專利名稱：糖基聚乙二醇化的因子ⅶ和因子ⅶa的制作方法
與其他申請的交叉引用本申請涉及2006年5月9日提交的美國臨時專利申請60/746,868；2006年1月5日提交的60/756,443；2005年11月4日提交的60/733,649；2005年10月26日提交的60/730,607；2005年10月11日提交的60/725,894；2005年8月19日提交的60/709,983，其通過引用完全并入用于所有目的。
發(fā)明概述
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)用一個或多個聚(乙二醇)部分受控修飾因子VII或因子VIIa提供新的因子VII或因子VIIa肽綴合物，其藥物動力學性質(zhì)相對于相應的天然(未聚乙二醇化的)因子VII或因子VIIa得到改進。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并發(fā)展出用于可靠和可再現(xiàn)地制備本發(fā)明的因子VII或因子VIIa肽綴合物的成本有效的方法。

在一種示例性的實施方案中，通過在糖基化的或未糖基化的因子VII或因子VIIa肽與在其結(jié)構(gòu)中包括修飾基團例如聚合物修飾基團如聚乙二醇的可酶促轉(zhuǎn)移的糖基部分之間酶介導形成綴合物，制成本發(fā)明的“糖基聚乙二醇化的”因子VII或因子VIIa分子。該PEG部分直接(即，通過兩個反應性基團的反應所形成的單一基團)連接到糖基部分上或者通過接頭部分例如取代的或未取代的烴基、取代的或未取代的雜烴基等連接到該糖基部分上。

因而，一方面，本發(fā)明提供PEG部分例如PEG與肽之間的綴合物，其具有與本領(lǐng)域公認的因子VII或因子VIIa相似的體內(nèi)活性或在其它方面相似。在本發(fā)明的綴合物中，PEG部分通過完整的糖基連接基團共價連接到肽上。示例性的完整的糖基連接基團包括用PEG衍生化的唾液酸部分。

所述聚合物修飾基團可以連接在因子VII或因子VIIa的糖基部分的任意位置上。此外，該聚合物修飾基團可以與野生型或突變的因子VII或因子VIIa肽的氨基酸序列中任意位置上的糖基殘基結(jié)合。

在一種示例性的實施方案中，本發(fā)明提供通過糖基連接基團與聚合物修飾基團綴合的因子VII或因子VIIa肽。示例性的因子VII或因子VIIa肽綴合物包括具有選自以下的式的糖基連接基團

和

在式I和II中，R2是H、CH2OR7、COOR7、COO-或OR7，其中R7表示H、取代的或未取代的烴基或者取代的或未取代的雜烴基。符號R3、R4、R5、R6和R6’獨立地表示H、取代的或未取代的烴基、OR8、NHC(O)R9。下標d是0或1。R8和R9獨立地選自H、取代的或未取代的烴基、取代的或未取代的雜烴基或唾液酸。R3、R4、R5、R6或R6’中的至少一個包括聚合物修飾基團例如PEG。在一種示例性的實施方案中，R6和R6’連同它們所連接的碳一起作為唾液酰部分的側(cè)鏈的組分。在另一示例性的實施方案中，該側(cè)鏈以聚合物修飾基團官能化。

在一種示例性的實施方案中，所述聚合物修飾基團通常如下所示通過接頭L經(jīng)由糖基核心上的雜原子(例如N、O)與糖基連接基團結(jié)合
R1是聚合物修飾基團而L選自鍵和連接基團。下標w表示選自1-6、優(yōu)選1-3以及更優(yōu)選1-2的整數(shù)。示例性的連接基團包括取代的或未取代的烴基、取代的或未取代的雜烴基部分和唾液酸。示例性的接頭組分是酰基部分。另一示例性的連接基團是氨基酸殘基(例如半胱氨酸、絲氨酸、賴氨酸、和短鏈寡肽例如Lys-Lys、Lys-Lys-Lys、Cys-Lys、Ser-Lys等)。

當L為鍵時，它通過R1的前體上的反應性官能團與糖基連接基團的前體上的具有互補反應性的反應性官能團的反應形成。當L是非零級連接基團時，在與R1前體反應之前L可以處于糖基部分的適當位置上。作為選擇，可以使R1和L的前體結(jié)合入預先形成的盒中，其隨后連接到糖基部分上。如本文所述，具有合適反應性官能團的前體的選擇和制備在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。此外，前體的偶合通過本領(lǐng)域熟知的化學方式進行。

在一種示例性的實施方案中，L是由提供其中聚合物修飾部分通過取代的烴基接頭連接的修飾糖的氨基酸或小肽(例如1-4個氨基酸殘基)所形成的連接基團。示例性的接頭包括甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸和半胱氨酸。如本文所定義的氨基酸類似物也可用作接頭組分。該氨基酸可以由另外的接頭組分例如烴基、雜烴基來修飾，其通過?；I，例如經(jīng)由氨基酸殘基的胺部分形成的酰胺或氨基甲酸酯而共價連接。

在一種示例性的實施方案中，糖基連接基團具有式I的結(jié)構(gòu)而且R5包括聚合物修飾基團。在另一示例性的實施方案中，R5同時包括聚合物修飾基團和將該聚合物修飾基團連接到糖基核心上的接頭L。L可以是線性或支化的結(jié)構(gòu)。類似地，聚合物修飾基團可以是支化或線性的。

所述聚合物修飾基團包含兩個或更多個可以是水溶性的或基本上不溶于水的重復單元。用于本發(fā)明化合物中的示例性的水溶性聚合物包括PEG例如m-PEG、PPG例如m-PPG、聚唾液酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚賴氨酸、聚乙烯亞胺、可生物降解的聚合物(例如聚交酯、聚甘油酯)、以及官能化的PEG例如末端官能化的PEG。

用于所述因子VII或因子VIIa肽綴合物的糖基連接基團的糖基核心選自天然的和非天然的呋喃糖和吡喃糖。非天然的糖任選地在環(huán)上包括烴基化的或?；牧u基和/或胺部分，例如醚、酯和酰胺取代基。其他非天然的糖包括在環(huán)的一定位置上的H、羥基、醚、酯或酰胺取代基，在該位置上天然糖中不存在上述取代基。作為選擇，碳水化合物中缺少其命名由來的碳水化合物中會存在的取代基，例如脫氧糖。更進一步的示例性的非天然糖包括氧化的(例如糖酮酸或糖醛酸)和還原的(糖醇)碳水化合物。糖部分可以是單糖、寡糖或多糖。

在本發(fā)明中用作糖基連接基團組分的示例性的天然糖包括葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、半乳糖胺、巖藻糖、甘露糖、甘露糖胺、木糖(xylanose)、核糖、N-乙酰葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖、N-乙酰半乳糖胺和唾液酸。

在一種實施方案中，本發(fā)明提供包含以下部分的因子VII或因子VIIa肽綴合物
其中D選自-OH和R1-L-HN-；G選自H和R1-L-及-C(O)(C1-C6)烴基；R1是包含直鏈或支化的聚(乙二醇)殘基的部分；以及L是接頭，例如鍵(“零級”)、取代的或未取代的烴基和取代的或未取代的雜烴基。在示例性的實施方案中，當D為OH時，G為R1-L-，以及當G為-C(O)(C1-C6)烴基時，D為R1-L-NH-。

在另一方面，本發(fā)明提供因子VII或VIIa肽綴合物，其包含可以是因子VII或因子VIIa的肽。該綴合物還包含糖基連接基團，其中該糖基連接基團連接到所述肽的氨基酸殘基上，以及其中所述糖基連接基團包含具有選自以下的式的唾液酰連接基團

和
其中
為修飾基團。R2選自H、CH2OR7、COOR7、COO-和OR7。R7選自H、取代的或未取代的烴基和取代的或未取代的雜烴基。R3和R4獨立地選自H、取代的或未取代的烴基、OR8和NHC(O)R9。R8和R9獨立地選自H、取代的或未取代的烴基、取代的或未取代的雜烴基和唾液酸。La是選自鍵、取代的或未取代的烴基和取代的或未取代的雜烴基的接頭。X5、R16和R17獨立地選自非反應性基團和聚合物臂(例如PEG)。X2和X4獨立地選自將聚合物部分R16和R17連接到C上的鍵片段。下標j是選自1-15的整數(shù)。

在另一示例性的實施方案中，所述聚合物修飾基團具有下式的結(jié)構(gòu)
其中下標m和n是獨立地選自0-5000的整數(shù)。A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10和A11獨立地選自H、取代的或未取代的烴基、取代的或未取代的雜烴基、取代的或未取代的環(huán)烴基、取代的或未取代的雜環(huán)烴基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的雜芳基、-NA12A13、-OA12和-SiA12A13。A12和A13獨立地選自取代的或未取代的烴基、取代的或未取代的雜烴基、取代的或未取代的環(huán)烴基、取代的或未取代的雜環(huán)烴基、取代的或未取代的芳基和取代的或未取代的雜芳基。

在一種示例性的實施方案中，所述聚合物修飾基團具有下式的結(jié)構(gòu)

和

在根據(jù)上述式的另一示例性實施方案中，聚合物修飾基團具有下式的結(jié)構(gòu)
在一種示例性的實施方案中，A1和A2各自選自-OH和-OCH3。

根據(jù)該實施方案的示例性的聚合物修飾基團包括

和

本發(fā)明提供因子VII或VIIa肽綴合物，其包含選自因子VII和因子VIIa的肽。該綴合物還包含糖基連接基團，其中該糖基連接基團連接到所述肽的氨基酸殘基上，以及其中該糖基連接基團包含具有下式的唾液酰連接基團
其中
為修飾基團。下標s為選自1-20的整數(shù)。下標f為選自1-2500的整數(shù)。Q選自H和取代的或未取代的C1-C6烴基。

在一種示例性的實施方案中，本發(fā)明提供具有下式的修飾的糖

本發(fā)明提供形成因子VII肽例如因子VII和因子VIIa的綴合物的方法。該方法包括使因子VII/因子VIIa肽與帶有與糖共價連接的修飾基團的修飾糖供體接觸。該修飾糖部分經(jīng)由酶的作用從供體轉(zhuǎn)移至因子VII/因子VIIa肽的氨基酸或糖基殘基上。代表性的酶包括但不限于糖基轉(zhuǎn)移酶例如唾液酸轉(zhuǎn)移酶。所述方法包括使因子VII/因子VIIa肽與a)修飾糖供體接觸；和b)在適合于將修飾糖部分從供體轉(zhuǎn)移至肽的氨基酸或糖基殘基上的條件下，能夠?qū)⑿揎椀奶遣糠謴脑撔揎椀奶枪w轉(zhuǎn)移至肽的氨基酸或糖基殘基上的酶接觸，由此合成所述因子VII/因子VIIa肽綴合物。

在一種優(yōu)選的實施方案中，在步驟a)之前，使所述肽與唾液酸酶接觸，由此除去所述肽上的至少一部分唾液酸。

在另一優(yōu)選的實施方案中，使因子VII/因子VIIa肽與唾液酸酶、糖基轉(zhuǎn)移酶和修飾的糖供體接觸。在該實施方案中，肽與唾液酸酶、糖基轉(zhuǎn)移酶和修飾的糖供體基本上同時接觸，不管各組分的添加順序如何。在適合于唾液酸酶從肽中除去唾液酸殘基以及糖基轉(zhuǎn)移酶將修飾糖部分從修飾糖供體轉(zhuǎn)移至肽的氨基酸或糖基殘基上的條件下進行反應。

在另一優(yōu)選的實施方案中，在同一容器中進行去唾液酸化和綴合，以及經(jīng)過去唾液酸化的肽優(yōu)選在綴合步驟之前不經(jīng)純化。在另一示例性的實施方案中，所述方法進一步包含涉及唾液酸化所述肽綴合物的‘加帽’步驟。在含有唾液酸酶、唾液酸轉(zhuǎn)移酶和修飾糖供體的同一反應容器中不經(jīng)在先純化而進行該步驟。

在另一優(yōu)選的實施方案中，進行因子VII/因子VIIa肽的去唾液酸化，并且純化該去唾液酸肽。然后使純化過的去唾液酸肽經(jīng)受綴合反應條件。在另一示例性的實施方案中，所述方法進一步包含涉及唾液酸化肽綴合物的‘加帽’步驟。在含有唾液酸酶、唾液酸轉(zhuǎn)移酶和修飾糖供體的同一反應容器中不經(jīng)在先純化而進行該步驟。

在另一示例性的實施方案中，在含有唾液酸酶、唾液酸轉(zhuǎn)移酶和修飾糖供體的同一反應容器中不經(jīng)在先純化而進行加帽步驟，唾液酸化所述肽綴合物。

在一種示例性的實施方案中，接觸時間少于20小時，優(yōu)選少于16小時，更優(yōu)選少于12小時，甚至更優(yōu)選少于8小時，以及再更優(yōu)選少于4小時。

在另一方面，本發(fā)明提供因子VII/因子VIIa肽綴合物反應混合物。該反應混合物包含a)唾液酸酶；b)選自糖基轉(zhuǎn)移酶、外切糖苷酶和內(nèi)切糖苷酶的酶；c)修飾的糖；和d)因子VII/因子VIIa肽。

在另一示例性的實施方案中，唾液酸酶與因子VII/因子VIIa肽的比率選自0.1U/L:2mg/mL至10U/L:1mg/mL，優(yōu)選0.5U/L:2mg/mL，更優(yōu)選1.0U/L:2mg/mL，甚至更優(yōu)選10U/L:2mg/mL，再更優(yōu)選0.1U/L:1mg/mL，更優(yōu)選0.5U/L:1mg/mL，甚至更優(yōu)選1.0U/L:1mg/mL，以及再更優(yōu)選10U/L:1mg/mL。

在一種示例性的實施方案中，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的所述因子VII/因子VIIa肽綴合物包括至多兩個PEG部分。該PEG部分可以在一鍋法中加入，或者它們可以在純化去唾液酸因子VII/因子VIIa后加入。

在另一示例性的實施方案中，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的因子VII/因子VIIa肽綴合物包括至多一個PEG部分。該PEG部分可以在一鍋法中加入，或者它可以在純化去唾液酸因子VII/因子VIIa后加入。

在另一示例性的實施方案中，該方法進一步包含“加帽”，或者向肽綴合物中加入唾液酸。在另一示例性的實施方案中，加入唾液酸酶，接著滯后30分鐘、1小時、1.5小時或2小時，然后加入糖基轉(zhuǎn)移酶、外切糖苷酶或內(nèi)切糖苷酶。

在另一示例性的實施方案中，加入唾液酸酶，接著滯后30分鐘、1小時、1.5小時或2小時，然后加入糖基轉(zhuǎn)移酶、外切糖苷酶或內(nèi)切糖苷酶。本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點從下面的詳細描述中對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言會是明顯的。

在另一示例性的實施方案中，所述方法包括(a)使包含選自以下的糖基的因子VII/因子VIIa肽

和
與具有下式的修飾的糖
以及將糖基連接基團轉(zhuǎn)移至選自所述糖基的GalNAc、Gal和Sia的成員上的合適的轉(zhuǎn)移酶，在適合于所述轉(zhuǎn)移的條件下接觸。示例性的修飾糖為通過接頭部分用聚合物例如直鏈或支化的聚(乙二醇)部分修飾的CMP-唾液酸。

所述肽可以從基本上任何來源獲得，然而，在一種實施方案中，在如上所述進行修飾之前，使因子VII/因子VIIa肽在合適的宿主中表達。哺乳動物(例如BHK、CHO)、細菌(例如大腸桿菌(E.coli))和昆蟲細胞(例如Sf-9)為提供用于本文所述的組合物和方法中的因子VII或因子VIIa的示例性表達體系。

在示例性的實施方案中，可以向患者施用因子VII/因子VIIa肽綴合物以治療組織損傷例如局部缺血、外傷、炎癥或者與有毒物質(zhì)接觸。在另外的示例性實施方案中，可以向患者施用因子VII/因子VIIa肽綴合物以治療患有A型血友病的患者、患有B型血友病的患者、患有A型血友病同時具有因子VIII抗體的患者、患有B型血友病同時具有因子IX抗體的患者、以及患有肝硬化的患者。

在另一示例性的實施方案中，可以向患者施用因子VII/因子VIIa肽綴合物以治療緊急事件、選擇性外科手術(shù)、心臟外科手術(shù)、脊柱外科手術(shù)、肝臟移植、部分肝切除術(shù)、骨盆-髖臼骨折重建、以及異基因干細胞移植中的出血。在另一示例性的實施方案中，可以向患者施用因子VII/因子VIIa肽綴合物以治療急性腦內(nèi)出血、創(chuàng)傷性腦損傷、靜脈曲張出血和上胃腸道出血。

在另一方面中，本發(fā)明提供包含因子VII/因子VIIa肽綴合物和可藥用載體的藥物制劑。

在所述因子VII/因子VIIa肽綴合物中，糖基連接基團或修飾基團所結(jié)合的氨基酸殘基中基本上每一個都具有相同的結(jié)構(gòu)。例如，如果一種肽包含Thr連接的糖基殘基的話，群體中至少約70％、80％、90％、95％、97％、99％、99.2％、99.4％、99.6％或者更優(yōu)選99.8％的肽會具有共價結(jié)合到相同Thr殘基上的相同糖基連接基團。

本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點從下面的詳細描述中對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言會是明顯的。




圖1說明可用于本發(fā)明實踐中的示例性的修飾的唾液酸核苷酸。A.示例性的支化(例如30KDa、40KDa)CMP-唾液酸-PEG糖核苷酸的結(jié)構(gòu)。B.線性因子VIIa-SA-PEG-10KDa的結(jié)構(gòu)。

圖2是制備示例性的用于制備本發(fā)明綴合物的PEG-糖基連接基團前體(修飾的糖)的合成方案。

圖3是提供示例性的用于以修飾的唾液酸形成本發(fā)明綴合物，例如糖基聚乙二醇化肽的唾液酸轉(zhuǎn)移酶的表。

包括圖4A至4E的圖4描述在因子VII和因子VIIa上重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)的示例性方案。圖4A是描繪因子VII和因子VIIa肽的圖，其顯示出與預期重構(gòu)的聚糖結(jié)合的殘基。圖4B是描繪因子VII和因子VIIa肽A(實線)和B(虛線)的圖，其顯示出與預期重構(gòu)的聚糖結(jié)合的殘基以及聚糖的化學式。圖4C至4E是基于其中表達肽的細胞種類和所需的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)的圖4B肽的聚糖預期重構(gòu)步驟的圖。

包括圖5A和5B的圖5是因子VIIa的示例性核苷酸和相應氨基酸序列(分別是SEQ ID NOS1和2)。

圖6是去唾液酸-因子VIIa的等電聚焦凝膠(pH 3-7)的圖象。泳道1是因子VIIa；泳道2-5是去唾液酸-因子VIIa。

圖7是因子VIIa的MALDI譜圖。

圖8是因子VIIa-SA-PEG-1KDa的MALDI譜圖。

圖9是描繪因子VIIa-SA-PEG-10KDa的MALDI譜的圖。

圖10是PEG化的因子VIIa的SDS-PAGE凝膠的圖象。泳道1是去唾液酸-因子VIIa。泳道2是去唾液酸-因子VIIa和CMP-SA-PEG-1KDa與ST3Gal3反應48小時的產(chǎn)物。泳道3是去唾液酸-因子VIIa和CMP-SA-PEG-1KDa與ST3Gal3反應48小時的產(chǎn)物。泳道4是去唾液酸-因子VIIa和CMP-SA-PEG-10KDa與ST3Gal3反應96小時的產(chǎn)物。

圖11A-B顯示在較少的唾液酸酶下同時去唾液酸化和PEG化。這些圖突出顯示在唾液酸酶存在下加帽是有效率的。圖11A顯示當唾液酸酶水平為0.5U/L時的反應過程。泳道1對應于天然的因子VIIa而泳道2是去唾液酸因子VIIa。從泳道3至泳道7，隨著時間前進PEG化產(chǎn)物的量增加。在泳道3中，主要產(chǎn)物是單PEG化的(見64處的點)，而在后面檢測的等分試樣顯示出形成二PEG化(見剛好在97下方的點)、三PEG化(見剛好在97上方的點)和更高PEG化的產(chǎn)物及其含量的增加。泳道8和9顯示出向反應中“加帽”或加入唾液酸的結(jié)果。當反應加帽時，反應程度得到終止，如同從泳道5、8和9中發(fā)現(xiàn)的類似PEG化產(chǎn)物分布中可以看出的那樣。圖11B顯示當唾液酸酶水平為0.1U/L時的反應過程。

圖12A和B。圖12A顯示當同時加入唾液酸酶和糖基轉(zhuǎn)移酶時的情形。圖12B顯示當首先加入唾液酸酶、接著在30分鐘延遲后加入糖基轉(zhuǎn)移酶時的情形。

圖13是一個或多個糖基連接基團可以結(jié)合到其上以便提供本發(fā)明肽綴合物的肽的列表。

圖14A和B顯示表現(xiàn)HPLC試驗結(jié)果的色譜圖。圖14A顯示由輕鏈方法分析的因子VIIa-SA-PEG-10KDa(上)和天然因子VIIa對照(下)的經(jīng)標記的色譜圖。顯示出LC(輕鏈)、1x10KDa-PEG-LC、2x10KDa-PEG-LC和3x10KDa-PEG-LC與其他產(chǎn)物的分離。圖14B顯示由重鏈方法分析的因子VIIa-SA-PEG-10KDa(上)和天然因子VIIa對照(下)的經(jīng)標記的色譜圖。顯示出HC(重鏈)、1x10KDa-PEG-HC、2x10KDa-PEG-HC和3x10KDa-PEG-HC與其他產(chǎn)物的分離。

圖15A-15D顯示表現(xiàn)HPLC試驗結(jié)果的色譜圖。圖15A和15B分別顯示由輕鏈方法分析的還原的天然因子VIIa對照和還原的因子VIIa-SA-PEG-40KDa的經(jīng)標記的色譜圖。顯示出LC(輕鏈)、1x40KDa-PEG-LC、2x40KDa-PEG-LC和3x40KDa-PEG-LC與其他產(chǎn)物的分離。圖15C和D分別顯示由重鏈方法分析的還原的天然因子VIIa對照和因子VIIa-SA-PEG-40KDa的經(jīng)標記的色譜圖。顯示出HC(重鏈)、1x40KDa-PEG-HC、2x40KDa-PEG-HC和3x40KDa-PEG-HC與其他產(chǎn)物的分離。
本發(fā)明的詳述和優(yōu)選實施方案 縮寫
PEG，聚(乙二醇)；PPG，聚(丙二醇)；Ara，阿拉伯糖基；Fru，果糖基；Fuc，巖藻糖基；Gal，半乳糖基；GalNAc，N-乙酰半乳糖胺基；Glc，葡萄糖基；GlcNAc，N-乙酰葡糖氨基；Man，甘露糖基；ManAc，乙酸甘露糖氨基；Xyl，木糖基；NeuAc，唾液?；騈-乙酰神經(jīng)氨酸基；Sia，唾液酰基或N-乙酰神經(jīng)氨酸基；及其衍生物和類似物。
定義
除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語一般具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。通常，細胞培養(yǎng)、分子遺傳學、有機化學和核酸化學以及雜交方面的本文所用命名以及實驗室操作是本領(lǐng)域熟知并通常采用的那些。標準技術(shù)用于核酸和肽合成。該技術(shù)和操作通常根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)方法和本文件中各處提供的各種一般參考文獻(通常參見Sambrook等，
A

，第2版(1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，其通過引用并入本文)來進行。分析化學和下述有機合成方面的本文所用命名以及實驗室操作是本領(lǐng)域熟知并通常采用的那些。標準技術(shù)或其變型用于化學合成和化學分析。

本文描述的所有寡糖以非還原糖的名稱或縮寫(即Gal)描述，接著是糖苷鍵構(gòu)型(α或β)、環(huán)鍵(1或2)、與參與鍵的還原糖的環(huán)位置(2、3、4、6或8)，然后是還原糖的名稱或縮寫(即GlcNAc)。每種糖優(yōu)選吡喃糖。標準糖生物學命名法的綜述參見Essentials of Glycobiology，Varki等編輯，CSHL Press(1999)。

寡糖被認為具有還原性末端和非還原性末端，無論該還原性末端上的糖是否實際為還原性糖。根據(jù)公認的命名法，寡糖在本文中以左側(cè)為非還原性末端而右側(cè)為還原性末端來描述。

術(shù)語“唾液酸”或“唾液酰基”是指九碳羧化糖家族的任何成員。唾液酸家族最常見的成員為N-乙酰神經(jīng)氨酸(2-酮-5-乙酰氨基-3，5-雙脫氧-D-甘油基-D-半乳糖nonulo吡喃糖-1-酮(onic)酸(往往縮寫為Neu5Ac、NeuAc或NANA)。該家族的另一成員為N-羥乙酰-神經(jīng)氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙?；涣u基化。又一唾液酸家族成員為2-酮-3-脫氧-nonulosonic酸(KDN)(Nadano等(1986)J.Biol.Chem.26111550-11557；Kanamori等，J.Biol.Chem.26521811-21819(1990))。還包括9-取代唾液酸例如9-O-C1-C6?；?Neu5Ac如9-O-乳酰基-Neu5Ac或9-O-乙?；?Neu5Ac、9-脫氧-9-氟-Neu5Ac和9-疊氮基-9-脫氧-Neu5Ac。唾液酸家族的綜述參見例如Varki，Glycobiology 225-40(1992)；Sialic acidsChemistry，Metabolism and Function，R.Schauer編輯(Springer-Verlag，NewYork(1992))。唾液酸化過程中唾液酸化合物的合成及使用在1992年10月1日公布的國際申請WO 92/16640中得到公開。

“肽”是指其中單體為氨基酸并通過酰胺鍵結(jié)合在一起的多聚體，也可稱為多肽。另外，非天然氨基酸例如β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸也包括在內(nèi)。非基因編碼的氨基酸也可以用于本發(fā)明中。此外，進行修飾以含有活性基團、糖基化位點、聚合物、治療部分、生物分子等的氨基酸也可以用于本發(fā)明中。本發(fā)明中使用的所有氨基酸可以是D-或L-異構(gòu)體。通常優(yōu)選L-異構(gòu)體。另外，其他肽模擬物(peptidomimetics)也可以用于本發(fā)明中。本文使用的“肽”是指糖基化的和未糖基化的肽。還包括由表達肽的體系不完全糖基化的肽。一般的綜述參見Spatola，A.F.，


，B.Weinstein編輯，Marcel Dekker，NewYork，第267頁(1983)。一些本發(fā)明的肽的列表在圖13中給出。

術(shù)語“肽綴合物”是指其中肽與本文所述的修飾的糖綴合的本發(fā)明的物種。

術(shù)語“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以與天然存在的氨基酸相似的方式發(fā)揮作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些以及隨后得到修飾的那些氨基酸，例如羥基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物是指具有與天然存在氨基酸相同的基本化學結(jié)構(gòu)的化合物，即與氫結(jié)合的α碳、羧基、氨基和R基團，例如高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這些類似物具有修飾的R基團(例如正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但是保持與天然存在的氨基酸相同的基本化學結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物是指具有與氨基酸的一般化學結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)，但是以與天然存在氨基酸類似的方式發(fā)揮作用的化合物。

本文使用的術(shù)語“修飾的糖”或“修飾的糖殘基”是指在本發(fā)明的方法中酶促加成至肽的氨基酸或糖基殘基上的天然或非天然存在的碳水化合物。修飾的糖選自酶底物，其包括但不限于糖核苷酸(單-、雙-和三磷酸酯)、活化的糖(例如糖基鹵化物、糖基甲磺酸酯)、和既未活化又非核苷酸的糖。“修飾的糖”用“修飾基團”共價官能化。有用的修飾基團包括但不限于PEG部分、治療部分、診斷部分、生物分子等。修飾基團優(yōu)選不是天然存在或未修飾的碳水化合物。選擇用修飾基團官能化的位置以使得它不會阻礙“修飾的糖”酶促加成至肽上。

術(shù)語“水溶性的”是指在水中具有一定可檢測的溶解性程度的部分。檢測和/或定量水溶解性的方法為本領(lǐng)域所熟知的。示例性的水溶性聚合物包括肽、糖、聚(醚)、聚(胺)、聚(羧酸)等。肽可以具有混合序列或由單一氨基酸組成，例如聚(賴氨酸)。示例性的多糖為聚(唾液酸)。示例性的聚醚為聚(乙二醇)。聚(乙烯亞胺)為示例性的聚胺，以及聚(丙烯)酸為代表性的聚(羧酸)。

水溶性聚合物的聚合物主鏈可以是聚(乙二醇)(即PEG)。然而，應當理解其他相關(guān)的聚合物也適合用于本發(fā)明的實踐中，而且術(shù)語PEG或聚(乙二醇)的使用意圖在這方面是包括性的而不是排他的。術(shù)語PEG包括以其任意形式的聚(乙二醇)，包括烷氧基PEG、雙官能PEG、多臂PEG、叉狀PEG、支化PEG、懸掛型PEG(即具有懸掛在聚合物主鏈上的一個或多個官能團的PEG或相關(guān)聚合物)、或其中具有可降解鍵的PEG。

聚合物主鏈可以是線性的或支化的。支化的聚合物主鏈通常是本領(lǐng)域已知的。通常，支化聚合物具有中樞分支核心部分和連接到該中樞分支核心上的多個線性聚合物鏈。PEG通常以支化形式使用，其可以通過向多種多元醇例如丙三醇、季戊四醇和山梨糖醇加成環(huán)氧乙烷來制備。中樞分支部分還可以衍生自若干氨基酸，例如賴氨酸。支化聚(乙二醇)可以表示成通式R(-PEG-OH)m，其中R代表核心部分例如甘油或季戊四醇，以及m代表臂的數(shù)目。多臂PEG分子也可以用作聚合物主鏈，例如美國專利No.5,932,462中所述的那些，該專利通過引用全部并入本文。

許多其他的聚合物也適合于本發(fā)明。非肽以及水溶性的在約2-約300個連接位置(loci)內(nèi)的聚合物主鏈在本發(fā)明中尤其有用。合適聚合物的實例包括但不限于其他聚(亞烷基二醇)例如聚(丙二醇)(“PPG”)、乙二醇和丙二醇的共聚物等、聚(氧乙烯多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(羥丙基甲基丙烯酰胺)、聚(α-羥基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉、聚(N-丙烯酰嗎啉)(例如在美國專利No.5,629,384中所描述的，該專利通過引用全部并入本文)、以及其共聚物，三元共聚物和混合物。盡管聚合物主鏈每條鏈的分子量可以變化，但是它典型地為約100Da-約100,000Da，通常是約6,000Da-約80,000Da。

本文在向患者施用肽藥物的上下文中使用的“曲線下面積”或“AUC”定義為描述作為從零到無窮大時間函數(shù)的患者體循環(huán)中藥物濃度的曲線下的總面積。

本文在向患者施用肽藥物的上下文中使用的術(shù)語“半衰期”或“t1/2”定義為藥物在患者中的血漿濃度降低一半所需的時間。根據(jù)多重清除機制、重分布和本領(lǐng)域熟知的其他機制，可以存在多于一個與肽藥物有關(guān)的半衰期。通常，定義α和β半衰期以使得α期與重分布有關(guān)，而β期與清除有關(guān)。然而，對于大部分被限制在血流中的蛋白質(zhì)藥物而言，可以存在至少兩個清除半衰期。對一些糖基化的肽來說，快速β期清除可以由巨噬細胞或內(nèi)皮細胞上識別末端半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺、甘露糖或巖藻糖的受體介導。較慢的β期清除可以通過腎小球?qū)τ行О霃?lt;2nm(約68kD)分子的過濾和/或在組織中特異或非特異吸收和代謝而發(fā)生。糖基聚乙二醇化可以給末端糖(例如半乳糖或N-乙酰半乳糖胺)加帽并由此阻斷通過識別這些糖的受體的快速α期清除。還可以給予較大的有效半徑并由此減少分布容積和組織吸收，從而延長晚β期。因此，如同本領(lǐng)域熟知的那樣，糖基聚乙二醇化對α期和β期半衰期的精確影響可以根據(jù)尺寸、糖基化狀態(tài)和其他參數(shù)而變化?！鞍胨テ凇钡倪M一步解釋可見Pharmaceutical Biotechnology(1997，DFA Crommelin和RD Sindelar編輯，Harwood Publishers，Amsterdam，第101-120頁)。

本文使用的術(shù)語“糖綴合”是指修飾的糖物種與多肽，例如本發(fā)明的G-CSF肽的氨基酸或糖基殘基的酶介導綴合?！疤蔷Y合”的下位類別是“糖基聚乙二醇化”，其中修飾的糖的修飾基團為聚(乙二醇)和其烴基衍生物(例如m-PEG)或活性衍生物(例如H2N-PEG、HOOC-PEG)。

術(shù)語“大規(guī)模的”和“工業(yè)規(guī)模的”可互換使用，而且是指在單個反應周期完成時產(chǎn)生至少約250mg、優(yōu)選至少約500mg、以及更優(yōu)選至少約1g糖綴合物的反應周期。

本文使用的術(shù)語“糖基連接基團”是指與修飾基團(例如PEG部分、治療部分、生物分子)共價結(jié)合的糖基殘基；該糖基連接基團將修飾基團連接到綴合物的其余部分上。在本發(fā)明的方法中，“糖基連接基團”共價結(jié)合在糖基化的或未糖基化的肽上，從而將試劑連接在肽上的氨基酸和/或糖基殘基上。“糖基連接基團”通常經(jīng)由“修飾的糖”酶促結(jié)合在肽的氨基酸和/或糖基殘基上而衍生自“修飾的糖”。糖基連接基團可以是糖衍生的結(jié)構(gòu)，其在修飾基團-修飾的糖盒形成過程中降解(例如氧化→Schiff堿形成→還原)，或者糖基連接基團可以是完整的?！巴暾奶腔B接基團”是指衍生自其中將修飾基團連接并至綴合物其余部分上的糖單體未降解，例如氧化(例如由偏高碘酸鈉氧化)的糖基部分的連接基團。本發(fā)明的“完整的糖基連接基團”可以衍生自天然存在的寡糖，通過向母體(parent)糖結(jié)構(gòu)加成糖基單元或從中除去一個或多個糖基單元來進行。

本文使用的術(shù)語“非糖苷修飾基團”是指不包含直接與糖基連接基團相連的天然存在的糖的修飾基團。

本文使用的術(shù)語“靶向部分”是指將選擇性定位于身體特定組織或區(qū)域的物種。定位由分子決定子的特異識別、靶向劑或綴合物的分子大小、離子相互作用、疏水性相互作用等介導。其他將試劑靶向至特定組織或區(qū)域的機制為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。示例性的靶向部分包括抗體、抗體片段、運鐵蛋白、HS-糖蛋白、凝血因子、血清蛋白、β-糖蛋白、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO等。

本文使用的“治療部分”是指任何可用于治療的試劑，其包括但不限于抗生素、抗炎劑、抗腫瘤藥物、細胞毒素和放射性試劑。“治療部分”包括生物活性劑的前藥，即其中多于一個的治療部分結(jié)合在載體例如多價試劑上的構(gòu)建體。治療部分還包括蛋白質(zhì)和包含蛋白質(zhì)的構(gòu)建體。示例性的蛋白質(zhì)包括但不限于粒細胞集落刺激因子(GCSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GMCSF)、干擾素(例如干擾素-α、-β、-γ)、白介素(例如白介素II)、血清蛋白(例如因子VII、VIIa、VIII、IX和X)、人體絨毛膜促性腺激素(HCG)、促卵泡激素(FSH)和黃體生成素(LH)以及抗體融合蛋白質(zhì)(例如腫瘤壞死因子受體((TNFR)/Fc結(jié)構(gòu)域融合蛋白質(zhì)))。

本文使用的“可藥用載體”包括與綴合物組合時保留綴合物的活性并且與受試者免疫系統(tǒng)無反應的任何物質(zhì)。實例包括但不限于任何標準藥物載體例如磷酸鹽緩沖鹽水溶液、水、乳液例如油/水乳液以及不同類型的濕潤劑。其他載體也可以包括無菌溶液、片劑(包括包衣片劑)和膠囊。通常這些載體包含賦形劑例如淀粉、乳、糖、某些種類的粘土、明膠、硬脂酸或其鹽、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、滑石、植物脂肪或油、樹膠、二元醇或其他已知賦形劑。這些載體還可以包括香料和顏色添加劑或其他成分。包含這些載體的組合物由熟知的常規(guī)方法配制。

本文使用的“施用”是指口服、作為栓劑施用、局部接觸、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、病灶內(nèi)、鼻內(nèi)或皮下施用，或向受試者植入緩釋裝置例如微型滲透泵。施用通過任何途徑進行，包括腸胃外和透粘膜(例如口腔的、鼻的、陰道的、直腸的或經(jīng)皮膚的)。腸胃外給藥包括例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、小動脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下的、腹膜內(nèi)的、心室內(nèi)和顱內(nèi)的。此外，當注射用于治療腫瘤例如誘導細胞調(diào)亡時，可以直接施用至腫瘤和/或腫瘤周圍組織。其他模式的遞送包括但不限于使用脂質(zhì)體制劑、靜脈內(nèi)輸注、透皮貼劑等。

術(shù)語“改善”是指在治療病理狀況或病癥(condition)中任何成功的征候，包括任何客觀的或主觀的參數(shù)例如癥狀的減輕、緩和或消除或患者身體或精神狀態(tài)的改善。癥狀的改善可以基于客觀的或主觀的參數(shù)，包括身體檢查和/或精神評估的結(jié)果。

術(shù)語“治療”是指對疾病或病癥的“治療”或“處理”，其包括預防疾病或病癥在傾向于患該疾病但是仍未經(jīng)歷或顯示該疾病癥狀的動物上發(fā)生(預防性治療)、抑制疾病(減緩或阻止其發(fā)展)、提供疾病癥狀或副作用的減輕(包括姑息療法)和解除疾病(使疾病消退)。

術(shù)語“有效量”或“對......有效的量”或“治療有效量”或任何語法上等價的術(shù)語是指當施用于動物以治療疾病時足夠?qū)崿F(xiàn)對該疾病的治療的量。

術(shù)語“分離的”是指材料實質(zhì)上或基本上不含用于制備該材料的成分。對于本發(fā)明的肽綴合物，術(shù)語“分離的”是指材料實質(zhì)上或基本上不含在用于制備肽綴合物的混合物中通常伴隨該材料的成分?！胺蛛x的”和“純的”可互換使用。通常，本發(fā)明的分離的肽綴合物具有的純度水平優(yōu)選以范圍表達。所述肽綴合物純度范圍的下限為約60％、約70％或約80％，而純度范圍的上限為約70％、約80％、約90％或大于約90％。

當肽綴合物純度大于約90％時，其純度也優(yōu)選以范圍表示。純度范圍的下限為約90％、約92％、約94％、約96％或約98％。純度范圍的上限為約92％、約94％、約96％、約98％或約100％純度。

純度由任何本領(lǐng)域公認的分析方法來測定(例如銀染凝膠、聚丙烯酰胺凝膠電泳上的譜帶強度、HPLC或相似方法)。

本文使用的“群體的基本上每個成員”描述本發(fā)明肽綴合物群體的特征，其中與肽加成的選定百分比的修飾的糖加成至該肽上多個同等的接納體位點。“群體的基本上每個成員”是說與修飾的糖綴合的肽上位點的“同質(zhì)性”以及是指至少約80％、優(yōu)選至少約90％和更優(yōu)選至少約95％同質(zhì)的本發(fā)明綴合物。

“同質(zhì)性”是指與修飾的糖綴合的接納體部分群體中的結(jié)構(gòu)一致性。因此，在本發(fā)明的肽綴合物中，其中每個修飾的糖部分與接納體位點綴合，該接納體位點與每個其他修飾的糖綴合的接納體位點具有相同結(jié)構(gòu)，該肽綴合物被稱為約100％同質(zhì)的。同質(zhì)性通常以范圍表達。所述肽綴合物同質(zhì)性范圍的下限為約60％、約70％或約80％，以及純度范圍上限為約70％、約80％、約90％或大于約90％。

當肽綴合物大于或等于約90％同質(zhì)時，其同質(zhì)性也優(yōu)選以范圍表達。該同質(zhì)性范圍的下限為約90％、約92％、約94％、約96％或約98％。純度范圍的上限為約92％、約94％、約96％、約98％或約100％同質(zhì)性。肽綴合物的純度通常由一種或多種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來測定，例如液相色譜法-質(zhì)譜法(LC-MS)、基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜法(MALDITOF)、毛細管電泳等。

當涉及糖肽物種時，“基本均一的糖形”或“基本均一的糖基化模式”是指由目標糖基轉(zhuǎn)移酶(例如巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)糖基化的接納體部分的百分比。例如，在α1，2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的情況下，如果在本發(fā)明的肽綴合物中基本上所有的(如下定義)Galβ1，4-GlcNAc-R及其唾液酸化的類似物均被巖藻糖基化，則存在基本均一的巖藻糖基化模式。在本文所述的巖藻糖基化結(jié)構(gòu)中，F(xiàn)uc-GlcNAc鍵通常是α1，6或α1，3，一般優(yōu)選α1，6。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解原料可以含有糖基化的接納體部分(例如巖藻糖基化的Galβ1，4-GlcNAc-R部分)。因此，計算出的糖基化百分比將會包括通過本發(fā)明方法糖基化的接納體部分以及在原料中已經(jīng)糖基化的那些接納體部分。

上述“基本均一的”定義中的術(shù)語“基本上”通常是指至少約40％、至少約70％、至少約80％、或更優(yōu)選至少約90％以及再更優(yōu)選至少約95％的特定糖基轉(zhuǎn)移酶的接納體部分得到糖基化。

當取代基由其從左至右書寫的常規(guī)化學式定義時，它們同等地包含由從右至左書寫結(jié)構(gòu)所得的在化學上等同的取代基，例如-CH2O-意味著同樣描述-OCH2-。

除非另有說明，術(shù)語“烴基”自身或作為另一取代基的一部分是指具有指定碳原子數(shù)(即C1-C10是指1-10個碳)的直鏈或支鏈的或環(huán)狀的烴基、或它們的組合，其可以是完全飽和的、單-或多不飽和的而且可以包括二價和多價基團。飽和烴基的實例包括但不限于諸如以下的基團甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、仲丁基、環(huán)己基、(環(huán)己基)甲基、環(huán)丙基甲基，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和異構(gòu)體。不飽和烴基為具有一個或多個雙鍵或三鍵的基團。不飽和烴基的實例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、2-丁烯基、2-異戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基和高級同系物及異構(gòu)體。除非另有說明，術(shù)語“烴基”還意味著包括下面更詳細定義的那些烴基衍生物，例如“雜烴基”。限于碳氫化合物基團的烴基稱為“高烴基(homoalkyl)”。

術(shù)語“亞烷基”自身或作為另一取代基的一部分是指衍生自烷烴的二價基團，例如但不限于-CH2CH2CH2CH2-，以及進一步包括下面描述成“雜亞烷基”的那些基團。通常，烴基(或亞烷基)會具有1-24個碳原子，在本發(fā)明中優(yōu)選具有10個或更少碳原子的那些基團?！暗图墴N基”或“低級亞烷基”是較短鏈的烴基或亞烷基，其通常具有8個或更少碳原子。

術(shù)語“烴氧基”、“烴基氨基”和“烴基硫基”(或硫代烴氧基)以其常規(guī)意義使用，而且是指各自通過氧原子、氨基或硫原子與分子的其余部分結(jié)合的那些烴基。

除非另有說明，術(shù)語“雜烴基”自身或與另一術(shù)語組合是指穩(wěn)定的直鏈或支鏈的或環(huán)狀的烴基或其組合，它由規(guī)定數(shù)量的碳原子和選自O(shè)、N、Si和S的至少一個雜原子組成，而且其中氮和硫原子可以任選地被氧化以及氮雜原子可以任選地被季銨化?？梢詫㈦s原子O、N和S及Si置于所述雜烴基的任何內(nèi)部位置上或者該烴基與分子其余部分結(jié)合的位置上。實例包括但不限于-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多可以有兩個連續(xù)雜原子，例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。類似地，術(shù)語“亞雜烷基”自身或作為另一取代基的一部分是指衍生自雜烴基的二價基團，例如但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。對于亞雜烷基，雜原子也可以占據(jù)鏈末端之一或兩端(例如亞烷氧基、亞烷基二氧基、亞烷基氨基、亞烷基二氨基等)。另外，對于亞烷基和亞雜烷基連接基團，連接基團式的書寫方向并不意味著連接基團的取向。例如，式-C(O)2R′-表示-C(O)2R′-和-R′C(O)2-兩者。

除非另有說明，術(shù)語“環(huán)烴基”和“雜環(huán)烴基”自身或與其他術(shù)語組合分別表示“烴基”和“雜烴基”的環(huán)狀形式。另外，對于雜環(huán)烴基，雜原子可以占據(jù)該雜環(huán)與分子其余部分結(jié)合的位置。環(huán)烴基的實例包括但不限于環(huán)戊基、環(huán)己基、1-環(huán)己烯基、3-環(huán)己烯基、環(huán)庚基等。雜環(huán)烴基的實例包括但不限于1-(1，2，5，6-四氫吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-嗎啉基、3-嗎啉基、四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。

除非另有說明，術(shù)語“鹵代”或“鹵素”自身或作為另一取代基的一部分是指氟、氯、溴或碘原子。另外，術(shù)語如“鹵代烴基”意味著包括單鹵代烴基和多鹵代烴基。例如，術(shù)語“鹵代(C1-C4)烴基”意味著包括但不限于三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。

除非另有說明，術(shù)語“芳基”是指多不飽和的、芳香族取代基，其可以是單環(huán)或者稠合在一起或共價連接的多環(huán)(優(yōu)選1-3個環(huán))。術(shù)語“雜芳基”是指包含選自N、O和S的1-4個雜原子的芳基(或環(huán))，其中氮和硫原子可以任選地被氧化以及氮原子可以任選地被季銨化。雜芳基可以通過雜原子與分子其余部分結(jié)合。芳基和雜芳基的非限制性實例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-聯(lián)苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-異噁唑基、4-異噁唑基、5-異噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基、四唑基、苯并[b]呋喃基、苯并[b]噻吩基、2，3-二氫苯并[1，4]二噁英-6基、苯并[1，3]間二氧雜環(huán)戊烯-5-基和6-喹啉基。上述各芳基和雜芳基環(huán)體系的取代基選自下述可接受的取代基。

簡言之，術(shù)語“芳基”在與其他術(shù)語組合使用時(例如芳氧基、芳基硫氧基(arylthioxy)、芳基烴基)包括如上定義的芳基和雜芳基環(huán)兩者。因此，術(shù)語“芳基烴基”意味著包括其中芳基與烴基結(jié)合的那些基團(例如芐基、苯乙基、吡啶基甲基等)，包括其中碳原子(如亞甲基)被例如氧原子代替的那些烴基(例如苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)。

上述術(shù)語(例如“烴基”、“雜烴基”、“芳基”和“雜芳基”)各自意味著包括所述基團的取代的和未取代的形式兩者。下面提供每種基團的優(yōu)選取代基。

烴基和雜烴基(包括通常被稱為亞烷基、鏈烯基、亞雜烷基、雜鏈烯基、炔基、環(huán)烴基、雜環(huán)烷烴、環(huán)烯基和雜環(huán)烯基)的取代基通稱為“烴基取代基”，而且它們可以是選自但不限于以下的多種基團中的一個或多個-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-鹵素、-SiR’R”R″′、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R″′、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R″′)＝NR″′、-NR-C(NR’R”)＝NR″′、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2，數(shù)量從0到(2m’+1)，其中m’為所述基團中碳原子的總數(shù)。R’、R”、R″′和R″′各自優(yōu)選獨立地表示氫、取代的或未取代的雜烴基、取代的或未取代的芳基例如1-3個鹵素取代的芳基、取代的或未取代的烴基、烴氧基或硫代烴氧基或芳基烴基。例如當本發(fā)明的化合物包含多于一個R基團時，獨立地選擇各個R基團，當存在多于一個R’、R”、R″′和R″″基團時，這些基團也一樣選擇。當R’和R”與同一個氮原子結(jié)合時，它們可以與該氮原子組合以形成5-、6-或7-元環(huán)。例如，-NR’R”意味著包括但不限于1-吡咯烷基和4-嗎啉基。從取代基的上述論述中，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解術(shù)語“烴基”意味著包括含有與除氫基團以外的基團例如鹵代烴基(例如-CF3和-CH2CF3)及?；?例如-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)結(jié)合的碳原子的基團。

類似于對烴基描述的取代基，將芳基和雜芳基的取代基通稱為“芳基取代基”。該取代基選自例如鹵素、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-鹵素、-SiR’R”R″′、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R″′、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R″′)＝NR″″、-NR-C(NR’R”)＝NR″′、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2、-R′、-N3、-CH(Ph)2、氟代(C1-C4)烴氧基和氟代(C1-C4)烴基，其數(shù)量從0到該芳環(huán)體系上開放價的總數(shù)；以及其中R’、R”、R″′和R″″優(yōu)選獨立地選自氫、取代的或未取代的烴基、取代的或未取代的雜烴基、取代的或未取代的芳基和取代的或未取代的雜芳基。例如當本發(fā)明的化合物包含多于一個R基團時，獨立地選擇各個R基團，當存在多于一個R’、R”、R″′和R″″基團時，這些基團也一樣選擇。在下面的方案中，符號X代表上述的“R”。

芳基或雜芳基環(huán)的相鄰原子上的兩個取代基可以任選地被式-T-C(O)-(CRR’)u-U-的取代基代替，其中T和U獨立地是-NR-、-O-、-CRR’-或單鍵，以及u是0-3的整數(shù)。作為選擇，芳基或雜芳基環(huán)的相鄰原子上的兩個取代基可以任選地被式-A-(CH2)r-B-的取代基代替，其中A和B獨立地是-CRR’、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR’-或單鍵，以及r是1-4的整數(shù)。如此形成的新環(huán)的單鍵之一可以任選地被雙鍵代替。作為選擇，芳基或雜芳基環(huán)的相鄰原子上的兩個取代基可以任選地被式-(CRR’)z-X-(CR”R″′)d-的取代基代替，其中z和d獨立地是0-3的整數(shù)，以及X是-O-、-NR’-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-S(O)2NR’-。取代基R、R’、R”和R″′優(yōu)選獨立地選自氫或取代的或未取代的(C1-C6)烴基。

本文使用的術(shù)語“雜原子”意味著包括氧(O)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)。

本文使用的因子VII肽是指因子VII和因子VIIa肽兩者。該術(shù)語通常涉及這些肽的變體和突變體，包括加成、缺失、取代和融合蛋白突變體。當使用因子VII和因子VIIa兩者時，該使用意圖說明類別“因子VII肽”的兩種物種。

本發(fā)明意欲包括本發(fā)明化合物的鹽，其根據(jù)本文所述化合物上存在的特定取代基用相對無毒的酸或堿制成。當本發(fā)明的化合物含有相對酸性的官能度時，可以通過使所述化合物的中性形式與充足量的純凈的或在合適惰性溶劑中的所需堿接觸來獲得堿加成鹽。堿加成鹽的實例包括鈉、鉀、鋰、鈣、銨、有機氨基或鎂鹽或者類似的鹽。當本發(fā)明的化合物含有相對堿性的官能度時，可以通過使所述化合物的中性形式與充足量的純凈的或在合適惰性溶劑中的所需酸接觸來獲得酸加成鹽。酸加成鹽的實例包括衍生自無機酸如鹽酸、氫溴酸、硝酸、碳酸、碳酸氫根、磷酸、磷酸一氫根、磷酸二氫根、硫酸、硫酸氫根、氫碘酸或亞磷酸等的那些鹽，以及衍生自相對無毒的有機酸如乙酸、丙酸、異丁酸、馬來酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富馬酸、乳酸、扁桃酸、鄰苯二甲酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸、酒石酸、甲烷磺酸等的鹽。另外包括氨基酸鹽如精氨酸等的鹽，以及有機酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等的鹽(參見例如Berge等，“Pharmaceutical Salts”，Journal of Pharmaceutical Science 661-19(1977))。本發(fā)明的某些特定化合物同時含有使得該化合物轉(zhuǎn)化成堿或酸加成鹽的堿性和酸性官能度。

所述化合物的中性形式優(yōu)選通過使該鹽與堿或酸接觸并且用常規(guī)方法分離母體化合物來再生?；衔锏哪阁w形式在某些物理性質(zhì)，例如在極性溶劑中的溶解度上與各種鹽形式不同。

本文使用的“鹽反荷離子”是指當本發(fā)明化合物的部分之一帶負電荷(例如COO-)時與該化合物結(jié)合的帶正電荷的離子。鹽反荷離子的實例包括H+、H3O+、銨、鉀、鈣、鋰、鎂和鈉。

本文使用的術(shù)語“CMP-SA-PEG”是與含有聚乙二醇部分的唾液酸綴合的胞苷單磷酸分子。如果沒有指定聚乙二醇鏈的長度，則任意PEG鏈長都是可以的(例如1KDa、2KDa、5KDa、10KDa、20KDa、30KDa、40KDa)。示例性的CMP-SA-PEG是方案1中的化合物5。
I.引言
本發(fā)明包含重建和修飾因子VII的方法。血液凝結(jié)途徑是包含許多事件的復雜反應。該途徑中的一個中間事件是凝血因子VII，通過在組織因子和鈣離子存在下(活化為因子VIIa后)將因子X轉(zhuǎn)變?yōu)閄a而參與血液凝結(jié)的外在途徑的酶原。因子Xa然后依次在因子Va、鈣離子和磷脂的存在下又將凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟?。因子X向因子Xa的活化是內(nèi)在和外在血液凝結(jié)途徑所共有的事件，因此，因子VIIa可以用于治療具有因子VIII缺陷或抑制物的患者。也有證據(jù)表明因子VIIa也可以參與內(nèi)在途徑，因此增加了因子VII/因子VIIa在血液凝結(jié)中作用的突出性和重要性。

因子VII是作為無活性酶原在血液中循環(huán)的單鏈糖蛋白。因子VIIa的示例性核苷酸和氨基酸序列在圖5中提供。因子VII向VIIa的活化可以由幾種不同的血漿蛋白酶催化，例如因子XIIa。當因子VII肽主鏈在天冬酰胺152切割時，發(fā)生因子VII的活化。該活化產(chǎn)物因子VIIa是包含由至少一個二硫鍵結(jié)合在一起的重鏈和輕鏈的糖蛋白。此外，不能轉(zhuǎn)變?yōu)橐蜃覸IIa的修飾的因子VII分子已有描述，其可用作例如在血凝塊、血栓等情況下的抗凝結(jié)藥物。鑒于因子VII在血液凝結(jié)途徑中的重要性及其作為對增加和降低的凝結(jié)水平的治療的用途，由此得出具有較長的生物學半衰期、提高的效價以及通常與在健康人體中合成和分泌出的野生型因子VII更相似的治療特性的分子會是有利的以及可用作對凝血障礙的治療。

雖然因子VII是治療應用的重要和有用的化合物，但是當前由重組細胞制備因子VII的方法產(chǎn)生具有相當短的生物學半衰期和非最佳糖基化模式的產(chǎn)物，其可能會導致免疫原性、功能缺失、為達到相同效應而增加需要更大和更頻繁劑量等。

為了提高用于治療目的的重組因子VII/因子VIIa的有效性，本發(fā)明提供糖基化的和未糖基化的因子VII/因子VIIa肽與修飾基團的綴合物。該修飾基團可以選自聚合物修飾基團例如PEG(m-PEG)、PPG(m-PPG)等、治療部分、診斷部分、靶向部分等等。例如用水溶性聚合物修飾基團修飾因子VII/因子VIIa肽可以提高重組因子VII/因子VIIa在患者循環(huán)中的穩(wěn)定性和保留時間，和/或減少重組因子VII/因子VIIa的抗原性。

本發(fā)明的肽綴合物可以通過修飾糖與糖基化的或未糖基化的肽的酶促結(jié)合來形成。糖基化位點和/或修飾的糖基提供用于例如通過糖綴合使帶有修飾基團的修飾的糖與肽綴合的位置。

本發(fā)明的方法還使得裝配具有基本上同質(zhì)衍生模式的肽綴合物和糖肽綴合物成為可能。本發(fā)明中使用的酶通常對肽的特定的氨基酸殘基、氨基酸殘基組合、特定的糖基殘基或糖基殘基組合具有選擇性。該方法對于大規(guī)模制備肽綴合物也是實用的。因此，本發(fā)明的方法提供用于大規(guī)模制備具有預選的均一衍生模式的肽綴合物的實用方法。該方法特別適合于修飾治療肽，其包括但不限于在細胞培養(yǎng)細胞(例如哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞或原核細胞)或轉(zhuǎn)基因植物或動物中制備期間不完全糖基化的糖肽。

所述因子VII/因子VIIa肽綴合物可以作為包含肽綴合物以及可藥用載體的藥物制劑來制備?？梢韵蜻x自以下的患者施用因子VII/因子VIIa肽綴合物具有出血情況的血友病患者、患有A型血友病的患者、患有B型血友病的患者、患有A型血友病同時具有因子VIII抗體的患者、患有B型血友病同時具有因子IX抗體的患者、患有肝硬化的患者、原位肝移植的肝硬化患者、具有上胃腸道出血的肝硬化患者、骨髓移植患者、肝臟切除患者、肝臟部分切除患者、經(jīng)歷骨盆-髖臼骨折重建的患者、急性腦間出血患者、經(jīng)歷異基因干細胞移植的患者、由于創(chuàng)傷性腦損傷而出血的患者、緊急事故中出血的患者、具有外傷出血的患者、經(jīng)歷靜脈曲張出血的患者、由于選擇性外科手術(shù)而出血的患者、由于心臟外科手術(shù)而出血的患者、由于脊柱外科手而出血的患者、由于肝切除術(shù)而出血的患者。在一種示例性的實施方案中，所述患者是人患者。

本發(fā)明還提供糖基化的和未糖基化肽的綴合物，其由于例如降低的清除率或者降低的免疫系統(tǒng)或網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)吸收的速率而具有提高的治療半衰期。此外，本發(fā)明的方法提供掩蔽肽上的抗原決定簇，從而降低或消除對該肽的宿主免疫應答的方法。也可以將靶向劑的選擇性附著用于將肽靶向至對特定靶向劑特異的特定組織或細胞表面受體。

確定制備具有水溶性聚合物的因子VII/因子VIIa綴合物的最佳條件例如包括取決于肽和水溶性聚合物同一性的眾多參數(shù)的優(yōu)化。例如，當聚合物是聚(乙二醇)、如支化聚(乙二醇)時，優(yōu)選在反應中利用的聚合物的量與可歸因于該聚合物存在的反應混合物粘度之間確立平衡如果聚合物高度濃縮，則反應混合物變粘，使傳質(zhì)和反應的速率放慢。

此外，雖然添加過量的酶在直覺上是明顯的，但是本發(fā)明人認識到當酶過高地過量存在時，過量的酶變成污染物，其除去需要額外的純化步驟和材料并且不必要地提高最終產(chǎn)物的成本。

此外，通常期望制備具有受控的修飾水平的肽。在一些情形下，理想的是優(yōu)先加成一種修飾的糖。在另外的情形下，理想的是優(yōu)先加成兩種修飾的糖。因此，優(yōu)選控制反應條件以影響修飾基團與肽綴合的程度。

本發(fā)明提供使得具有期望綴合水平的因子VII/因子VIIa肽的收率最大化的反應條件。本發(fā)明示例性實施方案中的條件也考慮各種試劑的花費以及純化產(chǎn)物所必需的材料和時間使本文所述的反應條件最優(yōu)化以提供期望產(chǎn)物的優(yōu)異收率同時使昂貴試劑的浪費減到最少。
II.物質(zhì)/肽綴合物的組成
在第一方面中，本發(fā)明提供修飾的糖與因子VII/因子VIIa肽之間的綴合物。本發(fā)明也提供修飾基團與因子VII/因子VIIa肽之間的綴合物。肽綴合物可以具有幾種形式中的一種。在一種示例性的實施方案中，肽綴合物可以包含因子VII/因子VIIa肽和通過糖基連接基團與肽的氨基酸相連的修飾基團。在另一示例性的實施方案中，肽綴合物可以包含因子VII/因子VIIa肽和通過糖基連接基團與肽的糖基殘基相連的修飾基團。在另一示例性的實施方案中，肽綴合物可以包含因子VII/因子VIIa肽和既與糖肽碳水化合物結(jié)合又與肽主鏈的氨基酸殘基直接結(jié)合的糖基連接基團。在又一示例性的實施方案中，肽綴合物可以包含因子VII/因子VIIa肽和直接與肽的氨基酸殘基相連的修飾基團。在該實施方案中，肽綴合物可以不含糖基。在這些實施方案的任一種中，因子VII/因子VIIa肽可以經(jīng)過或未經(jīng)糖基化。

本發(fā)明的綴合物通常會符合以下通式結(jié)構(gòu)
其中符號a、b、c、d和s表示非零正整數(shù)；以及t是0或正整數(shù)?！霸噭被蛐揎椈鶊F可以是治療劑、生物活性劑、可檢測標記、聚合物修飾基團例如水溶性聚合物(如PEG、m-PEG、PPG和m-PPG)等?！霸噭被蛐揎椈鶊F可以是肽例如酶、抗體、抗原等。接頭可以是以下寬范圍的連接基團中的任一種。作為選擇，接頭可以是單鍵或“零級接頭“。
II.A.肽
因子VII是長度約406個氨基酸以及分子量約50kDa的單鏈多肽。當因子VII肽主鏈在天冬酰胺152切割時，發(fā)生因子VII向因子VIIa的轉(zhuǎn)變。因子VII和/或因子VIIa肽含有兩個N-聚糖位點一個位于天冬酰胺145而另一個位于天冬酰胺322。天冬酰胺145的N-聚糖位點處于FVIIa的輕鏈上，而天冬酰胺322的N-聚糖位點處于FVIIa的重鏈上。因子VII和/或因子VIIa肽含有兩個O-聚糖位點。

因子VII或因子VIIa已經(jīng)進行克隆和測序。在一種示例性的實施方案中，因子VIIa肽具有以SEQ ID NO1提供的序列。

決不應當將本發(fā)明解釋成限于本文所述的因子VII核酸和氨基酸序列。使用經(jīng)過突變以提高或降低肽的性質(zhì)或修飾肽的結(jié)構(gòu)特征的其他序列的因子VII/因子VIIa肽處于本發(fā)明范圍內(nèi)。例如，用于本發(fā)明的突變型因子VII/因子VIIa肽包括具有附加的O-糖基化位點或在其他位置上具有所述位點的那些肽。此外，包含一個或多個N-糖基化位點的突變型肽可用于本發(fā)明中。因子VII的變體例如在美國專利Nos.4,784,950和5,580,560中得到描述，其中賴氨酸-38、賴氨酸-32、精氨酸-290、精氨酸-341、異亮氨酸-42、酪氨酸-278和酪氨酸-332被多種多樣的氨基酸替代。此外，美國專利Nos.5,861,374、6,039,944、5,833,982、5,788,965、6,183,743、5,997,864和5,817,788描述了不被切割以形成因子VIIa的因子VII變體。技術(shù)人員會認識到血液凝結(jié)途徑及其中因子VII的作用是眾所周知的，因此在本發(fā)明中包括許多如上所述的天然存在的和設(shè)計出的變體。在一種示例性的實施方案中，具有因子VII/因子VIIa活性的肽具有與本文所述的氨基酸序列至少約95％同源的氨基酸序列。優(yōu)選地，該氨基酸序列與本文所述的氨基酸序列至少約96％、97％、98％或99％同源。

在一種示例性的實施方案中，所述糖基連接基團所結(jié)合的氨基酸殘基選自絲氨酸、蘇氨酸和天冬酰胺。在另一示例性的實施方案中，所述肽具有SEQ.ID.NO 1的序列。在另一示例性的實施方案中，所述氨基酸殘基選自Asn 145、Asn 322及其組合。在另一示例性的實施方案中，所述肽是生物活性因子VII/因子VIIa肽。

在又一示例性的實施方案中，所述因子VIIa肽綴合物上的修飾的糖和/或PEG部分位于輕鏈上。在又一示例性的實施方案中，因子VIIa肽綴合物上的修飾的糖和/或PEG部分主要在重鏈上。在又一示例性的實施方案中，在因子VIIa肽綴合物的群體中，輕鏈主要含有修飾的糖和/或PEG部分。在又一示例性的實施方案中，在因子VIIa肽綴合物的群體中，重鏈主要含有修飾的糖和/或PEG部分。

在另一示例性的實施方案中，群體中輕鏈重鏈官能化的比率為約33:66。在另一示例性的實施方案中，群體中輕鏈重鏈官能化的比率為約35:65。在另一示例性的實施方案中，群體中輕鏈重鏈官能化的比率為約40:60。在另一示例性的實施方案中，群體中輕鏈重鏈官能化的比率為約45:55。在另一示例性的實施方案中，該比率為約50:50。在另一示例性的實施方案中，該比率為約55:45。在另一示例性的實施方案中，該比率為約60:40。在另一示例性的實施方案中，該比率為約65:35。在另一示例性的實施方案中，該比率為約66:33。在另一示例性的實施方案中，該比率為約70:30。在另一示例性的實施方案中，該比率為約75:25。在另一示例性的實施方案中，該比率為約80:20。在另一示例性的實施方案中，該比率為約85:15。在另一示例性的實施方案中，該比率為約90:10。在另一示例性的實施方案中，群體中輕鏈重鏈官能化的比率大于約90:10。

用于表達因子VII/因子VIIa和確定其活性的方法是本領(lǐng)域熟知的，以及例如在美國專利No.4,784,950中得到描述。簡言之，因子VII或其變體的表達可以在包括用桿狀病毒表達體系的昆蟲細胞、大腸桿菌(E.coli，)、CHO細胞、BHK細胞的多種原核及真核體系中完成，這全都是本領(lǐng)域熟知的。

根據(jù)本發(fā)明方法制成的因子VII/因子VIIa肽綴合物活性的測定可以用本領(lǐng)域熟知的方法來完成。作為非限制性的實例，Quick等(Hemorragic Disease and Thrombosis，第2版，Leat Febiger，Philadelphia，1966)描述了可用于測定根據(jù)本發(fā)明方法制成的因子VII分子的生物活性的一步凝固測定法。

當所述修飾基團是如下結(jié)構(gòu)時，本發(fā)明中使用的肽不限于因子VII/因子VIIa
在這些情況下，所述肽綴合物中的肽選自圖13中的肽。在這些情況下，肽綴合物中的肽選自因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、選自以下的肽促紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ、α1-抗胰蛋白酶(ATT、或α-1蛋白酶抑制劑、葡糖腦苷脂酶、組織型纖維蛋白溶酶原活化劑(TPA)、白細胞介素-2(IL-2)、尿激酶、人脫氧核糖核酸酶、胰島素、乙型肝炎表面蛋白(HbsAg)、人生長激素、TNF受體-IgG Fc區(qū)域融合蛋白(EnbrelTM)、抗-HER2單克隆抗體(HerceptinTM)、呼吸道合胞病毒F蛋白質(zhì)的單克隆抗體(SynagisTM)、TNF-α的單克隆抗體(RemicadeTM)、糖蛋白IIb/IIIa的單克隆抗體(ReoproTM)、CD20的單克隆抗體(RituxanTM)、抗凝血酶III(ATIII)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、α-半乳糖苷酶(FabrazymeTM)、α-艾杜糖苷酶(alpha-iduronidase)(AldurazymeTM)、促卵泡激素、β-葡糖苷酶、抗-TNF-α單克隆抗體(MLB 5075)、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、β-葡糖苷酶(MLB 5064)、α-半乳糖苷酶A(MLB 5082)和成纖維細胞生長因子。

在一種示例性的實施方案中，所述聚合物修飾基團具有下式的結(jié)構(gòu)

和

當所述修飾基團是如下結(jié)構(gòu)時，本發(fā)明中使用的肽也不限于因子VII或因子VIIa
在一種示例性的實施方案中，A1和A2各自選自-OH和-OCH3。

根據(jù)該實施方案的示例性聚合物修飾基團包括

和

在一種示例性的實施方案中，其中修飾基團為支化的水溶性聚合物，例如上面顯示的那些，通常優(yōu)選唾液酸酶的濃度為反應混合物的約1.5-約2.5U/L。更優(yōu)選唾液酸酶的量為約2U/L。

在另一示例性的實施方案中，使約5-約9g的肽底物與上述量的唾液酸酶接觸。

所述修飾的糖在反應混合物中的存在量為約1g-約6g，優(yōu)選約3g-約4g。通常優(yōu)選將具有支化水溶性聚合物修飾部分例如上面所示部分的修飾的糖的濃度保持少于約0.5mM。在優(yōu)選的實施方案中，修飾基團是分子量為約20KDa-約60KDa的支化聚(乙二醇)，更優(yōu)選約30KDa-約50KDa，以及甚至更優(yōu)選約40KDa。分子量約40KDa的示例性的修飾基團是約35KDa-約45KDa的基團。

關(guān)于糖基轉(zhuǎn)移酶濃度，在使用上述修飾基團的當前優(yōu)選的實施方案中，糖基轉(zhuǎn)移酶與肽的比率是約40μg/mL轉(zhuǎn)移酶比約200μM肽。
II.B.修飾的糖
在一種示例性的實施方案中，本發(fā)明的肽與修飾的糖反應，從而形成肽綴合物。修飾的糖包含“糖供體部分”以及“糖轉(zhuǎn)移部分”。糖供體部分是將會通過糖基部分或氨基酸部分與肽結(jié)合作為本發(fā)明綴合物的修飾的糖的任意部分。糖供體部分包括在其從修飾的糖轉(zhuǎn)變成肽綴合物糖基連接基團的過程中在化學上發(fā)生改變的那些原子。糖轉(zhuǎn)移部分是不會與肽結(jié)合作為本發(fā)明綴合物的修飾的糖的任意部分。例如，本發(fā)明的修飾的糖是PEG化的糖核苷酸，PEG-唾液酸CMP。對于PEG-唾液酸CMP，糖供體部分或者PEG-唾液?；w部分包含PEG-唾液酸而糖轉(zhuǎn)移部分或者唾液?；D(zhuǎn)移部分包含CMP。

在本發(fā)明中使用的修飾的糖中，糖部分優(yōu)選為糖、脫氧糖、氨基糖或N-?；恰Ｐg(shù)語“糖”及其等價物“糖基”是指單體、二聚物、寡聚物和聚合物。糖部分還用修飾基團官能化。修飾基團通常經(jīng)由與糖上的胺、巰基或羥基例如伯羥基部分綴合而與糖基部分綴合。在一種示例性的實施方案中，修飾基團通過糖上的胺部分結(jié)合，例如通過胺與修飾基團的活性衍生物反應所形成的酰胺、氨基甲酸酯或脲。

任何糖基部分可以用作所述修飾的糖的糖供體部分。該糖基部分可以是已知的糖例如甘露糖、半乳糖或葡萄糖，或者是具有已知糖的立體化學的物種。這些修飾的糖的通式為

和
可用于形成本發(fā)明組合物的其他糖基部分包括但不限于巖藻糖和唾液酸，以及氨基糖例如葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、唾液酸的5-胺類似物等。糖基部分可以是自然界中存在的結(jié)構(gòu)或者它可以進行修飾以提供綴合修飾基團的位點。例如，在一種實施方案中，修飾的糖提供其中9-羥基部分用胺代替的唾液酸衍生物。胺易于用選定修飾基團的活化類似物衍生化。

用于本發(fā)明的修飾的糖的實例在PCT專利申請No.PCT/US05/002522中得到描述，其通過引用并入本文。

在另一示例性的實施方案中，本發(fā)明采用其中6-羥基的位置轉(zhuǎn)化為相應胺部分的修飾的糖，該部分帶有例如上述那些的接頭-修飾基團盒?？梢杂米鬟@些修飾的糖的核心的示例性糖基基團包括Gal、GalNAc、Glc、GlcNAc、Fuc、Xyl、Man等。根據(jù)該實施方案的代表性的修飾的糖具有下式
其中R11-R14獨立地選自H、OH、C(O)CH3、NH和NH C(O)CH3。R10是與另一糖基殘基的連接(-O-糖基)或與因子VII/因子VIIa肽的氨基酸的連接(-NH-(因子VII/因子VIIa))。R14是OR1、NHR1或NH-L-R1。R1和NH-L-R1如上所述。
II.C.糖基連接基團
在一種示例性的實施方案中，本發(fā)明提供在本發(fā)明的修飾的糖與因子VII/因子VIIa肽之間形成的肽綴合物。在另一示例性的實施方案中，當所述修飾的糖上的修飾基團為以下結(jié)構(gòu)時
所述肽綴合物中的肽選自圖13中的肽。在又一示例性的實施方案中，肽綴合物中的肽選自因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、促紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ、α1-抗胰蛋白酶(ATT、或α-1蛋白酶抑制劑、葡糖腦苷脂酶、組織型纖維蛋白溶酶原活化劑(TPA)、白細胞介素-2(IL-2)、尿激酶、人脫氧核糖核酸酶、胰島素、乙型肝炎表面蛋白(HbsAg)、人生長激素、TNF受體-IgG Fc區(qū)域融合蛋白(EnbrelTM)、抗-HER2單克隆抗體(HerceptinTM)、呼吸道合胞病毒F蛋白質(zhì)單克隆抗體(SynagisTM)、TNF-α的單克隆抗體(RemicadeTM)、糖蛋白IIb/IIIa的單克隆抗體(ReoproTM)、CD20的單克隆抗體(RituxanTM)、抗凝血酶III(AT III)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、α-半乳糖苷酶(FabrazymeTM)、α-艾杜糖苷酶(AldurazymeTM)、促卵泡激素、β-葡糖苷酶、抗-TNF-α單克隆抗體(MLB5075)、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、β-葡糖苷酶(MLB 5064)、α-半乳糖苷酶A(MLB 5082)和成纖維細胞生長因子。在該實施方案中，修飾糖的糖供體部分(例如糖基部分和修飾基團)變成“糖基連接基團”。該“糖基連接基團”可替代地可以指位于肽和修飾基團之間的糖基部分。

在一種示例性的實施方案中，聚合物修飾基團具有下式的結(jié)構(gòu)

和

在一種示例性的實施方案中，所述修飾的糖上的修飾基團為
在一種示例性的實施方案中，A1和A2各自選自-OH和-OCH3。

根據(jù)該實施方案的示例性的聚合物修飾基團包括

和

由于可用于在肽上加成和/或修飾糖基殘基的方法的通用性，所述糖基連接基團可以具有基本上任何的結(jié)構(gòu)。在下面的論述中，參照使用選定的呋喃糖和吡喃糖衍生物來舉例說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到該論述集中在說明的清楚性而且所述的結(jié)構(gòu)和組成通?？蛇m用于各類糖基連接基團和修飾的糖。糖基連接基團可以包含實際上任何的單糖或寡糖。糖基連接基團可以通過側(cè)鏈或通過肽主鏈與氨基酸結(jié)合。作為選擇糖基連接基團可以通過糖基部分與肽結(jié)合。該糖基部分可以是肽上O-連接的或N-連接的聚糖結(jié)構(gòu)的一部分。

在一種示例性的實施方案中，本發(fā)明提供包含具有選自以下的式的完整糖基連接基團的肽綴合物

和
在式I中，R2是H、CH2OR7、COOR7或OR7，其中R7表示H、取代的或未取代的烴基或者取代的或未取代的雜烴基。當COOR7是羧酸或羧酸根時，兩種形式都由單一結(jié)構(gòu)的標記COO-或COOH表示。在式I和II中，符號R3、R4、R5、R6和R6’獨立地表示H、取代的或未取代的烴基、OR8、NHC(O)R9。下標d是0或1。R8和R9獨立地選自H、取代的或未取代的烴基、取代的或未取代的雜烴基、唾液酸或多聚唾液酸。R3、R4、R5、R6或R6’中的至少一個包括修飾基團。該修飾基團可以是通過鍵或連接基團相連的聚合物修飾基團例如PEG。在一種示例性的實施方案中，R6和R6’連同它們所結(jié)合的碳一起作為唾液酸的丙酮酰(pyruvyl)側(cè)鏈的組分。在另一示例性的實施方案中，該丙酮酰(pyruvyl)側(cè)鏈以聚合物修飾基團官能化。在另一示例性的實施方案中，R6和R6’連同它們所結(jié)合的碳一起作為唾液酸的側(cè)鏈的組分以及聚合物修飾基團是R5的組分。

在一種示例性的實施方案中，本發(fā)明采用具有下式的糖基連接基團
其中J為糖基部分，L為鍵或接頭以及R1為修飾基團，例如聚合物修飾基團。示例性的鍵為糖基部分上NH2部分與修飾基團上互補反應性的基團之間所形成的鍵。例如，當R1包含羧酸部分時，可以使該部分活化并與糖基殘基上的NH2部分偶合，提供結(jié)構(gòu)為NHC(O)R1的鍵。J優(yōu)選為“完整的”糖基部分，其暴露于切割吡喃糖或呋喃糖結(jié)構(gòu)的條件，例如氧化條件，例如高碘酸鈉下未經(jīng)降解。

示例性的接頭包括烴基和雜烴基部分。接頭包括連接基團，例如基于?；倪B接基團如-C(O)NH-、-OC(O)NH-等。連接基團為本發(fā)明物種組分之間形成的鍵，例如在糖基部分和接頭(L)之間，或者在接頭和修飾基團(R1)之間。其他示例性的連接基團為醚、硫醚和胺。例如，在一種實施方案中，接頭為氨基酸殘基，例如甘氨酸殘基。甘氨酸的羧酸部分通過與糖基殘基上的胺反應轉(zhuǎn)化為相應的酰胺，而甘氨酸的胺通過與修飾基團上活化的羧酸或碳酸根反應轉(zhuǎn)化為相應的酰胺或氨基甲酸酯。

示例性的NH-L-R1物種具有下式-NH{C(O)(CH2)aNH}s{C(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNH}tR1，其中下標s和t獨立地為0或1。下標a、b和d獨立地為0-20的整數(shù)，以及c為1-2500的整數(shù)。其他類似的接頭基于其中-NH部分由另一基團，例如-S、-O或-CH2代替的物種。如同技術(shù)人員會意識到的那樣，一個或多個對應于下標s和t的括號部分可以由取代的或未取代的烴基或雜烴基部分代替。

更具體地，本發(fā)明采用其中NH-L-R1為以下結(jié)構(gòu)的化合物NHC(O)(CH2)aNHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NHC(O)O(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NH(CH2)aNHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NHC(O)(CH2)aNHR1、NH(CH2)aNHR1和NHR1。在這些式中，下標a、b和d獨立地選自0-20的整數(shù)，優(yōu)選1-5。下標c為1-約2500的整數(shù)。

在一種示例性的實施方案中，選擇c以使得PEG部分為約1kD、5kD、10kD、15kD、20kD、25kD、30kD、35kD、40kD或45kD。

為了方便，本節(jié)其余部分中的糖基連接基團將基于唾液?；糠帧Ｈ欢?，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到其他糖基部分例如甘露糖基、半乳糖基、葡萄糖基或巖藻糖基可以代替唾液?；糠质褂谩?br>
在一種示例性的實施方案中，糖基連接基團為完整的糖基連接基團，其中形成該連接基團的糖基部分或多個部分不會由于化學(例如偏高碘酸鈉)或酶(例如氧化酶)過程而降解。本發(fā)明選定的綴合物包含與氨基糖例如甘露糖胺、葡糖胺、半乳糖胺、唾液酸等的胺部分結(jié)合的修飾基團。根據(jù)該模體的示例性的修飾基團-完整的糖基連接基團盒基于唾液酸結(jié)構(gòu)，例如具有下式的那些

和

在上式中，R1和L如上所述。關(guān)于示例性的R1基團結(jié)構(gòu)的更多細節(jié)在下面提供。

在又一示例性的實施方案中，在肽與其中修飾基團通過接頭在修飾的糖6-碳位上結(jié)合的修飾的糖之間形成綴合物。因此，根據(jù)該實施方案的說明性的糖基連接基團具有下式
其中各基團如上所述。糖基連接基團不限制地包括葡萄糖、葡糖胺、N-乙酰-葡糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-乙酰-半乳糖胺、甘露糖、甘露糖胺、N-乙酰-甘露糖胺等。

在一種實施方案中，本發(fā)明提供包含以下糖基連接基團的肽綴合物
其中D選自-OH和R1-L-HN-；G選自H和R1-L-和-C(O)(C1-C6)烴基；R1是包含直鏈或支化的聚(乙二醇)殘基的部分；以及L是接頭，例如鍵(“零級”)、取代的或未取代的烴基和取代的或未取代的雜烴基。在示例性的實施方案中，當D為OH時，G為R1-L-，以及當G為-C(O)(C1-C6)烴基時，D為R1-L-NH-。

在一種實施方案中，本發(fā)明提供包含以下糖基連接基團的肽綴合物
D選自-OH和R1-L-HN-；G選自R1-L-和-C(O)(C1-C6)烴基-R1；R1是包含選自直鏈聚(乙二醇)殘基和支化聚(乙二醇)殘基中的成員的部分；以及M選自H、鹽反荷離子和單個負電荷；L是選自鍵、取代的或未取代的烴基和取代的或未取代的雜烴基的接頭。在一種示例性的實施方案中，當D為OH時，G為R1-L-。在另一示例性的實施方案中，當G為-C(O)(C1-C6)烴基時，D為R1-L-NH-。

在任何本發(fā)明的化合物中，COOH基團也可以是COOM，其中M選自H、負電荷、及鹽反荷離子。

本發(fā)明提供包含具有下式的糖基連接基團的肽綴合物

在另外的實施方案中，糖基連接基團具有下式
其中下標t為0或1。

在又一示例性的實施方案中，糖基連接基團具有下式
其中下標t為0或1。

在另一實施方案中，糖基連接基團具有下式
其中下標p表示1-10的整數(shù)；以及a為0或1。

在另一示例性的實施方案中，所述肽綴合物包含選自下列式的糖基部分












其中下標a和接頭La如上所述。下標p為1-10的整數(shù)。下標t和a獨立地選自0或1。可以包含這些基團中的每一個作為上述單-、二-、三-和四天線(antennary)糖結(jié)構(gòu)的組分。AA是肽的氨基酸殘基。

在一種示例性的實施方案中，PEG部分具有約20KDa的分子量。在另一示例性的實施方案中，PEG部分具有約5KDa的分子量。在另一示例性的實施方案中，PEG部分具有約10KDa的分子量。在另一示例性的實施方案中，PEG部分具有約40KDa的分子量。

在一種示例性的實施方案中，糖基連接基團為基于半胱氨酸殘基的支化SA-PEG-10KDa部分，而且一個或兩個這些糖基連接基團與肽共價結(jié)合。在另一示例性的實施方案中，糖基連接基團為基于賴氨酸殘基的支化SA-PEG-10KDa部分，而且一個或兩個這些糖基連接基團與肽共價結(jié)合。在一種示例性的實施方案中，糖基連接基團為基于半胱氨酸殘基的支化SA-PEG-10KDa部分，而且一個或兩個這些糖基連接基團與肽共價結(jié)合。在一種示例性的實施方案中，糖基連接基團為基于賴氨酸殘基的支化SA-PEG-10KDa部分，而且一個或兩個這些糖基連接基團與肽共價結(jié)合。在一種示例性的實施方案中，糖基連接基團為基于半胱氨酸殘基的支化SA-PEG-5KDa部分，而且一個、兩個或三個這些糖基連接基團與肽共價結(jié)合。在一種示例性的實施方案中，糖基連接基團為基于賴氨酸殘基的支化SA-PEG-5KDa部分，而且一個、兩個或三個這些糖基連接基團與肽共價結(jié)合。在一種示例性的實施方案中，糖基連接基團為基于半胱氨酸殘基的支化SA-PEG-40KDa部分，而且一個或兩個這些糖基連接基團與肽共價結(jié)合。在一種示例性的實施方案中，糖基連接基團為基于賴氨酸殘基的支化SA-PEG-40KDa部分，而且一個或兩個這些糖基連接基團與肽共價結(jié)合。

在一種示例性的實施方案中，本發(fā)明的糖基聚乙二醇化的肽綴合物選自以下所述的式

和

在上式中，下標t為0-1的整數(shù)以及下標p為1-10的整數(shù)。符號R15’表示H、OH(例如Gal-OH)、唾液?；糠帧⑼僖乎；B接基團(例如唾液酰基連接基團-聚合物修飾基團(Sia-L-R1)，或者與聚合物修飾的唾液?；糠纸Y(jié)合的唾液酰基部分(例如Sia-Sia-L-R1)(“Sia-Siap”))。示例性的聚合物修飾的糖基部分具有式I和II的結(jié)構(gòu)。示例性的本發(fā)明肽綴合物將包含至少一個具有包含式I或II結(jié)構(gòu)的R15’的聚糖。式I和II的具有開放價的氧優(yōu)選通過糖苷鍵與Gal或GalNAc部分的碳結(jié)合。在另一示例性的實施方案中，氧與半乳糖殘基3位上的碳結(jié)合。在一種示例性的實施方案中，修飾的唾液酸α 2，3-連接至半乳糖殘基上。在另一示例性的實施方案中，唾液酸α 2，6-連接至半乳糖殘基上。

在一種示例性的實施方案中，唾液?；B接基團是與聚合物修飾的唾液酰基部分結(jié)合的唾液?；糠?例如Sia-Sia-L-R1)(“Sia-Siap”)。這里，糖基連接基團通過唾液?；糠峙c半乳糖基部分結(jié)合
根據(jù)該模體的示例性物種通過用形成Sia-Sia鍵的酶例如CST-II、ST8Sia-II、ST8Sia-III和ST8Sia-IV，使Sia-L-R1與聚糖的末端唾液酸綴合來制成。

在另一示例性的實施方案中，肽綴合物上的聚糖具有選自以下的式

和
及其組合。

在每一個上述式中，R15’如上所述。此外，示例性的本發(fā)明肽綴合物將包含至少一個帶有具備式I或II結(jié)構(gòu)的R15’部分的聚糖。

在另一示例性的實施方案中，糖基連接基團包含至少一種具有下式的糖基連接基團

和
其中R15是所述唾液?；B接基團；以及下標p是選自1-10的整數(shù)。

在一種示例性的實施方案中，糖基連接部分具有下式
其中b是0-1的整數(shù)。下標s表示1-10的整數(shù)；以及下標f表示1-2500的整數(shù)。

在一種示例性的實施方案中，聚合物修飾基團為PEG。在另一示例性的實施方案中，PEG部分具有約20KDa的分子量。在另一示例性的實施方案中，PEG部分具有約5KDa的分子量。在另一示例性的實施方案中，PEG部分具有約10KDa的分子量。在另一示例性的實施方案中，PEG部分具有約40KDa的分子量。在另一示例性的實施方案中，糖基連接基團與Asn145、Asn322、Ser52、Ser60或其組合結(jié)合。

在一種示例性的實施方案中，糖基連接基團為線性SA-PEG-10KDa部分，而且一個或兩個這些糖基連接基團與肽共價結(jié)合。在另一示例性的實施方案中，糖基連接基團為線性SA-PEG-20KDa部分，而且一個或兩個這些糖基連接基團與肽共價結(jié)合。在一種示例性的實施方案中，糖基連接基團為線性SA-PEG-5KDa部分，而且一個、兩個或三個這些糖基連接基團與肽共價結(jié)合。在一種示例性的實施方案中，糖基連接基團為線性SA-PEG-40KDa部分，而且一個或兩個這些糖基連接基團與肽共價結(jié)合。

在另一示例性的實施方案中，糖基連接基團為具有下式的唾液?；B接基團
在另一示例性的實施方案中，Q選自H和CH3。在另一示例性的實施方案中，其中所述糖基連接基團具有下式

和
其中R15是所述唾液?；B接基團；以及下標p為選自1-10的整數(shù)。在一種示例性的實施方案中，糖基連接基團包含下式
其中下標b為選自0和1的整數(shù)。在一種示例性的實施方案中，下標s為1；以及下標f為選自約200-約300的整數(shù)。在另一示例性的實施方案中，糖基連接基團選自SA-PEG-10KDa和SA-PEG-20KDa，以及其中與因子VII/因子VIIa肽共價結(jié)合的所述糖基連接基團的數(shù)目為選自1-2的整數(shù)。在另一示例性的實施方案中，糖基連接基團選自SA-PEG-5KDa和SA-PEG-40KDa，以及其中與因子VII/因子VIIa肽共價結(jié)合的所述糖基連接基團的數(shù)目為選自1-3的整數(shù)。
II.D.修飾基團
本發(fā)明的肽綴合物包含修飾基團。該基團可以通過氨基酸或糖基連接基團與因子VII/因子VIIa肽共價結(jié)合。在另一示例性的實施方案中，當修飾基團為以下結(jié)構(gòu)時，
所述肽綴合物中的肽選自圖13中的肽。在另一示例性的實施方案中，肽綴合物中的肽選自因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、促紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ、α1-抗胰蛋白酶(ATT、或α-1蛋白酶抑制劑、葡糖腦苷脂酶、組織型纖維蛋白溶酶原活化劑(TPA)、白細胞介素-2(IL-2)、尿激酶、人脫氧核糖核酸酶、胰島素、乙型肝炎表面蛋白(HbsAg)、人生長激素、TNF受體-IgG Fc區(qū)域融合蛋白(EnbrelTM)、抗-HER2單克隆抗體(HerceptinTM)、呼吸道合胞病毒F蛋白質(zhì)單克隆抗體(SynagisTM)、TNF-α的單克隆抗體(RemicadeTM)、糖蛋白IIb/IIIa的單克隆抗體(ReoproTM)、CD20的單克隆抗體(RituxanTM)、抗凝血酶III(AT III)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、α-半乳糖苷酶(FabrazymeTM)、α-艾杜糖苷酶(AldurazymeTM)、促卵泡激素、β-葡糖苷酶、抗-TNF-α單克隆抗體(MLB 5075)、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、β-葡糖苷酶(MLB 5064)、α-半乳糖苷酶A(MLB 5082)和成纖維細胞生長因子。“修飾基團”可以包含多種結(jié)構(gòu)，包括靶向部分、治療部分、生物分子。另外，“修飾基團”包括聚合物修飾基團，其為能夠改變肽的性質(zhì)例如其生物利用度或其在體內(nèi)的半衰期的聚合物。

在一種示例性的實施方案中，聚合物修飾基團具有下列式的結(jié)構(gòu)

和

在根據(jù)上式的另一示例性實施方案中，聚合物修飾基團具有根據(jù)以下式的結(jié)構(gòu)
在一種示例性的實施方案中，A1和A2各自選自-OH和-OCH3。

示例性的根據(jù)該實施方案的聚合物修飾基團包括

和

為了方便，本節(jié)其余部分中的修飾基團將主要基于聚合物修飾基團例如水溶性的和水不溶性聚合物。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到可以使用其他修飾基團例如靶向部分、治療部分和生物分子代替聚合物修飾基團。
II.D.i.修飾基團的接頭
修飾基團的接頭用于將修飾基團(即聚合物修飾基團、靶向部分、治療部分和生物分子)結(jié)合至肽上。在一種示例性的實施方案中，如下所示，聚合物修飾基團通過接頭L一般經(jīng)由核心上的雜原子例如氮結(jié)合至糖基連接基團上
R1是聚合物部分而L選自鍵和連接基團。下標w表示選自1-6，優(yōu)選1-3和更優(yōu)選1-2的整數(shù)。示例性的連接基團包括取代的或未取代的烴基、取代的或未取代的雜烴基部分和唾液酸。示例性的接頭組分是?；糠帧?br>
示例性的本發(fā)明化合物具有上述式I或II的結(jié)構(gòu)，其中R2、R3、R4、R5、R6或R6’中的至少一個具有下式

在根據(jù)本實施方案的另一實例中，R2、R3、R4、R5、R6或R6’中的至少一個具有下式
其中s為0-20的整數(shù)以及R1是線性聚合物修飾基團。

在一種示例性的實施方案中，聚合物修飾基團-接頭構(gòu)造物(construct)為支化結(jié)構(gòu)，其包含與中心部分結(jié)合的兩個或更多個聚合物鏈。在該實施方案中，構(gòu)造物具有下式
其中R1和L如上所述以及w’為2-6，優(yōu)選2-4以及更優(yōu)選2-3的整數(shù)。

當L為鍵時，它在R1的前體上的反應性官能團與糖基核心上具有互補反應性的反應性官能團之間形成。當L為非零級接頭時，在與R1前體反應之前L的前體可以處于糖基部分的適當位置上。作為選擇，可以使R1和L的前體結(jié)合入預先形成的盒中，其隨后連接到糖基部分上。如本文所述，具有合適反應性官能團的前體的選擇和制備在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。此外，前體的偶合通過本領(lǐng)域熟知的化學方式進行。

在一種示例性的實施方案中，L是由氨基酸或小肽所形成的連接基團(例如1-4個氨基酸殘基)，它提供其中聚合物修飾基團通過取代的烴基接頭結(jié)合的修飾的糖。示例性的接頭包括甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸和半胱氨酸。PEG部分可以通過酰胺或氨基甲酸酯鍵與接頭的胺部分結(jié)合。PEG分別通過硫醚或醚鍵連接至半胱氨酸和絲氨酸的硫或氧原子上。

在一種示例性的實施方案中，R5包含聚合物修飾基團。在另一示例性的實施方案中，R5同時包含聚合物修飾基團和將修飾基團連接到分子其余部分上的接頭L。如上所述，L可以是線性或支化的結(jié)構(gòu)。類似地，聚合物修飾基團可以是支化或線性的。
II.D.ii.水溶性聚合物
許多水溶性聚合物為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知而且可用于實踐本發(fā)明。術(shù)語水溶性聚合物包括例如糖(例如葡聚糖、直鏈淀粉、透明質(zhì)酸、多聚(唾液酸)、類肝素、肝素等)；聚(氨基酸)例如聚(天冬氨酸)和聚(谷氨酸)；核酸；合成聚合物(例如聚(丙烯酸)、聚醚如聚(乙二醇))；肽、蛋白質(zhì)等物種。本發(fā)明可以用任何水溶性聚合物來實施，唯一的限制在于該聚合物必須包含綴合物的其余部分能夠與它結(jié)合的位點。

活化聚合物的方法也可以見WO 94/17039、美國專利No.5,324,844、WO 94/18247、WO 94/04193、美國專利No.5,219,564、美國專利No.5,122,614、WO 90/13540、美國專利No.5,281,698以及WO 93/15189，以及對于活化的聚合物和肽之間的綴合參見以下文獻，例如凝血因子VIII(WO 94/15625)、血紅蛋白(WO 94/09027)、載氧分子(美國專利No.4,412,989)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等，App.Biochem.Biotech.11141-45(1985))。

示例性的水溶性聚合物為聚合物試樣中相當大部分聚合物分子有大致相同的分子量的那些聚合物；所述聚合物為“均勻分散的”。

本發(fā)明參照聚(乙二醇)綴合物來進一步舉例說明?？色@得關(guān)于PEG官能化和綴合的若干綜述和專題文章。參見例如Harris，Macronol.Chem.Phys.C25325-373(1985)；Scouten，MethodsinEnzymology，13530-65(1987)；Wong等，Enzyme Microb.Technol.14866-874(1992)；Delgado等，Critical Reviews in TherapeuticDrug Carrier Systems 9249-304(1992)；Zalipsky，Biocon jugateChem.6150-165(1995)；以及Bhadra等，Pharmazie，575-29(2002)。制備反應性PEG分子并用該反應性分子形成綴合物的途徑為本領(lǐng)域已知。例如，美國專利No.5,672,662公開了選自線性或支化聚氧化烯烴、聚(氧乙烯化多元醇)、聚(烯醇)和聚丙烯酰嗎啉的聚合物酸的活性酯的水溶性且可分離的綴合物。

美國專利No.6,376,604描述通過使聚合物的末端羥基與碳酸二(1-苯并三唑基)酯在有機溶劑中反應來制備水溶性的和非肽聚合物的水溶性1-苯并三唑基碳酸酯的方法。該活性酯用于與生物活性劑例如蛋白質(zhì)或肽形成綴合物。

WO 99/45964描述含生物活性劑和活化的水溶性聚合物的綴合物，該聚合物包含具有通過穩(wěn)定鍵與聚合物主鏈相連的至少一個末端的聚合物主鏈，其中至少一個末端含有具有與支化部分相連的近端反應性基團的支化部分，其中生物活性劑與至少一個近端反應性基團連接。另外的支化聚乙二醇在WO 96/21469中得到描述，美國專利No.5,932,462描述由包括含有反應性官能團的支化末端的支化PEG分子所形成的綴合物。游離反應性基團可用來與生物活性物種例如蛋白質(zhì)或肽反應，形成聚乙二醇與生物活性物種之間的綴合物。美國專利No.5,446,090描述雙官能PEG接頭及其在形成PEG接頭每端均有肽的綴合物中的用途。

包含可降解PEG鍵的綴合物在WO 99/34833和WO 99/14259以及美國專利No.6,348,558中得到描述。這些可降解鍵可適用于本發(fā)明。

上述本領(lǐng)域公認的聚合物活化方法在本文所述支化聚合物的形成方面以及對于這些支化聚合物與其他物種例如糖、糖核苷酸等的綴合可用于本發(fā)明的上下文中。

示例性的水溶性聚合物是聚乙二醇，例如甲氧基-聚乙二醇。本發(fā)明中使用的聚乙二醇不限于任何特定的形式或分子量范圍。對于非支化的聚乙二醇分子，分子量優(yōu)選為500-100,000。優(yōu)選使用2000-60,000的分子量以及優(yōu)選約5,000-約40,000。
II.D.iii.支化的水溶性聚合物
在另一實施方案中聚乙二醇為結(jié)合了多于一個的PEG部分的支化PEG。支化PEG的示例在美國專利No.5,932,462、美國專利No.5,342,940、美國專利No.5,643,575、美國專利No.5,919,455、美國專利No.6,113,906、美國專利No.5,183,660、WO 02/09766、Kodera Y.，Bioconjugate Chemistry 5283-288(1994)以及Yamasaki等，Agric.Biol.Chem.，522125-2127，1998中得到描述。在優(yōu)選的實施方案中，支化PEG的各個聚乙二醇的分子量小于或等于40,000道爾頓。

代表性的聚合物修飾部分包括基于含側(cè)鏈的氨基酸例如絲氨酸、半胱氨酸、賴氨酸和小肽例如lys-lys的結(jié)構(gòu)。示例性的結(jié)構(gòu)包括

技術(shù)人員會意識到二-賴氨酸結(jié)構(gòu)中的游離胺也可以通過酰胺或氨基甲酸酯鍵用PEG部分聚乙二醇化。

在又一實施方案中，聚合物修飾部分是基于三-賴氨酸肽的支化PEG部分。該三-賴氨酸可以是單-、二-、三-或四PEG化的。示例性的根據(jù)該實施方案的物種具有下式

和
其中下標e、f和f’獨立地為選自1-2500的整數(shù)；以及下標q、q’和q”獨立地為選自1-20的整數(shù)。

如同對技術(shù)人員而言明顯的那樣，用于本發(fā)明中的支化聚合物包括上面所述主題的變體。例如上面所示的二賴氨酸-PEG綴合物可以包含三個聚合物亞單元，第三個結(jié)合在上文結(jié)構(gòu)中顯示未修飾的α-胺上。類似地，用三個或四個以聚合物修飾部分標記的聚合物亞單元官能化的三賴氨酸的應用在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

如本文所述，用于本發(fā)明綴合物中的PEG可以是線性或支化的。用于形成根據(jù)本發(fā)明該實施方案的含支化PEG的肽綴合物的示例性前體具有下式
用于形成根據(jù)本發(fā)明該實施方案的含支化PEG的肽綴合物的另一示例性前體具有下式

根據(jù)該式的支化聚合物物種基本上是純水溶性聚合物。X3’是包含可離子化的(例如OH、COOH、H2PO4、HSO3、HPO3及其鹽等)或其他反應性官能團例如以下那些的部分。C是碳。X5、R16和R17獨立地選自非反應性基團(例如H、未取代的烴基、未取代的雜烴基)和聚合物臂(例如PEG)。X2和X4為可以相同或不同的優(yōu)選在生理條件下基本上非反應性的鍵片段。示例性的接頭既不包含芳族部分也不包含酯部分。作為選擇，這些鍵可以包含一個或多個設(shè)計成在生理上相關(guān)的條件下降解的部分例如酯、二硫化物等。X2和X4將聚合物臂R16和R17連接到C上。當X3’與接頭、糖或接頭-糖盒上具有互補反應性的反應性官能團反應時，X3’轉(zhuǎn)化成鍵片段X3的組分。

X2、X3和X4的示例性鍵片段獨立地選擇以及包括S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH和NHC(O)O、和OC(O)NH、CH2S、CH2O、CH2CH2O、CH2CH2S、(CH2)oO、(CH2)oS或(CH2)oY’-PEG，其中Y’為S、NH、NHC(O)、C(O)NH、NHC(O)O、OC(O)NH或O以及o為1-50的整數(shù)。在一種示例性的實施方案中，鍵片段X2和X4為不同的鍵片段。

在一種示例性的實施方案中，前體(式III)或其活化衍生物通過X3’和糖部分上互補反應性的基團例如胺之間的反應與糖、活化的糖或糖核苷酸反應并由此與其結(jié)合。作為選擇，X3’與前體上的反應性官能團反應成接頭L。式I和II的R2、R3、R4、R5、R6或R6’中的一個或多個可以包含支化的聚合物修飾部分，或者該部分通過L結(jié)合。

在一種示例性的實施方案中，聚合物修飾基團具有根據(jù)下式的結(jié)構(gòu)

和

在根據(jù)上式的另一示例性實施方案中，支化聚合物具有根據(jù)下式的結(jié)構(gòu)
在一種示例性的實施方案中，A1和A2各自選自-OH和-OCH3。

根據(jù)該實施方案的示例性的聚合物修飾基團包括

和

在一種示例性的實施方案中，以下部分
是接頭臂L。在該實施方案中，示例性的接頭衍生自天然或非天然的氨基酸、氨基酸類似物或氨基酸模擬物、或者由一個或多個上述物種形成的小肽。例如，本發(fā)明化合物中存在的某些支化聚合物具有下式

Xa是由支化聚合物修飾部分的前體上的反應性官能團例如X3’與糖部分或接頭前體上的反應性官能團的反應形成的鍵片段。例如，當X3’是羧酸時，它可以進行活化并且直接結(jié)合到氨基糖(例如Sia、GalNH2、GlcNH2、ManNH2等)上懸掛的胺基團上，形成作為酰胺的Xa。另外的示例性反應性官能團和活化前體在下文進行描述。下標c表示1-10的整數(shù)。其他符號具有如上述那些相同的含義。

在另一示例性的實施方案中，Xa是與另一接頭形成的連接部分
其中Xb是另一鍵片段以及獨立地選自對于Xa所述的那些基團，類似于L，L1是鍵、取代的或未取代的烴基或取代的或未取代的雜烴基。

Xa和Xb的示例性物種包括S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、C(O)NH和NHC(O)O以及OC(O)NH。

在另一示例性的實施方案中，X4是與R17的肽鍵，R17為其中α-胺部分和/或側(cè)鏈雜原子用聚合物修飾部分修飾的氨基酸、二肽(例如Lys-Lys)或三肽(例如Lys-Lys-Lys)。

在另一示例性的實施方案中，本發(fā)明的肽綴合物包含具有選自以下的式的部分，例如R15部分

和

其中由各種符號表示的基團的含義與上文所述的相同。La是鍵或如上對于L和L1所述的接頭，例如取代的或未取代的烴基或取代的或未取代的雜烴基部分。在一種示例性的實施方案中，La是如同所示那樣用聚合物修飾部分官能化的唾液酸的側(cè)鏈的部分。示例性的La部分包括含有一個或多個OH或NH2的取代的或未取代的烴基鏈。

在又一實施方案中，本發(fā)明提供具有下式的部分，例如R15部分的肽綴合物

和
由各種符號表示的基團的含義與上文所述的相同。如同技術(shù)人員會意識到的那樣，式VI和VII中的接頭臂可同等適用于本文所述的其他修飾的糖。在示例性的實施方案中，式VI和VII的物種為結(jié)合至本文所述的聚糖結(jié)構(gòu)上的R15部分。

在又一示例性的實施方案中，因子VII/因子VIIa肽綴合物包含具有選自以下的式的R15部分
其中基團的含義如上所述。La的示例性物種為-(CH2)jC(O)NH(CH2)hC(O)NH-，其中下標h和j為獨立地選自0-10的整數(shù)。另一示例性物種為-C(O)NH-。下標m和n為獨立地選自0-5000的整數(shù)。A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10和A11獨立地選自H、取代的或未取代的烴基、取代的或未取代的雜烴基、取代的或未取代的環(huán)烴基、取代的或未取代的雜環(huán)烴基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的雜芳基、-NA12A13、-OA12和-SiA12A13。A12和A13獨立地選自取代的或未取代的烴基、取代的或未取代的雜烴基、取代的或未取代的環(huán)烴基、取代的或未取代的雜環(huán)烴基、取代的或未取代的芳基和取代的或未取代的雜芳基。

上述本發(fā)明的實施方案參照其中聚合物為水溶性聚合物，特別是聚乙二醇(“PEG”)如甲氧基-聚乙二醇的物種來進一步舉例說明。技術(shù)人員會意識到以下段落中的焦點在于說明的清楚性而且用PEG作為示例性聚合物闡述的各種模體可同等適用于其中采用PEG以外的聚合物的物種。

任意分子量的PEG可用于本發(fā)明中，例如1KDa、2KDa、5KDa、10KDa、15KDa、20KDa、25KDa、30KDa、35KDa、40KDa和45KDa。

在一種示例性的實施方案中，R15部分具有選自以下的式
在上面的每種結(jié)構(gòu)中，接頭片段-NH(CH2)a-可以存在或不存在。

在另外的示例性實施方案中，肽綴合物包含選自以下的R15部分
和

在上面的各個式中，下標e和f為獨立地選自1-2500的整數(shù)。在另外的實施方案中，選擇e和f以提供約1KDa、2KDa、5KDa、10KDa、15KDa、20KDa、25KDa、30KDa、35KDa、40KDa和45KDa的PEG部分。符號Q表示取代的或未取代的烴基(例如C1-C6烴基，如甲基)、取代的或未取代的雜烴基或H。

其他支化的聚合物具有基于二-賴氨酸(Lys-Lys)肽的結(jié)構(gòu)，例如


和
以及基于三-賴氨酸肽(Lys-Lys-Lys)的結(jié)構(gòu)，例如

和
在上述各圖中，下標e、f、f’和f”表示獨立地選自1-2500的整數(shù)。下標q、q’和q”表示獨立地選自1-20的整數(shù)。

在另一示例性的實施方案中，修飾基團
具有選自以下的式


和
其中Q選自H和取代的或未取代的C1-C6烴基。下標e和f為獨立地選自1-2500的整數(shù)，以及下標q為選自0-20的整數(shù)。

在另一示例性的實施方案中，修飾基團
具有選自以下的式


和
其中Q選自H和取代的或未取代的C1-C6烴基。下標e、f和f’為獨立地選自1-2500的整數(shù)，以及下標q和q’為獨立地選自1-20的整數(shù)。

在另一示例性的實施方案中，支化聚合物具有根據(jù)下式的結(jié)構(gòu)
其中下標m和n為獨立地選自0-5000的整數(shù)。A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10和A11獨立地選自H、取代的或未取代的烴基、取代的或未取代的雜烴基、取代的或未取代的環(huán)烴基、取代的或未取代的雜環(huán)烴基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的雜芳基、-NA12A13、-OA12和-SiA12A13。A12和A13獨立地選自取代的或未取代的烴基、取代的或未取代的雜烴基、取代的或未取代的環(huán)烴基、取代的或未取代的雜環(huán)烴基、取代的或未取代的芳基和取代的或未取代的雜芳基。

式IIIa為式III的子集。式IIIa所述結(jié)構(gòu)也包括在式III中。

在一種示例性的實施方案中，聚合物修飾基團具有根據(jù)下列式的結(jié)構(gòu)

和

在根據(jù)上式的另一示例性實施方案中，支化聚合物具有根據(jù)下式的結(jié)構(gòu)
在一種示例性的實施方案中，A1和A2獨立地選自-OH和-OCH3。

根據(jù)該實施方案的示例性聚合物修飾基團包括

和

在一種說明性的實施方案中，修飾的糖是唾液酸而且用于本發(fā)明的選定的修飾的糖具有下式
和
下標a、b和d為0-20的整數(shù)。下標c為1-2500的整數(shù)。上述結(jié)構(gòu)可以是R15的組分。

在另一說明性的實施方案中，糖的伯羥基部分用修飾基團官能化。例如，唾液酸的9-羥基可以轉(zhuǎn)化成相應的胺并且官能化以提供本發(fā)明的化合物。根據(jù)該實施方案的式包括
上述結(jié)構(gòu)可以是R15的組分。

雖然本發(fā)明在前述段落中參照PEG來舉例說明，但是如同技術(shù)人員會意識到的那樣，一系列聚合物修飾部分可用于本文所述的化合物和方法中。

在選定的實施方案中，R1或L-R1為支化PEG，例如上述的物種之一。在一種示例性的實施方案中，支化PEG結(jié)構(gòu)基于半胱氨酸肽。根據(jù)該實施方案的說明性修飾的糖包括
其中X4為鍵或O。在上面各個結(jié)構(gòu)中，烴基胺接頭-(CH2)aNH-可以存在或不存在。上述結(jié)構(gòu)可以是R15/R15’的組分。

如本文所述，用于本發(fā)明的聚合物修飾的唾液酸也可以是線性結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明提供包含衍生自諸如以下結(jié)構(gòu)的唾液酸部分的綴合物
其中下標q和e如上所述。

示例性的修飾的糖用水溶性或水不溶性聚合物修飾。有用聚合物的實例在下面進一步說明。

在另一示例性的實施方案中，肽來源于昆蟲細胞，通過向甘露糖核心加成GlcNAc和Gal來重建并用帶有線性PEG部分的唾液酸來糖基聚乙二醇化，提供包含至少一個具有下式的部分的因子VII/因子VIIa肽
其中下標t為0-1的整數(shù)；下標s表示1-10的整數(shù)；以及下標f表示1-2500的整數(shù)。

在一種實施方案中，本發(fā)明提供包含以下糖基連接基團的肽綴合物
D選自-OH和R1-L-HN-；G選自R1-L-和-C(O)(C1-C6)烴基-R1；R1是包含選自直鏈聚乙二醇殘基和支化聚乙二醇殘基中的成員的部分；以及M選自H、鹽反荷離子和單個負電荷；L是選自鍵、取代的或未取代的烴基和取代的或未取代的雜烴基的接頭。在一種示例性的實施方案中，當D為OH時，G為R1-L-。在另一示例性的實施方案中，當G為-C(O)(C1-C6)烴基時，D為R1-L-NH-。

在一種示例性的實施方案中，L-R1具有下式
其中a為選自0-20的整數(shù)。

在一種示例性的實施方案中，R1具有選自以下的結(jié)構(gòu)


和
其中e、f、m和n為獨立地選自1-2500的整數(shù)；以及q為選自0-20的整數(shù)。

在一種示例性的實施方案中，R1具有選自以下的結(jié)構(gòu)


和
其中e、f和f’為獨立地選自1-2500的整數(shù)；以及q和q’為獨立地選自1-20的整數(shù)。

在另一示例性的實施方案中，R1具有選自以下的結(jié)構(gòu)


和
其中e、f和f’為獨立地選自1-2500的整數(shù)；以及q和q’為獨立地選自1-20的整數(shù)。

在另一示例性的實施方案中，R1具有選自以下的結(jié)構(gòu)

和
其中e和f為獨立地選自1-2500的整數(shù)。

在另一示例性的實施方案中，糖基接頭具有下式

在另一示例性的實施方案中，肽綴合物包含根據(jù)選自以下的式的至少一個所述糖基接頭

和 其中AA是所述肽綴合物的氨基酸殘基以及t為選自0和1的整數(shù)。

在另一示例性的實施方案中，肽綴合物包含至少一個所述糖基接頭，其中每一個所述糖基接頭具有獨立地選自下列式的結(jié)構(gòu)

其中AA是所述肽綴合物的氨基酸殘基以及t為選自0和1的整數(shù)。

在另一示例性的實施方案中，肽綴合物包含根據(jù)選自以下的式的至少一個所述糖基接頭



和
其中AA是所述肽綴合物的氨基酸殘基以及t為選自0和1的整數(shù)。在一種示例性的實施方案中，選自0和2個不含G的唾液?；糠种械某蓡T不存在。在一種示例性的實施方案中，選自1和2個不含G的唾液酰基部分中的成員不存在。

在另一示例性的實施方案中，肽綴合物包含根據(jù)選自以下的式的至少一個所述糖基接頭


和
其中AA是所述肽綴合物的氨基酸殘基以及t為選自0和1的整數(shù)。在一種示例性的實施方案中，選自0和2個不含G的唾液?；糠种械某蓡T不存在。在一種示例性的實施方案中，選自1和2個不含G的唾液酰基部分中的成員不存在。

在另一示例性的實施方案中，肽綴合物包含根據(jù)選自以下的式的至少一個所述糖基接頭


和
其中AA是所述肽綴合物的氨基酸殘基以及t為選自0和1的整數(shù)。在一種示例性的實施方案中，選自0和2個不含G的唾液?；糠种械某蓡T不存在。在一種示例性的實施方案中，選自1和2個不含G的唾液酰基部分中的成員不存在。

在另一示例性的實施方案中，因子VII/因子VIIa肽具有SEQ.ID.NO1的氨基酸序列。在另一示例性的實施方案中，糖基接頭通過選自絲氨酸和蘇氨酸的氨基酸殘基結(jié)合至所述因子VII/因子VIIa肽上。

在另一示例性的實施方案中，天冬酰胺殘基選自N152、N322及其組合。

在另一示例性的實施方案中，因子VIIa肽為生物活性因子VIIa肽。

在另一示例性的實施方案中，糖基接頭通過為天冬酰胺殘基的氨基酸殘基結(jié)合至所述因子VII/因子VIIa肽上。

在另一示例性的實施方案中，本發(fā)明提供在合適宿主中產(chǎn)生的因子VII/因子VIIa肽。本發(fā)明也提供表達該肽的方法。在另一示例性的實施方案中，宿主為哺乳動物表達體系。

在另一示例性的實施方案中，本發(fā)明提供一種治療需要該治療的受試者中病癥的方法，所述病癥的特征為所述受試者中凝血效價受損(compromised clotting potency)，所述方法包括向受試者施用有效改善所述受試者中所述病癥的量的本發(fā)明因子VII/因子VIIa肽綴合物的步驟。在另一示例性的實施方案中，該方法包括向所述哺乳動物施用適量的根據(jù)本文所述方法制備的因子VII/因子VIIa肽綴合物。

在另一方面中，本發(fā)明提供一種制備含有糖基接頭的因子VII/因子VIIa肽綴合物的方法，該糖基接頭包含具有下式的修飾的唾液?；鶜埢?
其中R2為H、CH2OR7、COOR7或OR7。R7表示H、取代的或未取代的烴基或取代的或未取代的雜烴基。R3和R4獨立地選自H、取代的或未取代的烴基、OR8、NHC(O)R9。R8和R9獨立地選自H、取代的或未取代的烴基、取代的或未取代的雜烴基或唾液酸。R16和R17為獨立選擇的聚合物臂。X2和X4為獨立選擇的將聚合物部分R16和R17連接到C上的鍵片段。X5是非反應性基團以及La是接頭基團。該方法包括使含有糖基部分的因子VII/因子VIIa肽
與具有下式的PEG-唾液酸供體部分
以及將PEG-唾液酸轉(zhuǎn)移至所述糖基部分的Gal上的酶，在適合于所述轉(zhuǎn)移的條件下進行接觸。

在另一示例性的實施方案中，部分
具有選自以下的式
其中e、f、m和n為獨立地選自1-2500的整數(shù)；以及 q為選自0-20的整數(shù)。

在另一示例性的實施方案中，部分
具有選自以下的式


和
其中e、f和f’為獨立地選自1-2500的整數(shù)；以及 q和q’為獨立地選自1-20的整數(shù)。

在另一示例性的實施方案中，糖基接頭包含下式

在另一示例性的實施方案中，因子VII/因子VIIa肽綴合物包含至少一個具有下式的糖基接頭


和
其中AA為所述肽的氨基酸殘基；t為選自0和1的整數(shù)；以及R15為修飾的唾液?；糠帧?br>
在另一示例性的實施方案中，因子VII/因子VIIa肽具有SEQ.ID.NO1的氨基酸序列。

在另一示例性的實施方案中，糖基接頭通過為天冬酰胺殘基的氨基酸殘基結(jié)合至所述因子VII/因子VIIa肽上。

在另一示例性的實施方案中，天冬酰胺殘基選自N152、N322及其組合。

在另一示例性的實施方案中，因子VIIa肽為生物活性因子VIIa肽。

在另一示例性的實施方案中，所述方法在步驟(a)之前包括(b)在合適宿主中表達因子VII/因子VIIa肽。

在另一方面中，本發(fā)明提供一種治療需要該治療的受試者中病癥的方法，所述病癥的特征為所述受試者中凝血能力受損，所述方法包括向受試者施用有效改善所述受試者中所述病癥的量的根據(jù)本文所述方法制備的因子VII/因子VIIa肽綴合物的步驟。在另一示例性的實施方案中，該方法包括向所述哺乳動物施用適量的根據(jù)本文所述方法制備的因子VII/因子VIIa肽綴合物。

在另一方面中，本發(fā)明提供合成因子VII或因子VIIa肽綴合物的方法，所述方法包括將a)唾液酸酶；b)選自糖基轉(zhuǎn)移酶、外切糖苷酶和內(nèi)切糖苷酶的酶；c)修飾的糖/修飾的唾液?；鶜埢?；d)因子VII/因子VIIa肽合并從而合成所述因子VII或因子VIIa肽綴合物。在一種示例性的實施方案中，合并的時間少于10小時。在另一示例性的實施方案中，本發(fā)明進一步包括加帽步驟。
II.D.iv.水不溶性聚合物
在另一實施方案中，與上面所討論的那些類似，修飾的糖包括水不溶性聚合物而不是水溶性聚合物。本發(fā)明的綴合物也可以包含一種或多種水不溶性聚合物。本發(fā)明的該實施方案通過使用綴合物作為以受控方式遞送治療肽的載體進行說明。聚合物藥物遞送系統(tǒng)為本領(lǐng)域已知。參見例如Dunn等編輯，


，ACS Symposium Series第469卷，American ChemicalSociety，Washington，D.C.1991。本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到，基本上任何已知的藥物遞送系統(tǒng)都可適用于本發(fā)明的綴合物。

對于R1、L-R1、R15、R15’和其他基團的上述模體可同等適用于水不溶性聚合物，可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員易于采取的化學方式將它們不受限制地引入線性和支化結(jié)構(gòu)中。

代表性的水不溶性聚合物包括但不限于聚膦嗪、聚乙烯醇、聚酰胺、聚碳酸酯、聚亞烷基(polyalkylene)、聚丙烯酰胺、聚亞烷基二醇、聚氧化烯烴、聚對苯二甲酸亞烷基酯、聚乙烯基醚、聚乙烯基酯、聚鹵乙烯、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚甲基丙烯酸異丁酯、聚甲基丙烯酸己酯、聚甲基丙烯酸異癸酯、聚甲基丙烯酸月桂酯、聚甲基丙烯酸苯酯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸異丙酯、聚丙烯酸異丁酯、聚丙烯酸十八烷基酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙二醇、聚氧乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯基吡咯烷酮、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(pluronics)和聚乙烯基苯酚及它們的共聚物。

用于本發(fā)明綴合物的合成修飾的天然聚合物包括但不限于烷基纖維素、羥烷基纖維素、纖維素醚、纖維素酯和硝酸纖維素。廣泛種類的合成修飾的天然聚合物中特別優(yōu)選的成員包括但不限于甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丁基甲基纖維素、乙酸纖維素、丙酸纖維素、乙酸丁酸纖維素、乙酸鄰苯二甲酸纖維素、羧甲基纖維素、三乙酸纖維素、纖維素硫酸鈉鹽以及丙烯酸和甲基丙烯酸酯和藻酸的聚合物。

本文所討論的這些和其他聚合物可以容易地從商業(yè)來源例如Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO.)、Polysciences(Warrenton，PA.)、Aldrich(Milwaukee，WI.)、Fluka(Ronkonkoma，NY)和BioRad(Richmond，CA)獲得，或者使用標準技術(shù)從這些供應商處所獲得的單體來合成。

用于本發(fā)明綴合物的代表性的可生物降解聚合物包括但不限于聚丙交酯、聚乙交酯及其共聚物、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚丁酸、聚戊酸、聚丙交酯-共-己內(nèi)酯、聚丙交酯-共-乙交酯、聚酐、聚原酸酯及其共混物和共聚物。特別有用的是形成凝膠的組合物，例如含有膠原、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物等的那些。

用于本發(fā)明的聚合物包括“雜化”聚合物，它包含在其結(jié)構(gòu)的至少一部分中具有可生物吸收分子的水不溶性物質(zhì)。這種聚合物的實例為含有水不溶性共聚物的聚合物，所述共聚物的每條聚合物鏈具有可生物吸收區(qū)域、親水性區(qū)域和多個可交聯(lián)官能團。

就本發(fā)明而言，“水不溶性物質(zhì)”包括基本上不溶于水或含水環(huán)境的物質(zhì)。因此，盡管共聚物的某些區(qū)域或鏈段可能是親水的乃至是水溶性的，但是聚合物分子整體上在水中沒有任何顯著程度的溶解。

就本發(fā)明而言，術(shù)語“可生物吸收的分子”包含能夠由身體進行代謝或分解并且吸收和/或通過正常排泄途徑消除的區(qū)域。所述代謝產(chǎn)物或分解產(chǎn)物優(yōu)選基本上對身體無毒。

可生物吸收的區(qū)域可以是疏水性的或親水性的，只要該共聚物組合物整體沒有變得水溶性即可。由此，基于使聚合物整體保持水不溶性的優(yōu)選情況來選擇可生物吸收的區(qū)域。因此，選擇相對特性，即可生物吸收的區(qū)域所含的官能團種類和該區(qū)域的相對比例以及親水性區(qū)域，從而確保有用的可生物吸收的組合物保持水不溶性。

示例性的可吸收聚合物包括例如合成制備的聚α-羥基羧酸/聚氧化烯烴的可吸收嵌段共聚物(參見Cohn等，美國專利No.4,826,945)。這些共聚物沒有交聯(lián)而且是水溶性的，以至于身體可以排泄降解后的嵌段共聚物組合物。參見Younes等，J Biomed.Mater.Res.211301-1316(1987)以及Cohn等，J Biomed.Mater.Res.22993-1009(1988)。

目前優(yōu)選的可生物吸收聚合物包括選自以下的一種或多種組分聚酯、聚羥基酸、聚內(nèi)酯、聚酰胺、聚酯-酰胺、聚氨基酸、聚酸酐、聚原酸酯、聚碳酸酯、聚膦嗪、聚磷酸酯、聚硫代酯、多糖及其混合物。更優(yōu)選地，可生物吸收的聚合物包括聚羥基酸組分。在聚羥基酸中，優(yōu)選聚乳酸、聚乙醇酸、聚己酸、聚丁酸、聚戊酸及其共聚物和混合物。

除了形成在體內(nèi)被吸收(“生物吸收”)的片段以外，用于本發(fā)明方法的優(yōu)選聚合物包衣還可以形成可排泄和/或可代謝的片段。

本發(fā)明中還可以使用高級共聚物。例如1984年3月20日頒發(fā)的Casey等的美國專利No.4,438,253公開了由聚乙醇酸和羥基末端的聚亞烷基二醇的酯交換產(chǎn)生的三嵌段共聚物。公開該組合物用作可吸收的單絲縫合線。通過向共聚物結(jié)構(gòu)中引入芳族原碳酸酯例如原碳酸四對甲苯酯來控制這些組合物的撓性。

還可以使用基于乳酸和/或乙醇酸的其他聚合物。例如1993年4月13日頒發(fā)的Spinu的美國專利No.5,202,413公開了具有聚丙交酯和/或聚乙交酯依次有序嵌段的可生物降解多嵌段共聚物，其通過將丙交酯和/或乙交酯開環(huán)聚合至低聚二醇或二胺殘基上、接著用二官能化合物例如二異氰酸酯、二酰氯或二氯硅烷進行擴鏈來制成。

可以將可用于本發(fā)明的包衣的可生物吸收區(qū)域設(shè)計成可水解和/或可酶促切割的。就本發(fā)明而言，“可水解切割”是指共聚物，特別是可生物吸收區(qū)域在水或含水環(huán)境中對水解的敏感性。類似地，本文使用的“可酶促切割”是指共聚物，特別是可生物吸收區(qū)域?qū)?nèi)源或外源酶切割的敏感性。

當置于身體中時，可以將親水性區(qū)域加工成可排泄和/或可代謝片段。因此，親水性區(qū)域可以包括如聚醚、聚氧化烯烴、多元醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚烷基噁唑啉、多糖、碳水化合物、肽、蛋白質(zhì)及其共聚物和混合物。此外，親水性區(qū)域還可以是例如聚氧化烯烴。所述聚氧化烯烴可以包括如聚氧乙烯、聚氧丙烯及其混合物和共聚物。

作為水凝膠組分的聚合物也可用于本發(fā)明。水凝膠是能夠吸收相對大量水的聚合物材料。形成水凝膠的化合物的實例包括但不限于聚丙烯酸、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷、明膠、角叉菜膠和其他多糖、羥基亞乙基甲基丙烯酸(HEMA)及其衍生物等等?？梢灾瞥煞€(wěn)定、可生物降解和可生物吸收的水凝膠。此外，水凝膠組合物可以包含表現(xiàn)出一種或多種這些性質(zhì)的亞單元(subunits)。

其完整性可以通過交聯(lián)進行控制的生物相容的水凝膠組合物是已知的，而且目前優(yōu)選用于本發(fā)明方法中。例如Hubbell等的1995年4月25日頒發(fā)的美國專利No.5,410,016和1996年6月25日頒發(fā)的5,529,914公開了水溶性體系，它是具有夾在兩個對水解不穩(wěn)定的延長部分之間的水溶性中心嵌段鏈段的交聯(lián)嵌段共聚物。這些共聚物進一步由可光聚合的丙烯酸酯官能度封端。在交聯(lián)時，這些體系變成水凝膠。上述共聚物的水溶性中心嵌段可以包括聚乙二醇，而對水解不穩(wěn)定的延長部分可以是聚α-羥基酸，例如聚乙醇酸或聚乳酸。參見Sawhney等，Macromolecules 26581-587(1993)。

在另一優(yōu)選的實施方案中，凝膠為熱可逆的凝膠。目前優(yōu)選包含諸如以下組分的熱可逆凝膠聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、膠原、明膠、透明質(zhì)酸、多糖、聚氨酯水凝膠、聚氨酯-脲水凝膠及其組合。

在又一示例性的實施方案中，本發(fā)明的綴合物包含脂質(zhì)體的組分?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備脂質(zhì)體，例如Eppstein等的美國專利No.4,522,811中所述那樣。例如，脂質(zhì)體制劑的制備可以通過將合適的脂質(zhì)(例如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰磷脂酰膽堿、花生酰(arachadoyl)磷脂酰膽堿和膽固醇)溶于無機溶劑中，隨后蒸發(fā)溶劑，在容器表面留下干燥脂質(zhì)的薄膜。然后向容器中引入活性化合物或其可藥用鹽的水溶液。接著用手旋動容器以從容器側(cè)面釋放脂質(zhì)物質(zhì)并分散脂質(zhì)聚集體，由此形成脂質(zhì)體懸浮液。

為了舉例提供上述微粒和制備微粒的方法，它們并非意圖限定可用于本發(fā)明的微粒的范圍。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言明顯的是，用不同方法制備的一系列微?？捎糜诒景l(fā)明中。

就水不溶性聚合物而言，上面在水溶性聚合物的上下文中論述的直鏈和支化的結(jié)構(gòu)形式一般也可適用。因此，例如可以使半胱氨酸、絲氨酸、二賴氨酸和三賴氨酸支化核心用兩個水不溶性聚合物部分官能化。用于制備這些物種的方法一般與用于制備水溶性聚合物的那些方法非常相似。
II.D.v.制備聚合物修飾基團的方法
可以活化聚合物修飾基團以便與糖基部分或氨基酸部分反應。示例性的活化物種結(jié)構(gòu)(例如碳酸酯和活性酯)包括


和

在上面的圖中，q選自1-40。適合活化可用于制備本文所述化合物的線性和支化PEG的其他活化基團或離去基團包括但不限于


和
用這些和其他物種活化的PEG分子以及制備活化PEG的方法在WO04/083259中得到描述。

本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到上面所示的支化聚合物的一個或多個m-PEG臂可以由具有不同末端例如OH、COOH、NH2、C2-C10-烴基等的PEG部分代替。此外，上述結(jié)構(gòu)容易地通過在氨基酸側(cè)鏈的α-碳原子和官能團之間插入烴基接頭(或除去碳原子)來進行修飾。因此，“同質(zhì)(homo)”衍生物和高級同系物以及低級同系物在可用于本發(fā)明的支化PEG核心的范圍內(nèi)。

本文所述的支化PEG物種容易地通過諸如以下方案中所述的方法來制備
其中Xd為O或S而r為1-5的整數(shù)。下標e和f為獨立地選自1-2500的整數(shù)。在一種示例性的實施方案中，選擇這些下標之一或其兩者以使得聚合物分子量為約5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa或40kDa。

因此，根據(jù)該方案，使天然或非天然的氨基酸與活性m-PEG衍生物(在該情況下為甲苯磺酸酯)接觸，通過將側(cè)鏈雜原子Xd烷基化而形成1。使單官能化的m-PEG氨基酸與活性m-PEG衍生物處于N-?；瘲l件下，從而組合成支化m-PEG 2。如同技術(shù)人員會意識到的那樣，甲苯磺酸酯離去基團可以用任何合適的離去基團代替，例如鹵素、甲磺酸酯、三氟甲基磺酸酯等。類似地，用于?；返姆磻蕴妓狨タ梢杂没钚怎ダ鏝-羥基琥珀酰亞胺等代替，或者酸可以用脫水劑例如二環(huán)己基碳二亞胺、羰基二咪唑等原位活化。

在另外的示例性實施方案中，脲部分由諸如酰胺等基團代替。
II.E.物質(zhì)的均勻分散的肽綴合物組合物
除了提供通過化學或酶促加成糖基連接基團而形成的肽綴合物以外，本發(fā)明提供包含在其取代模式上高度同質(zhì)的肽綴合物的物質(zhì)組合物。采用本發(fā)明的方法，可以形成其中因子VII/因子VIIa綴合物的群體中相當大部分的糖基連接基團和糖基部分與結(jié)構(gòu)上一致的氨基酸或糖基殘基結(jié)合的肽綴合物。因此，在另一方面中，本發(fā)明提供具有通過糖基連接基團，例如完整的糖基連接基團共價結(jié)合至肽上的水溶性聚合物部分的群體的肽綴合物。在示例性的本發(fā)明肽綴合物中，水溶性聚合物群體的基本上每個成員通過糖基連接基團結(jié)合至肽的糖基殘基上，而且該糖基連接基團所結(jié)合的肽的每個糖基殘基具有相同結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明還提供類似于上述那些的綴合物，其中肽與修飾基團例如治療部分、診斷部分、靶向部分、毒素部分等通過糖基連接基團綴合。每一個上述修飾基團可以是小分子、天然聚合物(例如肽)或合成聚合物。當修飾基團與唾液酸結(jié)合時，通常優(yōu)選該修飾基團是基本上非熒光的。

在一種示例性的實施方案中，本發(fā)明的肽包含至少一個O-連接的或N-連接的糖基化位點，其用包含聚合物修飾基團例如PEG部分的修飾的糖來糖基化。在一種示例性的實施方案中，PEG通過完整的糖基連接基團、或者通過非糖基的接頭例如取代的或未取代的烴基、取代的或未取代的雜烴基共價結(jié)合至肽上。糖基連接基團共價結(jié)合至肽的氨基酸殘基或糖基殘基上。作為選擇，糖基連接基團結(jié)合至糖肽的一個或多個糖基單元上。本發(fā)明也提供其中糖基連接基團既與氨基酸殘基又與糖基殘基結(jié)合的綴合物。

本發(fā)明肽上的聚糖通常對應于在根據(jù)本文所述方法重構(gòu)之后由哺乳動物(BHK、CHO)細胞或昆蟲(例如Sf-9)細胞所產(chǎn)生的因子VII/因子VIIa肽上存在的那些。例如用三甘露糖基核心表達的昆蟲來源的因子VII/因子VIIa肽隨后與GlcNAc供體和GlcNAc轉(zhuǎn)移酶以及Gal供體和Gal轉(zhuǎn)移酶接觸。將GlcNAc和Gal附加至三甘露糖基核心上在兩步或一步中完成。如本文所述使修飾的唾液酸加成到糖基部分的至少一個分支上。沒有用修飾的唾液酸官能化的那些Gal部分任選地通過在唾液酸轉(zhuǎn)移酶的存在下與唾液酸供體反應而“加帽”。

在一種示例性的實施方案中，肽群體中至少60％的末端Gal部分用唾液酸加帽，優(yōu)選至少70％、更優(yōu)選至少80％、再更優(yōu)選至少90％以及甚至更優(yōu)選至少95％、96％、97％、98％或99％的末端Gal部分用唾液酸加帽。
II.F.核苷酸糖
在本發(fā)明的另一方面中，本發(fā)明還提供糖核苷酸。根據(jù)該實施方案的示例性物種包括
其中下標y為選自0、1和2的整數(shù)。堿基為核酸堿基例如腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。R2、R3和R4如上所述。在一種示例性的實施方案中，L-(R1)w選自

和
其中各變量如上所述。

在一種示例性的實施方案中，L-(R1)w具有根據(jù)下式的結(jié)構(gòu)
在一種示例性的實施方案中，A1和A2各自選自-OH和-OCH3。

根據(jù)該實施方案的示例性聚合物修飾基團包括

和

在另一示例性的實施方案中，核苷酸糖具有選自以下的式


和

根據(jù)該實施方案的示例性核苷酸糖具有以下結(jié)構(gòu)

根據(jù)該實施方案的示例性核苷酸具有以下結(jié)構(gòu)

在另一示例性的實施方案中，核苷酸糖基于下式
其中R基團和L表示如上所述的部分。下標“y”為0、1或2。在一種示例性的實施方案中，L為NH與R1之間的鍵。該堿基為核酸堿基。

在一種示例性的實施方案中，L-R1選自

和
其中各變量如上所述。

在一種示例性的實施方案中，L-R1具有根據(jù)下式的結(jié)構(gòu)
在一種示例性的實施方案中，A1和A2各自選自-OH和-OCH3。
III.方法
除了上述綴合物以外，本發(fā)明提供制備這些及其他綴合物的方法。此外，本發(fā)明提供通過向具有發(fā)生所述疾病風險的受試者或患有所述病的受試者施用本發(fā)明的綴合物來預防、治療或改善疾病狀態(tài)的方法。

在示例性的實施方案中，在聚合物修飾部分與糖基化的或未糖基化的肽之間形成綴合物。聚合物與肽通過插入其間而且同時與肽(或糖基殘基)和修飾基團(例如水溶性聚合物)共價連接的糖基連接基團綴合。該方法包括使肽與含有修飾的糖以及使該修飾的糖與底物綴合的酶例如糖基轉(zhuǎn)移酶的混合物接觸。反應在適合于在修飾的糖與肽之間形成共價鍵的條件下進行。修飾的糖的糖部分優(yōu)選選自核苷酸糖。合成因子VII/因子VIIa肽綴合物的方法，包括將a)唾液酸酶；b)能夠催化糖基連接基團的轉(zhuǎn)移的酶，例如糖基轉(zhuǎn)移酶、外切糖苷酶或內(nèi)切糖苷酶；c)修飾的糖；d)因子VII/因子VIIa肽合并，從而合成該因子VII/因子VIIa肽綴合物。反應在適合于在修飾的糖與肽之間形成共價鍵的條件下進行。修飾的糖的糖部分優(yōu)選選自核苷酸糖。

在一種示例性的實施方案中，將修飾的糖，例如上述的那些，活化成相應的核苷酸糖。以其修飾過的形式用于本發(fā)明的示例性的糖核苷酸包括核苷酸單-、二-或三磷酸或其類似物。在優(yōu)選的實施方案中，修飾的糖核苷酸選自UDP-糖苷、CMP-糖苷、或GDP-糖苷。甚至更優(yōu)選地，修飾的糖核苷酸的糖核苷酸部分選自UDP-半乳糖、UDP-半乳糖胺、UDP-葡萄糖、UDP-葡糖胺、GDP-甘露糖、GDP-巖藻糖、CMP-唾液酸或CMP-NeuAc。在一種示例性的實施方案中，核苷酸磷酸結(jié)合至C-1。

本發(fā)明還提供在6-碳位上用L-R1修飾的糖核苷酸的應用。根據(jù)該實施方案的示例性物種包括
其中R基團和L表示如上所述的部分。下標“y”為0、1或2。在一種示例性的實施方案中，L為NH與R1之間的鍵。該堿基為核酸堿基。

其中6-位的碳被修飾的用于本發(fā)明的示例性的核苷酸糖包括具有GDP甘露糖的立體化學的物種，例如

和
其中X5為鍵或0。下標i表示0或1。下標a表示1-20的整數(shù)。下標e和f獨立地表示1-2500的整數(shù)。Q如上所述為H或取代的或未取代的C1-C6烴基。如同技術(shù)人員會意識到的那樣，其中S用0代替的絲氨酸衍生物也落在該通式模體中。

在又一示例性的實施方案中，本發(fā)明提供其中修飾的糖基于UDP半乳糖的立體化學的綴合物。用于本發(fā)明的示例性核苷酸糖具有以下結(jié)構(gòu)

和

在另一示例性的實施方案中，核苷酸糖基于葡萄糖的立體化學。根據(jù)該實施方案的示例性物種具有下式

和

因此，在其中糖基部分為唾液酸的說明性實施方案中，本發(fā)明方法采用具有下式的化合物
其中L-R1如上所述，以及L1-R1表示與修飾基團結(jié)合的接頭。如同L，根據(jù)L1的示例性接頭物種包括鍵、烴基或雜烴基部分。

此外，如上所述，本發(fā)明提供用直鏈或支化的水溶性聚合物修飾的核苷酸糖的應用。例如，具有下面所示式的化合物可用于制備本發(fā)明范圍內(nèi)的綴合物

和
其中X4為O或鍵。

一般而言，通過使用反應性基團將糖部分或糖部分-接頭盒與PEG或PEG-接頭盒基團連接在一起，該反應性基團通常由連接過程轉(zhuǎn)化成新的有機官能團或非反應性物種。糖反應性官能團位于糖部分的任何位置上?？捎糜趯嵺`本發(fā)明的反應性基團和反應種類一般為生物綴合化學領(lǐng)域中熟知的那些。目前有利的可用于反應性糖部分的反應類型是在相對溫和的條件下進行的那些。這些包括但不限于親核取代(例如醇和胺與?；u、活性酯的反應)、親電取代(例如烯胺反應)以及碳-碳和碳-雜原子多重鍵的加成(例如Michael反應、Diels-Alder加成)。這些及其他有用的反應例如在以下文獻中有論述March，

，第3版，John Wiley & Sons，New York，1985；Hermanson，

，Academic Press，San Diego，1996；以及Feeney等，

；Advancesin Chemistry Series，第198卷，American Chemical Society，Washington，D.C.，1982。

懸掛于糖核或修飾基團的有用的反應性官能團包括但不限于 (a)羧基及其各種衍生物，其包括但不限于N-羥基琥珀酰亞胺酯、N-羥基苯并三唑酯、?；u、?；溥颉⒘蝓?、對硝基苯基酯，烷基、烯基、炔基和芳香酯； (b)羥基，其可以例如轉(zhuǎn)化成酯、醚、醛等； (c)鹵代烴基，其中鹵化物可以隨后用親核基團例如胺、羧酸根陰離子、硫醇陰離子、負碳離子或醇鹽離子置換，從而引起鹵素原子官能團處新基團的共價結(jié)合； (d)能夠參與Diels-Alder反應的親二烯體基團，例如馬來酰亞氨基； (e)醛或酮基團，以至于可以通過形成羰基衍生物如亞胺、腙、縮氨基脲或肟、或者通過諸如Grignard加成或烷基鋰加成等機理而隨后衍生化； (f)磺?；u基團，以便隨后與胺反應例如形成磺酰胺； (g)硫醇基，其可以例如轉(zhuǎn)換成二硫化物或與?；u反應； (h)胺基團或巰基，其可以是例如?；?、烴基化的或氧化的； (i)能夠經(jīng)歷例如環(huán)加成、?；?、Michael加成等的烯烴；和 (j)能夠例如與胺和羥基化合物反應的環(huán)氧化物。

可以選擇反應性官能團以使得它們不參與或不干擾組裝反應性糖核或修飾基團所必需的反應。作為選擇，可以通過保護基團的存在來保護反應性官能團免于參與反應。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解如何保護特定的官能團以使其不會干擾選定的一組反應條件。對于有用保護基團的實例，例如參見Greene等，


，John Wiley & Sons，New York，1991。

在下面的論述中，闡述了可用于實踐本發(fā)明的修飾的糖的若干具體實例。在示例性的實施方案中，將唾液酸衍生物用作結(jié)合有修飾基團的糖核。對唾液酸衍生物集中論述只是為了說明的清楚性而不應當解釋成限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到可以用以唾液酸作為實例闡述的類似方法活化和衍生化各種其他糖部分。例如，許多方法可用于修飾半乳糖、葡萄糖、N-乙酰半乳糖胺和巖藻糖以列舉幾種糖底物，該糖底物容易通過本領(lǐng)域已知的方法修飾。例如參見Elhalabi等，Curr.Med.Chem.693(1999)和Schafe等，J.Org.Chem.6524(2000)。

在一種示例性的實施方案中，修飾的糖基于6-氨基-N-乙?；?糖基部分。

在上述方案中，下標n表示1-2500的整數(shù)。在一種示例性的實施方案中，選擇該下標以使得聚合物分子量為約10KDa、15KDa或20KDa。符號“A”表示活化基團，例如鹵素、活化酯的組分(例如N-羥基琥珀酰亞胺酯)、碳酸酯的組分(例如對硝基苯基碳酸酯)等。本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到其他PEG-酰胺核苷酸糖容易由該方法和類似方法制成。

肽通常從新合成，或者在原核細胞(例如細菌細胞如大腸桿菌)或在真核細胞如哺乳動物、酵母、昆蟲、真菌或植物細胞中重組表達。肽可以是全長蛋白質(zhì)或片段。此外，肽可以是野生型或突變的肽。在一種示例性的實施方案中，肽包括向肽序列中加入一個或多個N-或O-連接的糖基化位點的突變。

本發(fā)明的方法還提供重組產(chǎn)生的不完全糖基化肽的修飾。許多重組產(chǎn)生的糖蛋白不完全糖基化，露出可能具有不期望的性質(zhì)例如免疫原性、被RES識別的碳水化合物殘基。在本發(fā)明方法中采用修飾的糖，可以使肽同時進一步糖基化和用例如水溶性聚合物、治療劑等衍生化。修飾的糖的糖部分可以是會適當?shù)嘏c完全糖基化肽中的接納體綴合的殘基或具有期望性質(zhì)的另一糖部分。

技術(shù)人員會意識到可以用來自任意來源的基本上任何的肽或糖肽來實踐本發(fā)明。可以用來實踐本發(fā)明的示例性的肽在WO03/031464以及其中所述的參考文獻中得到敘述。

通過本發(fā)明方法修飾的肽可以是合成的或野生型肽，或者它們可以是通過本領(lǐng)域已知的方法例如定點誘變產(chǎn)生的突變肽。肽的糖基化通常是N-連接的或O-連接的。示例性的N-連接為修飾的糖與天冬酰胺殘基的側(cè)鏈結(jié)合。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸為碳水化合物部分酶促結(jié)合至天冬酰胺側(cè)鏈上的識別序列，其中X為除脯氨酸以外的任何氨基酸。因此，這些三肽序列中的任一種在多肽中的存在產(chǎn)生潛在的糖基化位點。O-連接的糖基化是指一個糖(例如N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、甘露糖、GlcNAc、葡萄糖、巖藻糖或木糖)結(jié)合至羥基氨基酸的羥基側(cè)鏈上，該羥基氨基酸優(yōu)選絲氨酸或蘇氨酸，盡管也可以使用不常見或非天然的氨基酸例如5-羥基脯氨酸或5-羥基賴氨酸。

此外，除了肽以外，可以用其他生物結(jié)構(gòu)(例如含有糖基化位點的糖脂、脂質(zhì)、鞘氨基醇(sphingoid)、神經(jīng)酰胺、全細胞等)實踐本發(fā)明的方法。

通過改變氨基酸序列以使得它含有一個或多個糖基化位點來便利地實現(xiàn)向肽或其他結(jié)構(gòu)中加入糖基化位點。也可以通過在肽的序列中并入一個或多個提供-OH基團的物種，優(yōu)選絲氨酸或蘇氨酸殘基(用于O-連接的糖基化位點)來完成該添加?？梢酝ㄟ^肽的突變或完全化學合成來完成添加。優(yōu)選通過DNA水平的變化，特別是通過在預選的堿基處使編碼肽的DNA突變以至于產(chǎn)生將翻譯成期望的氨基酸的密碼子，來改變肽的氨基酸序列。優(yōu)選用本領(lǐng)域已知的方法進行DNA突變。

在一種示例性的實施方案中，通過改組(shuffling)多核苷酸加入糖基化位點?？梢杂肈NA改組實驗流程調(diào)控編碼候選肽的多核苷酸。DNA改組是遞歸重組和突變的方法，其通過隨機片段化相關(guān)基因庫接著由類似于聚合酶鏈式反應的方法重新組裝片段來進行。例如參見Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9110747-10751(1994)；Stemmer，Nature 370389-391(1994)；以及美國專利Nos.5,605,793、5,837,458、5,830,721和5,811,238。

可以用其實踐本發(fā)明的示例性的肽、加入或去除糖基化位點以及加入或去除糖基結(jié)構(gòu)或亞結(jié)構(gòu)的方法在WO 03/031464及相關(guān)的美國和PCT申請中得到詳細描述。

本發(fā)明還利用向肽中加入(或從中去除)一個或多個選定的糖基殘基，其后使修飾的糖與肽中至少一個選定的糖基殘基綴合。例如，當期望使修飾的糖與不存在于肽中或未以期望的量存在的選定糖基殘基綴合時，本實施方案是有用的。因此，在使修飾的糖與肽偶合之前，通過酶或化學偶合使選定的糖基殘基與肽綴合。在另一實施方案中，在修飾的糖綴合之前，通過從糖肽中去除碳水化合物殘基來改變糖肽的糖基化模式。例如參見WO 98/31826。

用化學或酶促方法實現(xiàn)糖肽上存在的任何碳水化合物部分的加入或去除。示例性的化學脫糖基化通過將多肽變體暴露于化合物三氟甲磺酸或等效化合物下來進行。該處理導致除連接性糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)外大部分或所有糖的切割，同時保留肽完整?；瘜W脫糖基化在以下文獻中有描述Hakimuddin等，Arch.Biochem.Biophys.25952(1987)和Edge等，Anal.Biochem.118131(1981)。多肽變體上的碳水化合物部分的酶促切割可以通過利用多種內(nèi)切糖苷酶或外切糖苷酶來實現(xiàn)，如同Thotakura等，Meth.Enzymol.138350(1987)所述的那樣。

在一種示例性的實施方案中，在肽上進行糖綴合或重構(gòu)步驟之前用神經(jīng)氨酸酶使肽基本上完全去唾液酸化。在糖綴合或重構(gòu)之后，任選地用唾液酸轉(zhuǎn)移酶使肽重新唾液酸化。在一種示例性的實施方案中，唾液?；蛹{體群體中的基本上每個(例如>80％，優(yōu)選大于85％、大于90％，優(yōu)選大于95％以及更優(yōu)選大于96％、97％、98％或99％)末端糖基接納體上發(fā)生重新唾液酸化。在優(yōu)選的實施方案中，糖具有基本上均一的唾液酸化模式(即基本上均一的糖基化模式)。

糖基部分的化學加入通過任何本領(lǐng)域公認的方法來進行。糖部分的酶促加入優(yōu)選采用本文所述方法的變型、用原始的糖基單元代替本發(fā)明中所用的修飾的糖來實現(xiàn)。加入糖部分的其他方法在美國專利No.5,876,980、6,030,815、5,728,554和5,922,577中得到公開。

示例性的用于選定糖基殘基的結(jié)合點包括但不限于(a)N-連接糖基化的共有位點和O-連接糖基化的位點；(b)作為糖基轉(zhuǎn)移酶接納體的末端糖基部分；(c)精氨酸、天冬酰胺和組氨酸；(d)游離羧基；(e)游離巰基，如半胱氨酸中的那些；(f)游離羥基，如絲氨酸、蘇氨酸或羥基脯氨酸中的那些；(g)芳族殘基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸中的那些；或(h)谷氨酰胺的酰胺基。可用于本發(fā)明的示例性方法在以下文獻中有描述1987年9月11日公布的WO87/05330以及Aplin和Wriston，CRC

.，第259-306頁(1981)。

在一種實施方案中，本發(fā)明提供通過連接基團連接兩個或更多個肽的方法。該連接基團具有任何有用的結(jié)構(gòu)而且可以選自直鏈和支鏈結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，結(jié)合至肽上的接頭的每個末端包含修飾的糖(即初生的完整的糖基連接基團)。

在示例性的本發(fā)明方法中，通過包含聚合物的接頭部分(例如PEG接頭)將兩個肽連接在一起。該構(gòu)造物符合上面圖中所述的通式結(jié)構(gòu)。如本文所述，本發(fā)明的構(gòu)造物包含兩個完整的糖基連接基團(即s+t＝1)。集中在包含兩個糖基基團的PEG接頭是為了清楚起見而且不應當解釋成限制可用于本發(fā)明該實施方案中的接頭臂的同一性。

因此，使PEG部分在第一末端用第一糖基單元以及在第二末端用第二糖基單元官能化。該第一和第二糖基單元優(yōu)選為不同轉(zhuǎn)移酶的底物，其分別容許第一和第二肽正交(orthogonal)結(jié)合至第一和第二糖基單元上。實際上，使(糖基)1-PEG-(糖基)2接頭與第一肽和第一糖基單元為其底物的第一轉(zhuǎn)移酶接觸，由此形成(肽)1-(糖基)1-PEG-(糖基)2。然后任選地從反應混合物中除去轉(zhuǎn)移酶和/或未反應的肽。向(肽)1-(糖基)1-PEG-(糖基)2綴合物中加入第二肽和第二糖基單元為其底物的第二轉(zhuǎn)移酶，形成(肽)1-(糖基)1-PEG-(糖基)2-(肽)2；至少一個糖基殘基是直接或間接地O-連接的。本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到以上概述的方法也可適用于例如通過利用支化PEG、枝狀物、聚氨基酸、多糖等而形成多于兩個肽之間的綴合物。

在一種示例性的實施方案中，由本發(fā)明方法修飾的肽為在哺乳動物細胞(例如CHO細胞)或在轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生并因而含有不完全唾液酸化的N-和/或O-連接寡糖鏈的糖肽。缺乏唾液酸并含有末端半乳糖殘基的糖肽的寡糖鏈可以被PEG化、PPG化或以其它方式用修飾的唾液酸進行修飾。

在方案1中，用受保護氨基酸(例如甘氨酸)衍生物的活性酯處理氨基糖苷1，將糖胺殘基轉(zhuǎn)化成相應的受保護氨基酸酰胺加合物。用醛縮酶處理該加合物以形成α-羥基羧酸鹽2。通過CMP-SA合成酶的作用將化合物2轉(zhuǎn)化成相應的CMP衍生物，接著催化氫化該CMP衍生物以產(chǎn)生化合物3。將經(jīng)由甘氨酸加合物的形成所引入的胺用作通過使化合物3與活化的PEG或PPG衍生物(例如PEG-C(O)NHS、PEG-OC(O)O-對-硝基苯基)反應而結(jié)合PEG的位點，分別產(chǎn)生諸如4或5的物種。
方案1
在一種示例性的實施方案中，可以使修飾的糖結(jié)合至因子VII/因子VIIa肽上的O-聚糖結(jié)合位點上?？梢杂糜谥苽湓撘蜃覸II/因子VIIa肽綴合物的糖基轉(zhuǎn)移酶包括對于Ser56(-Glc-(Xyl)n-Gal-SA-PEG-，半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和唾液酸轉(zhuǎn)移酶；對于Ser56-Glc-(Xyl)n-Xyl-PEG-，木糖基轉(zhuǎn)移酶；以及對于Ser60-Fuc-GlcNAc-(Gal)n-(SA)m-PEG-，GlcNAc轉(zhuǎn)移酶。
III.A.修飾的糖與肽的綴合
使PEG修飾的糖與糖基化的或未糖基化的肽綴合，其使用適當?shù)拿竵斫閷г摼Y合。優(yōu)選地，選擇修飾的供體糖、酶和接納體肽的濃度以使得進行糖基化直至將接納體耗盡為止。下面論述的考慮因素，雖然在唾液酸轉(zhuǎn)移酶的上下文中闡述，但是通?？蛇m用于其他糖基轉(zhuǎn)移酶反應?？捎糜诒景l(fā)明的優(yōu)選唾液酸轉(zhuǎn)移酶的列表在圖3中提供。

使用糖基轉(zhuǎn)移酶合成期望的寡糖結(jié)構(gòu)的許多方法是已知的而且通?？蛇m用于本發(fā)明。示例性的方法例如在以下文獻中有描述WO 96/32491、Ito等，PureAppl.Chem.65753(1993)、美國專利Nos.5,352,670、5,374,541、5,545,553以及共同擁有的美國專利Nos.6,399,336和6,440,703，以及共同擁有已公布PCT申請WO03/031464、WO 04/033651、WO 04/099231，其通過引用并入本文。

使用單一的糖基轉(zhuǎn)移酶或糖基轉(zhuǎn)移酶的組合來實踐本發(fā)明。例如，可以使用唾液酸轉(zhuǎn)移酶和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的組合。在使用多于一種酶的實施方案中，優(yōu)選在初始反應混合物中合并酶和底物，或者一旦第一酶促反應完成或接近完成時向反應介質(zhì)中加入第二酶促反應的酶和試劑。通過在單一容器中依次進行兩個酶促反應，總收率相對其中分離中間產(chǎn)物物種的方法得到提高。此外，減少了額外溶劑和副產(chǎn)物的清除及處理。

在一種優(yōu)選的實施方案中，第一和第二種酶各自是糖基轉(zhuǎn)移酶。在另一優(yōu)選的實施方案中，一種酶為內(nèi)切糖苷酶。在另外的優(yōu)選實施方案中，用多于兩種酶來裝配本發(fā)明的修飾的糖蛋白。在向肽中加入修飾的糖之前或之后任意時刻用酶來改變肽上的糖結(jié)構(gòu)。

在另一實施方案中，本方法使用一種或多種外切糖苷酶或內(nèi)切糖苷酶。糖苷酶通常是經(jīng)過設(shè)計以形成糖基鍵而非使它們斷裂的突變體。該突變體聚糖酶通常包括用氨基酸殘基代替活性位點酸性氨基酸殘基。例如，當內(nèi)切聚糖酶為endo-H時，取代的活性位點殘基通常會是130位置的Asp、132位置的Glu或其組合。該氨基酸一般由絲氨酸、丙氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺取代。

突變體酶通常經(jīng)由與內(nèi)切聚糖酶水解步驟的逆反應相似的合成步驟來催化反應。在這些實施方案中，糖基供體分子(例如期望的寡糖或單糖結(jié)構(gòu))含有離去基團，通過將供體分子加到蛋白質(zhì)的GlcNAc殘基上進行反應。例如，離去基團可以是鹵素例如氟化物。在另外的實施方案中，離去基團為Asn或Asn-肽部分。在其他實施方案中，糖基供體分子上的GlcNAc殘基被修飾。例如該GlcNAc殘基可以包含1，2噁唑啉部分。

在優(yōu)選的實施方案中，用于制備本發(fā)明綴合物的每一種酶以催化量存在。具體酶的催化量根據(jù)該酶底物的濃度以及反應條件例如溫度、時間和pH值而改變。在預選的底物濃度和反應條件下測定給定酶的催化量的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。

進行上述方法的溫度的范圍可以從剛好在冰點以上到最敏感的酶變性的溫度。優(yōu)選的溫度范圍是約0℃-約55℃，以及更優(yōu)選約20℃-約37℃。在另一示例性的實施方案中，使用嗜熱酶在升高的溫度下進行本發(fā)明方法的一個或多個部分。

將反應混合物保持足以使接納體糖基化的一段時間，從而形成期望的綴合物。一些綴合物往往可以在幾小時后檢測到，通常在24小時或更短時間內(nèi)得到可回收的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解反應速率取決于許多變量因素(例如酶濃度、供體濃度、接納體濃度、溫度、溶劑體積)，其對選定體系進行優(yōu)化。

本發(fā)明還提供修飾的肽的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。本文使用的工業(yè)規(guī)模一般產(chǎn)生至少1g純化的成品綴合物。

在下面的論述中，通過將修飾的唾液酸部分綴合至糖基化的肽上來舉例說明本發(fā)明。用PEG標記示例性的修飾的唾液酸。下面的論述集中在使用PEG-修飾的唾液酸和糖基化的肽是為了說明的清楚性，而且并非意圖暗示本發(fā)明限于這兩種配對體的綴合物。技術(shù)人員理解該論述一般可適用于加入除唾液酸以外的修飾的糖基部分。此外，該論述同樣可適用于以包含其他PEG部分、治療部分和生物分子的除PEG以外的試劑修飾糖基單元。

可以將酶促方法用于PEG化或PPG化的碳水化合物選擇性引入肽或糖肽上。該方法使用含PEG、PPG或受掩蔽的反應性官能團的修飾的糖，并與適當?shù)奶腔D(zhuǎn)移酶或糖合酶組合。通過選擇將會產(chǎn)生期望的碳水化合物鍵的糖基轉(zhuǎn)移酶以及使用修飾的糖作為供體底物，可以將PEG或PPG直接引入至肽主鏈上，引入至糖肽中現(xiàn)有的糖殘基上或者引入至已加到肽中的糖殘基上。

在一種示例性的實施方案中，唾液酸轉(zhuǎn)移酶的接納體作為天然存在的結(jié)構(gòu)存在于有待修飾的肽上或者它以重組、酶促或化學方式位于其上。合適的接納體例如包括半乳糖基接納體如Galβ1，4GlcNAc、Galβ1，4GalNAc、Galβ1，3GalNAc、乳-N-四糖、Galβ1，3GlcNAc、Galβ1，3Ara、Galβ1，6GlcNAc、Galβ1，4Glc(乳糖)以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他接納體(例如參見Paulson等，J.Biol.Chem.2535617-5624(1978))。示例性的唾液酸轉(zhuǎn)移酶為本文所述的。

在一種實施方案中，唾液酸轉(zhuǎn)移酶的接納體在糖肽的體內(nèi)合成后存在于有待修飾的糖肽上?？梢圆活A先修飾糖肽的糖基化模式而使用所要求保護的方法將這些糖肽唾液酸化。作為選擇，本發(fā)明的方法可以用于唾液酸化不含合適接納體的肽；首先通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法修飾該肽以含有接納體。在一種示例性的實施方案中，通過GalNAc轉(zhuǎn)移酶的作用加入GalNAc殘基。

在一種示例性的實施方案中，通過將半乳糖殘基結(jié)合至與肽相連的適當接納體例如GlcNAc來裝配半乳糖基接納體。該方法包括將有待修飾的肽與含適當量的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(例如Galβ1，3或Galβ1，4)和適當?shù)陌肴樘腔w(例如UDP-半乳糖)的反應混合物孵育。使反應基本進行至完成或者作為選擇在加入預選量的半乳糖殘基時中止該反應。裝配選定的糖接納體的其他方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員會是顯而易見的。

在另一實施方案中，首先整體或部分“修剪”糖肽連接的寡糖，以暴露出唾液酸轉(zhuǎn)移酶接納體或可以加入一個或多個適當?shù)臍埢缘玫胶线m接納體的部分。諸如糖基轉(zhuǎn)移酶和內(nèi)切糖苷酶等的酶(例如參見美國專利No.5,716,812)可用于結(jié)合和修剪反應。在該方法的另一實施方案中，基本上完全除去肽的唾液酸部分(例如至少90、至少95或至少99％)，暴露出修飾的唾液酸的接納體。

在下面的論述中，通過利用具有與其結(jié)合的PEG部分的修飾的糖來舉例說明本發(fā)明的方法。論述的集中是為了說明的清楚性。技術(shù)人員會意識到該論述同樣與其中修飾的糖帶有治療部分、生物分子等的那些實施方案有關(guān)。

在其中加入修飾的糖之前“修剪”碳水化合物殘基的本發(fā)明示例性實施方案中，將高級甘露糖剪回至第一代雙天線式結(jié)構(gòu)。將帶有PEG部分的修飾的糖與通過“剪回”暴露出的一個或多個糖殘基綴合。在一個實例中，通過與PEG部分綴合的GlcNAc部分加入PEG部分。該修飾的GlcNAc結(jié)合至雙天線式結(jié)構(gòu)的末端甘露糖殘基之一或兩者上。作為選擇，未修飾的GlcNAc可以加入至該支化物種的末端之一或兩者上。

在另一示例性的實施方案中，通過具有半乳糖殘基的修飾的糖將PEG部分加至雙天線式結(jié)構(gòu)的末端甘露糖殘基之一或兩者上，該修飾的糖與加至末端甘露糖殘基上的GlcNac殘基綴合。作為選擇，未修飾的Gal可以加至一個或兩個末端GlcNAc殘基上。

在又一實例中，PEG部分用修飾的唾液酸例如上述那些加至Gal殘基上。

在另一示例性的實施方案中，將高級甘露糖結(jié)構(gòu)“剪回”至雙天線式結(jié)構(gòu)從中分支的甘露糖。在一個實例中，通過用聚合物修飾的GlcNAc加入PEG部分。作為選擇，將未修飾的GlcNAc加至甘露糖，接著加入結(jié)合了PEG部分的Gal。在另一實施方案中，將未修飾的GlcNAc和Gal殘基順序加至甘露糖，接著加入用PEG部分修飾的唾液酸部分。

也可以將高級甘露糖結(jié)構(gòu)剪回至基本的三甘露糖基核心。

在另一示例性的實施方案中，將高級甘露糖“剪回”至結(jié)合有第一個甘露糖的GlcNAc。使GlcNAc與帶有PEG部分的Gal殘基綴合。作為選擇，將未修飾的Gal加至GlcNAc，接著加入用水溶性糖修飾的唾液酸。在另一實例中，末端GlcNAc與Gal綴合，隨后用帶有PEG部分的修飾的巖藻糖將GlcNAc藻糖化。

還可以將高級甘露糖剪回至與肽的Asn結(jié)合的第一個GlcNAc。在一個實例中，GlcNAc-(Fuc)a殘基的GlcNAc與帶有水溶性聚合物的GlcNAc綴合。在另一實例中，用帶有水溶性聚合物的Gal修飾GlcNAc-(Fuc)a的GlcNAc。在另一實施方案中，用Gal修飾GlcNAc，接著與用PEG部分修飾的唾液酸的Gal綴合。

另外的示例性實施方案在以下文獻中被闡述共同擁有的美國專利申請公開文本20040132640、20040063911、20040137557；美國專利申請Nos10/369,979、10/410,913、10/360,770、10/410,945和PCT/US02/32263，其各自引用并入本文。

上述實例提供對本文所述方法的能力的說明。使用本文所述的方法，可以“剪回”和建立基本上任何期望結(jié)構(gòu)的碳水化合物殘基。修飾的糖可以如上所述加至碳水化合物部分的末端，或者它可以是肽核心和碳水化合物末端之間的中間物。

在一種示例性的實施方案中，用唾液酸酶從糖肽中除去存在的唾液酸，從而暴露出全部或大部分的下面的半乳糖殘基。作為選擇，用半乳糖殘基或者末端為半乳糖單元的寡糖殘基標記肽或糖肽。暴露或加入半乳糖殘基之后，使用適當?shù)耐僖核徂D(zhuǎn)移酶加入修飾的唾液酸。

在另一示例性的實施方案中，采用將唾液酸轉(zhuǎn)移至唾液酸上的酶?？梢圆挥猛僖核崦柑幚硗僖核峄木厶且员┞冻鐾僖核嵯碌木厶菤埢鴮嵤┰摲椒?。示例性的聚合物修飾的唾液酸為用聚乙二醇修飾的唾液酸。將唾液酸和修飾的唾液酸部分加至包含唾液酸殘基的聚糖上或者將聚糖上現(xiàn)有的唾液酸殘基換成這些物種的其他示例性的酶包括ST3Gal3、CST-II、ST8Sia-II、ST8Sia-III和ST8Sia-IV。

在另一種方法中，受掩蔽的反應性官能度存在于唾液酸上。該受掩蔽的反應性基團優(yōu)選未受用于將修飾的唾液酸結(jié)合至因子VII/因子VIIa肽的條件影響。在將修飾的唾液酸共價結(jié)合于肽之后，除去掩蔽并使肽與試劑例如PEG綴合。該試劑通過其與修飾的糖殘基的未掩蔽的反應性基團的反應以特異性方式與肽綴合。

根據(jù)糖肽寡糖側(cè)鏈的末端糖，任何修飾的糖可以與其適當?shù)奶腔D(zhuǎn)移酶一起使用。如上所述，引入PEG化結(jié)構(gòu)所需的糖肽末端糖可以在表達過程中天然引入，或者它可以在表達后用適當?shù)奶擒彰?、糖基轉(zhuǎn)移酶或糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的混合物來制成。

在另一示例性的實施方案中，使UDP-半乳糖-PEG與β1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶反應，從而將修飾的半乳糖轉(zhuǎn)移至適當?shù)哪┒薔-乙酰葡糖胺結(jié)構(gòu)上。糖肽的末端GlcNAc殘基可以在表達過程中產(chǎn)生，如在諸如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌等的表達體系中可以發(fā)生的那樣，也可以根據(jù)需要通過用唾液酸酶和/或糖苷酶和/或糖基轉(zhuǎn)移酶處理糖肽而產(chǎn)生。

在另一示例性的實施方案中，將GlcNAc轉(zhuǎn)移酶例如GNT1-5用于使PEG化的GlcNAc轉(zhuǎn)移至糖肽的末端甘露糖殘基上。在另一示例性的實施方案中，從糖肽中酶促去除N-和/或O-連接的聚糖結(jié)構(gòu)以暴露出隨后與修飾的糖綴合的氨基酸或末端糖基殘基。例如，使用內(nèi)切糖苷酶去除糖肽的N-連接結(jié)構(gòu)以暴露出糖肽上作為GlcNAc-連接-Asn的末端GlcNAc。將UDP-Gal-PEG和適當?shù)陌肴樘腔D(zhuǎn)移酶用于在暴露出的GlcNAc上引入PEG-半乳糖官能度。

在一種可供選擇的實施方案中，使用已知將糖殘基轉(zhuǎn)移至肽主鏈上的糖基轉(zhuǎn)移酶直接將修飾的糖加至肽主鏈上?？捎糜趯嵺`本發(fā)明的示例性的糖基轉(zhuǎn)移酶包括但不限于GalNAc轉(zhuǎn)移酶(GalNAcT1-14)、GlcNAc轉(zhuǎn)移酶、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、木糖基轉(zhuǎn)移酶、甘露糖基轉(zhuǎn)移酶等。使用該方法容許將修飾的糖直接加到缺少任何碳水化合物的肽上或者作為選擇地加到原有的糖肽上。在這兩種情況下，修飾的糖的加入在由糖基轉(zhuǎn)移酶的底物特異性所限定的肽主鏈的特定位置上發(fā)生，而且不是如同使用化學方法修飾蛋白質(zhì)肽主鏈過程中出現(xiàn)的那樣以隨機方式發(fā)生。可以通過將適當?shù)陌被嵝蛄性O(shè)計到多肽鏈中而將一系列試劑引入缺少糖基轉(zhuǎn)移酶底物肽序列的蛋白質(zhì)或糖肽中。

在上述各個示例性的實施方案中，在修飾的糖與肽綴合后，可以采用一個或多個額外的化學或酶促修飾步驟。在示例性的實施方案中，使用酶(例如巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)將糖基單元(例如巖藻糖)附加到與肽結(jié)合的末端修飾的糖上。在另一實例中，使用酶促反應來使修飾的糖未能綴合的位點“加帽”。作為選擇，使用化學反應來改變所綴合的修飾的糖的結(jié)構(gòu)。例如，使所綴合的修飾的糖與試劑反應，該試劑使修飾的糖與它所結(jié)合的肽組分之間的鍵穩(wěn)定化或去穩(wěn)定化。在另一實例中，在其與肽綴合后使修飾的糖的組分去保護。技術(shù)人員會意識到在修飾的糖與肽綴合之后的階段中，存在可用于本發(fā)明方法的一系列酶促和化學過程。修飾的糖-肽綴合物的進一步加工在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

用于制備本發(fā)明綴合物的酶和反應條件在本申請的母體(parent)以及共有的已公布PCT專利申請WO 03/031464、WO04/033651、WO 04/099231中得到詳細論述。

在選定的實施方案中，重構(gòu)在昆蟲細胞中表達的因子VII/因子VIIa肽以使得經(jīng)過重構(gòu)的糖肽上的聚糖包含GlcNAc-Gal糖基殘基。GlcNAc和Gal的加入可以作為分開的反應或者在單一容器中作為單一反應進行。在該實例中，使用GlcNAc-轉(zhuǎn)移酶I和Gal-轉(zhuǎn)移酶I。用ST3Gal-III加入修飾的唾液?；糠帧?br>
在另一實施方案中，GlcNAc、Gal和修飾的Sia的加入也可以在單一反應容器中用上述酶進行。酶促重構(gòu)和糖基聚乙二醇化步驟各自單獨地進行。

當在哺乳動物細胞中表達肽時，可用不同的方法。在一種實施方案中，通過使肽與唾液酸轉(zhuǎn)移酶接觸，該唾液酸轉(zhuǎn)移酶將修飾的唾液酸直接轉(zhuǎn)移至肽的唾液酸上形成Sia-Sia-L-R1，或者將肽上的唾液酸換成修飾的唾液酸形成Sia-L-R1，在綴合之前無需重構(gòu)而使肽綴合。可用于該方法的示例性的酶為CST-II。將唾液酸加至唾液酸上的其他酶為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知而且這些酶的實例在附圖中得到闡述。

在制備本發(fā)明綴合物的又一方法中，在哺乳動物體系中表達的肽用唾液酸酶去唾液酸化。用對O-連接的聚糖特異性的唾液酸轉(zhuǎn)移酶以修飾的唾液酸使露出的Gal殘基唾液酸化，提供具有O-連接修飾聚糖的因子VII/因子VIIa肽。經(jīng)過去唾液酸化的修飾的因子VII/因子VIIa肽任選地通過使用唾液酸轉(zhuǎn)移酶例如ST3GalIII部分或完全地重新唾液酸化。

在另一方面中，本發(fā)明提供制備本發(fā)明的PEG化因子VII/因子VIIa肽綴合物的方法。該方法包括(a)使包含選自以下的糖基基團的因子VII/因子VIIa肽

和
與具有選自以下的式的PEG-唾液酸供體


和
以及將PEG-唾液酸從所述供體轉(zhuǎn)移至選自所述糖基基團的GalNAc、Gal和Sia中的成員上的酶，在適合于所述轉(zhuǎn)移的條件下接觸。示例性的修飾的唾液酸供體為通過接頭部分用聚合物例如直鏈或支化的聚乙二醇部分修飾的CMP-唾液酸。如本文所述，肽在結(jié)合修飾的糖之前任選地用GalNAc和/或Gal和/或Sia糖基化(“重構(gòu)”)。重構(gòu)步驟可以在同一容器中依次進行而在步驟間沒有糖基化肽的純化。作為選擇，在一個或多個重構(gòu)步驟之后，可以在使糖基化的肽進行下一個糖基化或糖基聚乙二醇化步驟之前將它純化。在一種示例性的實施方案中，該方法進一步包括在宿主中表達肽。在一種示例性的實施方案中，該宿主為哺乳動物細胞或昆蟲細胞。在另一示例性的實施方案中，該哺乳動物細胞選自BHK細胞和CHO細胞以及該昆蟲細胞為草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞。

如同在實施例中舉例說明以及下面進一步論述的那樣，PEG-糖的接納體部分的布置以任意期望數(shù)目的步驟來完成。例如，在一種實施方案中，在GalNAc加至肽上以后，可以在同一反應容器中進行使PEG-糖與GalNAc綴合的第二步。作為選擇，這兩個步驟可以在單一容器中近似同時地進行。

在一種示例性的實施方案中，PEG-唾液酸供體具有下式


在另一示例性實施方案中，PEG-唾液酸供體具有下式

在另一示例性實施方案中，因子VII/因子VIIa肽在進行糖基聚乙二醇化或重構(gòu)之前在適當?shù)谋磉_體系中表達。示例性的表達體系包括Sf-9/桿狀病毒和中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。

在一種示例性的實施方案中，本發(fā)明提供制備包含糖基接頭的因子VII/因子VIIa肽綴合物的方法，該接頭包含具有下式的修飾的唾液酰基殘基
其中D選自-OH和R1-L-HN-；G選自R1-L-和-C(O)(C1-C6)烴基-R1；R1是包含選自直鏈聚乙二醇殘基和支化聚乙二醇殘基中的成員的部分；M選自H、金屬和單個負電荷；L是選自鍵、取代的或未取代的烴基和取代的或未取代的雜烴基的接頭，以至于當D為OH時，G為R1-L-，以及當G為-C(O)(C1-C6)烴基時，D為R1-L-NH- 所述方法包括(a)使包含糖基部分的因子VII/因子VIIa肽
與具有下式的PEG-唾液酸供體
和將所述PEG-唾液酸轉(zhuǎn)移至所述糖基部分的Gal上的酶，在適合于所述轉(zhuǎn)移的條件下接觸。

在一種示例性的實施方案中，L-R1具有下式
其中a為選自0-20的整數(shù)。

在另一示例性的實施方案中，R1具有選自以下的式的結(jié)構(gòu)


和
其中e、f、m和n為獨立地選自1-2500的整數(shù)；以及q為選自0-20的整數(shù)。

可以通過本文所述的方法制備大規(guī)模或小規(guī)模量的因子VII/因子VIIa肽綴合物。在一種示例性的實施方案中，因子VII/因子VIIa肽的量選自約0.5mg-約100kg。在一種示例性的實施方案中，因子VII/因子VIIa肽的量選自約0.1kg-約1kg。在一種示例性的實施方案中，因子VII/因子VIIa肽的量選自約0.5kg-約10kg。在一種示例性的實施方案中，因子VII/因子VIIa肽的量選自約0.5kg-約3kg。在一種示例性的實施方案中，因子VII/因子VIIa肽的量選自約0.1kg-約5kg。在一種示例性的實施方案中因子VII/因子VIIa肽的量選自約0.08kg-約0.2kg。在一種示例性的實施方案中，因子VII/因子VIIa肽的量選自約0.05kg-約0.4kg。在一種示例性的實施方案中，因子VII/因子VIIa肽的量選自約0.1kg-約0.7kg。在一種示例性的實施方案中，因子VII/因子VIIa肽的量選自約0.3kg-約1.75kg。在一種示例性的實施方案中，因子VII/因子VIIa肽的量選自約25kg-約65kg。

用于本文所述反應中的因子VII/因子VIIa肽的濃度選自約0.5-約10mg因子VII/因子VIIa肽/mL反應混合物。在一種示例性的實施方案中，因子VII/因子VIIa肽濃度選自約0.5-約1mg因子VII/因子VIIa肽/mL反應混合物。在一種示例性的實施方案中，因子VII/因子VIIa肽濃度選自約0.8-約3mg因子VII/因子VIIa肽/mL反應混合物。在一種示例性的實施方案中，因子VII/因子VIIa肽濃度選自約2-約6mg因子VII/因子VIIa肽/mL反應混合物。在一種示例性的實施方案中，因子VII/因子VIIa肽濃度選自約4-約9mg因子VII/因子VIIa肽/mL反應混合物。在一種示例性的實施方案中，因子VII/因子VIIa肽濃度選自約1.2-約7.8mg因子VII/因子VIIa肽/mL反應混合物。在一種示例性的實施方案中，因子VII/因子VIIa肽濃度選自約6-約9.5mg因子VII/因子VIIa肽/mL反應混合物。

可以用于本文所述反應中的CMP-SA-PEG的濃度選自約0.1-約1.0mM?？梢蕴岣呋蚪档驮摑舛鹊囊蛩匕≒EG的尺寸、孵育時間、溫度、緩沖組分以及所用糖基轉(zhuǎn)移酶的種類和濃度。一種示例性的實施方案中，CMP-SA-PEG濃度選自約0.1-約1.0mM。在一種示例性的實施方案中，CMP-SA-PEG濃度選自約0.1-約0.5mM。在一種示例性的實施方案中，CMP-SA-PEG濃度選自約0.1-約0.3mM。在一種示例性的實施方案中，CMP-SA-PEG濃度選自約0.2-約0.7mM。在一種示例性的實施方案中，CMP-SA-PEG濃度選自約0.3-約0.5mM。在一種示例性的實施方案中，CMP-SA-PEG濃度選自約0.4-約1.0mM。在一種示例性的實施方案中，CMP-SA-PEG濃度選自約0.5-約0.7mM。在一種示例性的實施方案中，CMP-SA-PEG濃度選自約0.8-約0.95mM。在一種示例性的實施方案中，CMP-SA-PEG濃度選自約0.55-約1.0mM。

可以用于本文所述反應中的CMP-SA-PEG的摩爾當量基于可以加至因子VII/因子VIIa蛋白上的SA-PEGs的理論數(shù)量。當與CMP-SA-PEG的MW和由此其摩爾數(shù)比較時，該SA-PEGs的理論數(shù)量基于因子VII/因子VIIa蛋白上的唾液酸化位點的理論數(shù)量以及因子VII/因子VIIa蛋白的MW。對于因子VII/因子VIIa，以僅有兩個聚糖位點的主要是二-和三-天線式的N-聚糖計，其為約4或5個PEGs。在一種示例性的實施方案中，CMP-SA-PEG的摩爾當量為選自1-20的整數(shù)。在一種示例性的實施方案中，CMP-SA-PEG的摩爾當量為選自1-20的整數(shù)。在一種示例性的實施方案中，CMP-SA-PEG的摩爾當量為選自2-6的整數(shù)。在一種示例性的實施方案中，CMP-SA-PEG的摩爾當量為選自3-17的整數(shù)。在一種示例性的實施方案中，CMP-SA-PEG的摩爾當量為選自4-11的整數(shù)。在一種示例性的實施方案中，CMP-SA-PEG的摩爾當量為選自5-20的整數(shù)。在一種示例性的實施方案中，CMP-SA-PEG的摩爾當量為選自1-10的整數(shù)。在一種示例性的實施方案中，CMP-SA-PEG的摩爾當量為選自12-20的整數(shù)。在一種示例性的實施方案中，CMP-SA-PEG的摩爾當量為選自14-17的整數(shù)。在一種示例性的實施方案中，CMP-SA-PEG的摩爾當量為選自7-15的整數(shù)。在一種示例性的實施方案中，CMP-SA-PEG的摩爾當量為選自8-16的整數(shù)。
III.B.因子VII/因子VIIa的同時去唾液酸化和糖基聚乙二醇化
本發(fā)明提供將因子VII/因子VIIa糖基聚乙二醇化的“一鍋”式方法。該一鍋法與制備因子VII/因子VIIa肽綴合物的其他示例性方法不同，它們采取用唾液酸酶順序去唾液酸化，隨后在陰離子交換柱上純化去唾液酸因子VII/因子VIIa，接著用CMP-唾液酸-PEG和糖基轉(zhuǎn)移酶(例如ST3Gal3)、外切糖苷酶或內(nèi)切糖苷酶糖基聚乙二醇化。該因子VII/因子VIIa肽綴合物然后通過陰離子交換接著以尺寸排阻色譜法進行純化以制備純化過的因子VII/因子VIIa肽綴合物。

該一鍋法是制造因子VII/因子VIIa肽綴合物的改進方法。在該方法中，將去唾液酸化和糖基聚乙二醇化反應合并在一鍋反應中，其避免在前面所述的方法中用于純化去唾液酸因子VII/因子VIIa肽的第一陰離子交換色譜法步驟。這種工藝步驟的減少產(chǎn)生了若干優(yōu)點。首先，減少了制備因子VII/因子VIIa肽綴合物所需的工藝步驟數(shù)目，這也降低了工藝的操作復雜性。其次，減少用于制備肽綴合物的工藝時間，例如從4天減少到2天。這使與工序間控制相關(guān)的原料要求和質(zhì)量控制成本降低。第三，本發(fā)明使用較少的唾液酸酶，例如相對于該過程需要直至少20倍的唾液酸酶，例如500mU/L來制備因子VII/因子VIIa肽綴合物。這種唾液酸酶用量上的減少使反應混合物中的污染物如唾液酸酶的量顯著減少。

在一種示例性的實施方案中，由以下方法制備因子VII/因子VIIa肽綴合物。在第一步中，將因子VII/因子VIIa肽與唾液酸酶、本發(fā)明的修飾的糖以及能夠催化糖基連接基團從修飾的糖轉(zhuǎn)移至肽的酶合并，從而制備因子VII/因子VIIa肽綴合物。任何唾液酸酶可以用于該方法中。可用于本發(fā)明的示例性的唾液酸酶可以在CAZY數(shù)據(jù)庫中找到(參見http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/index.html和www.cazy.org/CAZY)。示例性的唾液酸酶可以從許多來源(QA-Bio、Calbiochem、Marukin、Prozyme等)購買到。在一種示例性的實施方案中，唾液酸酶選自細胞質(zhì)唾液酸酶、溶酶體唾液酸酶、外切-α唾液酸酶和內(nèi)切唾液酸酶。在另一示例性的實施方案中，所用唾液酸酶由細菌例如產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)或肺炎雙球菌(Streptococcus pneumoniae)或者由病毒例如腺病毒制成。在一種示例性的實施方案中，能夠催化糖基連接基團從修飾的糖轉(zhuǎn)移至肽的酶選自糖基轉(zhuǎn)移酶，例如唾液酸轉(zhuǎn)移酶和巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，以及外切糖苷酶和內(nèi)切糖苷酶。在一種示例性的實施方案中，該酶為糖基轉(zhuǎn)移酶，它是ST3Gal3。在另一示例性的實施方案中，所用的酶由細菌例如大腸桿菌或真菌例如黑曲霉(Aspergillus niger)制成。在另一示例性的實施方案中，將唾液酸酶在糖基轉(zhuǎn)移酶之前加入到因子VII/因子VIIa肽中持續(xù)一段規(guī)定時間，使唾液酸酶反應進行，然后在加入PEG-唾液酸試劑和糖基轉(zhuǎn)移酶下開始糖基聚乙二醇化反應。許多的這些實例在本文中得到論述。最后，本文所述的任何修飾的糖可以用于該反應。

在另一示例性的實施方案中，該方法進一步包括“加帽”步驟。在該步驟中，向反應混合物中加入另外的未PEG化的唾液酸。在一種示例性的實施方案中，將該唾液酸加至因子VII/因子VIIa肽或肽綴合物上，從而阻止PEG-唾液酸的進一步加成。在另一示例性的實施方案中，該唾液酸阻止反應混合物中糖基轉(zhuǎn)移酶的功能，有效中止糖基連接基團加至因子VII/因子VIIa肽或肽綴合物上。最重要地，加入到反應混合物中的唾液酸使未糖基聚乙二醇化的聚糖加帽，由此提供具有改善的藥物動力學的因子VII/因子VIIa肽綴合物。另外，當期望PEG化的程度至一定量時可以不經(jīng)在先純化將該唾液酸酶直接加入到糖基聚乙二醇化反應混合物中。

在一種示例性的實施方案中，加帽步驟之后，因子VII/因子VIIa肽或肽綴合物上少于約50％的唾液酸化位點不含唾液酰部分。在一種示例性的實施方案中，加帽步驟之后，因子VII/因子VIIa肽或肽綴合物上少于約40％的唾液酸化位點不含唾液酰部分。在一種示例性的實施方案中，加帽步驟之后，因子VII/因子VIIa肽或肽綴合物上少于約30％的唾液酸化位點不含唾液酰部分。在一種示例性的實施方案中，加帽步驟之后，因子VII/因子VIIa肽或肽綴合物上少于約20％的唾液酸化位點不含唾液酰部分。在一種示例性的實施方案中，加帽步驟之后，因子VII/因子VIIa肽或肽綴合物上少于約10％的唾液酸化位點不含唾液酰部分。在一種示例性的實施方案中，因子VII/因子VIIa肽或肽綴合物上約20％-約5％的唾液酸化位點不含唾液酰部分。在一種示例性的實施方案中，因子VII/因子VIIa肽或肽綴合物上少于約25％-約10％的唾液酸化位點不含唾液酰部分。在一種示例性的實施方案中，加帽步驟之后，因子VII/因子VIIa肽或肽綴合物上基本上所有的唾液酸化位點包含唾液酰部分。
III.C.因子VII/因子VIIa肽的去唾液酸化和選擇性修飾
在另一示例性的實施方案中，本發(fā)明提供使因子VII/因子VIIa肽去唾液酸化的方法。該方法優(yōu)選提供至少約40％、優(yōu)選45％、優(yōu)選約50％、優(yōu)選約55％、優(yōu)選約60％、優(yōu)選約65％、優(yōu)選約70％、優(yōu)選約75％、優(yōu)選約80％、優(yōu)選至少85％、更優(yōu)選至少90％、再更優(yōu)選至少92％、優(yōu)選至少94％、甚至更優(yōu)選至少96％、再更優(yōu)選至少98％以及再更優(yōu)選100％去唾液酸化的因子VII/因子VIIa肽。

該方法包括使因子VII/因子VIIa肽與唾液酸酶接觸，優(yōu)選接觸一段時間。該預先選定的時間期間足以使因子VII/因子VIIa肽去唾液酸化至期望的程度。在優(yōu)選的實施方案中，當達到期望的去唾液酸化程度時，將去唾液酸化的因子VII/因子VIIa肽與唾液酸酶分離。示例性的去唾液酸化反應和純化循環(huán)描述于本文中。

技術(shù)人員能夠確定進行去唾液酸化反應的適當?shù)念A選時間期間。在一種示例性的實施方案中，該期間少于24小時，優(yōu)選少于8小時，更優(yōu)選少于6小時，更優(yōu)選少于4小時，再更優(yōu)選少于2小時以及甚至更優(yōu)選少于1小時。

在另一示例性的實施方案中，在去唾液酸化反應結(jié)束時在因子VII/因子VIIa制備物中，因子VII/因子VIIa肽群體中至少10％的成員僅有一個與其結(jié)合的唾液酸，優(yōu)選至少20％、更優(yōu)選至少30％、再更優(yōu)選至少40％、甚至更優(yōu)選至少50％和更優(yōu)選至少60％、以及再更優(yōu)選全部去唾液酸化。

在又一示例性的實施方案中，在去唾液酸化反應結(jié)束時在因子VII/因子VIIa制備物中，因子VII/因子VIIa肽群體中至少10％的成員徹底去唾液酸化，優(yōu)選至少20％、更優(yōu)選至少30％、甚至更優(yōu)選至少40％、再更優(yōu)選至少50％和甚至再更優(yōu)選至少60％徹底去唾液酸化。

在另一示例性的實施方案中，在去唾液酸化反應結(jié)束時在因子VII/因子VIIa制備物中，因子VII/因子VIIa肽群體中至少10％、20％、30％、40％、50％或60％的成員僅有一個唾液酸，以及至少10％、20％、30％、40％、50％或60％的因子VII/因子VIIa肽徹底去唾液酸化。

在一種優(yōu)選的實施方案中，在去唾液酸化反應結(jié)束時在因子VII/因子VIIa制備物中，因子VII/因子VIIa肽群體中至少50％徹底去唾液酸化以及因子VII/因子VIIa肽群體中至少40％的成員僅帶有一個唾液酸部分。

在去唾液酸化之后，因子VII/因子VIIa肽任選地與修飾的糖綴合。示例性的修飾的糖包含與支化或線性聚乙二醇部分結(jié)合的糖基部分。由將修飾的糖從修飾的糖供體轉(zhuǎn)移至因子VII/因子VIIa肽的氨基酸或糖基殘基上的酶來催化該綴合。示例性的修飾的糖供體為帶有支化或線性聚乙二醇部分的CMP-唾液酸。示例性的聚乙二醇部分的分子量為至少約2KDa，更優(yōu)選至少約5KDa，更優(yōu)選至少約10KDa，優(yōu)選至少約20KDa，更優(yōu)選至少約30KDa以及更優(yōu)選至少約40KDa。

在一種示例性的實施方案中，用于從修飾的糖供體中轉(zhuǎn)移修飾的糖部分的酶為糖基轉(zhuǎn)移酶，例如唾液酸轉(zhuǎn)移酶?？捎糜诒景l(fā)明方法的示例性的唾液酸轉(zhuǎn)移酶為ST3Gal3。

示例性的本發(fā)明方法產(chǎn)生帶有至少一個、優(yōu)選至少兩個、優(yōu)選至少三個修飾基團的修飾的因子VII/因子VIIa肽。在一種實施方案中，制成的因子VII/因子VIIa肽在該因子VII/因子VIIa肽的輕鏈上帶有一個修飾基團。在另一實施方案中，該方法提供在重鏈上帶有一個修飾基團的修飾的因子VII/因子VIIa肽。在又一實施方案中，該方法提供在輕鏈上具有一個修飾基團而且在重鏈上具有一個修飾基團的修飾的因子VII/因子VIIa肽。

在另一方面中，本發(fā)明提供制備修飾的因子VII/因子VIIa肽的方法。該方法包括使因子VII/因子VIIa肽與帶有修飾基團的修飾的糖供體和能夠?qū)⑿揎椀奶遣糠謴男揎椀奶枪w轉(zhuǎn)移至肽的氨基酸或糖基殘基上的酶接觸。

在一種示例性的實施方案中，該方法提供修飾的因子VII/因子VIIa肽群體，其中至少40％、優(yōu)選至少50％、優(yōu)選至少60％、更優(yōu)選至少70％和甚至更優(yōu)選至少80％的群體成員為在該因子VII/因子VIIa肽的輕鏈上單綴合的。

在一種示例性的實施方案中，該方法提供修飾的因子VII/因子VIIa肽群體，其中至少40％、優(yōu)選至少50％、優(yōu)選至少60％、更優(yōu)選至少70％和甚至更優(yōu)選至少80％的群體成員為在該因子VII/因子VIIa肽的輕鏈上二綴合的。

在該方面的一種示例性實施方案中，該方法提供修飾的因子VII/因子VIIa肽群體，其中不大于50％、優(yōu)選不大于30％、優(yōu)選不大于20％、更優(yōu)選不大于10％的群體成員為在該因子VII/因子VIIa肽的重鏈上單綴合的。

在該方面的一種示例性實施方案中，該方法提供修飾的因子VII/因子VIIa肽群體，其中不大于50％、優(yōu)選不大于30％、優(yōu)選不大于20％、更優(yōu)選不大于10％的群體成員為在該因子VII/因子VIIa肽的重鏈上二綴合的。

可以使因子VII/因子VIIa肽在該接觸步驟之前受到唾液酸酶的作用，或者該肽可以不經(jīng)在先去唾液酸化而使用。當肽與唾液酸酶接觸時，可以使它基本上全部去唾液酸化或者僅部分去唾液酸化。在優(yōu)選的實施方案中，在接觸步驟之前使因子VII/因子VIIa肽至少部分地去唾液酸化。因子VII/因子VIIa肽可以是基本上徹底去唾液酸化的(基本上脫唾液酸的)或只是部分去唾液酸化。在優(yōu)選的實施方案中，去唾液酸化的因子VII/因子VIIa肽是上文所述的去唾液酸化的實施方案之一。
III.D.因子VII/因子VIIa肽綴合物合成中加入的額外等分試樣的試劑
在本文所述肽綴合物合成的一種示例性實施方案中，在選定的時間期間后向反應混合物中加入一種或多種額外等分試樣的反應組分/試劑。在一種示例性的實施方案中，該肽綴合物為因子VII/因子VIIa肽綴合物。在另一示例性的實施方案中，加入的反應組分/試劑為修飾的糖核苷酸。向反應中引入修飾的糖核苷酸會提高促使糖基聚乙二醇化反應完全的可能性。在一種示例性的實施方案中，該核苷酸糖為本文所述的CMP-SA-PEG。在一種示例性的實施方案中，加入的反應組分/試劑為唾液酸酶。在一種示例性的實施方案中，加入的反應組分/試劑為糖基轉(zhuǎn)移酶。在一種示例性的實施方案中，加入的反應組分/試劑為鎂。在一種示例性的實施方案中，加入的額外等分試樣占反應開始時加入的原始量的約10％、或20％、或30％、或40％、或50％、或60％、或70％、或80％或90％。在一種示例性的實施方案中，在反應開始后約3小時、或6小時、或8小時、或10小時、或12小時、或18小時、或24小時、或30小時或36小時向其中加入該反應組分/試劑。
III.E.輕鏈PEG化的因子VII/因子VIIa肽綴合物的選擇性制備
在一種示例性的實施方案中，本發(fā)明提供增加制備在輕鏈上修飾的因子VIIa肽綴合物的方法，相對于在重鏈上修飾的綴合物。該方法包括重鏈的鈍化或螯合，從而使糖基聚乙二醇化優(yōu)先在輕鏈上發(fā)生。因子VIIa重鏈的絲氨酸蛋白酶活性可以用作該螯合的基礎(chǔ)。向糖基聚乙二醇化反應混合物中加入芐脒基質(zhì)和/或絲氨酸蛋白酶的假親和性(pseudoaffinity)樹脂引起重鏈的螯合，而糖基聚乙二醇化在輕鏈上進行。然后可以由本領(lǐng)域已知的標準技術(shù)從重鏈中純化出輕鏈?？梢酝ㄟ^加入芐脒從基質(zhì)中除去重鏈，或者通過降低溶液的pH從樹脂中除去重鏈。在該步驟中引入的芐脒雜質(zhì)可以通過滲濾除去。
III.E.因子VII/因子VIIa肽綴合物的純化
通過上述方法產(chǎn)生的產(chǎn)物可以不經(jīng)純化而使用。然而，通常優(yōu)選回收產(chǎn)物以及一種或多種中間產(chǎn)物，例如核苷酸糖、支化和線性的PEG物種、修飾的糖和修飾的核苷酸糖?？梢允褂没厥仗腔牡氖熘臉藴始夹g(shù)，例如薄層或厚層色譜法、柱色譜法、離子交換色譜法或膜過濾。如下文中以及本文引用文獻中論述的那樣，優(yōu)選使用膜過濾，更優(yōu)選采用反滲透膜，或一種或多種柱色譜法技術(shù)進行回收。例如，可以將其中膜的截留分子量為約3000-約10,000的膜過濾用于除去蛋白質(zhì)例如糖基轉(zhuǎn)移酶。在某些情形下，為了確保產(chǎn)物純化將會利用雜質(zhì)和產(chǎn)物之間的截留分子量差異。例如，為了從未反應的CMP-SA-PEG-40KDa中純化產(chǎn)物因子VIIa-SA-PEG-40KDa，必須選擇例如會使因子VIIa-SA-PEG-40KDa留在保留物中而使CMP-SA-PEG-40KDa流入濾液中的過濾器。然后可以用納濾或反滲透來除去鹽和/或純化產(chǎn)物糖(例如參見WO 98/15581)。納濾膜是一類反滲透膜，它使一價鹽通過但是保留多價鹽和大于約100-約2,000道爾頓的未帶電荷的溶質(zhì)，其取決于所用的膜。因此，在通常的應用中，由本發(fā)明方法制備的糖會保留在膜上而污染的鹽會通過。

如果在細胞內(nèi)制備肽，作為第一步，除去微粒碎屑(宿主細胞或裂解片段)。在糖基聚乙二醇化之后，通過本領(lǐng)域已知的方法，例如通過離心或超濾純化該PEG化的肽；任選地，可以用市售的蛋白濃縮過濾器濃縮蛋白質(zhì)，接著通過選自以下的一個或多個步驟將其他雜質(zhì)與多肽變體分離免疫親和色譜法，離子交換柱分級分離(例如在二乙基氨基乙基(DEAE)或含有羧甲基或磺基丙基的基質(zhì)上)，在Blue-Sepharose、CM Blue-Sepharose、MONO-Q、MONO-S、lentillectin-Sepharose、WGA-Sepharose、Con A-Sepharose、EtherToyopearl、Butyl Toyopearl、Phenyl Toyopearl或A蛋白Sepharose上的色譜法，SDS-PAGE色譜法，硅石色譜法，層析聚焦，反相HPLC(例如具有附屬脂族基團的硅膠)，例如使用Sephadex分子篩的凝膠過濾或尺寸排阻色譜法，與多肽選擇性結(jié)合的柱色譜法以及乙醇或硫酸銨沉淀法?？梢詫⒓兓糜谑挂蜃覸II/因子VIIa肽綴合物的一種鏈與另一種鏈分離，如同本節(jié)后面進一步描述的那樣。

在培養(yǎng)物中產(chǎn)生的修飾糖肽通常經(jīng)由最初從細胞、酶等中提取，接著進行一次或多次濃縮、鹽析、含水離子交換或尺寸排阻色譜法步驟來分離。另外，可以通過親和色譜法純化修飾的糖蛋白。最后，可以將HPLC用于最后的純化步驟。

可以在任何前述步驟中包括蛋白酶抑制劑以抑制蛋白水解，以及可以包括抗生素或防腐劑以阻止外來污染物的生長。用于前述步驟中的蛋白酶抑制劑可以是低分子量抑制劑，其包括抗蛋白酶、α-1抗胰蛋白酶、抗凝血酶、亮抑蛋白酶肽、氨肽酶抑制劑、胰凝乳蛋白酶抑制劑、banzamidin以及其他絲氨酸蛋白酶抑制劑(即絲氨酸蛋白酶抑制劑類)。通常，絲氨酸蛋白酶抑制劑應當以0.5-100μM的濃度使用，盡管細胞培養(yǎng)物中的胰凝乳蛋白酶抑制劑可以在超過200μM的濃度下使用。其他絲氨酸蛋白酶抑制劑將包括對類胰凝乳蛋白酶、類枯草桿菌蛋白酶、α/β水解酶或絲氨酸蛋白酶的信號肽酶異種集團特異的抑制劑。除絲氨酸蛋白酶以外，也可以使用其他種類的蛋白酶抑制劑，包括半胱氨酸蛋白酶抑制劑(1-10μM)和天冬氨酸蛋白酶抑制劑(1-5μM)，以及非特異性的蛋白酶抑制劑例如胃酶抑制劑(0.1-5μM)。用于本發(fā)明的蛋白酶抑制劑還可以包括天然的蛋白酶抑制劑，例如從水蛭中分離出的hirustasin抑制劑。在一些實施方案中，蛋白酶抑制劑會包含合成的肽或抗體，其能夠特異性與蛋白酶催化位點結(jié)合以穩(wěn)定因子VII/因子VIIa而不干擾糖基聚乙二醇化反應。

在另一實施方案中，首先用市售的蛋白質(zhì)濃縮過濾器例如Amicon或Millipore Pellicon超濾設(shè)備濃縮來自制備本發(fā)明修飾糖肽的體系的上清液。在該濃縮步驟之后，可以將濃縮物應用于合適的純化基質(zhì)。例如，合適的親和基質(zhì)可以含有與合適的載體結(jié)合的肽的配體、凝集素或抗體分子。作為選擇，可以使用陰離子交換樹脂，例如具有懸掛DEAE基團的基質(zhì)或底物。合適的基質(zhì)包括丙烯酰胺、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素或在蛋白質(zhì)純化中普遍使用的其他類型。作為選擇，可以采用陽離子交換步驟。合適的陽離子交換劑包括含有磺基丙基或羧甲基的各種不溶性基質(zhì)。特別優(yōu)選磺基丙基。

用于純化的其他方法包括尺寸排阻色譜法(SEC)、羥基磷灰石色譜法、疏水作用色譜法和Blue Sepharose色譜法。這些和其他有用的方法在共同轉(zhuǎn)讓的美國臨時專利(律師案卷號No.40853-01-5168-P1，2005年5月6日提交)中得到說明。

可以采取一個或多個用疏水RP-HPLC介質(zhì)例如具有懸掛甲基或其他脂族基團的硅膠的RP-HPLC步驟以進一步純化多肽綴合物組合物。也可以將各種組合的一些或全部的上述純化步驟用于提供同質(zhì)的或基本上同質(zhì)的修飾的糖蛋白。

由大規(guī)模發(fā)酵產(chǎn)生的本發(fā)明的修飾糖肽可以通過與Urdal等，J.Chromatog.296171(1984)所公開那些類似的方法來純化。該參考文獻描述了用于在制備型HPLC柱上純化重組人IL-2的兩個連續(xù)的RP-HPLC步驟。作為選擇，可以將諸如親和色譜法等技術(shù)用于純化該修飾的糖蛋白。

在一種示例性的實施方案中，通過在共同擁有的、共同轉(zhuǎn)讓的2005年3月24日提交的美國臨時專利No.60/665,588中所述的方法來完成純化。

根據(jù)本發(fā)明，通過順序的去-唾液酸化或同時的唾液酸化所制成的聚乙二醇化的肽，例如因子VII、因子VIIa肽或肽綴合物可以通過使用氯化鎂梯度來純化或解析。

在一種示例性的實施方案中，可以將因子VII/因子VIIa肽綴合物分離成輕鏈和重鏈，而且可以將一種鏈從另一種鏈中純化出來。在另一示例性的實施方案中，獲得其中產(chǎn)物中至少80％的因子VII/因子VIIa肽綴合物為該因子VII/因子VIIa肽綴合物的輕鏈部分的產(chǎn)物。在另一示例性的實施方案中，獲得其中產(chǎn)物中至少90％的因子VII/因子VIIa肽綴合物為該因子VII/因子VIIa肽綴合物的輕鏈部分的產(chǎn)物。在另一示例性的實施方案中，獲得其中產(chǎn)物中至少95％的因子VII/因子VIIa肽綴合物為該因子VII/因子VIIa肽綴合物的輕鏈部分的產(chǎn)物。在另一示例性的實施方案中，獲得其中產(chǎn)物中基本上全部的因子VII/因子VIIa肽綴合物為該因子VII/因子VIIa肽綴合物的輕鏈部分的產(chǎn)物。對于本發(fā)明的任意化合物而言該產(chǎn)物是可能的。

在另一示例性的實施方案中，獲得其中產(chǎn)物中至少80％的因子VII/因子VIIa肽綴合物為該因子VII/因子VIIa肽綴合物的重鏈部分的產(chǎn)物。在另一示例性的實施方案中，獲得其中產(chǎn)物中至少90％的因子VII/因子VIIa肽綴合物為該因子VII/因子VIIa肽綴合物的重鏈部分的產(chǎn)物。在另一示例性的實施方案中，獲得其中產(chǎn)物中至少95％的因子VII/因子VIIa肽綴合物為該因子VII/因子VIIa肽綴合物的重鏈部分的產(chǎn)物。在另一示例性的實施方案中，獲得其中產(chǎn)物中基本上全部的因子VII/因子VIIa肽綴合物為該因子VII/因子VIIa肽綴合物的重鏈部分的產(chǎn)物。對于本發(fā)明的任意化合物而言該產(chǎn)物是可能的。
III.F.因子VII/因子VIIa綴合物的性質(zhì)
在一種示例性的實施方案中，本發(fā)明的因子VII/因子VIIa肽綴合物具有與天然因子VII/因子VIIa肽基本上相同的生物化學性質(zhì)(例如凝血)。在一種示例性的實施方案中，根據(jù)PEG化的位點、加入的PEG的尺寸和加入的PEGs的數(shù)量，本發(fā)明的因子VII/因子VIIa肽綴合物相對于天然因子VII/因子VIIa肽具有降低的或提高的生物化學性質(zhì)(例如凝血)。

因子VII/因子VIIa肽綴合物參與血液凝結(jié)過程。在一種示例性的實施方案中，因子VII/因子VIIa肽綴合物保留約20％、或約25％、或約30％、或約35％、或約40％、或約45％、或約50％、或約55％、或約60％、或約65％、或約70％、或約75％、或約80％、或約85％、或約90％、或約95％的天然因子VII/因子VIIa的凝血活性。

因子VII/因子VIIa肽綴合物具有酰胺分解活性(amidolytic activity)。在一種示例性的實施方案中，因子VII/因子VIIa肽綴合物保留約20％、或約25％、或約30％、或約35％、或約40％、或約45％、或約50％、或約55％、或約60％、或約65％、或約70％、或約75％、或約80％、或約85％、或約90％、或約95％的天然因子VII/因子VIIa的酰胺分解活性。

因子VII/因子VIIa肽綴合物能夠使因子X轉(zhuǎn)變?yōu)橐蜃覺a。在一種示例性的實施方案中，因子VII/因子VIIa肽綴合物保留約20％、或約25％、或約30％、或約35％、或約40％、或約45％、或約50％、或約55％、或約60％、或約65％、或約70％、或約75％、或約80％、或約85％、或約90％、或約95％的天然因子VII/因子VIIa的因子X轉(zhuǎn)變活性。
IV.藥物組合物
在另一方面中，本發(fā)明提供藥物組合物。該藥物組合物包含可藥用稀釋劑以及非天然存在的PEG部分、治療部分或生物分子與糖基化的或未糖基化的肽之間的共價綴合物。聚合物、治療部分或生物分子通過完整的糖基連接基團與肽綴合，該連接基團介于肽和聚合物、治療部分或生物分子之間并與二者共價連接。

本發(fā)明的藥物組合物適合用于多種藥物遞送系統(tǒng)。可用于本發(fā)明的合適制劑參見Remington′s Pharmaceutical Sciences，MacePublishing Company，Philadelphia，PA，第十七版，(1985)。藥物遞送方法的簡短綜述參見Langer，Science 2491527-1533(1990)。

在一種示例性的實施方案中，藥物制劑包含因子VII/因子VIIa肽綴合物和選自氯化鈉、氯化鈣二水合物、甘氨酰甘氨酸、聚山梨酯80和甘露糖醇的可藥用稀釋劑。在另一示例性的實施方案中，可藥用稀釋劑為氯化鈉和甘氨酰甘氨酸。在另一示例性的實施方案中，可藥用稀釋劑為氯化鈣二水合物和聚山梨酯80。在另一示例性的實施方案中，可藥用稀釋劑為甘露糖醇。

可以配制藥物組合物用于任何適當?shù)慕o藥方式，所述方式例如包括局部、口服、鼻、靜脈內(nèi)、顱內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或肌內(nèi)給藥。對于腸胃外給藥例如皮下注射，載體優(yōu)選包含水、鹽水、醇、脂肪、蠟或緩沖劑。對于口服給藥，可以采用任何上述載體或固體載體例如甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖和碳酸鎂。也可以用可生物降解微球(例如聚乳酸、聚乙醇酸)作為本發(fā)明藥物組合物的載體。合適的可生物降解微球例如在美國專利Nos.4,897,268和5,075,109中被公開。

通常，藥物組合物經(jīng)腸胃外例如靜脈內(nèi)給藥。因此，本發(fā)明提供用于腸胃外給藥的組合物，其含有溶解或懸浮于可接受載體、優(yōu)選水性載體如水、緩沖水、鹽水、PBS等的化合物。組合物可以含有接近生理條件所需的可藥用輔助物質(zhì)，例如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、張力調(diào)整劑、濕潤劑、去污劑等。

這些組合物可以通過常規(guī)滅菌技術(shù)滅菌或可以進行過濾滅菌。得到的水溶液可以原樣包裝待用或凍干，使凍干制劑在給藥前與無菌水性載體合并。制劑的pH通常為3-11，更優(yōu)選5-9和最優(yōu)選7-8。

在一些實施方案中，本發(fā)明的糖肽可以混入由標準小泡形成性(vesicle-forming)脂質(zhì)所形成的脂質(zhì)體中。多種方法可用于制備脂質(zhì)體，如同在例如Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467(1980)、美國專利Nos.4,235,871、4,501,728和4,837,028中所述那樣。使用多種靶向劑(例如本發(fā)明的唾液酰半乳糖苷)靶向脂質(zhì)體為本領(lǐng)域所熟知(例如參見美國專利Nos.4,957,773和4,603,044)。

可以使用將靶向劑與脂質(zhì)體偶合的標準方法。這些方法一般包括將脂質(zhì)組分混入脂質(zhì)體中，該組分例如是可以進行活化以便與靶向劑結(jié)合的磷脂酰乙醇胺，或者衍生化的親脂化合物例如本發(fā)明的脂質(zhì)衍生化的糖肽。

靶向機制一般要求以一定的方式將靶向劑置于脂質(zhì)體的表面，該方式使得靶向部分可用于與靶標例如細胞表面受體相互作用。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(例如分別用長鏈烷基鹵或脂肪酸烷基化或?；妓衔锷洗嬖诘牧u基)在形成脂質(zhì)體之前將本發(fā)明的碳水化合物與脂質(zhì)分子結(jié)合。作為選擇，可以一定的方式構(gòu)造脂質(zhì)體，該方式使得在形成膜時首先將連接體部分引入膜中。該連接體部分必須具有牢固嵌入并錨定在膜中的親脂部分。它還必須具有在脂質(zhì)體的水性表面上可化學利用的反應性部分。選擇該反應性部分以使得它會在化學上適合與隨后加入的靶向劑或碳水化合物形成穩(wěn)定的化學鍵。在一些情況下，可以將靶向劑直接與連接體分子結(jié)合，但在大多數(shù)情況下更適合使用第三方分子來充當化學橋，從而連接膜中的連接體分子和三維擴張到小泡表面外的靶向劑或碳水化合物。

通過本發(fā)明方法制備的化合物還可以用作診斷劑。例如，可以將標記過的化合物用于在懷疑具有炎癥的患者中定位炎癥或腫瘤轉(zhuǎn)移的區(qū)域。對于該用途，化合物可以使用125I、14C或氚進行標記。

本發(fā)明藥物組合物中所用的活性成分為具有刺激血液凝結(jié)產(chǎn)生的生物特性的因子VII/因子VIIa肽綴合物。優(yōu)選地，該因子VII/因子VIIa肽綴合物經(jīng)腸胃外施用(例如IV、IM、SC或IP)。有效劑量預期根據(jù)被治療的病癥和給藥途徑而顯著變化，但是預期活性物質(zhì)為約0.1(～7U)-100(～7000U)μg/kg體重。治療貧血病癥的優(yōu)選劑量為每周三次約50-約300單位/kg。由于本發(fā)明提供具有增強的體內(nèi)停留時間的包含因子VII/因子VIIa肽的物質(zhì)的組合物，因此在施用本發(fā)明的組合物時，任選地降低所述劑量。

可用于制備本發(fā)明組合物的物種的制備方法通常在各種專利出版物中得到闡述，例如US 20040137557、WO 04/083258和WO04/033651。提供下列實施例來舉例說明本發(fā)明的綴合物和方法，但是不限制要求保護的本發(fā)明。
實施例 實施例1 因子VIIa的去唾液酸化
在不含血清的介質(zhì)中表達的因子VIIa，在含血清的介質(zhì)中產(chǎn)生的因子VIIa加上三種因子VIIa突變體N145Q、N322Q和類似物DVQ(V158D/E296V/M298Q)。

為準備酶促去唾液酸化，用10KDa的MWCO在Snakeskin滲析管中在4℃下過夜?jié)B析至MES中，150mM NaCl，5mM CaCl2，50mMMES，pH6。用10U/L來自產(chǎn)脲節(jié)桿菌(Arthrobacter ureafaciens)的可溶性唾液酸酶(Calbiochem)在32℃下在交換緩沖液中進行因子VIIa(1mg/mL)的去唾液酸化18小時。
實施例2 因子VIIa的唾液酰-PEG化
在32℃下在去唾液酸化緩沖液中用100 U/L ST3Ga1-III和200μMCMP-唾液酸-PEG(40KDa、20KDa、10KDa、5KDa和2KDa)對去唾液酸-因子VIIa(1mg/mL)進行唾液酰-PEG化(“糖基聚乙二醇化”)2-6小時。在適當?shù)姆磻獣r間屆滿后，立即純化該PEG化的試樣以使進一步糖基聚乙二醇化減到最少。

為了用加帽有唾液酸的試樣使糖基聚乙二醇化的因子VII/因子VIIa加帽，首先通過如下面說明的陰離子交換色譜法從去唾液酸-因子VIIa中除去唾液酸酶。加入過量的CMP-唾液酸(5mM)并在32℃下孵育2小時，用唾液酸使糖基聚乙二醇化的因子VIIa加帽。由非還原SDS-PAGE(三甘氨酸凝膠和/或NuPAGE凝膠)和ColloidalBlue Staining試劑盒分析因子VIIa的唾液酰-PEG化形式，如Invitrogen所述那樣。
實施例3 PEG化因子VIIa的純化
用改進的陰離子交換方法純化因子VIIa的糖基聚乙二醇化試樣。試樣在5℃下進行處理。剛好在裝柱之前，向重建的樣品中每10mL因子VIIa溶液加入1g Chelex 100(BioRad)。在攪拌10分鐘后，用真空體系在乙酸纖維素膜(0.2μm)上過濾該懸浮液。將過濾器上保留下的螯合劑樹脂每10mL體積用1-2mL水洗滌一次。將濾液的電導率調(diào)節(jié)至5℃下10mS/cm，需要的話調(diào)節(jié)至pH8.6。

陰離子交換在8-10℃下進行。在裝載之前通過用1M NaOH(10柱容積)，水(5柱容積)，2M NaCl、50mM HOAc、pH 3(10柱容積)洗滌，并用175mM NaCl、10mM甘氨酰甘氨酸、pH 8.6(10柱容積)平衡，制成含Q Sepharose FF的柱。對于各個PEG化反應，將15-20mg因子VIIa以100cm/h的流速裝載至具有10mL QSepharose FF(每mL樹脂不大于2mg蛋白質(zhì))的XK16柱(AmershamBiosciences)上。對于2KDa線性PEG，將20mg因子VIIa以100cm/h的流速裝載至具有40mL Q Sepharose FF(每mg樹脂0.5mg蛋白質(zhì))的XK26柱(Amersham Biosciences)上。

裝載之后，用175mM NaCl、10mM甘氨酰甘氨酸、pH 8.6(10柱容積)和50mM NaCl、10mM甘氨酰甘氨酸、pH 8.6(2柱體積)洗滌該柱。通過使用50mM NaCl、10mM甘氨酰甘氨酸、15mM CaCl2、pH 8.6(5柱體積)以15mM CaCl2的步梯度進行洗脫。然后用1M NaCl、10mM甘氨酰甘氨酸、pH8.6(5柱體積)洗滌該柱。由280nm下的吸光度監(jiān)控流出物。在流動通過和兩次洗滌期間收集級分(5mL)；在CaCl2和1M鹽洗脫期間收集2.5mL級分。由非還原SDS-PAGE(三甘氨酸凝膠和/或NUPAGE凝膠)和Colloidal Blue Staining試劑盒分析含因子VIIa的級分。將適合的具有因子VIIa的級分集中，用4MHCl調(diào)節(jié)pH至7.2。

除了以下改變外，如上所述純化因子VIIa-SA-PEG-10KDa。向PEG化的因子VIIa溶液中加入EDTA(10mM)，調(diào)節(jié)pH至pH 6，以及調(diào)節(jié)電導率至5℃下5mS/cm。將約20mg因子VIIa-SA-PEG-10KDa以100cm/h的流速裝載至具有10mL Poros 50 Micron HQ樹脂(每mL樹脂不大于2mg蛋白質(zhì))的XK16柱(Amersham Biosciences)上。裝載之后，用175mM NaCl、10mM組氨酸、pH6(10柱容積)和50mMNaCl、10mM組氨酸、pH6(2柱體積)洗滌該柱。在50mM NaCl、10mM組氨酸、pH6(5柱體積)中以20mM CaCl2的步梯度進行洗脫。然后用1M NaCl、10mM組氨酸、pH6(5柱體積)洗滌該柱。

通過根據(jù)制造商的說明使用Amicon Ultra-15 10K離心過濾裝置(Millipore)將含有因子VIIa-SA-PEG-10KDa(25mL)的陰離子交換洗脫液濃縮至5-7mL。在濃縮之后，進行尺寸排阻色譜法。將試樣(5-7mL)裝載至對于大多數(shù)PEG化的變體在50mMNaCl、10mM甘氨酰甘氨酸、15mM CaCl2、pH 7.2中平衡的含Superdex 200(HiLoad16/60，制備級；Amersham Biosciences)的柱上。在1mL/min的流速下使未修飾的去唾液酸-因子VIIa與因子VIIa-SA-PEG-10KDa分離，并且在280nm下監(jiān)控吸光度。收集含因子VIIa的級分(1mL)并通過非還原SDS-PAGE(三甘氨酸凝膠和/或NuPAGE凝膠)和ColloidalBlue Staining試劑盒分析。將含有目標PEG化的同工型(isoform)而且沒有未修飾去唾液酸-因子VIIa的級分混合并且用AmiconUltra-15 10K離心過濾裝置濃縮至1mg/mL。由采用1.37(mg/mL)-1cm-1的消光系數(shù)在280nm下的吸光度讀數(shù)測定蛋白質(zhì)濃度。
實施例4 通過反相HPLC分析測定PEG化的同工型
通過反相柱(Zorbax 300SB-C3，5μm粒度，2.1 x 150mm)上的HPLC分析PEG化的因子VIIa。洗脫劑為A)水中的0.1 TFA和B)乙腈中的0.09％ TFA。在214nm下檢測。梯度、流速和柱溫取決于PEG長度(40KDa、20KDa和10KDa PEG30min內(nèi)35-65％ B，0.5mL/min，45℃；10KDa PEG30min內(nèi)35-60％ B，0.5mL/min，45℃；5KDa40min內(nèi)40-50％ B，0.5mL/min，45℃；2KDa67min內(nèi)38-43％ B，0.6mL/min，55℃)。基于四種不同證據(jù)中的兩種或更多種指定每個峰的身份天然因子VIIa的已知保留時間，分離的峰的SDS-PAGE遷移，分離的峰的MALDI-TOF質(zhì)譜，以及隨著增加結(jié)合的PEG數(shù)目各個峰保留時間的有序進展。
實施例5 通過反相HPLC測定PEG結(jié)合的位點
通過將試樣(10μL濃度為1mg/mL)與還原緩沖液(40μL，50mM NaCl，10mM甘氨酰甘氨酸，15mM EDTA，8M尿素，20mM DTT，pH 8.6)在室溫下混合15min而還原因子VIIa和PEG化因子VIIa變體。加入水(50μL)并使試樣冷卻至4℃直至注入HPLC為止(<12hrs)。HPLC柱、洗脫劑和檢測如同以上對于未還原的試樣描述的那樣。流速為0.5mL/min以及梯度為90min內(nèi)30-55％ B，接著是簡短的洗滌周期直至90％ B。如實施例4中所述指定每個峰的身份。
實施例6 因子VIIa凝結(jié)試驗
PEG化試樣和標準物一式兩份進行測試，而且在100mMNaCl、5mM CaCl2、0.1％ BSA(wt/vol)、50mM Tris、pH 7.4中稀釋。在0.1-10ng/mL的范圍內(nèi)檢驗該標準物和試樣。將相同體積的稀釋過的標準物和試樣與缺乏因子VIIa的血漿(Diagnostica Stago)混合，并且在檢驗它們之前在冰上存儲不超過4小時。

用STart4血凝度計(Coagulometer，Diagnostica Stago)測量凝結(jié)時間。血凝度計測量直至如同由樣品杯中磁性球緩和的來回移動的停止所指示的那樣形成體外凝塊為止所經(jīng)過的時間。

向每個杯中放入一個磁性球加上100μL因子VIIa試樣/缺乏該因子的血漿和100μL稀釋的大鼠腦腦磷脂溶液(在冰上存儲不超過4小時)。每種試劑每孔之間間隔5秒加入，最后的混合物在37℃下孵育300秒。稀釋的大鼠腦腦磷脂(RBC)溶液由2mL RBC儲備溶液(來自Haemachem的1小瓶RBC儲備液，加上10mL150mM NaCl)和4mL100mM NaCl、5mM CaCl2、0.1％ BSA(wt/vol)、50mM Tris，pH7.4制成。

在300秒時，通過加入100μL預熱過的(37℃)可溶性組織因子在100mM NaCl、12.5mM CaCl2、0.1％ BSA(wt/vol)、50mM Tris、pH 7.4中的溶液(2μg/mL；氨基酸1-209)開始檢驗。再一次地，該接下來的溶液在試樣間以5秒間隔加入。

來自稀釋過的標準物的凝結(jié)時間用于產(chǎn)生標準曲線(對數(shù)凝結(jié)時間相對于對數(shù)因子VIIa濃度)。由該曲線得到的線性回歸用來測定PEG化變體的相對凝結(jié)活性。將PEG化的因子VIIa變體與因子VIIa的等分儲備液進行比較。
實施例7 在BHK細胞中產(chǎn)生的重組因子VIIa的糖基聚乙二醇化
本實施例闡述在BHK細胞中制成的重組因子VIIa的PEG化。

去唾液酸-因子VIIa的制備。在BHK細胞(幼倉鼠腎細胞)中制備重組因子VIIa。將因子VIIa(14.2mg)以1mg/mL溶解在緩沖溶液中(pH 7.4，0.05M Tris，0.15M NaCl，0.001M CaCl2，0.05％NaN3)并且用300mU/mL唾液酸酶(霍亂弧菌)-瓊脂糖綴合物在32℃下孵育3天。為監(jiān)控反應，將該反應的小等分試樣用適當?shù)木彌_液稀釋并且根據(jù)Invitrogen方法(圖157)進行IEF凝膠。將混合物在3,500rpm下離心并收集上清液。用上述緩沖溶液(pH 7.4，0.05MTris，0.15M NaCl，0.05％ NaN3)洗滌樹脂三次(3×2mL)并且將合并的洗滌液在Centricon-Plus-20中濃縮。余下的溶液用0.05MTris(pH7.4)，0.15M NaCl，0.05％ NaN3緩沖液交換至14.4mL的最終體積。

因子VIIa-SA-PEG-1KDa和因子VIIa-SA-PEG-10KDa的制備。因子VIIa溶液的去唾液酸化分成兩份相同的7.2mL試樣。向每一份試樣中加入CMP-SA-PEG-1KDa(7.4mg)或CMP-SA-PEG-10KDa(7.4mg)。向兩個管中加入ST3Gal3(1.58U)并使反應混合物在32℃孵育96小時。用Invitrogen所述的試劑和條件由SDS-PAGE凝膠監(jiān)控反應。當反應完成時，以PBS緩沖液(pH 7.1)用Toso HaasTSK-Gel-3000制備型柱純化反應混合物并且基于UV吸收收集級分。將合并的含有產(chǎn)物的級分在4℃下在Centricon-Plus-20離心過濾器(Millipore，Bedford，MA)中濃縮，并且將濃縮過的溶液重新配制以得到1.97mg(二金雞寧酸蛋白質(zhì)檢測，BCA檢測，Sigma-Aldrich，St.Louis MO)的因子VIIa-SA-PEG。根據(jù)Invitrogen提供的方法和試劑用SDS-PAGE和IEF分析來分析反應產(chǎn)物。將試樣對水透析并由MALDI-TOF分析。圖7顯示天然因子VIIa的MALDI結(jié)果。圖8包含因子VIIa-SA-PEG-1KDa的MALDI結(jié)果。圖9包含因子VIIa-SA-PEG-10KDa的MALDI結(jié)果。圖10描繪所有反應產(chǎn)物的SDS-PAGE分析，其中因子VIIa-SA-PEG-10KDa的帶明顯。
實施例8 因子VIIa-SA-PEG-10KDa一鍋法
將因子VIIa(5mg，在產(chǎn)物配制緩沖液中稀釋至1mg/mL的最終濃度)、CMP-SA-PEG-10KDa(10mM，60μL)和黑曲霉酶ST3Gal3(33U/L)以及10mM組氨酸、50mM NaCl、20mM CaCl2連同10U/L、1U/L、0.5U/L或0.1U/L唾液酸酶(CalBiochem)一起在反應容器中合并。各成分在32℃下混合及孵育。通過前4個小時以30分鐘間隔分析等分試樣來測量反應進展。然后在20小時時間點取出一等分試樣并進行SDS-PAGE。通過在1.5、2.5和3.5小時時間點取出試樣并在Poros50HQ柱上純化樣品來確定PEG化的程度。

對于含10U/L唾液酸酶的反應條件，沒有形成可察覺量的因子VIIa-SA-PEG產(chǎn)物。對于含1U/L唾液酸酶的反應條件，在1.5小時后反應混合物中約17.6％的因子VIIa為單-或二PEG化的。在2.5小時后這提高至29％，以及在3.5小時后提高至40.3％。對于含0.5U/L唾液酸酶的反應條件，在3小時后反應混合物中約44.5％的因子VIIa為單-或二PEG化的，以及0.8％為三PEG化或更多。20小時后，69.4％為單-或二PEG化的，以及18.3％為三PEG化或更多。

對于含0.1U/L唾液酸酶的反應條件，在3小時后反應混合物中約29.6％的因子VIIa為單-或二PEG化的。在20小時后，71.3％為單-或二PEG化的，以及15.1％為三PEG化或更多。

結(jié)果示于圖11和圖12中。
實施例9 半胱氨酸-PEG2(2)的制備
a.化合物1的合成
將氫氧化鉀(84.2mg，1.5mmol，粉末)在氬氣下加入到L-半胱氨酸(93.7mg，0.75mmol)在無水甲醇(20L)中的溶液內(nèi)。在室溫下攪拌混合物30min，然后用2小時分若干份加入分子量為20千道爾頓的mPEG-O-甲苯磺酸酯(Ts；1.0g，0.05mmol)。在室溫下攪拌混合物5天，并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。用水(30mL)稀釋殘留物并在室溫攪拌2小時以破壞任何過量的20千道爾頓mPEG-O-甲苯磺酸酯。然后用乙酸中和該溶液，將pH調(diào)節(jié)至pH 5.0并且裝載至反相色譜(C-18硅石)柱上。用甲醇/水梯度洗脫該柱(產(chǎn)物在約70％甲醇下洗脫)，通過蒸發(fā)光散射監(jiān)控產(chǎn)物洗脫，收集適當?shù)募壏植⒂盟?500mL)稀釋。對該溶液進行色譜分析(離子交換，XK 50 Q，BIGBeads，300mL，氫氧化物形式；水至水/乙酸的梯度-0.75N)并且用乙酸將適當級分的pH降低至6.0。然后使該溶液在反相柱(C-18硅石)上捕獲并用如上所述的甲醇/水梯度洗脫。將產(chǎn)物級分混合，濃縮，重新溶解于水并凍干以提供453mg(44％)的白色固體(1)。

化合物的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)如下1H-NMR(500MHz；D2O)δ 2.83(t，2H，O-C-CH2-S)，3.05(q，1H，S-CHH-CHN)，3.18(q，1H，(q，1H，S-CHH-CHN)，3.38(s，3H，CH3O)，3.7(t，OCH2CH2O)，3.95(q，1H，CHN)。產(chǎn)物的純度由SDS PAGE確定。
b.半胱氨酸-PEG2(2)的合成
將三乙氨(～0.5mL)滴加至溶解于無水CH2Cl2(30mL)的化合物1溶液(440mg，22μmol)中直至溶液堿性為止。室溫下用1小時分若干份加入20千道爾頓mPEG-O-對硝基苯基碳酸酯(660mg，33μmol)和N-羥基琥珀酰亞胺(3.6mg，30.8μmol)在CH2Cl2(20mL)中的溶液。在室溫下攪拌反應混合物24小時。然后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。將殘留物溶解于水(100mL)，用1.0N NaOH調(diào)節(jié)pH至9.5。在室溫下攪拌該堿性溶液2小時然后用乙酸中和至pH 7.0。接著將溶液裝載至反相色譜(C-18硅石)柱上。用甲醇/水梯度洗脫該柱(產(chǎn)物在約70％甲醇下洗脫)，通過蒸發(fā)光散射監(jiān)控產(chǎn)物洗脫，收集適當?shù)募壏植⒂盟?500mL)稀釋。對該溶液進行色譜分析(離子交換，XK 50 Q，BIG Beads，300mL，氫氧化物形式；水至水/乙酸的梯度-0.75N)并且用乙酸將適當級分的pH降低至6.0。然后使該溶液在反相柱(C-18硅石)上捕獲并用如上所述的甲醇/水梯度洗脫。將產(chǎn)物級分混合，濃縮，重新溶解于水并凍干以提供575mg(70％)的白色固體(2)。

化合物的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)如下1H-NMR(500MHz；D2O)δ 2.83(t，2H，O-C-CH2-S)，2.95(t，2H，O-C-CH2-S)，3.12(q，1H，S-CHH-CHN)，3.39(s，3H CH3O)，3.71(t，OCH2CH2O)。產(chǎn)物的純度由SDS PAGE確定。
實施例10 因子VIIa-SA-PEG-40KDa
因子VIIa的糖基聚乙二醇化(一鍋法并加帽)。在其中去唾液酸化和PEG化同時進行的一鍋式反應中實現(xiàn)因子VIIa的糖基聚乙二醇化，接著用唾液酸加帽。在通過循環(huán)水浴控制在32℃的帶夾套的玻璃容器中進行反應。首先，將濃縮過的0.2μm-經(jīng)過濾的因子VIIa引入容器中并且通過用攪拌棒混合20分鐘加熱至32℃。唾液酸酶溶液由干燥粉末在10mM組氨酸/50mM NaCl/20mM CaCl2、pH 6.0中以4,000U/L的濃度制成。一旦因子VIIa達到32℃，向因子VIIa中加入唾液酸酶，混合反應混合物約5分鐘以在中止混合之后確保均勻的溶液。使去唾液酸化在32℃進行1.0h。在去唾液酸化反應期間，將CMP-SA-PEG-40KDa溶解入10mM組氨酸/50mM NaCl/20mM CaCl2、pH 6.0緩沖劑中，并由271nm下的UV吸光度確定濃度。在CMP-SA-PEG-40KDa溶解后，向反應中加入該CMP-SA-PEG-40KDa以及ST3Gal3，將反應用攪拌棒混合約15分鐘以確保均勻的溶液。加入85mL額外體積的緩沖液以使反應混合物為1.0L。使反應在沒有攪拌下進行24小時，然后加入CMP-SA至4.3mM的濃度以使反應猝滅并且用唾液酸使剩余的末端半乳糖殘基加帽。使猝滅在32℃混合30分鐘下進行。猝滅前反應混合物的總體積為1.0L。在0、4.5、7.5和24h取出時間點試樣(1mL)，用CMP-SA猝滅，并用RP-HPLC和SDS-PAGE分析。

因子VIIa-SA-PEG-40KDa的純化。在加帽后，溶液用2.0L已經(jīng)在4℃存儲過夜的10mM組氨酸、pH 6.0稀釋并且通過0.2μmMillipakn 60過濾器過濾試樣。所得裝載體積為3.1L。在Akta Pilot系統(tǒng)上在20-25℃(環(huán)境室溫)進行AEX2色譜分析。裝載后，用平衡緩沖液進行10柱體積洗滌，并且用10柱體積MgCl2梯度從柱中洗脫產(chǎn)物，其導致未PEG化因子VIIa與PEG化-因子VIIa物種的拆分。有意地將該柱的裝載保持在低水平，目標為<2mg因子VIIa/mL樹脂。除了選定級分和級分集合的RP-HPLC分析以外還運行SDS-PAGE凝膠，以便制備原料(bulk)產(chǎn)物的集合物。將混合的級分用1M NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0并在2-8℃的冷藏室中存儲過夜。

最后濃縮/滲濾，無菌過濾和等分(aliquoting)。將混合的級分通過Millipak 20 0.2μm過濾器來過濾并在2-8℃下存儲過夜。為進行濃縮/滲濾，在裝有蠕動泵和硅樹脂管的系統(tǒng)中使用Millipore 0.1m2 30KDa再生纖維素膜。裝配該系統(tǒng)并用水沖洗，然后用0.1M NaOH清潔至少1小時，接著存儲在0.1M NaOH中直至剛好在使用前用10mM組氨酸/5mM CaCl2/100mM NaCl pH 6.0滲濾緩沖液平衡為止。將產(chǎn)物濃縮至大約400mL然后在用大約5diavolumes緩沖液在定容下進行滲濾。接著將產(chǎn)物濃縮至約300mL并在低壓再循環(huán)5分鐘后回收，將膜通過再循環(huán)5分鐘用200mL滲濾緩沖液沖洗。洗滌液與產(chǎn)物一起回收，并將另外50mL緩沖液再循環(huán)另外5分鐘以便最終洗滌。所得體積為約510mL，通過裝有0.2μm PES膜(Millipore)的1L真空過濾器將其過濾。然后將無菌過濾的散裝物(bulk)在50mL無菌falcon管中等分成25mL等分試樣并在-80℃冷凍。
PEG化反應的HPLC分析(實施例10)
24小時后，批量產(chǎn)物PEG狀態(tài)分布為0.7％未聚乙二醇化，85.3％單聚乙二醇化，11.5％二聚乙二醇化和0.3％三聚乙二醇化。在產(chǎn)生該產(chǎn)物分布的方法中柱色譜法是主要步驟，其主要通過從單-和二-聚乙二醇化的物種中除去未聚乙二醇化的物質(zhì)進行。
實施例11 因子VIIa-SA-PEG-10KDa
下列實施例描述通過反相HPLC測定與因子VIIa-SA-PEG-10KDa的輕鏈和重鏈結(jié)合的修飾的糖數(shù)量的程序。

使因子VIIa-SA-PEG-10KDa經(jīng)受還原條件以便將重鏈與輕鏈分離。分離之后，使重鏈和輕鏈進行單獨的反相HPLC試驗?；谒鼈兿鄬τ谔烊灰蜃覸IIa對照物的色譜圖中未修飾的因子VIIa峰的峰位置來將指定各峰。

下表描述用于輕鏈的HPLC溶劑梯度參數(shù)。柱溫為39℃。
HPLC輕鏈溶劑梯度參數(shù)
輕鏈因子VIIa-SA-PEG-10KDa(上)和天然的輕鏈因子VIIa(下)的色譜圖提供于圖14A中。

下表描述用于重鏈的HPLC溶劑梯度參數(shù)。柱溫為52℃。
HPLC重鏈溶劑梯度參數(shù)
重鏈因子VIIa-SA-PEG-10KDa(上)和天然的重鏈因子VIIa(下)的色譜圖提供于圖14B中。
實施例12 因子VIIa-SA-PEG-40KDa
下列實施例描述通過反相HPLC測定與因子VIIa-SA-PEG-40KDa的輕鏈和重鏈結(jié)合的修飾的糖數(shù)量的程序。

使因子VIIa-SA-PEG-40KDa經(jīng)受還原條件以便將重鏈與輕鏈分離。分離之后，使重鏈和輕鏈進行單獨的反相HPLC試驗?；谒鼈兿鄬τ谔烊灰蜃覸IIa對照物的色譜圖中未修飾的糖峰的峰位置來指定各峰。

下表描述用于輕鏈的HPLC溶劑梯度參數(shù)。柱溫為25℃。
HPLC輕鏈溶劑梯度參數(shù)
輕鏈因子VIIa-SA-PEG-40KDa和天然的輕鏈因子VIIa的色譜圖分別提供于圖15B和圖15A中。

下表描述用于重鏈的HPLC溶劑梯度參數(shù)。柱溫為40℃。HPLC重鏈溶劑梯度參數(shù)
重鏈因子VIIa-SA-PEG-40KDa和天然的重鏈因子VIIa的色譜圖分別提供于圖15D和圖15C中。

應當理解本文所述的實施例和實施方案只是為了說明性目的，根據(jù)它們的多種改進或變化會暗示給本領(lǐng)域技術(shù)人員，而且會包括在本申請的精神和范圍以及所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。本文引用的所有出版物、專利和專利申請通過引用完全并入本文用于所有目的。
權(quán)利要求
1.制備包含糖基接頭的因子VII/因子VIIa肽綴合物的方法，所述接頭包含具有下式的修飾的唾液?；鶜埢?br> 其中
D選自-OH和R1-L-HN-；
G選自R1-L-和-C(O)(C1-C6)烴基-R1；
R1是包含選自直鏈聚(乙二醇)殘基和支化聚(乙二醇)殘基中的成員的部分；以及
M選自H、金屬和單個負電荷；
L是選自鍵、取代的或未取代的烴基和取代的或未取代的雜烴基的接頭，
以至于當D為OH時，G為R1-L-，以及當G為-C(O)(C1-C6)烴基時，D為R1-L-NH-
所述方法包括
(a)使包含糖基部分的因子VII/因子VIIa肽
與具有下式的PEG-唾液酸供體部分
以及將所述PEG-唾液酸轉(zhuǎn)移至所述糖基部分的Gal上的酶，在適合于所述轉(zhuǎn)移的條件下進行接觸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中L-R1具有下式
其中
a為選自0-20的整數(shù)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中R1具有選自以下的結(jié)構(gòu)
和
其中
e、f、m和n為獨立地選自1-2500的整數(shù)；以及
q為選自0-20的整數(shù)。
4.權(quán)利要求1的方法，其中R1具有選自以下的結(jié)構(gòu)
和
其中
e、f和f’為獨立地選自1-2500的整數(shù)，以及
q和q’為獨立地選自1-20的整數(shù)。
5.權(quán)利要求1的方法，其中R1具有選自以下的結(jié)構(gòu)
和
其中
e和f為獨立地選自1-2500的整數(shù)。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述糖基接頭具有下式
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述肽綴合物包含至少一個根據(jù)選自以下的式的所述糖基接頭
和
其中AA是所述肽綴合物的氨基酸殘基以及t為選自0和1的整數(shù)。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述肽綴合物包含至少一個所述糖基接頭，其中所述糖基接頭各自具有獨立地選自以下式的結(jié)構(gòu)
其中AA是所述肽綴合物的氨基酸殘基以及t為選自0和1的整數(shù)。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述肽綴合物包含至少一個根據(jù)選自以下的式的所述糖基接頭
和
其中AA是所述肽綴合物的氨基酸殘基以及t為選自0和1的整數(shù)
以及其中選自0和2個不含G的唾液?；糠种械某蓡T不存在。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述肽綴合物包含至少一個根據(jù)選自以下的式的所述糖基接頭
和
其中AA是所述肽綴合物的氨基酸殘基以及t為選自0和1的整數(shù)
以及其中選自0和2個不含G的唾液?；糠种械某蓡T不存在。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述因子VII/因子VIIa肽具有SEQ.ID.NO1的氨基酸序列。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述糖基接頭通過選自絲氨酸和蘇氨酸的氨基酸殘基結(jié)合至所述因子VII/因子VIIa肽上。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述糖基接頭通過為天冬酰胺殘基的氨基酸殘基結(jié)合至所述因子VII/因子VIIa肽上。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述天冬酰胺殘基選自N152、N322及其組合。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述因子VIIa肽為生物活性的因子VIIa肽。
16.權(quán)利要求1的方法，其在步驟(a)之前進一步包括
(b)在適合的宿主中表達所述因子VII/因子VIIa肽。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述宿主為哺乳動物表達體系。
18.在有此需要的受試者中治療病癥的方法，所述病癥的特征為所述受試者中凝血效價受損，所述方法包括向受試者施用有效改善所述受試者中所述病癥的量的根據(jù)權(quán)利要求1的方法制備的因子VII/因子VIIa肽綴合物的步驟。
19.提高哺乳動物中凝血效價的方法，所述方法包括向所述哺乳動物施用適量的根據(jù)權(quán)利要求1的方法制備的因子VII/因子VIIa肽綴合物。
20.制備包含糖基接頭的因子VII/因子VIIa肽綴合物的方法，所述接頭包含具有下式的修飾的唾液酰基殘基
其中
R2為H、CH2OR7、COOR7或OR7
其中
R7表示H、取代的或未取代的烴基或取代的或未取代的雜烴基；
R3和R4獨立地選自H、取代的或未取代的烴基、OR8、NHC(O)R9
其中
R8和R9獨立地選自H、取代的或未取代的烴基、取代的或未取代的雜烴基或唾液酸；
R16和R17為獨立選擇的聚合物臂；
X2和X4為獨立選擇的將聚合物部分R16和R17連接到C上的鍵片段；
X5是非反應性基團；以及
La是接頭基團
所述方法包括
(a)使含有糖基部分的因子VII/因子VIIa肽
與具有下式的PEG-唾液酸供體部分
以及將所述PEG-唾液酸轉(zhuǎn)移至所述糖基部分的Gal上的酶，在適合于所述轉(zhuǎn)移的條件下進行接觸。
21.權(quán)利要求20的方法，其中部分
具有選自以下的式
其中
e、f、m和n為獨立地選自1-2500的整數(shù)；以及
q為選自0-20的整數(shù)。
22.權(quán)利要求20的方法，其中部分
具有選自以下的式
和
其中
e、f和f’為獨立地選自1-2500的整數(shù)，以及
q和q’為獨立地選自1-20的整數(shù)。
23.權(quán)利要求20的方法，其中所述糖基接頭包含下式
24.權(quán)利要求20的方法，其中所述因子VII/因子VIIa肽綴合物包含至少一個具有下式的糖基接頭
和
其中
AA是所述肽的氨基酸殘基；
t為選自0和1的整數(shù)；以及
R15為修飾的唾液酸部分。
25.權(quán)利要求20的方法，其中所述因子VII/因子VIIa肽具有SEQ.ID.NO1的氨基酸序列。
26.權(quán)利要求20的方法，其中所述糖基接頭通過為天冬酰胺殘基的氨基酸殘基結(jié)合至所述因子VII/因子VIIa肽上。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述天冬酰胺殘基選自N152、N322及其組合。
28.權(quán)利要求20的方法，其中所述因子VIIa肽為生物活性的因子VIIa肽。
29.權(quán)利要求20的方法，其在步驟(a)之前進一步包括
(b)在適合的宿主中表達所述因子VII/因子VIIa肽。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述宿主為哺乳動物表達體系。
31.在有此需要的受試者中治療病癥的方法，所述病癥的特征為所述受試者中凝血效價受損，所述方法包括向受試者施用有效改善所述受試者中所述病癥的量的根據(jù)權(quán)利要求20的方法制備的因子VII/因子VIIa肽綴合物的步驟。
32.提高哺乳動物中凝血效價的方法，所述方法包括向所述哺乳動物施用適量的根據(jù)權(quán)利要求20的方法制備的因子VII/因子VIIa肽綴合物。
33.合成因子VII或因子VIIa肽綴合物的方法，所述方法包括將
a)唾液酸酶；
b)選自糖基轉(zhuǎn)移酶、外切糖苷酶和內(nèi)切糖苷酶的酶
c)修飾的糖/修飾的唾液?；鶜埢?br> d)因子VII/因子VIIa肽
合并，從而合成所述因子VII或因子VIIa肽綴合物。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述合并的進行時間少于10小時。
35.權(quán)利要求33的方法，其進一步包括加帽步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供因子VII或因子VIIa肽與PEG部分之間的綴合物。該綴合物通過插入肽與修飾基團之間而且與兩者共價結(jié)合的完整的糖基連接基團連接。綴合物由糖基化的和未糖基化的肽通過糖基轉(zhuǎn)移酶的作用形成。糖基轉(zhuǎn)移酶將修飾的糖部分結(jié)合至肽的氨基酸或糖基殘基上。另外提供包含該綴合物的藥物制劑。制備綴合物的方法也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
文檔編號C07K14/435GK101374861SQ200680038896
公開日2009年2月25日 申請日期2006年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月19日
發(fā)明者S·德弗里斯, D·A·佐普夫, S·陶特, W·S·維萊特, R·J·拜爾, M·卡洛 申請人:尼奧斯技術(shù)有限公司