dá) VEGFR-死亡配體的宿主細(xì)胞中。可通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染將VEGFR-FasL核酸引 入細(xì)胞中(實(shí)施例4和圖11a和IIB)。
將表達(dá)載體引入細(xì)胞后，在有利于VEGFR-死亡配體表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的 細(xì)胞，然后用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)回收培養(yǎng)物中的VEGFR-死亡配體(參見例如，Scopes,蛋白 質(zhì)純化原理和實(shí)踐(Protein Purification: Principles and Practice) (1982);美國專利號 4,673,641; Ausubel等，同上；和Sambrook等，同上)。產(chǎn)生有用的VEGFR-FasL融 合蛋白參見實(shí)施例4和圖11和11B的描述。
I.純化VEGFR-FasL融合蛋白
可采用本領(lǐng)域熟知的方法純化本發(fā)明的VEGFR-死亡配體融合蛋白，如， Sambrook和RusseU， Molecular Cloning, A Laboratory Manual(分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手 冊；第3版，2001); Kriegler， Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual(基 因轉(zhuǎn)移和表達(dá)實(shí)驗(yàn)室手冊)(1990);和Current Protocols in Molecular Biology(新編分 子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南)(Ausubel等編，1994-1999)。
因此，可通過常規(guī)的蛋白質(zhì)純化方法純化本發(fā)明VEGFR-死亡配體融合蛋白， 或者，利用連接于VEGFR-死亡配體融合蛋白的標(biāo)簽進(jìn)行蛋白質(zhì)純化。本領(lǐng)域已知各 種標(biāo)簽，包括但不限于FLAG-和HA-標(biāo)簽。 一般將這些標(biāo)簽的編碼序列連接于 VEGFR-死亡配體編碼序列，當(dāng)轉(zhuǎn)錄RNA翻譯時(shí)即可表達(dá)。優(yōu)選標(biāo)簽是FLAG標(biāo)簽。 含有FLAG標(biāo)記的VEGFR-死亡配體融合蛋白的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式見圖6和11，
詳見實(shí)施例3和4。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，將可切割的肽序列插入標(biāo)簽與VEGFR-死亡配體融合 蛋白之間。這特別有利于在純化蛋白后切割掉此標(biāo)簽。
J. VEGF結(jié)合于VEGFR-FasL
本發(fā)明VEGFR融合蛋白能結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。本領(lǐng)域已知用于監(jiān) 測VEGF與VEGF受體胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的生物試驗(yàn)，參見本文的描述。例如，Achen 等(納入本文作參考)描述了用于監(jiān)測VEGF配體與VEGFR-2胞外結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的生 物試驗(yàn)和采用可溶性VEGFR胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)合試驗(yàn)?？衫肁chen等(Proc Natl Acad Sci USA(1998)， 95:548-553)的試驗(yàn)檢測VEGF與本發(fā)明VEGFR融合蛋白的結(jié)合。
VEGF與本發(fā)明VEGFR-FasL融合蛋白的結(jié)合激活了 VEGFR-FasL融合蛋白。 本發(fā)明VEGFR-FasL融合蛋白可由人VEGF、小鼠VEGF(實(shí)施例ll)或任何其它哺乳 動(dòng)物VEGF激活。此外，本發(fā)明VEGFR-FasL融合蛋白可由VEGF/P1GF異源二聚 體或PIGF激活(實(shí)施例11)。
K. VEGFR-FasL與Fas結(jié)合
本發(fā)明VEGFR-FasL融合蛋白能結(jié)合Fas。本領(lǐng)域己知用于監(jiān)測FasL-Fas結(jié)合 的生物試驗(yàn)，參見本文的描述。例如，Schneider等(納入本文作參考)描述了細(xì)胞毒試 驗(yàn)和用于監(jiān)測FasL與Fas胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的體外Fas-FasL結(jié)合試驗(yàn)?？刹捎?Schneider等(J Biol Chem (1997)， 272(30): 18827-18833)的試驗(yàn)測定本發(fā)明 VEGFR-FasL與Fas的結(jié)合。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，與可溶性FasL或其胞外結(jié)構(gòu)域相比，VEGFR-FasL融合蛋 白誘導(dǎo)表達(dá)Fas的癌細(xì)胞凋亡或死亡的效率更高。
III.用VEGFR-死亡配體融合蛋白中和VEGF激活VEGF受體的方法
可以各種方式使用本發(fā)明VEGFR-死亡配體融合蛋白。例如，VEGFR-死亡配體 融合蛋白，具體是VEGFR-FasL融合蛋白，可用作過度表達(dá)VEGF的腫瘤的抗癌劑。 本發(fā)明VEGFR-死亡配體融合蛋白還可用作特征是病理性血管新生的疾病，如癌癥、 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或增殖性視網(wǎng)膜病所用的抗血管新生劑。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，提供了利用VEGFR-死亡配體融合蛋白中和VEGF 激活VEGF受體的方法。該方法包括使VEGF與VEGFR-死亡配體融合蛋白相接觸
的步驟。
可在體外或體內(nèi)中和VEGF激活細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞上的VEGF受體。中和VEGF 激活VEGF受體包括使含有表面表達(dá)VEGF受體的細(xì)胞的生物學(xué)樣品與本發(fā)明融合 蛋白相接觸。可以在加入VEGF之前、同時(shí)或之后，在體外使生物學(xué)樣品與該融合 蛋白如VEGFR-FasL相接觸。
通過給予哺乳動(dòng)物，使本發(fā)明融合蛋白與生物液體如血液或腫瘤在體內(nèi)相接觸。 這種體內(nèi)中和法可用于患有疾病如腫瘤生長的哺乳動(dòng)物，以抑制或阻止血管新生。 因此，本發(fā)明融合蛋白，如VEGFR-FasL是抗血管新生性和抗腫瘤治療藥物。
該方法能有效治療患有腫瘤，包括惡性腫瘤和瘤，如胚細(xì)胞瘤、癌癥或肉瘤， 特別是高度血管化腫瘤的對象?？捎帽景l(fā)明抗體或片段治療的腫瘤的一些例子包括 表皮樣瘤、鱗狀細(xì)胞瘤如頭頸腫瘤、結(jié)直腸腫瘤、前列腺腫瘤、乳腺腫瘤、肺腫瘤(包 括小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺腫瘤)、胰腺腫瘤、甲狀腺腫瘤、卵巢腫瘤和肝腫瘤。
IV.用VEGFR-死亡配體融合蛋白誘導(dǎo)凋亡的方法
可以各種方式使用本發(fā)明VEGFR-死亡配體融合蛋白。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方 式中，提供了將血管新生因子的VEGF活性逆轉(zhuǎn)為細(xì)胞死亡因子的方法。該方法根 據(jù)VEGF在許多癌癥，尤其是人癌中過度表達(dá)的觀察結(jié)果。過度表達(dá)VEGF的癌癥 包括但不限于膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、胃癌、卡波西肉瘤、表皮樣癌、成血管細(xì)胞瘤、 乳腺癌、結(jié)腸癌、腎細(xì)胞瘤、垂體瘤、肺癌和前列腺癌。優(yōu)選的癌癥是成膠質(zhì)細(xì)胞 瘤。另一種優(yōu)選的癌癥是前列腺癌。 (
該方法的構(gòu)思是利用腫瘤中過度表達(dá)的VEGF作為對抗腫瘤本身或其血管的死 亡因子。實(shí)際上，使腫瘤的武器，即過度表達(dá)的VEGF(腫瘤需要它來維持生長和轉(zhuǎn) 移)轉(zhuǎn)向?qū)鼓[瘤本身。因此，本發(fā)明組合物可用于在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡或細(xì)胞毒作 用。
該方法包括使VEGF與本發(fā)明VEGFR-死亡配體融合蛋白相接觸的步驟。該方 法還包括使細(xì)胞表面上的死亡受體與VEGF多肽結(jié)合的本發(fā)明VEGFR-死亡配體融 合蛋白相接觸的步驟。因此，在此實(shí)施方式中，如果不結(jié)合VEGF多肽，VEGFR-死亡配體融合蛋白將不結(jié)合死亡受體。
本發(fā)明組合物也可用于在除癌細(xì)胞外的細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡或細(xì)胞毒作用。例如， 本發(fā)明VEGFR-FasL融合蛋白可用于在微血管內(nèi)皮細(xì)胞，如腎上腺皮質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞中 誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞毒作用。
VEGFR-死亡配體融合蛋白(含有結(jié)合的VEGF多肽)結(jié)合于細(xì)胞上的死亡受體 后，則誘導(dǎo)凋亡，即細(xì)胞死亡。如本文所述，VEGFR-死亡配體融合蛋白通過死亡受 體識別部分結(jié)合于死亡受體。例如，作為三聚體產(chǎn)生的FasL能通過結(jié)合Fas、與Fas 成簇從而激活Fas來誘導(dǎo)凋亡。含有FasL多肽的本發(fā)明VEGFR-FasL融合蛋白能以 相同方式誘導(dǎo)凋亡，所述FasL多肽含有寡聚化結(jié)構(gòu)域和死亡受體識別部分。因此， 一個(gè)重要特征是Fas活化需要Fas與FasL，或Fas與VEGFR-FasL融合蛋白聚集成 簇。
優(yōu)選在沒有VEGF的情況下本發(fā)明VEGFR-配體融合蛋白沒有凋亡活性或活性 很小。在幾次體外實(shí)驗(yàn)中證明了這一現(xiàn)象，參見圖ll、 13、 14和15。
優(yōu)選在沒有VEGF的情況下本發(fā)明VEGFR-配體融合蛋白的凋亡活性提高。在 幾次體外實(shí)驗(yàn)中證明了這一現(xiàn)象；參見圖11、 13、 14和15。在這里，"凋亡活性提 高"指與不用VEGF相比，至少激活提高兩倍，優(yōu)選激活提高三倍、更優(yōu)選5倍。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，在VEGF表達(dá)上調(diào)和表達(dá)死亡受體的細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的方 法包括使細(xì)胞接觸組合物或使細(xì)胞與含有本文所述的VEGFR-死亡配體融合蛋白或 編碼VEGFR-死亡配體融合蛋白的多核苷酸的組合物相接觸的步驟。在優(yōu)選實(shí)施方式 中，該多核苷酸編碼SEQ ID N0.22或SEQ ID NO:23的VEGFR-死亡配體融合蛋白。
在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方式中，該多核苷酸包含SEQIDNO: 14。
在本發(fā)明一方面，利用VEGFR-死亡配體融合蛋白或多核苷酸在體外誘導(dǎo)培養(yǎng) 的細(xì)胞系凋亡。在另一優(yōu)選方面，利用VEGFR-死亡配體融合蛋白或多核苷酸在體內(nèi) 即在動(dòng)物體內(nèi)，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，包括人，優(yōu)選在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。
V.過度表達(dá)VEGF和表達(dá)FAS受體的癌癥的治療方法
A. 測定正常個(gè)體和癌癥患者中的VEGF
現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)描述了用于測定或確定正常個(gè)體和癌癥患者中VEGF的生物試 驗(yàn)，可用于在給予本發(fā)明VEGFR-死亡配體融合蛋白之前測定個(gè)體中內(nèi)源性VEGF 的水平。例如，Cooper等評估了在區(qū)分卵巢癌患者與良性附件區(qū)包塊患者的血清 VEGF水平的臨床相關(guān)性，結(jié)論是手術(shù)前VEGF水平可用于區(qū)分良性附件區(qū)包塊與 惡性腫瘤(Clin Cancer Res， (2002) 8(10):3193-7)。
B. 測定癌細(xì)胞表達(dá)的Fas受體
現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)描述了用于測定或確定癌細(xì)胞表達(dá)的Fas受體的生物試驗(yàn)，可用
于確定要靶向的癌細(xì)胞是否表達(dá)FasR或任何其它死亡受體，因此，是否易受本發(fā)明 VEGFR-死亡配體融合蛋白的凋亡誘導(dǎo)作用的影響。在給予本發(fā)明VEGFR-死亡配體 融合蛋白之前需要確定患者的癌癥是否表達(dá)Fas或任何其它死亡受體。例如，可采用 Algeciras-Schimnich等，Proc Natl Acad Sci USA， (2003) 100:11445)所述的生物試驗(yàn)。
C. 治療癌癥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明方法包括治療VEGF上調(diào)和表達(dá)死亡受體的癌細(xì)胞。該方法一般包括用 本發(fā)明VEGFR-死亡配體融合蛋白誘導(dǎo)凋亡。優(yōu)選的癌細(xì)胞選自乳腺癌、前列腺癌、 結(jié)腸癌、肺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤或卵巢癌。
該方法能有效治療患有腫瘤，包括惡性腫瘤和瘤，例如胚細(xì)胞瘤、癌癥或肉瘤， 特別是高度血管化腫瘤的對象?？捎帽景l(fā)明抗體或片段治療的腫瘤的一些例子包括 表皮樣瘤、鱗狀細(xì)胞瘤如頭頸腫瘤、結(jié)直腸腫瘤、前列腺腫瘤、乳腺腫瘤、肺腫瘤(包 括小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺腫瘤)、胰腺腫瘤、甲狀腺腫瘤、卵巢腫瘤和肝腫瘤。
本發(fā)明提供了治療VEGF表達(dá)上調(diào)癌癥的方法。該方法包括給予患者藥物組合 物的步驟。這類藥物組合物包括例如，VEGFR-死亡配體融合蛋白、VEGFR-死亡配 體融合蛋白類似物、VEGFR-死亡配體融合蛋白模擬物、VEGFR-死亡配體融合蛋白 相關(guān)多肽；或者編碼VEGFR-死亡配體融合蛋白、VEGFR-死亡配體融合蛋白類似物、 VEGFR-死亡配體融合蛋白模擬物、VEGFR-死亡配體融合蛋白相關(guān)多肽的多核苷酸。 本發(fā)明藥物組合物可單獨(dú)給藥或與一種或多種其它治療性化合物或療法聯(lián)合給藥。 這類治療性化合物或療法的例子包括但不限于紫杉醇、環(huán)磷酰胺、他莫昔芬、氟 尿嘧啶和多柔比星。
D. 抑制細(xì)胞增殖
可以各種方式使用本發(fā)明VEGFR-死亡配體融合蛋白。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方 式中，提供了抑制過度表達(dá)VEGF的細(xì)胞增殖的方法。"增殖"指細(xì)胞生長、細(xì)胞繁 殖或倍增或形成病理囊腫。過度表達(dá)的VEGF可以是VEGF多肽或VEGF mRNA。 這種方法包括使細(xì)胞接觸能有效抑制細(xì)胞增殖用量的VEGFR-死亡配體融合蛋白的 步驟。'
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，在體外實(shí)施該方法。如本文進(jìn)一步所述，也可在 體內(nèi)實(shí)施本發(fā)明方法。
VI.用VEGFR-FASL融合蛋白治療與血管新生和/或血管生成失控相關(guān)性疾病 或失調(diào)的方法
也可利用防止或抑制血管新生治療與血管新生和/或血管生成失控相關(guān)性疾病、 失調(diào)或非腫瘤疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、新生血管性青光眼、增殖性視網(wǎng)膜病，包 括增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病、黃斑變性、血管瘤、血管纖維瘤和牛皮癬。本發(fā)明組合 物可用于治療這種疾病。
可以各種方式使用本發(fā)明VEGFR-死亡配體融合蛋白。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí) 施方式中，提供了治療與VEGF過度表達(dá)或病理性血管新生有關(guān)的疾病的方法。該 方法包括以下步驟:將有效治療該疾病用量的具有VEGFR-死亡配體融合蛋白活性的 多肽給予對象，優(yōu)選需要治療的對象。所述對象優(yōu)選是人。
A. 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，用本發(fā)明VEGFR-死亡配體融合蛋白或編碼 VEGFR-死亡配體融合蛋白的多核苷酸治療的疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎(RA)是以中性粒細(xì)胞浸入滑膜液、T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤滑膜、滑膜細(xì)胞過 度增殖(導(dǎo)致形成關(guān)節(jié)腫大(apannus))以及軟骨和骨被破壞為特征的炎性關(guān)節(jié)疾病 (Feldman等，Ann Rev Immunol (1996), 14:397-440; Paleolog， Br J Rheumatol (1996)， 35:917-920)。認(rèn)為血管新生在RA發(fā)病過程中有重要作用(Colville-Nash和Scott，. Annals Rheumatic Diseases (1992)， 51:919-925和其中的參考文獻(xiàn))。
在RA中存在VEGF起著直接血管新生因子作用的最強(qiáng)證據(jù)。RA患者的滑膜液 和組織中VEGF表達(dá)顯著高于其它類型關(guān)節(jié)炎的患者(Fava等，《/Med (1994) 180:341-346; Koch等，J Immunol (1994) 152:4149-4156)。此種VEGF的來源似乎是 由于滑膜內(nèi)皮細(xì)胞、滑膜下巨噬細(xì)胞、微血管周圍的成纖維細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞 中表達(dá)升高所致(Fava等， / Ex/ . Afed (1994)， 180:341-346; Koch等，J Immunol (1994)， 152:4149-4156; Nagashima等，J Rheumatol (1995), 22:1624-1630)。也可采 用其它因子間接誘導(dǎo)VEGF。
B. 牛皮癬
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，用本發(fā)明VEGFR-死亡配體融合蛋白或編碼 VEGFR-死亡配體融合蛋白的多核苷酸治療的疾病是牛皮癬。牛皮癬是特征是表皮過 度增殖、炎癥和血管新生的慢性皮膚病。血管新生似乎是牛皮癬發(fā)病的主要原因， 微血管改變是發(fā)生牛皮癬損傷中最早可檢測到的變化之一(綜述參見Creamer和
Barker, Clin Exp Dermatol (1995)， 20:6-9)。幾項(xiàng)報(bào)道表明表皮是血管新生因子的來 源(Nishioka和Ryan， J Invest Dermatol (1972)， 58:33-45; Wolf和Harrison, J Invest Dermatol (1973)， 59:40-43; Barnhill等，Br J Dermatol (1984)， 110:273-281; Malhotra 等，Lab Invest (1989)， 61:162-165)。
在皮膚中鑒定到的許多血管新生因子中(Arbiser， Am Acad Derm(1996)， 34:486-497)， VEGF是最具特征的血管新生直接誘導(dǎo)物。VEGF在牛皮癬皮膚角質(zhì)形 成細(xì)胞中過度表達(dá)，但在正常表皮中表達(dá)量很少(Detmar等，J Exp Med (1994)， 180:1141-1146)。 VEGF也在其它皮膚病如大皰型類天皰瘡、皰疹樣皮炎和多形性紅 斑中(Brown等，Invest Dermatol 1995， 104， 744-749)、遲發(fā)型皮膚過敏性反應(yīng)(Brown 等，Jlmmuno1 1995， 154， 2801-2807)、也可能在皮膚暴曬后過度表達(dá)，例如使培養(yǎng) 的角質(zhì)形成細(xì)胞接觸紫外線后誘導(dǎo)了 VEGF表達(dá)(Brauchle等，J Biol Chem (1996), 271:21793-21797)。
C.黃斑變性
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，用本發(fā)明VEGFR-死亡配體融合蛋白或編碼 VEGFR-死亡配體融合蛋白的多核苷酸治療的疾病是黃斑變性。假定視網(wǎng)膜缺血引起 的血管新生因子釋放是視網(wǎng)膜新血管形成的核心剌激物。在幾種眼病如早熟性視網(wǎng) 膜病、衰老相關(guān)性黃斑變性和糖尿病視網(wǎng)膜病中，繼發(fā)于眼內(nèi)新血管形成的青光眼、 玻璃體出血和視網(wǎng)膜剝離會(huì)導(dǎo)致失明。視網(wǎng)膜缺血引起的血管新生因子釋放能誘導(dǎo) 新血管生長并提高該區(qū)域的氧供給，其結(jié)果是有害的，因?yàn)樾卵懿灰哉＝Y(jié)構(gòu)生 長。水腫、出血、血管曲張和病理性新血管形成結(jié)果導(dǎo)致視網(wǎng)膜剝離，繼而導(dǎo)致失 明。
正常眼睛的血管網(wǎng)組織中組成型表達(dá)VEGF(Adamis等，Arch Ophthalmol (1996)， 114:66-71)，然而，在諸如糖尿病視網(wǎng)膜病等疾病中眼內(nèi)VEGF基因表達(dá)提 高(Adamis等，Amer J Ophthalmology (1994)， 118:445-450; Malecaze等，Arch Ophthalmology (1994)， 112:1476-1482)。
VII.聯(lián)合治療
如本文所詳述，本發(fā)明提供了采用VEGFR-死亡配體融合蛋白中和VEGF受體 被VEGF活化的方法。這些方法尤其可用于誘導(dǎo)凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞毒作用、治療癌癥 和與血管新生和/或血管生成失控相關(guān)性疾病或失調(diào)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，
這些方法各自還可包括給予患者第二種治療劑，如化療藥或放療。
化療藥的例子包括但不限于道諾霉素、道諾霉素、放線菌素d、多柔比星、 表柔比星、伊達(dá)比星、依索比星、博來霉素、麥黃磷芥、異環(huán)磷酰胺、胞嘧啶阿糖 胞苷、雙氯乙基亞硝基脲、白消安、絲裂霉素C、放線菌素D、光神霉素、氯潑尼松、 羥基孕酮、睪酮、他莫昔芬、達(dá)卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽 醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基環(huán)己基亞硝基脲、氮芥、美法侖、環(huán)磷酰胺、6-巰基
嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷(CA)、 5-氮雜胞苷、羥基脲、脫氧助間型霉素、4-羥基 過氧環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、 5-氟脫氧尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤(MTX)、秋水 仙素、紫杉醇、長春新堿、長春堿、依托泊甙、三甲曲沙、替尼泊苷、順鉑和二乙 基已烯雌酚(DES)。通常參見，The Merck Manual of Diagnosis and Therapy(默克診療 手冊)，第15版，1987，第1206-1228頁，Berkow等，編，Rahway， NJ。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，化療藥選自喜樹堿、依托泊甙、雙吲哚基馬來酰 亞胺VIII、順鉑、紫杉醇、多柔比星、替莫唑胺、硼替佐米、LY294002或丙戊酸。
VIII.給予VEGFR-死亡配體融合蛋白
在本發(fā)明的一方面，可采用表達(dá)VEGFR-死亡配體融合蛋白如VEGFR-FasL的 核酸分子(如本文詳述)將該核酸引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞或靶組織中?？刹捎贸Ｒ?guī)的病毒和 非病毒基因轉(zhuǎn)移方法將編碼VEGFR-死亡配體融合蛋白的核酸引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞或 靶組織中。非病毒載體遞送系統(tǒng)包括DNA質(zhì)粒、裸露核酸和與遞送運(yùn)載體如脂質(zhì)體 復(fù)合的核酸。病毒載體遞送系統(tǒng)包括DNA和RNA病毒，遞送給細(xì)胞后成為附加體 或整合到基因組中?；蛑委煼椒ǖ木C述參見，Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel和Feigner, TIBTECH 11:211-217 (1993);Mitani和Caskey， TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455- 460 (1992); Van Brunt， Biotechnology 6(10): 1149-U54 (1988); Vigne， Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer和Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada等，Current Topics in Microbiology and Immunology(微生物學(xué)禾口免疫 學(xué)的當(dāng)前熱點(diǎn))Doerfler和Bmim (編)(1995);和Yu等，Gene Therapy 1:13-26 (1994)。
A.非病毒遞送方法
編碼本發(fā)明工程改造多肽的核酸的非病毒遞送方法包括脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(lipofection)、
顯微注射、生物射彈、病毒體、脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、聚陽離子或脂質(zhì):核酸綴合物、
裸露DNA、人工病毒體和藥物增強(qiáng)的DNA攝取。脂質(zhì)轉(zhuǎn)染參見例如US 5,049,386、 US 4,946,787和US 4,897,355，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑可購得(如川司菲坦(TransfectamTM)和力 波菲汀(LipofectinTM))。適合對多核苷酸進(jìn)行有效的受體識別脂質(zhì)轉(zhuǎn)染的陽離子性和 中性脂質(zhì)包括Feigner、 WO 91/17424、 WO 91/16024所述的脂質(zhì)。可以遞送給細(xì)胞(離 體給藥)或靶組織(體內(nèi)給藥)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知脂質(zhì):核酸復(fù)合物，包括靶向脂質(zhì)體如免疫脂質(zhì)復(fù)合物的制 備(參見例如，Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese等，Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr等，Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy等， Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao等，Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad 等，Cancer Res. 52:4817-4820(1992);美國專利號4,186,183、 4,217,344、 4，235，871、 4,261,975、 4,485,054、 4,501,728、 4,774,085、 4,837,028和4,946,787)。
B.病毒遞送方法
本領(lǐng)域知道利用RNA或DNA病毒系統(tǒng)來遞送VEGFR-死亡配體融合蛋白編碼 核酸。用于基因轉(zhuǎn)移的常規(guī)病毒系統(tǒng)包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴隨病 毒和單純皰疹病毒載體。
在許多基因治療應(yīng)用中，需要用對特定組織類型，如肺組織或乳房組織高度特 異的基因治療載體遞送?？尚揎棽《据d體，使其表達(dá)配體與病毒外表面的病毒包被 蛋白構(gòu)成的融合蛋白而對給定的細(xì)胞類型具有特異性。選擇的配體應(yīng)對感興趣細(xì)胞 類型上存在的已知受體具有親和力。例如，Han等，Prac. A^/. 乂cW. t/.S乂 92:91 Al-9151 (1995)報(bào)道，可修飾莫洛尼鼠白血病病毒，使其表達(dá)融合于gp70的人調(diào)蛋 白，該重組病毒感染表達(dá)人表皮生長因子受體的某些人乳腺癌細(xì)胞。這一原理可延 伸至其它成對的表達(dá)配體融合蛋白的病毒和表達(dá)受體的耙細(xì)胞。例如，可工程改造 絲狀噬菌體，使之展示對基本上任何所選細(xì)胞受體具有特異性結(jié)合親和力的抗體片 段(如Fab或Fv)。雖然上述說明主要應(yīng)用于病毒載體，但相同的原理也可應(yīng)用于非 病毒載體?？晒こ谈脑爝@類載體，使其含有認(rèn)為能促進(jìn)特定靶細(xì)胞攝入的特定攝入 序列。
一般通過全身給藥(如靜脈內(nèi)、應(yīng)膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或顱內(nèi)輸注)或局部應(yīng)用 給予患者個(gè)體，向體內(nèi)遞送基因治療載體，如下所述。或者，可將載體離體遞送給 細(xì)胞，如取自患者個(gè)體的細(xì)胞。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知用于診斷、研究或基因治療的離體細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法(如將轉(zhuǎn)染
細(xì)胞再輸回到宿主生物體中)。在一些實(shí)施方式中，分離對象生物體的細(xì)胞，用
VEGFR-死亡配體編碼核酸轉(zhuǎn)染，在輸注回對象生物體(如患者)中。本領(lǐng)域技術(shù)人員 熟知適合離體轉(zhuǎn)染的各種細(xì)胞類型(參見例如，F(xiàn)reshney等，Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique(動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，基本技術(shù)手冊)(第3版，1994))和其中引
用的參考文獻(xiàn)，有關(guān)如何分離和培養(yǎng)患者細(xì)胞的討論)。
還可將含有治療性核酸的載體(如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、脂質(zhì)體等)直接給予生物 體，以在體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞?；蛘?，可給予裸露的DNA。通過常用的使分子與血液或組 織細(xì)胞最終相接觸的任何途徑給藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得和熟知給予這類核酸 的合適方法，雖然可采用一種以上途徑給予某具體組合物，但與其它途徑相比，某 一具體途徑?？商峁┍攘硪煌緩礁旖莞行У姆磻?yīng)。
部分根據(jù)給予的具體組合物以及給予該組合物所用的具體方法確定藥學(xué)上可接 受的運(yùn)載體。因此，本發(fā)明藥物組合物可采用各種合適劑型，如下所述(參見例如， Remington's Pharmaceutical Sciences(雷明頓藥物科學(xué))，第17版，1989)。
IX.藥物組合物
本發(fā)明提供了含有本發(fā)明VEGFR-死亡配體融合蛋白的藥物組合物。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，藥物組合物含有(i)含以下組分的融合蛋白(l)能 結(jié)合VEGF蛋白的VEGFR多肽；和(2)含寡聚化結(jié)構(gòu)域和Fas配體蛋白胞外結(jié)構(gòu)域 的Fas受體識別部分的Fas配體；和(ii)藥學(xué)上可接受的賦形劑、運(yùn)載體和/或稀釋劑。
在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，提供了含有編碼VEGFR-死亡配體融合蛋白的核酸 的載體和藥學(xué)上可接受的賦形劑、運(yùn)載體和/或稀釋劑的組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中， 編碼VEGFR-死亡配體融合蛋白的核酸含有SEQIDNO: 14所示的核苷酸序列。
該藥物組合物可用于治療過度表達(dá)VEGF和表達(dá)死亡受體如Fas的癌癥。該藥 物組合物也可用于治療特征是本文所述病理性血管新生的疾病。
A.給予藥物組合物
可將含有VEGFR-死亡配體融合蛋白或編碼VEGFR-死亡配體融合蛋白的多核 苷酸激活物的藥物組合物給予患者，以治療癌癥，如肺癌或乳腺癌。如本文以下所 詳述，任選地將該化合物與藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體一起給藥。
可將治療有效量的VEGFR-死亡配體融合蛋白或編碼VEGFR-死亡配體融合蛋
白的多核苷酸給予患者，以預(yù)防、治療或控制癌癥。給予某患者足以在該患者中引
發(fā)有效治療反應(yīng)的用量的化合物。有效治療反應(yīng)是至少部分阻滯或減緩該疾病的癥 狀或并發(fā)癥的反應(yīng)。將足以實(shí)現(xiàn)這一目的的用量定義為"治療有效量"。該劑量取決于
所用具體VEGFR-死亡配體的功效和對象的病情、以及體重或待治療區(qū)域的表面積。 劑量大小也取決于與具體化合物或載體給予具體對象時(shí)是否存在伴隨的副作用、特 性或程度。
可通過標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中測定這類化合物的毒性和療 效，例如，測定LD50(對50。/。群體致死的劑量)和ED50(在50。/。群體中有效治療的劑 量)。毒性和療效的劑量比是治療指數(shù)，可表示為LD50/ED50之比。優(yōu)選治療指數(shù)較 大的化合物。雖然可采用具有毒副作用的化合物，但應(yīng)小心設(shè)計(jì)使這類化合物靶向 患病組織的遞送系統(tǒng)，以最大程度降低對正常細(xì)胞的可能傷害，從而降低副作用。
可采用獲自(例如)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物研究的數(shù)據(jù)計(jì)算用于人的劑量范圍。這類 化合物的劑量優(yōu)選在無毒性或毒性較小的包含ED50的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。劑量可以在 此范圍內(nèi)變化，取決于所用劑型和給藥途^g。對于本發(fā)明方法所用的任何化合物， 可先通過細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)評估其治療有效劑量?？膳渲瞥蓜?dòng)物模型中所用的劑量，以 獲得包括在細(xì)胞培養(yǎng)中測定的IC50(對癥狀實(shí)現(xiàn)半數(shù)最大抑制的受試化合物濃度)的 循環(huán)血漿濃度范圍?？衫眠@類信息更精確地確定用于人體的劑量。可用(例如)高效 液相色譜(HPLC)測定血漿水平。通常，對典型對象而言，調(diào)節(jié)物的劑量當(dāng)量約為1 ng/kg-10 mg/kg。
可采用一種或多種生理上可接受的運(yùn)載體或賦形劑以標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)配制本發(fā)明所用 的藥物組合物?？膳渲圃摶衔锛捌渖砩峡山邮艿柠}和溶劑合物，用于通過任何 合適途徑，包括吸入、局部、經(jīng)鼻、口服、胃腸道外(如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、膀胱內(nèi)或 鞘內(nèi))或直腸途徑給藥。
就口服給藥而言，該藥物組合物可以取(例如)用常規(guī)方法制備的含有藥學(xué)上可接 受賦形劑的片劑或膠囊劑型，所述賦形劑包括粘合劑，如預(yù)明膠化的玉米淀粉、聚 乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素；填料，如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣；潤滑 劑，如硬脂酸鎂、滑石粉或二氧化硅；崩解劑，如馬鈴薯淀粉或淀粉乙醇酸鈉；或 者濕潤劑，如十二烷基硫酸鈉?？梢杂帽绢I(lǐng)域熟知方法給片劑包衣。用于口服給藥 的液體制劑可以取(例如)溶液、糖漿或懸液劑型，或者可以將它們制備成干燥產(chǎn)品， 臨用前用水或其它合適載體構(gòu)建。可通過常規(guī)方法制備含有藥學(xué)上可接受添加劑的 這類液體制劑，所述添加劑包括(例如)懸浮劑，如山梨糖醇糖漿、纖維素衍生物或 氫化食用脂肪；乳化劑，如卵磷脂或阿拉伯膠；非水性載體，如杏仁油、油性酯、
乙醇或分餾的植物油；和防腐劑，如甲基或丙基-對-羥基苯甲酸或山梨酸。該制劑也 可適當(dāng)?shù)睾芯彌_鹽、調(diào)味劑、著色劑和/或甜味劑。如果需要，可適當(dāng)?shù)嘏渲瓶诜? 給藥制劑，以控釋該活性化合物。'
,在吸入給藥中，通?？捎眉訅喊b或噴霧器以氣溶膠噴霧形式遞送該化合物， 其中采用了合適的推進(jìn)劑，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化 碳或其它合適氣體。在加壓氣溶膠的情況下，可提供一個(gè)閥門以確定的單位劑量遞 送計(jì)量藥物。可配制用于吸入器或吹藥器的膠囊和藥筒(例如明膠膠囊和藥筒)，使其 含有所述化合物和合適的粉末基料如乳糖或淀粉的粉末混合物。
可配制胃腸道外注射給藥，例如推注或連續(xù)輸注給藥的化合物。注射制劑可以 是單位劑型，例如，裝在安瓿或多劑量容器中添加有防腐劑的單位劑型。這類形式 的該組合物可以是用油性或水性載體配制的懸浮液、溶液或乳劑，可含有配制物質(zhì)， 如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘撸钚猿煞挚梢允欠勰┬问?，在臨用前用合適 載體如無菌無熱原水構(gòu)建。
可以將該化合物配制成直腸給藥組合物，如栓劑或保留灌腸劑，例如，含有常 規(guī)栓劑基料如可可油或其它甘油酯的制劑。
而且，可將該化合物配制成長效制劑。這類長效制劑可通過植入(例如皮下或肌 肉內(nèi)植入)或肌肉內(nèi)注射給藥。因此，例如，可將該化合物與合適的聚合物或疏水材 料(例如用可接受的油配制成乳劑)或離子交換樹脂配制在一起，或者將其配制成微溶 衍生物如微溶鹽。
如果需要，可將該組合物保存在含有一個(gè)或多個(gè)單位劑型的包裝或分配裝置中， 所述單位劑型中含有活性成分。所述包裝(例如)包括金屬箔或塑料薄膜，如起泡包裝。 包裝或分配裝置中可裝有給藥說明書。
B.治療有效量和給藥
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，如本文所述，將治療有效量的藥物組合物或藥劑 給予對象，優(yōu)選人或非人動(dòng)物，以預(yù)防、治療或控制病情或疾病。將足以在對象中 引起有效治療反應(yīng)的量的此藥物組合物或藥劑給予對象。有效治療反應(yīng)是至少部分 阻滯或減緩病情、失調(diào)或疾病的癥狀或并發(fā)癥的反應(yīng)。將足以實(shí)現(xiàn)這一目的的用量 定義為"治療有效劑量"，也稱為"治療有效量"。
給藥的活性藥物劑量取決于溫血?jiǎng)游锏姆N類(哺乳動(dòng)物)、體重、年齡、個(gè)體情況、 待治療區(qū)域的表面積或體積和給藥方式。劑量大小也取決于與具體小分子化合物給
予具體對象時(shí)是否存在伴隨的副作用、特性或程度。口服給予約50-70 kg的哺乳動(dòng) 物的單位劑量可含有約5-500 mg活性藥物。 一般地，本發(fā)明活性化合物的劑量是足 以實(shí)現(xiàn)所需效果的劑量?？赏ㄟ^對象體內(nèi)藥物累積的測定結(jié)果計(jì)算最優(yōu)給藥方案。 通常，可以每天、每周或每月給藥一次或多次。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不難確定最優(yōu) 劑量、給藥方法和重復(fù)速率。
所給活性藥物的劑量也取決于該藥物的特性。例如，本發(fā)明蛋白質(zhì)或多肽的治 療有效量(即有效劑量)范圍是約0.001-30 mg/kg體重，優(yōu)選約0.01-25 mg/kg體重， 更優(yōu)選約0.1-20 mg/kg體重，更優(yōu)選約1-10 mg/kg、 2-9 mg/kg、 3-8 mg/kg、 4-7 mg/kg 或5-6mg/kg體重。在約1-10周，優(yōu)選2-8周，更優(yōu)選約3-7周，更優(yōu)選約4、 5或6 周中，可以每周給予一次該蛋白質(zhì)或多肽。
此外應(yīng)理解，任何具體動(dòng)物對象的特定劑量水平將取決于各種因素，包括所用 具體VEGFR-FasL融合蛋白的活性，對象的年齡、體重、總體健康狀況、性別和飲 食，給藥時(shí)間，給藥途徑，排泄速率，聯(lián)用藥物以及所要調(diào)節(jié)的表達(dá)程度或活性水 平。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，含有本發(fā)明VEGFR-死亡配體融合蛋白的藥物組 合物或藥劑的每天給藥劑量范圍是每kg對象體重約1 mg各化合物(l mg/kg)至約1 g/kg數(shù)天。在另一實(shí)施方式中，每日劑量的范圍是約5mg/kg-500 mg/kg。在又一實(shí) 施方式中，每日劑量約為10 mg/kg-250 mg/kg。在另一實(shí)施方式中，每日劑量約為 25mg/kg-150mg/kg。優(yōu)選劑量約為10 mg/kg?？擅刻旖o予一次每日劑量，或者分成 亞劑量給藥多次，如每天給藥兩次、三次或四次。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解， 可以不同量、在不同時(shí)間給予這些多肽和蛋白質(zhì)，如本發(fā)明VEGFR-死亡配體融合蛋 白。本領(lǐng)域技術(shù)人員也理解，某些因素可能影響有效治療對象所需的劑量和時(shí)間， 這些因素包括但不限于疾病或失調(diào)的嚴(yán)重程度、曾用治療、對象的總體健康狀況 和/或年齡以及存在的其它疾病。而且，用治療有效量的化合物治療對象可包括單次 治療，或者優(yōu)選可包括一系列治療。
為了實(shí)現(xiàn)所需療效，可以治療有效的每日劑量給藥數(shù)天VEGFR-死亡配體融合 蛋白或其編碼核酸。因此，治療有效地給予VEGFR-死亡配體融合蛋白或其編碼核酸， 以治療對象的本文所述的病情或疾病，需要在3天至兩周或更長時(shí)間的一段時(shí)間內(nèi) 定期(如每日)給藥。 一般地，至少連續(xù)三天，常常至少連續(xù)5天，更常見至少10天， 有時(shí)連續(xù)20、 30、 40或更多天給予VEGFR-死亡配體融合蛋白或其編碼核酸。雖然 連續(xù)每日給藥是實(shí)現(xiàn)治療有效劑量的優(yōu)選途徑，但即使VEGFR-死亡配體融合蛋白或
其編碼核酸不是每日給藥，也能獲得有益的治療效果，只要重復(fù)給藥，重復(fù)的頻率
足以在對象體內(nèi)維持VEGFR-死亡配體融合蛋白或其編碼核酸的治療有效濃度。例 如，可以每隔一天、每隔兩天給予VEGFR-死亡配體融合蛋白或其編碼核酸，或者， 如果采用較高劑量范圍并且對象能耐受，則每周給藥一次。
VEGFR-死亡配體融合蛋白或其編碼核酸的最優(yōu)劑量、毒性和療效可能取決于單 個(gè)VEGFR-死亡配體融合蛋白或其編碼核酸的相對強(qiáng)度，可通過細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物 的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法測定，例如，測定LD50(對5(P/。群體致死的劑量)和ED50(在5(P/。群 體中有效治療的劑量)。毒性與療效的劑量比是治療指數(shù)，表示為LD50/ED50之比。 優(yōu)選治療指數(shù)較大的VEGFR-死亡配體融合蛋白或其編碼核酸。雖然可采用具有毒副 作用的VEGFR-死亡配體融合蛋白或其編碼核酸，但應(yīng)小心設(shè)計(jì)使這類藥物靶向患病 組織的遞送系統(tǒng)，以最大程度降低對正常細(xì)胞的可能損傷，從而降低副作用。
可采用獲自(例如)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物研究的數(shù)據(jù)確定用于人的劑量范圍。這類 VEGFR-死亡配體融合蛋白或其編碼核酸的劑量優(yōu)選在無毒性或毒性很小的包含 ED50的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。劑量可以在此范圍內(nèi)變化，取決于所用劑型和給藥途徑。 對本發(fā)明方法所用的任何VEGFR-死亡配體融合蛋白或其編碼核酸，可先通過細(xì)胞培 養(yǎng)實(shí)驗(yàn)評估其治療有效劑量?？膳涑蓜?dòng)物模型中所用的劑量，以獲得包括在細(xì)胞培 養(yǎng)中測定的IC50(對癥狀實(shí)現(xiàn)半數(shù)最大抑制的藥物濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍?？衫?用這類信息更精確地確定用于人體的劑量?？赏ㄟ^(例如)高效液相色譜(HPLC)測定血 漿水平。通常，對典型對象而言，此藥物的劑量當(dāng)量約為lng/kg-100mg/kg。
成功治療后，可能需要讓對象進(jìn)行維持治療，以防止所治療的病情或疾病復(fù)發(fā)。
X.用于診斷、研究和治療應(yīng)用的試劑盒(藥盒)
用于診斷、研究和上述治療應(yīng)用時(shí)，本發(fā)明也提供了試劑盒。在診斷和研究應(yīng) 用中，這種試劑盒可包括以下任何或所有物質(zhì)測定試劑、緩沖液、VEGFR-死亡配 體多肽、VEGFR-死亡配體特異性核酸或抗體、雜交探針和/或引物、VEGFR-死亡配 體表達(dá)構(gòu)建物、VEGFR-死亡配體的小分子激活物等。治療產(chǎn)品可包括無菌鹽水和另 一種藥學(xué)上可接受的乳劑和懸液基料。
此外，該試劑盒可包括含有實(shí)施本發(fā)明方法的指南(即方案)的說明書。該說明書 可以是裝在本發(fā)明試劑盒中的各種形式，其中一種或多種可裝在該試劑盒中。雖然 說明書一般包括手寫或打印材料，但它們不限于此。本發(fā)明考慮了能夠存儲(chǔ)這類說 明書并將它們輸送給終端用戶的任何媒介。這類介質(zhì)包括但不限于電子儲(chǔ)存介質(zhì)(如
磁盤、磁帶、磁帶盒、芯片)、光學(xué)介質(zhì)(如CD ROM)等。這類介質(zhì)可包括提供說明 材料的因特網(wǎng)址。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，該試劑盒是藥盒，裝有含以下組分的藥物組合物
(i)編碼VEGFR-死亡配體多肽的多核苷酸和(ii)藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體。在本發(fā)明另 ^優(yōu)選實(shí)施方式中，該試劑盒是藥盒，裝有含以下組分的藥物組合物(i)VEGFR-死 亡配體多肽和(ii)藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體。藥盒任選裝有陳述藥物組合物可以或應(yīng)該 用于治療VEGF表達(dá)上調(diào)癌癥的說明書。
本發(fā)明試劑盒還可裝有進(jìn)行質(zhì)譜分析的試劑。這類試劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知 的，包括例如探針或芯片。
本發(fā)明其它實(shí)施方式的試劑盒裝有使本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠進(jìn)行本文所述的 方法變型的任選功能組分。
雖然為了闡述和理解，通過說明和舉例的方式詳細(xì)描述了上述發(fā)明，但本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員不難理解，根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)容，可以在不背離本發(fā)明構(gòu)思和范圍的情 況下作出某些修改、改變、修飾和等同物取代。因此，對本文所述實(shí)施方式進(jìn)行的 各種修飾、改變等也屬于本發(fā)明范圍，本發(fā)明范圍僅參考所附權(quán)利要求書確定。本 領(lǐng)域技術(shù)人員容易了解，可改變、修改或修飾各種不重要的參數(shù)，仍能產(chǎn)生基本相 似的結(jié)果。
雖然本文描述了本發(fā)明各元素的多種實(shí)施方式，但應(yīng)理解，除非另有說明，本 發(fā)明給定元素的各個(gè)實(shí)施方式能夠與本發(fā)明其它元素的各個(gè)實(shí)施方式一起使用，這 種使用意味著形成本發(fā)明的獨(dú)特實(shí)施方式。
通過上述說明可了解，本發(fā)明具有廣泛應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)通過以下實(shí)施例進(jìn)一步說 明本發(fā)明，這些實(shí)施例只是說明，而不以任何方式限制本發(fā)明的邊界和范圍。
XI.實(shí)施例
實(shí)施例l:材料和方法 1.通常的重組DNA方法
除非另有說明，為了闡述編碼本發(fā)明融合蛋白的核酸和表達(dá)融合蛋白，可采用 重組基因組學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。介紹本發(fā)明所用普通方法的基本教科書包括 Sambrook禾卩Russell， Molecular Cloning, A Laboratory Manual(分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手 冊)(第3版，2001); Kriegler， Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual(基 因轉(zhuǎn)移和表達(dá)實(shí)驗(yàn)室手冊)(1990);禾卩Current Protocols in Molecular Biology(新編分
子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南)(Ausubel等編，1994-1999)。
核酸的大小以千堿基(kb)或堿基對(bp)計(jì)算。它們是衍生自瓊脂糖或丙烯酰胺凝 膠電泳、測序核酸或公開的DNA序列的估計(jì)值。蛋白質(zhì)的大小以千道爾頓(kDa)或 氨基酸殘基數(shù)計(jì)算。由凝膠電泳、測序蛋白、衍生的氨基酸序列或公開的蛋白質(zhì)序 列估計(jì)蛋白質(zhì)大小。
按照首先由Beaucage和Caruthers， r"raAet/ra"22:1859-1862 (1981)描述的 固相亞磷酰胺三酯法，用自動(dòng)化合成儀化學(xué)合成市場上不能獲得的寡核苷酸，參見 Van Devanter等，M/c/e/c 及"12:6159-6168 (1984)所述。通過天然丙烯酰胺凝 膠電泳或陰離子-交換HPLC純化寡核苷酸，見Pearson和Reanier， 《/ CTzraw. 255:137-149 (1983)所述。
克隆后，可采用(如)WalIace等，Gene ,16:21-26 (1981)所述的測序雙鏈模板的鏈 終止法驗(yàn)證所克隆基因和所合成寡核苷酸的序列。
2.細(xì)胞系和組織培養(yǎng)
Cos-7細(xì)胞獲自UCSF細(xì)胞培養(yǎng)機(jī)構(gòu)。在37'C、 5% C02的組織培養(yǎng)箱中，用補(bǔ) 充有10%胎牛血清和青霉素/鏈霉素的DME-H21培養(yǎng)基培養(yǎng)此細(xì)胞。
T-47D人乳腺癌細(xì)胞獲自UCSF細(xì)胞培養(yǎng)機(jī)構(gòu)。在37'C、 5% (302的組織培養(yǎng) 箱中，用補(bǔ)充有胰島素(0.2 U/mL)'、 10%胎牛血清和青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培 養(yǎng)基培養(yǎng)此細(xì)胞。
JurkatE6.1細(xì)胞獲自UCSF細(xì)胞培養(yǎng)機(jī)構(gòu)。在37。C、 5% C02的組織培養(yǎng)箱中， 用補(bǔ)充有10%胎牛血清和青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)此細(xì)胞。
U87MG和U373是獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC;美國弗吉尼亞州馬納 薩斯，20108)的人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系。這兩種細(xì)胞都用補(bǔ)充有10%胎牛血清和抗 生素的MEM Eagle培養(yǎng)基和Earl's BSS培養(yǎng)基培養(yǎng)。U373細(xì)胞能對抗Fas受體介導(dǎo) 的凋亡，而U87MG細(xì)胞敏感(Rieger等，1998， FEBS Lett 427:124-128; Yount等， 1999， Cancer Res 59:1362-1365)。
DU145是人前列腺癌細(xì)胞系。DU145獲自ATCC，用補(bǔ)充有10%胎牛血清和抗 生素的MEM Eagle培養(yǎng)基和Earl's BSS培養(yǎng)基培養(yǎng)。
人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)獲自克隆泰克公司(Clonetics)，用補(bǔ)充有胎牛血清、 氫化可的松、hFGF、 IGF和抗壞血酸的生產(chǎn)商提供的EGM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)。由加州大 學(xué)舊金山分校的Richard博士獲得牛腎上腺皮質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞(微血管細(xì)胞)。用補(bǔ)充有10%胎牛血清和抗生素的含有1 g/L葡萄糖的DME H-16培養(yǎng)這些細(xì)胞(Ferrara等， 1991， Endocrinology 129:896-900)。
3. Western印跡
VEGFR-2胞外結(jié)構(gòu)域的抗體購自貝克頓-迪金森/法鳴公司 (Becton-Dickinson/Pharmingen) (#555307)。將大鼠單克隆抗體用于Western印跡，其 終濃度為0.5微克/mL。第二抗體是購自圣克魯斯生物技術(shù)公司(Santa Cruz Biotechnology)的山羊抗大鼠IgG HRP偶聯(lián)抗體(弁SC- 2065)，所用的終濃度為0.4微 克/mL。利用化學(xué)發(fā)光(安瑪西亞的ECL試劑)觀察條帶。
4. PCR方法
用PCR擴(kuò)增編碼氨基酸139-281的入FasL片段。正義引物(購自UCSF生物醫(yī) 學(xué)中心)是
的5'端包含XhoI和Spel位點(diǎn)。反義引物(購自UCSF生物醫(yī)學(xué)中心)是 5'-GGGTCTAGATCTTAGAGCTTATATAAGCCGAAAAACGTCTG-3'，它的3'端包含 BgIII位點(diǎn)和Xbal位點(diǎn)。模板是pOTB7/hFasL (購自ATCC); DNA聚合酶是Pfu (司 査塔基公司(Stratagene)); dNTP來自羅氏公司(Roche)。
PCR條件模板pOTB7/hFasL: 2.0微克；引物100pMol; dNTP: 20nMol;
Pfu: 2.5單位;第一輪循環(huán):95。C 5'; 95。C-35°C 10'以上;72。C 5';第2-ll輪循環(huán)
95°C 45"; 60°C 45"; 72°C 60"。用瓊脂糖凝膠層析純化440 bp PCR片段，用凝膠 提取試劑盒(凱杰公司(Qiagen))純化，亞克隆到pBJ載體的XhoI/Xbal限制性位點(diǎn)中。
5. 凋亡分析
用三種試驗(yàn)測定凋亡和細(xì)胞毒性細(xì)胞計(jì)數(shù)、膜聯(lián)蛋白V陽性細(xì)胞的FACS分 析和LDH(乳糖脫氫酶)釋放。在Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞計(jì)數(shù)中，將100 pL細(xì)胞懸液與等 體積的臺(tái)盼藍(lán)染料(0.4。/。)混合，室溫靜置2分鐘。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞， 一式三 份。用lnStat統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件計(jì)算細(xì)胞平均數(shù)/視野和SEM。在FACS分析中，按照生產(chǎn) 商方案使用購自羅氏公司的膜聯(lián)蛋白-V-Fluos試劑盒。簡言之，用FlkFasL或?qū)φ諚l 件培養(yǎng)基士VEGF-165 (2nM，來自派普泰科公司(Peprotech))處理后，離心沉淀Jurkat 細(xì)胞，重懸于100 膜聯(lián)蛋白-V-Fluos標(biāo)記溶液(FITC-膜聯(lián)蛋白V加碘化丙錠)，室
溫靜置15分鐘。用CellQuest軟件在貝克頓迪金森FACSCalibufTM上進(jìn)行FACS分析， 進(jìn)行門控分選以區(qū)分膜聯(lián)蛋白V-陽性(凋亡)與陰性細(xì)胞，和碘化丙錠陽性(即壞死)與 陰性細(xì)胞。測定凋亡細(xì)胞群(膜聯(lián)蛋白-V-陽性和碘化丙錠-陰性)的百分?jǐn)?shù)。在LDH釋 放試驗(yàn)中，按照生產(chǎn)商方案使用羅氏公司的LDH細(xì)胞毒檢測試劑盒。簡要說，用 FlkFasL或?qū)φ諚l件培養(yǎng)基iVEGF-165 (2nM)處理48小時(shí)后，將細(xì)胞培養(yǎng)物上清液 500 g離心3分鐘，使細(xì)胞碎片沉淀。取25 ^L上清液與LDH檢測試劑混合， 一式 三份，測定492 nm的吸光度定量LDH活性。用InStat統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件計(jì)算平均值和SEM。
實(shí)施例2:構(gòu)建編碼嵌合型小鼠/人VEGFR/FasL融合蛋白的核酸 以逐步方式構(gòu)建編碼FlkFasL的pBJ質(zhì)粒pBJ/Flk(Dl-D3)+FasL(139-281)。首先 進(jìn)行PCR，以擴(kuò)增編碼側(cè)接有5' Xho I/Spe I和3' Bgl II/Xba I位點(diǎn)的氨基酸139-281 的人FasL序列。用XhoI和XbaI消化PCR片段，亞克隆到pBJ哺乳動(dòng)物表達(dá)載體 的Xho I和Xba I位點(diǎn)中，以產(chǎn)生pBJ/hFasL(l39-28l)(圖6)。然后用Xho I切割此質(zhì) 粒，將含有Flk-I信號序列和免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域1-3的質(zhì)粒LNCX/Flk(l-3)Ha的Xho I/Xho I片段克隆到此質(zhì)粒中。得到的質(zhì)粒pBJ/Flk(Dl-D3)+FasL(139-281)(圖5)含有 圖7所示的FlkFasL核苷酸序列。
質(zhì)粒pBJ/Flk(Dl-D3)+FasL(139-281)編碼含有圖8所示氨基酸序列的 VEGFR-2-FasL融合蛋白。
實(shí)施例3:構(gòu)建編碼嵌合型小鼠/人FLAG-VEGFR/FasL融合蛋白的核酸 為了產(chǎn)生表達(dá)FlkFasL和FLAG表位標(biāo)簽的質(zhì)粒pFLAG/FlkhFasL (Dl-D3/139-281;圖6)，由西格瑪公司(SIGMA)購得pFLAG-CMV-3載體。如圖6所 示，用Notl切割pFLAG-CMV-3載體，用克列諾(Klenow)酶補(bǔ)齊末端。用Aval切割 質(zhì)粒pBJ/FlkFasL(Dl-D3 /139-281),用綠豆核酸酶形成鈍端。得到的片段編碼Flk-I 胞外結(jié)構(gòu)域，從信號序列末端的氨基酸Ala-19至結(jié)構(gòu)域3末端的Ser-336。將Aval/ 綠豆片段連接到Notl/克列諾-處理的pFLAG-CMV-3中產(chǎn)生pFLAG-Flk(Dl-D3)，其 中Flk-I序列位于編碼FLAG表位標(biāo)簽的核苷酸框內(nèi)下游。為了完成將FlkFasL cDNA 組裝到pFLAG載體中，亞克隆pBJ/FlkFasL的BspEI/Bgl II片段(Dl-D3/139-281)。 最終質(zhì)粒ppLAG-FlkFasL編碼含有N-末端FLAG表位標(biāo)簽的FlkFasL。
Rl[D2]FasL蛋白由融合于三聚體的人VEGFR1第二結(jié)構(gòu)域(氨基酸129-230: SDTG...NTH;圖10)和hFasL的Fas受體結(jié)合域(氨基酸139-281;圖10)組成。VEGFR1與FasL結(jié)構(gòu)域之間存在5個(gè)氨基酸的接頭序列(ARGTS)(圖10)。該接頭序列和FasL 結(jié)構(gòu)域與最初描述的R2FasL蛋白相同。此外，其3'端有框內(nèi)前胰蛋白酶原前導(dǎo)序列 和FLAG表位標(biāo)簽，它們也存在于pFLAG3載體中(圖10)。
簡要說，按如下方法構(gòu)建含有Rl[D2]FasL核酸序列的質(zhì)粒。采用5'引物 (5'-CCCGCGGCCGCCAGTGATACAGGTAGACCTTTCG-3') 禾卩 3' 弓| 物 (5'-GGCCTCGAGCTATGATTGTATTGGTTTGTCG-3')擴(kuò)增含有VEGFR1的質(zhì)粒中的 VEGFR1結(jié)構(gòu)域2的cDNA(deVries等，1992， Science 255:989-991)。將得到的PCR 片段亞克隆到Notl和Xhol限制性位點(diǎn)中，產(chǎn)生pFLAG3/Rl[D2]FasL質(zhì)粒。FLAG-標(biāo)記的rl[D2]FasL的核酸序列見圖9。
實(shí)施例4:產(chǎn)生含有VEGFR/FasL融合蛋白的條件培養(yǎng)基 用Cos-7細(xì)胞產(chǎn)生含有FlkFasL蛋白的條件培養(yǎng)基。采用由Sambrook和Russell， Molecular Cloning, A Laboratory Manual(分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊)(第3版，2001)改良 的DEAE-右旋糖苷方案轉(zhuǎn)染Cos-7細(xì)胞。簡要說，用不含血清或抗生素的培養(yǎng)基將 10厘米平板中培養(yǎng)的Cos-7細(xì)胞洗滌兩次。各平板中加入3 mL不含血清或抗生素的 培養(yǎng)基，加入3mLDEAE-右旋糖苷溶液使DEAE/右旋糖苷的終濃度0.4mg/mL。將 質(zhì)粒DNA (pBJ/FlkFasL或僅編碼新霉素抗性基因的對照質(zhì)粒pBJ/Neo各1-3嗎)加入 各平板，將平板放回培養(yǎng)箱中。30分鐘或3小時(shí)后，吸出DEAE-右旋糖苷-DNA溶 液，用含有血清的完全培養(yǎng)基洗滌各平板。24小時(shí)后，將培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基(雜 交瘤-SFM，吉布科公司(GIBCO))。 72小時(shí)后，收集平板中的條件培養(yǎng)基，通過0.2拜 濾器過濾，儲(chǔ)存于4'C，準(zhǔn)備用于實(shí)驗(yàn)。為了驗(yàn)證FlkFasL蛋白的表達(dá)，DEAE-右旋 糖苷轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，用甘油/Triton X-100裂解緩沖液裂解Cos-7細(xì)胞。用PAGE分 離裂解物，用VEGFR-2胞外結(jié)構(gòu)域的抗體(法鳴公司(Pharmingen))進(jìn)行免疫印跡在證 實(shí)了與單體、二聚體和三聚體相符的分子量大小的FlkFasL的表達(dá)(圖IIA)。
也產(chǎn)生了分泌FLAG標(biāo)記R2FasL的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞。簡要說，用10:1 的pFLAG/R2FasL和新霉素抗性-表達(dá)載體pBSR-a的混合物電穿孔CHO細(xì)胞。48 小時(shí)后，將細(xì)胞分瓶，在含有新霉素(l mg/mL)的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。選擇在新霉素 中生長的集落進(jìn)行亞培養(yǎng)，用VEGFR2胞外結(jié)構(gòu)域的抗體(法鳴公司)通過Western印 跡篩選分泌有R2FasL的條件培養(yǎng)基。通過細(xì)胞有限稀釋法再次選擇陽性克隆，并用 Western印跡再次驗(yàn)證R2FasL己分泌到條件培養(yǎng)基中。采用抗-FLAG抗體(西格瑪公 司(Sigma))對條件培養(yǎng)基進(jìn)行親和色譜證明，表達(dá)了 FLAG標(biāo)記的R2FasL蛋白(圖
IIB)。
為了產(chǎn)生Rl[D2]FasL蛋白，通過DEAE-右旋糖苷介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染將 pFLAG3/Rl[D2]FasL質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Cos7細(xì)胞中。96小時(shí)時(shí)收集條件培養(yǎng)基。用抗 -FLAG抗體親和層析沐自西格瑪公司的M2凝膠)和用FLAG表位肽洗脫純化得到條 件培養(yǎng)基中的Rl[D2]FasL。
實(shí)施例5: VEGFR/FasL融合蛋白的劑量依賴性細(xì)胞殺傷作用
將Jurkat細(xì)胞接種到24孔板中(500，000個(gè)細(xì)胞，500 pl/孔)，用體積遞增的獲自 對照質(zhì)粒pSV/Neo或質(zhì)粒pBJ/FlkFasL轉(zhuǎn)染的Cos-7細(xì)胞的條件培養(yǎng)基處理。再用 VEGF-165(2nM，來自派普泰科公司)或不用VEGF處理Jurkat細(xì)胞。32小時(shí)后，經(jīng) 臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞。代表性結(jié)果見圖12。
實(shí)施例6: VEGFR/FasL融合蛋白的細(xì)胞殺傷作用取決于VEGF用量 將Jurkat細(xì)胞接種到24孔板中(500，000個(gè)細(xì)胞，500 pl/孔)，用25 ^L/孔的獲自 對照質(zhì)粒pSV/Neo或質(zhì)粒pBJ/FlkFasL轉(zhuǎn)染的Cos-7細(xì)胞的條件培養(yǎng)基處理。再用不 同量的VEGF-165處理Jurkat細(xì)胞。24小時(shí)后，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞。代表性 結(jié)果見圖13。
實(shí)施例7; FlkFasL以VEGF依賴性方式誘導(dǎo)凋亡
將Jurkat細(xì)胞接種到24孔板中(500,000個(gè)細(xì)胞，500 pl/ L)，用1 ^L/孔或5 ^L/ 孔獲自對照質(zhì)粒pSV/Neo或質(zhì)粒pB J/FlkFasL轉(zhuǎn)染的Cos-7細(xì)胞的條件培養(yǎng)基處理。 再用VEGF-165 (2 nM)處理一些孔60分鐘。通過FACS分析FLTC-膜聯(lián)蛋白V-陽性/ 碘化丙錠陰性細(xì)胞，評估所誘導(dǎo)的凋亡。代表性結(jié)果見圖14。
實(shí)施例8: VEGFR/FasL融合蛋白誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡
將T-47D人乳腺癌細(xì)胞接種到24孔板中(500，000個(gè)細(xì)胞，500 pl/孔)，生長至匯 合。用25 ^L/孔獲自對照質(zhì)粒pSV/Neo或質(zhì)粒pBJ/FlkFasL轉(zhuǎn)染的Cos-7細(xì)胞的條件 培養(yǎng)基處理細(xì)胞。還用2 nM VEGF-165.或不用VEGF-165處理細(xì)胞。處理24小時(shí)后， 對細(xì)胞拍照。在T-47D細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)源性VEGF的存在下，F(xiàn)lkFasL誘導(dǎo)凋亡(圖13， 中心)。加入內(nèi)源性VEGF后，觀察到細(xì)胞死亡顯著增加，這表明FlkFasL凋亡活性 受VEGF調(diào)控。代表性結(jié)果見圖15。
實(shí)施例9: VEGFR/FasL融合蛋白以VEGF依賴性方式在乳腺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì) 胞毒性
將T-47D人乳腺癌細(xì)胞接種于24-孔板中(500,000個(gè)細(xì)胞，500 pl/孔)，生長至匯 合。用25 ^L/孔獲自對照質(zhì)粒pSV/Neo或質(zhì)粒FlkFasL轉(zhuǎn)染的Cos-7細(xì)胞的條件培養(yǎng) 基處理細(xì)胞。還用2nMVEGF-165或不用VEGF-165處理細(xì)胞。48小時(shí)后，用LDH 細(xì)胞毒檢測試劑盒(羅氏公司(Roche))檢測細(xì)胞毒性。在T-47D細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)源性 VEGF的存在下，F(xiàn)lkFasL誘導(dǎo)細(xì)胞毒性(圖14，泳道B)。加入內(nèi)源性VEGF后，觀 察到細(xì)胞毒性顯著提高，這表明FlkFasL凋亡活性受VEGF調(diào)控(圖16，泳道D)。
將圖14所示結(jié)果(誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡)與圖16所示結(jié)果(在乳腺癌細(xì)胞中刺激 細(xì)胞毒性)作比較后，注意到添加或不添加VEGF的對照條件培養(yǎng)基，凋亡誘導(dǎo)/細(xì)胞 毒性刺激的基礎(chǔ)水平同樣低下(將圖16的泳道A和B與圖16作比較)。雖然在沒有 VEGF的情況下加入條件培養(yǎng)基不提高對Jurkat細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)水平(圖14)，但分析 在相似條件下的乳腺癌細(xì)胞時(shí)觀察到凋亡誘導(dǎo)顯著提高(圖16，泳道C)。已知乳腺癌 細(xì)胞表達(dá)和分泌內(nèi)源性VEGF。因此，在乳腺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)或刺激細(xì)胞毒作用可解釋 為內(nèi)源性VEGF結(jié)合于FlkFasL，隨后FlkFasL融合蛋白(已結(jié)合VEGF多肽)結(jié)合于 乳腺癌細(xì)胞表面上的Fas所致。因此，圖16的泳道C描述了對癌細(xì)胞分泌的內(nèi)源性 VEGF的凋亡反應(yīng)，說明體內(nèi)給予本發(fā)明融合蛋白的可觀前景。值得注意的是，加入 內(nèi)源性VEGF后，甚至增強(qiáng)了細(xì)胞毒作用。
實(shí)施例10: R2FasL在U87MG人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞和DU145人前列腺癌細(xì)胞 中，但不在U373人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞毒性或凋亡
為了研究R2FasL能否在人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中誘導(dǎo)細(xì)胞毒性，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。以 25，000個(gè)細(xì)胞/孔將U87MG人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞接種于含有100^lL完全培養(yǎng)基的96-孔板中，所述培養(yǎng)基含有10%胎牛血清，使細(xì)胞生長84小時(shí)而不更換培養(yǎng)基。然后 將經(jīng)FLAG表位標(biāo)簽親和層析純化的R2FasL溶液(0、 0.01、 0.1、 1或10 pL)加入各 孔(圖17A)。此外，各孔接受300ng中和性抗VEGF抗體、中和性抗FasL抗體或?qū)?照山羊Ig (均來自R&S系統(tǒng)公司)。24小時(shí)后，用LDH釋放試驗(yàn)(羅氏公司)測定細(xì) 胞毒性，其中將10pL細(xì)胞懸液與100nLLDH反應(yīng)混合物混合，總反應(yīng)體積為200 HL。測定492 nm吸光度，用分光光度法測定細(xì)胞毒性。VEGF或FasL的中和性抗 體能抑制細(xì)胞毒性說明，它們都是R2FasL介導(dǎo)細(xì)胞毒性所必需(圖17A)。
為了研究R2FasL能否誘導(dǎo)人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤凋亡，進(jìn)行了以下試驗(yàn)。以約287,500 個(gè)細(xì)胞/孔將U87MG人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞接種于含有500 完全培養(yǎng)基的12孔板 中，所述培養(yǎng)基中含有10%胎牛血清。24小時(shí)后，加入用pFLAG/R2FasL或空pFLAG 載體轉(zhuǎn)染的Cos7細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(圖17B)。用市售rhsFasL作為標(biāo)準(zhǔn)品(R&S系統(tǒng) 公司)進(jìn)行定量免疫印跡，從而分別測定R2FasL濃度。再經(jīng)過36.小時(shí)后，用胰蛋白 酶處理細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)染色，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。圖17B的數(shù)據(jù)表示為平均值士SEM。
為了研究R2FasL能否在人前列腺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞毒性，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。將 DU145人前列腺癌細(xì)胞接種于含有500 pL完全培養(yǎng)基的24孔板中，所述完全培養(yǎng) 基含有10%胎牛血清，使其生長54小時(shí)而不更換培養(yǎng)基。加入所示體積的用 pFLAG/R2FasL或空pFLAG載體轉(zhuǎn)染的Cos7細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。再經(jīng)過34小時(shí)后， 用上述LDH釋放試驗(yàn)測定細(xì)胞毒性。代表性數(shù)據(jù)組見圖17C。
為了研究R2FasL活性對U87MG成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的特異性，分析了 R2FasL 對U373成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒作用。已知U373細(xì)胞對Fas受體介導(dǎo)的殺傷 作用有抗性，即U373細(xì)胞基本上是陰性對照，以顯示R2FasL沒有組成型毒性。以 25,000個(gè)細(xì)胞/孔將U87MG和U373人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞接種于含有100 ^iL完全培 養(yǎng)基的96孔板中，所述培養(yǎng)基含有10%胎牛血清，使其生長96小時(shí)而不更換培養(yǎng) 基。加入所示體積的用pFLAG/R2FasL載體轉(zhuǎn)染的Cos7細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。再經(jīng)過 36小時(shí)后，用本文所述的LDH釋放試驗(yàn)檢測細(xì)胞毒性(圖17D)。.
實(shí)施例ll: RlD21FasL以VEGF依賴性方式誘導(dǎo)凋亡
為了研究Rl[D2]FasL能否以VEGF依賴性方式誘導(dǎo)凋亡，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。將 JurkatE6.1人T細(xì)胞接種于包含100^iL含有10Q/o胎牛血清的完全培養(yǎng)基的96孔板中。 在不存在或存在rhVEGF-165(終濃度2 nM)的情況下，加入用pFLAG/Rl[D2]FasL載 體轉(zhuǎn)染的Cos7細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(0.001、 0.01、 0.1、 I或IO ^L)。 22小時(shí)后，用刃 天青試驗(yàn)(來自生物資源公司(BioSource)的阿爾瑪藍(lán)試劑)檢測細(xì)胞活力。將20 阿 爾瑪藍(lán)加入各孔和檢測540 nm和620 nM的吸光度，測定活細(xì)胞將多少阿爾瑪藍(lán)底 物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物。按照生產(chǎn)商方案計(jì)算底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的％。顯示Rl[D2]FasL以VEGF 依賴性方式誘導(dǎo)凋亡的代表性數(shù)據(jù)組見圖18A。
為了研究哪種生長因子能激活Rl[D2]FasL，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。將JurkatE6.1人 T細(xì)胞接種于包含100pL含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基的96孔板中。在不存在或 存在rhVEGF-165(重組人VEGF-165) 、 rmVEGF-164(重組小鼠 VEGF-164)、
rhVEGF-121(重組人VEGF-121)、 rhVEGF-165/rhPlGF-129異源二聚體或rhPlGF-129 的情況下，加入用pFLAG/Rl[D2]FasL載體轉(zhuǎn)染的Cos7細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(2 ^L/孔)。 所用的所有生長因子的終濃度為10 nM，來自派普泰科公司或R&D系統(tǒng)公司。19 小時(shí)后，用上述刃天青試驗(yàn)檢測細(xì)胞活力。代表性數(shù)據(jù)見圖18B。結(jié)果表明，在這 些實(shí)驗(yàn)中，所檢測的所有生長因子都能激活Rl[D2]FasL。
在類似實(shí)驗(yàn)中，所檢測的生長因子濃度不同。簡要說，將JurkatE6.1人T細(xì)胞 接種于包含100 ^tL含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基的96孔板中。在不存在或存在 終濃度為0.001、 0.01、 0.1、 1和10 nM的rhVEGF-165或rmVEGF-165的情況下， 加入用pFLAG/R2FasL載體或空pFLAG載體轉(zhuǎn)染的Cos7細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(l ^L/ 孔)。18小時(shí)后，用本文所述的刃天青試驗(yàn)測定細(xì)胞活力。圖21A所示數(shù)據(jù)表明，人 和小鼠VEGF-165能相似地激活R2FasL。
為了測定hVEGF-165對Rl[D2]FasL的ED50，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。將Jurkat E6.1 人T細(xì)胞接種于包含100 (iL含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基的96孔板中。在不存 在或存在0、 0.01、 0.1、 1、 10、 100、 l，OOO或10,000 nMrhVEGF-165的情況下，力口 入用pFLAG/Rl[D2]FasL載體轉(zhuǎn)染的Cos7細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(2 pL/孔)。19小時(shí)后， 用上述刃天青試驗(yàn)檢測細(xì)胞活力。發(fā)現(xiàn)hVEGF-165對Rl[D2]FasL的ED50約為100 pM(圖18C)。
在類似實(shí)驗(yàn)中，測定了 hVEGF-165對R2FasL的ED50。簡要說，將JurkatE6.1 人T細(xì)胞接種于包含100 )iL含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基的96孔板中。在不存 在或存在終濃度為0、 0.02、 0.02、 0.2禾P 2 nM的rhVEGF-165的情況下，加入所示 體積的用pFLAG/R2FasL載體轉(zhuǎn)染的Cos7細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。18小時(shí)后，用刃天青 試驗(yàn)測定細(xì)胞活力。rhVEGF-165的ED50為20 pM-200 pM (圖21B)。
實(shí)施例12:用化療藥加強(qiáng)R2FasL活性
為了測定化療藥可否加強(qiáng)R2FasL活性，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。以25,000個(gè)細(xì)胞/孔將 U87MG人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞接種于包含100pL含有10%胎牛血清的96孔板中。48 小時(shí)后，用雙吲哚基馬來酰亞胺VIII(Bis VIII，終濃度1 pM)、喜樹堿(終濃度20 nM)、 依托泊甙(終濃度5 nM)或DMSO載體(l. nL/孔)處理細(xì)胞。將Bis VIII、喜樹堿和依托 夠甙(均來自拜爾默公司(Biomol))溶解于DMSO，每孔加入1 ^L。接觸藥物72小時(shí) 后，用FLAG抗體親和純化的R2FasL溶液(10nL/孔)處理細(xì)胞，再培育40小時(shí)。分 別用上述刃天青試驗(yàn)和LDG釋放試驗(yàn)測定細(xì)胞活力和細(xì)胞毒性。圖19A和19B所
示結(jié)果證明，在這些實(shí)驗(yàn)中檢測的化療藥均能增強(qiáng)R2FasL的活性。
實(shí)施例13: R2FasL在大血管內(nèi)皮細(xì)胞中不誘導(dǎo)細(xì)胞毒性，但在微血管內(nèi)皮細(xì) 胞中具有活性 、
為了測定R2FasL能否在大血管內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞毒性，微血管和大血管可表 達(dá)不同的死亡因子受體和生長因子受體群。R2FasL在腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞(微血管)中的活 性有差異，對正常大血管(如動(dòng)脈和靜脈)內(nèi)皮細(xì)胞的毒性較小。為了測定R2FasL能 否在大血管內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞毒性，.進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(大血 管內(nèi)皮細(xì)胞；HUVEC，第4代，來自克隆泰克公司(Clonetics))接種于含有100 pL培 養(yǎng)基的96孔板中，所述培養(yǎng)基含有10。/。胎牛血清但不含VEGF。 24小時(shí)后，撤消血 清開始血清饑餓(以使細(xì)胞對死亡信號敏感)。血清饑餓15小時(shí)后，在不存在或存在 rhVEGF-165 (終濃度2 nM)的情況下，用含有R2FasL (10 iliL/ L)的Cos7細(xì)胞條件培 養(yǎng)基處理細(xì)胞。用R2FasL土rhVEGF處理22小時(shí)后，用本文所述的刃天青試驗(yàn)測定 細(xì)胞活力。表明R2FasL+VEGF對這些大血管內(nèi)皮細(xì)胞沒有作用(圖20A)。
為了測定R2FasL能否在微血管內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞毒性，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。將 牛腎上腺皮質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞(微血管內(nèi)皮細(xì)胞)接種于包含100 ^L含有1%胎牛血清的完全 培養(yǎng)基的96孔板中。22小時(shí)后，在不存在或存在rhVEGF-165(終濃度2 nM)的情況 下，加入用pFLAG/R2FasL或空pFLAG載體轉(zhuǎn)染的Cos7細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(2 |iL/ 孔)。24小時(shí)后，用上述LDH釋放試驗(yàn)檢測細(xì)胞毒性。圖20B顯示，R2FasL和VEGF 能在腎上腺皮質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。因此，R2FasL對大血管內(nèi)皮細(xì)胞(如 HUVEC)無活性，但對微血管內(nèi)皮細(xì)胞有活性。
實(shí)施例14:檢測VEGFR-FasL的體內(nèi)(作用)
也可在體內(nèi)，(例如)在佐劑關(guān)節(jié)炎模型中檢測本發(fā)明融合蛋白的活性。本文所用 術(shù)語"佐劑關(guān)節(jié)炎模型"指大鼠，優(yōu)選Wistar-Lewis或本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的其它大鼠 品系，將0.1mL弗氏佐劑注射到尾根部誘導(dǎo)此疾病。這種佐劑關(guān)節(jié)炎模型只是一個(gè) 可用于檢測本發(fā)明化合物的動(dòng)物模型例子。三種最常見的動(dòng)物模型的綜述參見Oliver 和Brahn (1996) J. Rheumatol. 23:56-60，將其全文，包括附圖、數(shù)據(jù)或表格納入本文 作參考。
已經(jīng)開發(fā)了許多動(dòng)物模型來研究VEGF在腫瘤血管新生中的功能。例如，大鼠 C6膠質(zhì)瘤和人U87MG成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞能分泌VEGF，在無胸腺小鼠皮下生長
(Saleh等，Cancer Res (1996) 56:393-401; Cheng等，尸亂淑/. ^cad , (1996)， 93:8502-8507)。將VEGF mRNA的反義構(gòu)建物引入這些細(xì)胞系能減緩其體內(nèi)生長， 并降低新血管形成的程度。VEGF的單克隆抗體能抑制人橫紋肌肉瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、 平滑肌肉瘤(Kim等，Nature (1993)， 362:841-844)和纖維肉瘤(Asano等，Cancer Res (1995)，55:5296-5301)在無胸腺小鼠皮下生長?？筕EGF抗體也能阻斷纖維肉瘤(Asano 等，Cancer Res (1995)， 55:5296-5301)和結(jié)腸癌腫瘤(Warren等，J Clin Invest (1995)， 95:1789-1797)的轉(zhuǎn)移。因此，這些動(dòng)物模型可用于檢測本發(fā)明融合蛋白的體內(nèi)活性。 雖然為了闡述和理解，通過說明和舉例的方式詳細(xì)描述了上述發(fā)明，但本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員不難理解，根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)容，可以在不背離所附權(quán)利要求書的構(gòu)思 和范圍的情況下作出某些改變和修飾。
-將本說明書引用的所有發(fā)表物和專利申請納入本文作參考，就像將單個(gè)發(fā)表物 或?qū)＠暾垖ｉT或單獨(dú)納入本文作參考的那樣。
權(quán)利要求
1. 一種結(jié)合于死亡受體的融合蛋白，所述融合蛋白包含(i)結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多肽的血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)多肽；和(ii)含有寡聚化結(jié)構(gòu)域和死亡受體識別部分的死亡配體；其中所述VEGFR多肽的C末端連接于所述死亡配體的N末端。
2. 如權(quán)利要求l所述的融合蛋白，其特征在于，所述死亡受體是Fas，所述 死亡配體是Fas配體。
3. 如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述VEGFR多肽包含VEGF 受體-l(VEGFR-l)的VEGF結(jié)合域。
4. 如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述VEGFR多肽包含VEGF 受體-2(VEGFR-2)的VEGF結(jié)合域。
5. 如權(quán)利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述VEGF受體-1是人VEGF 受體-1。
6. 如權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述VEGF受體-2是人VEGF 受體-2。
7. 如權(quán)利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述Fas配體是人Fas配體。
8. 如權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述VEGFR-2是鼠 VEGFR-2，所述死亡配體包括人Fas配體。
9. 如權(quán)利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含與SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23所示氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列。
10. 如權(quán)利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含SEQID NO:22或SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
11. 如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，還包含(iii)表位標(biāo)簽。
12. 如權(quán)利要求ll所述的融合蛋白，其特征在于，所述表位標(biāo)簽包括FLAG 樣標(biāo)簽或HA標(biāo)簽。
13. 如權(quán)利要求12所述的融合蛋白，其特征在于，可切掉所述表位標(biāo)簽。
14. 如權(quán)利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述Fas配體選自 (i) 含有氨基酸序列SEQ ID NO: 11的多肽；(ii) 含有氨基酸序列SEQ ID NO: 12的多肽；(iii) 含有氨基酸序列SEQIDNO: 13的多肽；和(iv) 包含在(i)-(iii)中任一項(xiàng)氨基酸序列中缺失、取代或添加一個(gè)至數(shù)個(gè)氨基 酸殘基的氨基酸序列的具有Fas結(jié)合活性的多肽。
15. 如權(quán)利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述VEGFR-l選自(i) 包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的多肽；(ii) 包含SEQ ID NO: 19的氨基酸殘基1-747的多肽；(iii) 包含SEQ ID NO: 19的氨基酸殘基32-747的多肽；(iv) 包含SEQ ID NO: 19的氨基酸殘基151-214的多肽；(v) 包含SEQIDNO: 19的氨基酸殘基230-327的多肽；禾口(vi) 包含在(i)-(v)中任一項(xiàng)氮基酸序列中缺失、取代或添加一個(gè)至數(shù)個(gè)氨基酸 殘基的氨基酸序列的具有VEGF結(jié)合活性的多肽。
16. 如權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述VEGFR-2多肽選自(i) 包含氨基酸序列SEQ IDNO:l的多肽；(ii) 包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的多肽；(iii) 包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的多肽；(iv) 包含氨基酸序列SEQIDNO:4的多肽；(v) 包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的多肽；(vi) 包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的多肽； (iiv)包含SEQ IDNO:l的氨基酸殘基141-207的多肽； (iix)包含SEQ ID NO:l的氨基酸殘基224-320的多肽；和 (ix)包含在(i)-(iix)中任一項(xiàng)氨基酸序列中缺失、取代或添加一個(gè)至數(shù)個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的具有VEGF結(jié)合活性的多肽。
17. —種核酸，其包含SEQIDNO: 14所示的核苷酸序列。
18. —種載體，其包含權(quán)利要求17所述的核酸。
19. 一種調(diào)節(jié)死亡受體介導(dǎo)的途徑的方法，所述方法包括以下步驟 使表達(dá)死亡受體的細(xì)胞與含有以下組分的融合蛋白相接觸(i) 結(jié)合VEGF蛋白的VEGFR多肽；(ii) 含有寡聚化結(jié)構(gòu)域和死亡受體識別部分的死亡配體；其中所述VEGFR多肽已結(jié)合VEGF蛋白，所述融合蛋白的含量能有效調(diào)節(jié) 死亡受體介導(dǎo)的途徑。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述死亡受體是Fas，所述死亡配體是Fas配體。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述Fas-介導(dǎo)途徑是凋亡。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白的量能有效誘導(dǎo)凋亡。
23.如權(quán)利要求19所述的方法，可在體外實(shí)施。
24.如權(quán)利要求19所述的方法，可在體內(nèi)實(shí)施。
25.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是癌細(xì)胞。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述癌細(xì)胞過度表達(dá)VEGF。
27,如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述癌細(xì)胞選自乳腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞或卵巢癌細(xì)胞。
28.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，該方法在選自下組的疾病中調(diào)節(jié)Fas介導(dǎo)的途徑類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬和黃斑變性。
29.如權(quán)利要求19所述的方法，還包括使表達(dá)所述死亡受體的細(xì)胞與化療藥相接觸的步驟。'
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述化療藥選自喜樹堿、依托泊甙、雙吲哚基馬來酰亞胺VIII、順鉑、紫杉醇、多柔比星、替莫唑胺、硼替佐米、LY294002或丙戊酸。
31. —種藥物組合物，其包含(i) 含有以下組分的融合蛋白(l)結(jié)合VEGF蛋白的VEGFR多肽；(2)含有寡 聚化結(jié)構(gòu)域和Fas配體蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的Fas受體識別部分的Fas配體；和(ii) 藥學(xué)上可接受的賦形劑、運(yùn)載體和/或稀釋劑。
32. 如權(quán)利要求31所述的藥物組合物，其特征在于，所述Fas配體是人Fas配體。
33. 如權(quán)利要求31所述的藥物組合物，其特征在于，所述VEGFR多肽包 含VEGF受體的VEGF結(jié)合域。
34. —種組合物，其包含(i) 含有SEQIDNO: 14所示核苷酸序列的核酸的載體；和(ii) 藥學(xué)上可接受的賦形劑、運(yùn)載體和/或稀釋劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了VEGF受體的胞外結(jié)構(gòu)域和死亡配體構(gòu)成的融合蛋白。該融合蛋白結(jié)合于VEGF和腫瘤細(xì)胞上的死亡受體，從而抑制VEGF激活VEGF受體并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。本發(fā)明融合蛋白可用于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞毒作用、治療癌癥和血管新生和/或血管生成失控相關(guān)性疾病或失調(diào)。因此，本發(fā)明還提供了用該融合蛋白、編碼該融合蛋白的多核苷酸，含有該多核苷酸的載體，含有該融合蛋白或編碼該融合蛋白的多核苷酸的藥物組合物和藥盒治療血管新生相關(guān)性疾病的方法。
文檔編號C07K14/00GK101384614SQ200680038148
公開日2009年3月11日 申請日期2006年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月15日
發(fā)明者T·P·奎恩 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)