專利名稱：包含多肽的多層膜、涂層和微粒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及通過靜電疊層自組裝("ELBL〃)在適當表面上形成超
薄多層膜。更具體的，本發(fā)明涉及用于設計多肽的方法，所述多肽 用于通過ELBL納米加工薄膜、涂層和微囊，應用于生物醫(yī)藥和其他 領域。
背景技術：
ELBL是已經建立的技術，其中超薄膜通過改變帶相反電荷的聚 電解質的吸附而被組裝。該過程是基于在每層沉積之后薄膜表面電 荷的逆轉。圖1顯示了一般的ELBL過程的示意圖帶相反電荷的聚 離子(陽離子聚離子10和陰離子聚離子11)的薄膜在負電性平面 12上逐層組裝；表面電荷在每層沉積之后逆轉。重復該過程直至形 成所需厚度的薄膜。結合的物理基礎是靜電學和抗衡離子釋放入溶 液后的熵增加，重力和核力實際上沒有起作用。因為該過程的通用 性和相對簡單性，ELBL允許很多不同類型的物質在很多不同類型的 表面上沉積。因此，存在大量可能有用的物質和表面的組合。關于 ELBL的綜合性討論包括它的歷史參見YuriLvov， "Electrostatic Layer-by-Layer Assembly of Proteins and Polyions〃 in Protein Architecture: Interfacial Molecular Assembly and Immobilization Biotechnology, Y. Lvov & H. M6hwald eds. (New
York: Marcel Dekker， 1999)， pp.125- 167，其在這里通過引用整 體并入本文。
ELBL最近己經成為納米技術領域的焦點，因為它可以被用來制 造厚度大致小于1微米的薄膜。另外，ELBL允許對薄膜制造過程的 特殊控制，實現了納米級材料的使用，并允許納米級的結構修飾。 因為每層的厚度都在幾納米或更少的層次上，取決于所使用的材料 的類型和特定的吸附過程，所以能夠形成可精確重復厚度的多層組 裝。
許多合成的聚電解質己經在ELBL應用中被采用，包括聚(苯乙 烯磺酸)鈉(〃PSS〃)、聚(丙烯胺鹽酸)("PAH〃)、聚(二甲基二烯 丙基氯化銨)(〃PDDA〃)、聚(丙烯酰胺-共-二甲基二烯丙基氯化銨)、 聚(乙烯亞胺)(〃PEI〃)、聚(丙烯酸)(〃PAA〃)、聚(茴香烯磺酸)、 聚(乙烯磺酸鹽)(〃PVS〃)和聚(乙烯磺酸)。然而，這類物質并非普 遍用于生物醫(yī)學應用，因為它們是抗原性或毒性的。
蛋白質，作為帶有具有可電離基團的側鏈的聚合物，能夠在用于 各種應用的ELBL中使用，包括生物醫(yī)學的應用。已經在ELBL中使 用的蛋白質的例子包括細胞色素d雞蛋蛋清溶菌酶、免疫球蛋白G、 肌紅蛋白、血紅蛋白和血清白蛋白(^uV)。然而，對于使用蛋白 質用于該目的還存在困難。這些包括對多層結構的有限的控制(因 為蛋白質表面是高度不規(guī)則的且蛋白質一般不會吸附于規(guī)則結構的 表面)，對pH的限制(由于pH依賴性的蛋白質溶解度和結構穩(wěn)定
性)，當使用外源性蛋白時缺乏生物相容性，和放大生產的成本(如 果基因還沒有被克隆)；除非所述蛋白質在容易獲得的來源(例如， 母牛)中是相同的，否則蛋白質將必須從它預期應用的生物體中獲 得，這使得蛋白質的大規(guī)模生產的成本是禁止性的。
對比多肽，其一般比蛋白質小且比較不復雜，構成極好的一類用 于ELBL組裝的材料，而且通過ELBL制造的多肽薄膜結構將有用于 廣泛的應用。本發(fā)明提供了通過ELBL用于薄膜、涂層和微囊的納米 加工的多肽的設計方法。使用本發(fā)明方法設計的多肽將表現幾個有 用的性質，包括但不限于完全確定的一級結構、在水溶液中最低
限度的二級結構、單分散性、每單位長度完全受控制的凈電荷、根 據需要形成交聯的能力、逆轉交聯形成的能力、形成更有組織的薄 膜(比使用蛋白質可能形成的)和相對廉價的大規(guī)模生產成本(假 定基因設計、合成、克隆和宿主表達于大腸桿菌(E C^i)或酵母 中，或者肽合成)。
使用本發(fā)明方法設計的多肽已經顯示有用于薄膜結構的ELBL， 所述薄膜結構在生物醫(yī)學技術、食品技術和環(huán)境技術中具有定向或 可能的應用。這類多肽可以用來例如制造人工紅細胞、給藥裝置和 抗微生物薄膜。
發(fā)明內容
本文公開了包含兩層或更多層聚電解質的多層S臭其中相鄰層包 含帶相反電荷的聚電解質。第一層聚電解質包含復合多肽，所述復 合多肽包含與一個或多個功能區(qū)共價連接的一個或多個表面吸附 區(qū)，所述功能區(qū)生成單個多肽鏈，其中所述復合多肽和所述一個或 多個表面吸附區(qū)具有相同的極性。其中所述一個或多個表面吸附區(qū) 包含一個或多個氨基酸序列基序，所述基序由5至15個氨基酸殘基 組成并且在中性pH下每個殘疾具有大于或等于0. 4的凈電荷強度。 所述一個或多個功能區(qū)包含3至約250個氨基酸殘基。所述復合多 肽不是均聚物，長度至少為15個氨基酸殘基，并且在pH4至10范 圍內具有大于50 pg/mL的水溶解度。而且，第二層包含第二層聚電 解質，所述第二層聚電解質包含聚陽離子材料或聚陰離子材料，所 述聚陽離子材料或聚陰離子材料具有大于1,000的分子量和每分子 至少5個電荷，以及一個與所述第一層聚電解質相反的電荷。
一種生產多層膜的方法，所述膜包含第一層和第二層，其中相鄰 層包含帶相反電荷的聚電解質，所述方法包括共價結合一個或多 個表面吸附區(qū)與一個或多個功能區(qū)以生成復合多肽，其中所述復合 多肽和所述一個或多個表面吸附區(qū)具有相同極性；以及將所述復合 多肽沉積在基質或第二層上，以形成第一層。當沉積步驟包括將所
述復合多肽沉積在基質上時，所述方法進一步包括將所述第二層聚 電解質沉積在所述第一層上。
本發(fā)明還提供了用于在氨基酸序列信息中識別用于在ELBL中使 用的具有確定長度和中性pH下的凈電荷的"序列基序"以及用于記錄 所需數目的基序的新方法。所述方法包括步驟(a)獲得來自特定 生物體的肽或蛋白質的氨基酸序列；(b)定位所述氨基酸序列中的 起始氨基酸；(c)檢査所述起始氨基酸和所述隨后n個氨基酸以確 定具有與所述某一極性相反的極性的荷電氨基酸的數目；(d)如果 具有與所述某一極性相反的極性的所述荷電氨基酸的數目是一或更 多，從步驟g繼續(xù)該方法；(e)檢查所述起始氨基酸和所述隨后n 個氨基酸以確定具有所述某一極性的荷電氨基酸的數目；(f)如果 具有所述某一極性的荷電氨基酸的數目等于或大于&記錄由所述起 始氨基酸和所述隨后n個氨基酸組成的所述氨基酸序列基序；(g) 定位所述氨基酸序列中另一個起始氨基酸；和(h)從步驟c開始 重復所述方法直至所述所需數目的氨基酸序列基序已經被識別或者 所述氨基酸序列中的所有氨基酸已經作為步驟c中的所述起始氨基 酸被使用；其中x大于或等于約1/2 n。
本發(fā)明還提供了用于設計用于在ELBL中使用的多肽的新型方 法，包括步驟(a)使用前段提到的步驟來識別并記錄一個或多個 具有某一極性的凈電荷的氨基酸序列基序和(b)連接多個所述被記 錄的氨基酸序列基序以生成多肽。
本發(fā)明還提供了用于設計在ELBL中使用的多肽的新型方法，包 括如下歩驟(a)重新設計多個氨基酸序列基序，其中所述氨基酸 序列基序由n個氨基酸組成，其中至少x個氨基酸是帶正電且沒有 一個氨基酸是帶負電，或者其中至少x個氨基酸是帶負電且沒有一 個氨基酸是帶正電，其中x是大于或等于約1/2 n;和(b)連接所 述多個所述氨基酸序列基序。氨基酸序列基序可以包含20個普通氨 基酸或非天然氨基酸，所述氨基酸可以是左旋(L-氨基酸)也可以 是右旋(D-氨基酸)。
本發(fā)明還提供了一種薄膜，該薄膜包括多個多肽層，所述多肽層
具有交替的電荷，其中所述多肽包含至少一個由n個氨基酸組成的 氨基酸序列基序，其中至少x個氨基酸帶正電且沒有一個氨基酸帶 負電，或者其中至少x個氨基酸帶負電且沒有一個氨基酸帶正電，
其中x大于或等于約1/2 n。這些多肽中的基序可以使用上述任一方 法來選擇。
本發(fā)明還提供了使用半胱氨酸或其他含巰基的氨基酸類型來"鎖 定(lock)"和"解鎖(unlock)"多肽ELBL薄膜多層的方法。該方法
使薄膜在極端PH下保持穩(wěn)定，對由所設計的多肽納米加工的薄膜的 機械穩(wěn)定性和擴散性質產生較強控制并增加了它們在廣泛應用中的 效用。
圖1是一般ELBL過程的示意圖。
圖2是使用本發(fā)明方法在人類氨基酸序列信息中識別的氨基酸
序列基序的累積二級結構傾向性圖，與105個隨機氨基酸序列的結構
傾向性分布相比較。
圖3 (a)顯示了由石英晶體微量天平技術rQCM")所監(jiān)測到的關
于根據本發(fā)明設計的氨基酸序列組合的吸附數據。
圖3 (b)顯示了由QCM監(jiān)測到的關于根據本發(fā)明設計的不同氨
基酸序列組合的吸附數據的比較。
圖3 (c)顯示了關于根據本發(fā)明設計并制造的氨基酸序列的吸
附質量(納克)與層數的圖。
圖4 (a)描述了根據本發(fā)明半胱氨酸鎖定方法的內層二硫鍵。 圖4 (b)描述了根據本發(fā)明半胱氨酸鎖定方法的中間層二硫鍵。 圖4 (c)描述了由根據本發(fā)明方法設計的多肽所制造的微囊中
二硫鍵的氧化和還原。
圖5是用于識別現有氨基酸序列信息中具有適當的靜電性質用
于ELBL的氨基酸序列基序的本發(fā)明的選擇方法的示意圖。
圖6顯示了在可獲得的人類氨基酸序列數據中識別的非多余序 列基序的數目。
圖7顯示了來自水性介質的聚L-谷氨酸和聚L-賴氨酸的ELBL吸 附，作為離子強度的函數。
圖8顯示了根據本發(fā)明方法設計的多肽的吸附，用于實驗以探測
二硫鍵形成的效果。
圖9顯示了在參考圖8所討論的酸性pH下的薄膜分解過程中材
料保留的百分比。
圖10顯示了在涉及重新設計的含有半胱氨酸的多肽的實驗的酸 性PH分解步驟中材料損失的百分比。
圖ll (a)描述了肽的溶液結構在薄膜組裝上的作用，顯示了聚 L-谷氨酸和聚L-賴氨酸的組裝行為是如何依賴pH的。針對吸附層標 繪出QCM共振頻率。聚L-谷氨酸的平均分子量是84600 Da，而聚L-賴氨酸的平均分子量是84000 數字指的是pH值。E=Glu， K=Lys。 用于組裝的肽濃度是2 mg/mL。
圖ll (b)描述了肽的溶液結構在薄膜組裝上的作用，顯示了聚 L-谷氨酸和聚L-賴氨酸的溶液結構是如何依賴pH的。平均摩爾殘基 橢圓率被標繪為pH的函數。肽濃度是0.05 mg/mL。
圖12顯示了不同長度的聚電解質的吸附數據，說明長的聚電解 質比短的吸附更好。
圖13描述了 "復合"多肽(4)的實施方案，包含兩個表面吸附 (1， 2)區(qū)和一個功能區(qū)(3)。每個表面吸附區(qū)(1， 2)包含一個或多個基 序。
圖14描述了通過溶液相合成、固相合成或重組肽生成來制備復 合多肽(4)的三個不同區(qū)(1，2， 3)。
圖15描述了復合肽(4)的三個區(qū)(1，2， 3)通過肽合成而結合生成 一個多肽鏈。結合該實例三個區(qū)的其他方法是可能的。
圖16描述了 3T3成纖維細胞在具有不同表面涂層的蓋玻片上3 天后的增殖程度。PLL指15層聚(L-谷氨酸)(PLGA)和聚(L-賴氨酸) (PLL) 。 PLL/RGD指10層PLGA/PLL，加5層含RGD的肽，而RGD指
15層含RGD的肽。涂層通過疊層組裝制備，每種情況中的末端層具 有凈正電荷，未涂布的蓋玻片作為對照。涂布表面顯示比未涂布表 面更大的增殖程度，用PLL/RGD涂布的表面顯示最大的增殖。
圖17描述了 "復合"多肽的實施方案，包含兩個表面吸附區(qū) (120和130)和一個功能區(qū)(110)。
圖18(200)描述了 "復合"多肽的實施方案，包含兩個面吸附區(qū) (120和130)和一個功能區(qū)(111)，連接至表面(150)。
具體實施方式
術語解釋
為了在隨后描述中的方便，采納術語的以下解釋。然而，這些解 釋僅僅意為示例性的。它們不是意欲當術語在整個說明書中被描述 或提及時來限制這些術語。更正確的，這些解釋意味著要包括如這 里所描述或主張的術語的其他方面和/或例子。
本文使用的"層"表示經過吸附步驟后在例如薄膜形成模板上 的薄膜厚度增加。"多層"表示多個(即，兩個或更多)厚度增加。"聚 電解質多層薄膜"是包含一個或多個聚電解質厚度增加的薄膜。沉積 后，多層薄膜的層不可以保持為分離的層。事實上，可能存在明顯 的物類摻混，特別是在厚度增加的界面。
本文使用的"生物相容性"表示在攝食、皮膚接觸或引入血液后沒 有引起不利的健康影響。
本文使用的"免疫應答"表示人類免疫系統(tǒng)對血液中物質存在的 響應。免疫應答能以多種方式表征，例如，通過增加血液中識別某 一抗原的抗體的數目(抗體是由免疫系統(tǒng)生成的蛋白質，抗原是引發(fā) 免疫應答的實體)。人體通過增加血液中抗體的數目來對抗感染和抑 制再感染。特異性免疫應答在一定程度上取決于個體，盡管普遍的 應答模式是標準的。
本文使用的"表位"表示被抗體識別的蛋白質的結構。通常，表位 將位于蛋白質的表面上。"連續(xù)表位"是包括成排的幾個氨基酸的表 位，不是包括與折疊蛋白質發(fā)生接觸的氨基酸殘基的表位。
本文使用的"序列基序"和"基序"表示使用本發(fā)明方法識別的給 定殘基數目的氨基酸序列。在優(yōu)選實施方案中，所述殘基數目是7。
本文使用的"氨基酸序列"和"序列"表示至少兩個氨基酸殘基長 度的任意長度的多肽鏈。
本文使用的"殘基"表示聚合物中的氨基酸；這是由此形成所述聚
合物的氨基酸單體的殘基。多肽合成包括水解，即，在氨基酸加入 多肽鏈時"丟失"單個水分子。
本文使用的"設計的多肽"表示使用本發(fā)明方法設計的多肽，術語 "肽"和"多肽"被互換使用。
本文使用的"一級結構"表示多肽鏈中線性的氨基酸序列，"二級 結構"表示由非共價相互作用(通常為氫鍵)包括穩(wěn)定的或多或少有
規(guī)則的結構類型一例子包括a-螺旋、|3-折疊和(3-轉角。
本文使用的"氨基酸"不限于20種通常天然存在的L-a-氨基酸； 如上下文許可，該術語還指L-氨基酸、D-氨基酸和其他非天然氨基 酸。
本文使用的"非天然氨基酸"表示不同于20種天然存在的氨基酸 的氨基酸。
"類肽"或N-取代甘氨酸表示相應的氨基酸單體的類似物，具有 與相應氨基酸相同的側鏈，但是該側鏈附于氨基氮原子而非殘基的 a-碳。因此，聚類肽中單體間的化學鍵合不是肽鍵，這可以用來限 制蛋白水解消化。
"基質"表示具有供水溶液中聚電解質吸附的適當表面的固體材 料?；|表面可以具有實際任何形狀，例如平面、球形、柱形等。 基質表面可以是規(guī)則或不規(guī)則的?；|可以是結晶的?；|大小范 圍從納米尺度至大尺度。而且，基質任選包含膠粒聚集?；|可以 由有機材料、無機材料、生物活性材料或其組合制成。基質硅晶片 的非限制性實例；荷電膠粒，例如CaC03或三聚氰胺甲醛的微粒；生 物細胞例如紅細胞、肝細胞、細菌細胞或酵母細胞；有機聚合物晶 格，例如聚苯乙烯或苯乙烯共聚物晶格；脂質體；細胞器；和病毒。
在一個實施方案中，基質是醫(yī)療裝置，例如人工起搏器、耳蝸植入 物或支架。
當基質在薄膜形成過程中或之后分解或以其他方式去除時，其被 稱為"模板"(用于薄膜形成)。模板顆?？梢匀芙庥谶m當溶劑或 者通過熱處理去除。例如，如果使用部分交聯的三聚氰胺甲醛模板 顆粒，則所述模板可以通過溫和的化學方法分解，例如用二甲亞砜
(DMSO)或通過pH值變化。模板顆粒溶解后，留下由交替聚電解質層 構成的中空多層殼。
〃微囊"是中空殼或核心外涂層形式的聚電解質薄膜。所述核心包 含多種不同的密封劑，例如蛋白質、藥物或其組合。
"生物活性分子〃表示具有生物效應的分子、大分子或大分子組 裝。具體的生物效應可以以適當測定法測量，來測量所述生物效應 并標準化為每單位重量或每分子生物活性分子。生物活性分子可以 封裝或保留在多肽膜內。生物活性分子的非限制性實例是蛋白質、 蛋白質的功能片斷、蛋白質復合物、寡肽、寡核苷酸、核酸、核糖 體、活性治療劑、磷脂、多糖。本文使用的〃生物活性分子"還包括 生物活性結構，例如功能膜片斷、膜結構、病毒、病原體、細胞、 細胞聚集物和細胞器?？杀环庋b或保留在多肽膜內的蛋白質的實例
是血紅蛋白；酶，例如葡萄糖氧化酶、尿素酶、溶菌酶等；細胞 外基質蛋白，例如纖維結合蛋白、層粘連蛋白、玻璃體結合蛋白和 膠原；和抗體?？煞庋b或保留在多肽膜內的細胞的實例是移植的胰 島細胞、真核細胞、細菌細胞、植物細胞和酵母。
本文使用的可溶性多肽在pH 7. 0水溶液中具有大于50嗎/mL的 溶解度。在另一實施方案中，可溶性多肽在pH7.0下具有大于或等 于約1 mg/mL的水溶解度。
下述三字母簡稱在這里用來代表20種普通氨基酸
Ala二賴氨酸 Cyr半胱氨酸 Asp^天冬氨酸
Gli^谷氨酸 Phe二苯丙氨酸 Gly二賴氨酸
His二組氨酸 Ile二異亮氨酸 Lyr賴氨酸 Leu二亮氨酸 Prc^脯氨酸 Ser二絲氨酸 Trp二色氨酸
Met二蛋氨酸 Gl『谷氨酰胺 ThF蘇氨酸 Ty^酪氨酸
As『天冬酰胺
Arg二精氨酸
Val4領氨酸
A.發(fā)明描述
本發(fā)明包括包含帶相反電荷的聚電解質交替層的多層薄S莫其中 所述薄膜的第一層包含設計的多肽。"設計的多肽"表示包含一個或 多個氨基酸序列基序的多肽，其中所述多肽長度為至少15個氨基 酸，并且在pH7.0下，相同符號荷電殘基的數目減去相反符號的殘 基數目，與多肽總殘基數目的比值大于或等于0.4。換言之，每個殘 基的凈電荷強度大于或等于0.4:在另一實施方案中，在pH7.0下，
相同符號荷電殘基的數目減去相反符號的殘基數目，與多肽總殘基 數目的比值大于或等于0.5。換言之，每個殘基的凈電荷強度大于或 等于0.5。在一個實施方案中，設計的多肽不是均聚物。
在一個實施方案中，聚電解質包含具有大于1， 000的分子量和每 分子至少5個電荷的聚陽離子材料或聚陰離子材料。在一個實施方 案中，聚陽離子材料包含聚胺，例如多肽、聚乙烯胺、聚(氨苯乙烯)、 聚(氨基丙烯酸酯)、聚(N-甲基氨基丙烯酸酯)、聚(N-乙基氨基丙烯 酸酯)、聚(N，N-二甲基氨基丙烯酸酯)、聚(N，N-交聯羧甲基纖維素 二乙基氨基丙烯酸酯)、聚(氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N-甲基氨基-甲 基丙烯酸酯)、聚(N-乙基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N，N-二甲基氨基 甲基丙烯酸酯)、聚(N，N-二乙基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(乙烯亞 胺)、聚(二烯丙基二甲基氯化銨)、聚(N，N，N-三甲基氨基丙烯酸酯 氯化物)、聚(甲基丙烯酰胺丙基三甲基氯化銨)、殼聚糖以及包含一 種或多種前述聚陽離子材料的組合物。在另一實施方案中，聚陰離 子材料包含多肽、核酸、藻酸鹽、角叉菜膠、帚叉藻聚糖、果膠、 黃原膠、透明質酸、肝素、硫酸肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、 硫酸葡聚糖、聚甲基丙烯酸、氧化纖維素、羧甲基纖維素、酸性多
糖、交聯羧甲纖維素、含有側鏈羧基的合成聚合物和共聚物，以及 包含一種或多種前述聚陰離子材料的組合物。
本發(fā)明還提供了用于通過ELBL納米加工薄膜、涂層和微囊的多 肽的設計方法，用于在生物醫(yī)學和其他領域的應用。所述方法包括5 個主要的設計，其關注(1)多肽的靜電性質；(2)多肽的物理 結構；(3)從多肽制造的薄膜的物理穩(wěn)定性；(4)多肽和薄膜的 生物相容性；和(5)多肽和薄膜的生物活性。第一個設計關注，靜 電學，可能是最重要的，因為它是ELBL的基礎。沒有適當的電荷性 質，多肽將不溶于水溶液中并不能用于薄膜的ELBL納米加工。我們 已經設計了新型的方法，用于識別氨基酸序列信息中具有適合于 ELBL的靜電性質的氨基酸序列基序。
用于ELBL的多肽的二級結構也是重要的，因為薄膜的物理性 質，包括它的穩(wěn)定性，將取決于肽的溶液結構如何轉變?yōu)樗诒∧?中的結構。圖11描述了某些多肽的溶液結構如何與薄膜組裝相關。 (a)顯示了聚L-谷氨酸和聚L-賴氨酸的組裝行為是如何依賴pH 的。顯然，oi-螺旋構型與沉積材料的相關程度高于卩-折疊構型。這 一行為的精確分子解釋有待闡明。(b)顯示這些肽的溶液結構是如 何依賴pH的。在pH4.2時，聚L-谷氨酸大多是or螺旋，如同聚L-賴氨酸在pH 10. 5時。兩種多肽在pH7. 3時都是大多為無結構的線 團狀構型。
余下的關注涉及多肽薄膜的應用。在實施本發(fā)明中，將根據特定 應用的設計要求將或多或少的權重放在這些其他關注上。
通過使用本發(fā)明的選擇方法以在氨基酸序列信息中識別具有適 當的電荷特征的氨基酸序列基序并利用其他設計關注以選擇特定基 序，能夠設計適合于ELBL制造應用于生物醫(yī)學和其他領域的納米結 構薄膜的多肽?；蛘撸梢允褂帽景l(fā)明的方法來重新設計用于在ELBL 中使用的多肽。所述重新設計的方法基本上與在現有氨基酸序列信 息中識別基序的方法相同，除了氨基酸序列基序中每個殘基是由實 施人員選定而非在特定生物體的基因組或蛋白組信息中被識別的完 整基序。必須強調的是，關于新生多肽的設計，本發(fā)明所舉出的基
本的多肽設計原則不依賴于所涉及的氨基酸是否為20種普通天然存 在的氨基酸、非天然氨基酸或它們的一些新型組合。而且，其他D-
氨基酸和L-氨基酸都能夠被使用。
本發(fā)明的設計關注在下面更詳細的討論。 1.靜電學
我們已經設計了用于在氨基酸序列信息中識別具有適合用于
ELBL的靜電性質的氨基酸序列基序的方法。使用該方法，我們己經 在人類蛋白質組數據一編碼人體中所有已知蛋白質的基因組的蛋白 質翻譯一中識別了 88315個非多余氨基酸序列基序。該信息可通過 美國國立生物技術信息中心("NCBI〃)網 站http:〃ww. ncbi. nlm. nih. gov等公開獲得。這類信息隨人類基 因組的進一步分析而被經常更新。隨著這類信息的增加，在人類序 列信息中通過本發(fā)明的選擇方法能夠被識別為具有用于ELBL的適當 的靜電性質的氨基酸序列基序的數目也將增加。對于任何生物體而 言都是同樣的。被接受的生化和物理學原理以及下面描述的實驗結 果表明，被識別的序列基序將對于用于ELBL結構的納米加工的多肽 的設計是有用的。
關鍵的選擇標準是在中性pH (pH7，接近人類血液的pH)下每單
位長度的平均電荷。另外，有幾個結構的優(yōu)選。首先，優(yōu)選的是每 個氨基酸序列基序由僅7個殘基組成。 a.基序中殘基的總數
在優(yōu)化生物相容性、物理結構和非多余序列基序數目的努力中， 長度為7的基序在可獲得的氨基酸序列數據中被選擇。
如下所討論的，氨基酸序列基序上每個殘基的凈電荷強度大于或 等于0.4。在一個實施方案中，每個序列基序中至少半數氨基酸殘基 是荷電的，這樣，氨基酸序列基序上每個殘基的凈電荷強度大于或 等于0.5。而且，優(yōu)選但非必須的，每個基序的所有荷電殘基具有相 同電荷。這些要求保證了每個基序可充分溶解于水溶劑，并在中性 pH下具有足夠的電荷用于ELBL。因為只有相對小比例的氨基酸類型 是帶電的，當給定氨基酸序列長度增加時，所述序列具有足夠比例
的適當荷電氨基酸用于ELBL的幾率降低。對于大小為7的基序，4 個荷電氨基酸是優(yōu)選最低限度的，因為少于4個電荷，產生實質降 低的肽溶解度和降低的對ELBL的控制。
關于生物相容性(下面進一步討論)，每個被識別的序列基序是 足夠長的以在7個殘基上構成連續(xù)表位(相關于設計的肽可能被引 入其中的生物體的可能的免疫應答)，但不是長至完全符合在蛋白 質表面上和其內部的殘基；電荷要求幫助確保序列基序在折疊蛋白 質的表面出現；荷電殘基不能形成于折疊蛋白的核心。相反，非常 短的基序可能對于機體而言是隨機的序列或者非特別"自我"的序 列，并因此引發(fā)免疫應答。盡管用于生成抗體的肽的理想長度是一 些爭論點，但大部分肽抗原的長度范圍從12至16個殘基。9個殘基 或更短的肽可以是有效的抗原；長于12或16個氨基酸的肽可以含 有多個表位(Angeletti， R. H. (1999) Design of Useful P印tide Antigens, / ^j'o歷o丄7fec力.10:2-10，其因此通過引用整體并入 本文)。因此，為最小化抗原性，可以優(yōu)選短于12以和更好的短于9 個殘基的肽。
優(yōu)選的基序不應該太長的另外一個原因為最小化二級結構的形 成。二級結構降低了多肽(見下文)和由它們制成的薄膜的物理結 構的控制。因此，氨基酸序列基序應該含有5至15個連續(xù)氨基酸。
而l當每個基序的殘基數目為7時發(fā)現了最大數目的非多余基 序。圖6顯示了在可獲得的人類氨基酸序列信息中的非多余基序的 數目。陽性基序的最大數目是對于5個氨基酸長度，而陰性基序的 最大數目是對于7個殘基長度。陽性和陰性基序的最大數目對于5 和7是大約相同的。因此，7個殘基的基序長度似乎將最大化非多余
基序的數目。
由于所有的上述原因，7個殘基是以優(yōu)化用于ELBL的多肽設計 的優(yōu)選的基序長度。然而，有可能在一些情況下，稍微更短的或稍 微更長的基序也將同樣起作用。例如，可以采用5或6個殘基長度 的基序，而長度處于8-15個殘基級別的基序也可能是有效的。因此， 7個殘基的基序長度似乎將最大化非多余基序的數目。
b.荷電殘基的數目
第二，優(yōu)選地至少4個荷正電的(堿性的)氨基酸(Arg、 His或 Lys)或至少4個荷負電的(酸性的)氨基酸(Glu或Asp)在中性pH 下存在于每個7殘基的基序中。在致力于保證中性pH下足夠高的電 荷密度時，不贊成正電荷和負電荷的組合。然而，同時含有陽性氨 基酸和陰性氨基酸的基序可能用于ELBL。例如，稍微更長的(約9 個殘基)基序可以具有6個荷正電的氨基酸和1個荷負電的氨基酸。 重要的是凈電荷強度(即，靜電荷的絕對值)一整個肽必須在中性PH 下是或者足夠荷正電或足夠荷負電的。然而，所述基序的優(yōu)選的實 施方案將只含有Glu或Asp或者只含有Arg、 His或Lys作為荷電氨 基酸(盡管其他非荷電氨基酸可能并且通常是形成基序的部分)， 除非非天然氨基酸被允許作為酸性或堿性氨基酸。
圖5是顯示在用于識別具有適當的靜電性質的氨基酸序列的選 擇過程中所涉及的步驟的流程圖。假定只有20種普通氨基酸被涉 及。如果尋找荷負電的基序，所述過程從定位序列數據中的氨基酸 開始。該氨基酸將被稱為"起始氨基酸"，因為它是用于分析周圍氨 基酸的起始點(即，它將開始所述基序)。接下來，對起始氨基酸 和隨后6個殘基檢查Arg、 His或Lys的出現。如果一個或多個Arg、 His或Lys位于這7個氨基酸中，該過程在另一個起始氨基酸重新開 始。如果沒有發(fā)現Arg、 His或Lys，對這7個氨基酸檢査以確定Glu 和/或Asp出現的數目。如果Glu和/或Asp在這7個殘基中出現至 少4次，則該序列基序被編入目錄。所述選擇過程對荷正電的氨基 酸基本相同，除了分別地Glu和Asp被Arg、 His和Lys所取代以及 Lys被Glu和Asp所取代之外。顯然，也可以在氨基酸序列的起始端 (氨基末端)開始該方法并進行至結束端(羧基末端)，或者，可 選地，可以在隨機位點開始并隨機地或者系統(tǒng)地以任一方向完成序 列中所有的氨基酸。而且，可以使用該方法來識別序列信息中含有 非天然氨基酸的基序，例如，如果密碼子被用來代表各非天然氨基 酸類型。在這種情況下，可以搜尋分別代替Glu和Asp以及Arg、 Lys 和His的非天然的酸性或堿性氨基酸。
在一個實施方案中， 一個或多個第一氨基酸序列基序由5至15
個氨基酸組成，其中所述第一氨基酸序列上每個殘基的凈電荷強度
大于或等于0.4。另一實施方案中， 一個或多個第一氨基酸序列基序 由n個氨基酸組成，其中在pH7時所述第一氨基酸序列上每個殘基 的凈電荷強度大于或等于約1/2 n，并且其中n為5至15。
其余的設計關注，即物理結構、物理穩(wěn)定性、生物相容性和生物 功能性，主要涉及將使用設計的多肽的特定應用。如上所述，將根 據特定應用所需的肽性質在設計過程中或多或少地權衡這些關注。
2.物理結構
關于氨基酸序列基序的一個設計關注是它們形成二級結構的傾 向性，特別是or螺旋或P-折疊。我們已經在幾個途徑尋求控制、顯 著最小化所設計的多肽在含水介質中的二級結構，以最大化對薄膜 層制造的控制。首先，優(yōu)選地所述序列基序是相對短的，因為長基 序更容易在溶液中采用穩(wěn)定的三維結構。第二，我們在多肽設計的 優(yōu)選實施方案中的每個基序之間設置了甘氨酸殘基。甘氨酸具有非 常低的cx-螺旋傾向性和非常低的P-折疊傾向性，使其積極地非常不 利于甘氨酸和其鄰近氨基酸在水溶液中形成規(guī)則的二級結構。脯氨 酸在一些方面具有類似的性質并能夠作為甘氨酸的替代物被用來連 接基序。第三，我們已經尋求最小化所設計的多肽自身的a-螺旋或 卩-折疊傾向性，通過關注累積a-螺旋傾向性小于7. 5和累積p-折疊 傾向性小于8的基序("累積"傾向性表示基序中所有氨基酸的or螺 旋或P-折疊傾向性的總和)。然而，在一些情況下，具有高幾分的累 積(X-螺旋傾向性和/或(3-折疊傾向性的氮基酸序列將可能適合用于 ELBL，因為基序間的Gly (或Pro)殘基將在抑制穩(wěn)定的二級結構在 所設計的多肽形成中起關鍵作用。事實上，在某些應用中可能希望 多肽的傾向性以形成相對高級的二級結構作為薄膜制造的特殊設計 特征；如上所述，依然必須滿足對ELBL的必要的靜電電荷要求。
為了能夠選擇具有所需二級結構傾向性的氨基酸序列，我們首先 使用Chou和Fasman的方法(見P. Chou和G. Fasman歷oc力e肌'W/y 13:211 (1974)，其全部內容通過引用并入本文)為全部20個氨基酸
計算了二級結構傾向性，利用來自超過1800個高分辨率的X射線晶 體結構的結構信息(1334個含有a-螺旋和1221含有p折疊股 (P-strands))。結構選自蛋白質數據庫(Protein Data Bank,公 共可獲得的蛋白質結構庫)，基于(a)結構測定方法(X-射線衍射)； (b)分辨率(好于2.0A)—這里的"分辨率"指如在Rayleigh標準中 能夠分辨的最小尺寸；和(c)結構多樣性(被用來計算各種氨基酸的 螺旋和折疊傾向性的蛋白質晶體結構之間少于50%的序列同一性)。 其原理是選擇由最可靠的方法學所確定的高分辨率結構并通過具有 相似結構而不偏移傾向性計算。接下來，使用個人計算機中的隨機 數字發(fā)生器生成100000個非多余性隨機序列用于比較。然后，我們 計算了使用上面(A) (l)部分中描述的選擇方法所識別的88315個氨 基酸序列(59385個非多余性堿性序列基序和28930個非多余性酸性 序列基序)的二級結構傾向性。然后將所述隨機序列的傾向性與所 選擇的序列的傾向性進行比較。圖2顯示了在這些序列基序中的二 級結構形成的分布。圖2中的矩形突出了我們已經識別為最小限度 可能形成基于二級結構傾向性的二級結構的序列基序。 3.物理穩(wěn)定性
另外一個設計關注是多肽ELBL薄膜的穩(wěn)定性的控制。離子鍵、 氫鍵、范德華相互作用和疏水性相互作用為ELBL薄膜提供了一些盡 管相對有限的穩(wěn)定性。相反，共價的二硫鍵可以提供特殊的結構強 度。我們已經設計了使用半胱氨酸(或一些其他類型的含巰基氨基 酸)來"鎖定"和"解鎖"相鄰的ELBL薄膜多肽層的新型方法。該方法 使多肽納米加工的薄膜能夠在極端PH下保持穩(wěn)定，產生對其機械穩(wěn) 定性和擴散性質的較強控制(關于由非多肽聚電解質制成的多層薄 膜的多孔性的討論，參見Caruso, F. ， Niikura， K. ， Furlong, N. 和Okahata (1997) L3塔廳'rl3:3427以及Caruso, F. ， Furlong, K Ariga， K. , Ichinose， L禾口Kunitake, T. (1998)力3/7g麗'r 14:4559, 兩者在這里都通過引用整體并入本文)。而且，在所設計的多肽的序 列基序中整合入半胱氨酸(或一些其他類型的含巰基氨基酸)實現 了相對短的肽在薄膜制造中的使用，由于分子間二硫鍵的形成。沒
有半胱氨酸，這種肽一般不能生成足夠穩(wěn)定的薄膜(見圖12，如下討 論)。因此，我們新穎的半胱氨酸的使用將避免需要在大部分可能 的應用中生成昂貴的長類型的設計的多肽。這將特別有利于要在被 包裹的材料上制造薄膜的情況，所述材料如小的藥物晶體、小球狀 的血紅蛋白晶體或含有血紅蛋白的溶液。
對于其中薄膜物理穩(wěn)定性是重要的應用，含有半胱氨酸(或一些 其他類型的含巰基氨基酸)的氨基酸序列基序可以選自使用上述方 法識別的基序文庫，或者使用上述原理進行重新設計。然后，能夠 根據所選自或設計的氨基酸序列基序設計并形成多肽。 一旦多肽被 化學合成或在宿主生物體中生成，則在還原劑存在完成含有半胱氨
酸的肽的ELBL組裝，以防止過早的二硫鍵形成。緊接著組裝，還原 劑被去除并加入氧化劑。在氧化劑存在下，半胱氨酸殘基之間形成 二硫鍵，從而一起"鎖定"含有它們的多肽層。
該"鎖定"方法可以使用下面的特定的微囊制造的例子來進一步 描述。首先，含有半胱氨酸的設計的多肽被用來在適當荷電的球形 表面上通過ELBL制造多層，正常在中性pH下并含有二硫蘇糖醇 (〃DTT")(—種還原劑)的水溶液中。接下來，通過過濾、滲濾或其 他現有技術中已知的類似方法去除DTT，引起胱氨酸形成配對的半胱 氨酸側鏈并從而穩(wěn)定薄膜。如果肽多層被構建在含有希望包裹的物 質(例如晶狀體物質)的核心顆粒上，所述制造過程是完全的并且 能夠隨后使所述核心顆粒在被包裹的環(huán)境中溶解，例如通過pH的改 變。然而，如果所述多層被構建在"對照劑"核心顆粒上，則所述核 心必須被去除。當例如三聚氰胺甲醛顆粒(〃MF〃)時， 一般通過降低 pH溶解核心一溶解是酸催化的。隨著核心的溶解，溶液的pH被調至 4其中肽多聚陰離子上的部分電荷使微囊可半滲透的(compare Lvov 等人(2001) 7V朋0 Ze"ers 1: 125，其由此整體并入本文)。接下 來，lOmM的DTT被加至微囊溶液以減少胱氨酸至半胱氨酸。然后微 囊可以被"裝填"，通過將它們轉移至將要被包裹的材料的濃縮溶 液，例如，蛋白質(ibid)。所述蛋白質通過移下其濃度梯度而進入,
微囊。微囊化的蛋白質通過去除還原劑和加入氧化劑而被"鎖入"， 從而促進二硫鍵的形成。
本發(fā)明的半胱氨酸"鎖定"和"解鎖"的方法示意圖在圖4中顯示。 半胱氨酸能夠同時形成分子內和分子間的二硫鍵。進一步的，二硫 鍵能夠在同一層或相鄰層中的分子間形成，取決于薄膜中含有半胱
氨酸的肽的位置。參考圖4 (a)，堿性多肽2通過二硫鍵3在其中 堿性肽含有半胱氨酸的所有層中連接。插入層(圖中由半透明層4 表示)的酸性肽不含半胱氨酸。然而，如果酸性和堿性側鏈在周圍 環(huán)境的pH下荷電，則交替層繼續(xù)靜電相互吸引。參考圖4(b)， 二硫 鍵在層間顯示。這種結構將在用于ELBL的酸性和堿性多肽(即交替 層)同時含有半胱氨酸并且所使用的方法己經適合于二硫鍵形成的 時候形成。參考圖4(c)，還原和氧化反應通過分別斷裂和形成二硫 鍵3被用來調節(jié)被包裹的化合物5的釋放，并從而調節(jié)顆粒通過囊 壁的擴散。
半胱氨酸"鎖定"和"解鎖"是調節(jié)ELBL薄膜結構完整性和滲透性 的新穎方法。現有技術已知戊二醛能夠被用來交聯蛋白質，這種化 學物質因此能夠被用來穩(wěn)定多肽薄膜。然而，戊二醛交聯是不可逆 的。相反，本發(fā)明的半胱氨酸"鎖定"和"解鎖"方法是可逆的并因此提 供了對結構形成更好的控制，并且重要的是提供了能夠使用本發(fā)明 方法制造的薄膜和膠囊的應用。血液是一種氧化環(huán)境。因此，在某 一生物醫(yī)學應用中，例如由設計的多肽所制造的人工紅細胞或給藥 系統(tǒng)，在二硫鍵形成后將Cys-交聯的多肽薄膜暴露于血液或一些其 他氧化環(huán)境不預期引起這些鍵的斷裂。最后，還應該注意，涉及非 天然氨基酸的應用將使用一些其他的含巰基氨基酸類型取代Cys。例 如巰基能夠被加至P-氨基酸如D，L-(3-氨基-(3-環(huán)己基丙酸D,L-3-氨基丁酸；或5-(甲基硫)-3-氨基戊炔酸(見 http://www. synthatex. com)。
4.生物相容性
生物相容性是生物醫(yī)學應用中的主要設計關注。在這類應用中， 本發(fā)明的實施者將旨在識別會產生"免疫惰性"多肽的基因組或蛋白
組信息，特別是如果形成或包裹的對象將與循環(huán)血液接觸。為了本 發(fā)明的目的，優(yōu)選地，上述(A)(1)部分中討論的選自過程被用來分 析血液蛋白的氨基酸序列。這將使最小化生物體免疫反應的機率最 大化。
存在用于預測氨基酸序列抗原性的計算機算法。然而，這類方法
在現有技術中已知為至多是半可靠的。在本發(fā)明中，使用上面(A) (1)
部分中討論的選擇方法所識別的序列基序是高極性的。因此，所述 基序必須出現在天然狀態(tài)蛋白質的表面，其中基序是所述蛋白質的 部分。"表面"是折疊蛋白質與溶劑相接觸的部分或因為水的粒狀性 質而難以獨自接近溶劑的部分。"內部"是折疊蛋白質因任何其他原 因而難以接近溶劑的部分。折疊的球狀可溶性蛋白類似有機晶體， 內部被稠密地包裹如在晶格中而外部與溶劑水相接觸。因為它們的 電荷性質，使用本發(fā)明方法識別的多肽序列基序必須主要(如果不 是唯一地)發(fā)生在蛋白質表面上。因此，當所述蛋白質在血液中時， 使用本發(fā)明的選擇方法在人類血液蛋白中識別的所有序列基序總是 與免疫系統(tǒng)有效地接觸。這適用于可以在血液中數目增加的蛋白質 的所有構型，包括變性狀態(tài)，因為這高度積極不利于傳遞電荷從水 介質至低價電解質(如存在于蛋白質內部)。因此，被接受的生化 原理表明，使用本發(fā)明方法從血液蛋白設計的多肽或者不會引發(fā)免 疫應答或者引發(fā)最低限度的免疫應答。同樣的原因，使用本發(fā)明方 法設計的多肽應該是可生物相容的。不僅是血液蛋白中的那些，使 用本發(fā)明的選擇方法從基因組數據中識別的所有序列基序都應該是 可生物相容的，盡管免疫應答或任何其他類型的生物反應的程度很 可能依賴于序列基序的特定細節(jié)(因為基序所基于的多肽序列實際 存在于所述薄膜為之制造的生物體中，這種方法將至少原則上同樣 適合用于任何類型的生物體。例如，該方法可以對獸醫(yī)科學具有重 要價值)。免疫反應和生物相容性對設計的肽在生物醫(yī)學應用中的 用途都是重要的，包括但不限于生產人工紅細胞、給藥系統(tǒng)或用于 制造生物相容性薄膜以包裹用于長期或短期引入生物體的植入物的 多肽。
5.生物活性
在多肽薄膜、涂層或微囊的一些應用中，期望調整多肽的設計來 包括用于某一結構層(通常是最外層)的功能性結構域。這里的功 能性結構域是具有特定生物功能性(例如結合磷酸酪氨酸)的蛋白 質的獨立地熱穩(wěn)定區(qū)域?，F有技術中已知這種生物功能性可以與多 結構域蛋白質中的其他功能性整合，例如在張力蛋白中，其包括磷 酸酪氨酸結合結構域和蛋白質酪氨酸磷酸酶結構域。在設計的多肽 中包括這種結構域可以許多方式行使功能，包括但不限于特異性配 體結合、細胞內靶向、生物傳感或生物催化。
在一個實施方案中，多層膜包含第一層復合多肽，所述第一層復 合多肽包含與一個或多個功能區(qū)連接的一個或多個表面吸附區(qū)，其 中所述第一層復合多肽和所述一個或多個表面吸附區(qū)具有相同極 性。所述表面吸附區(qū)包含一個或多個氨基酸序列基序。所述第一層
復合多肽長度至少為15個氨基酸，并且在pH 4至10的水溶液中具 有大于50 ng/mL的溶解度。在一個實施方案中， 一個或多個表面吸 附區(qū)和一個或多個功能區(qū)具有相同極性。在另一實施方案中，所述 第一層復合多肽在pH 4至10時的溶解度大于或等于約1 mg/mL。溶 解度是實際的限制，以促進多肽從水溶液沉積。復合多肽聚合度的 實際上限為約l，OOO個殘基。但是，可以想象，更長的復合多肽可 以通過適當的合成方法來實現。
在一個實施方案中，復合多肽包含一個功能區(qū)和一個表面吸附 區(qū)，其中所述表面吸附區(qū)包含兩個氨基酸序列基序。在另一實施方 案中，復合多肽(4)包含一個功能區(qū)(3)和兩個表面吸附區(qū)(1，2)， 一 個吸附區(qū)連接至功能區(qū)的N末端，而另一吸附區(qū)連接至功能區(qū)的C 末端，其中每個表面吸附區(qū)包含一個或多個氨基酸基序，并且兩個 表面吸附區(qū)相同或不同并具有相同的極性(圖13)。表面吸附區(qū)的目 的是使多肽能夠吸附在帶相反電荷的表面上，以構建多層膜。功能 區(qū)的目的是為所述膜提供特定功能性，例如生物功能。其他類型的 功能是可能的。例如，在一個實施方案中，功能區(qū)賦予多肽多層以 高度特異性結合二價鈣離子的能力，因為在此情況下，功能區(qū)是已 知的鈣結合蛋白質基序，例如人乳蛋白(x-乳白蛋白的鈣結合環(huán)。即 使一些生物大分子表現出這種能力，并且實現這種結合的肽結構己 經被設計成多層膜，但是多層膜高特異性結合鈣離子的能力決不是 生物的。
相對功能區(qū)的數目和/或長度的復合多肽中表面吸附區(qū)數目與溶 解度需求有關。例如，如果功能區(qū)是短的氨基酸序列，例如"RGD"，
即精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，則僅需要一個至少12個氨基酸殘基的
氨基酸序列基序來吸附復合多肽至適當荷電表面上。相對比，如果
功能區(qū)是適當折疊的蛋白質結構域，例如包含120個氨基酸殘基， 則通常兩個氨基酸序列基序將足以賦予復合多肽足夠的電荷以使其 為水溶性的并適合吸附。所述基序可以是連續(xù)的并位于結構域的N 末端，或者是連續(xù)的并位于結構域的C末端，或者是不連續(xù)的，一 個位于N末端而一個位于C末端。
與復合肽功能區(qū)的氨基酸殘基數目相比較結合的表面吸附區(qū)長 度與由于熱能的分散更有關，所述分散必須在復合肽吸附的同時被 克服。因此，將功能區(qū)聚合度提高至兩倍不一定需要表面吸附區(qū)長 至復合肽表面吸附區(qū)有效結合長度的兩倍。復合肽與表面的吸附的 物理基礎是靜電吸引(和抗衡離子釋放至總體溶液)，結構域的精 確質量對于納米長度尺度是次重要的，抵抗復合肽吸附的主要 "力"是熱能，鑒于此，本領域技術人員能夠容易設計適合物理吸 附至特定目標功能區(qū)表面的表面吸附區(qū)。
一個功能區(qū)包含3至約250個氨基酸殘基術語功能區(qū)包括功能 基序和功能結構域。功能基序包括相對少的氨基酸殘基，因此一般 不具有緊密或持久的三維結構;但是，它們可以表現出特定功能性， 如一些肽激素和神經肽的功能，并且它們可以包含二級結構元件例 如or螺旋和(3-折疊。功能基序的實例由細胞外基質蛋白纖維結合素 的RGD序列提供。當功能單元是功能基序時，其通常包含3至約50 個氨基酸殘基。當功能區(qū)是結構域時，其通常包含約50至約250個 氨基酸殘基。
功能區(qū)在本文定義為至少多肽的一部分，當折疊時產生其自身的 疏水核心。例如，天然蛋白可以含有多個結構域，每個結構域作為 獨立的結構和功能單元起作用。 一個結構域的生物功能可以完全獨 立于另一個結構域的功能，如同一肽鏈中的催化結構域和結合結構 域的情況，其中這兩個結構域彼此完全不相互作用。天然蛋白中結 構域之間的結構相互作用不僅是可能的，而且是相對普遍的；在這
些情況下， 一個結構域與另一結構域之間的相互作用可以視為一種 四級結構。
本文使用的功能結構域通常具有最少約50個氨基酸殘基和最大 約250個氨基酸殘基。原則上，蛋白質的任何功能結構域可以用于 本文描述的復合肽，只要復合多肽具有用于ELBL沉積的適當水溶解 度。在一個實施方案中，功能結構域在pH 4至10具有大于50昭/mL 的水溶解度。在另一實施方案中，功能結構域在pH 4至10具有大 于1 mg/mL的水溶解度。在另一實施方案中，當功能單元包含功能 結構域時，第一層復合多肽包含至少兩個氨基酸序列基序。
當復合多肽包含替代功能結構域的功能基序時，其每個殘基的凈 電荷通常大于或等于0. 4。但是，如果功能基序具有小于0.4的凈電 荷/殘基，則一個或多個表面吸附區(qū)的每個殘疾通常會具有大于0.4 的凈電荷，以補償并給予復合多肽適當的電荷性質，用于溶解性和 物理吸附。
包括在復合多肽中的適當功能區(qū)包括控制薄膜穩(wěn)定性和/或封 囊物質從薄膜/膠囊釋放的含半胱氨酸的基序或蛋白酶識別部位；控 制免疫原性的T細胞表位、B細胞表位或細胞毒性T淋巴細胞表位； 適合通過酶催化連接單糖或多糖的序列，例如，如在N-聯或O-聯糖 基化中；控制表面功能性和組織工程的細胞外基質蛋白中的肽識別 序列；控制抗微生物性質的抗細菌肽的序列；用于體內特異性耙向 跨膜受體的細胞外結構域；和用于控制二價陽離子結合的陽離子結 合基序，例如EF手基序。
在一個非限制性實施方案中，復合肽的功能區(qū)包含蛋白酶識別序 列。適當的蛋白酶識別序列包括例如Xa因子識別序列He-Glu/
Asp-Gly-Arg I ，腸激酶識別序列Asp-Asp- Asp-Asp-Lys I ，凝血酶 識別序列Leu-Val- Pro-Arg I Gly-Ser ， TEV蛋白酶識別序列 Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln i Gly， PreScissionTM蛋白酶識別序列 Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln I Gly-Pro等。
在另一非限制性實施方案中，復合肽的功能區(qū)包含T細胞表位、 B細胞表位或細胞毒性T細胞表位。本文使用的"T細胞表位"指由 T細胞識別的任何肽抗原決定子。本文使用的"B細胞表位"指由B 細胞免疫球蛋白受體識別并且當施用至動物時能夠在T細胞適當輔 助下引發(fā)抗體生成的任何肽抗原決定子。本文使用的"細胞毒性T 淋巴細胞表位"指由細胞毒性T淋巴細胞識別的任何肽抗原決定 子。所述表位是由病毒、細菌、真菌或寄生蟲產生的多肽。有時， 所述表位可以是連接或能夠連接單糖或寡糖的多肽，例如通過N-聯 或O-聯糖基化。
糖基化是在大部分真核細胞中發(fā)生的普遍且高度多樣的蛋白質 修飾反應。這種修飾可以分為兩大類，N-聯和O-聯。在N-聯中，碳 水化合物部分連接至天冬酰胺側鏈的酰胺氮，此時天冬酰胺是共有 序列Asn-X-Ser/Thr的部分。該信號對于糖基化是必要但非充分的， 例如，X不能是Pra并且當Pro剛好在Ser/Thr糖基化下游出現時， 糖基化被抑制，在0-聯糖基化中，碳水化合物部分連接至Ser或Thr 的羥基氧；其還可以發(fā)生為酪氨酸的初步修飾和5-羥賴氨酸和4-羥 脯氨酸的次生修飾。在O-聯糖基化位點周圍高頻率出現Pro、 Ser、 Thr和Ala殘基。
線性表位是由沿聚合物鏈的氨基酸殘基連續(xù)串構成的片斷。通常 的線性表位長度約5至約30個氨基酸。相反，構象表位由兩個或更
多個不連續(xù)的片斷構成，所述不連續(xù)的片斷通過抗原折疊成其天然 結構而結合在一起。構象表位一般對應的肽鏈比線性表位對應的肽 鏈更長。任一類型的表位都可以用作LBL的復合多肽的功能區(qū)。
在另一非限制性實施方案中，復合肽的功能區(qū)包含來自抗細菌肽 的序列。抗微生物肽包括例如延緩微生物生長的抑制性肽、有效殺 傷微生物的微生物肽(例如，殺菌和殺狂犬病毒的肽藥物、殺菌劑
和消毒劑)以及有效干擾微生物繁殖、宿主毒性等的肽?？刮⑸?br>
肽的實例包括尼生素、桿菌素(carnobacteriocins) B2和BM1、明 串珠菌素(leucocin) A、腸膜菌素Y105、 sakacins P和A以及 curvacin A。
在另一非限制性實施方案中，復合肽的功能區(qū)是用于細胞外基質 (ECM)識別的肽識別序列。 一個這樣的序列，RGD，出現在各種細 胞外基質蛋白中，并且是整聯蛋白跨膜受體分子的關鍵識別序列。 另一ECM識別序列是GFOGER、 GLOGER或GASGER，其中'O'代表羥脯
氨酸。這些是用于膠原結合整聯蛋白的膠原中的識別序列。兩種識 別序列都適合用于LBL的復合肽的功能區(qū)。
在另一非限制性實施方案中，復合肽的功能區(qū)是信號傳導基序， 由用于體內特異性靶向的細胞表面受體識別。受體的細胞外區(qū)域將 結合具有顯著特異性的肽或蛋白質信號配體。肽或蛋白質配體可以 是肽激素(例如，胰島素、加壓素、催產素)、生長因子(例如VEGF， PDGF， FGF)等。這種信號序列適合用于LBL的復合肽的功能區(qū)。在 這樣的情況下，用于LBL的復合肽的功能區(qū)通常是功能基序。類似 地，膜受體的細胞外區(qū)域適合用于LBL的復合肽的功能區(qū)。這樣的 情況下，用于LBL的復合肽的功能區(qū)通常是功能結構域。
在另一非限制性實施方案中，用于LBL的復合肽的功能區(qū)是用于 控制二價陽離子結合的陽離子結合基序，例如EF手基序。其他陽離 子結合結構域包括C2結構i恭"VSFASSQQ"基序和dockerin結構域。
在另一非限制性實施方案中，復合肽的功能區(qū)是磷酸酪氨酸識別 結構域，例如蛋白酪氨酸磷酸酶結構域、C2結構域、SH2結構域或 酪氨酸磷酸酶結合結構域。來自多種不同蛋白質的該結構域對于獨 立折疊單元是已知的。
在另一非限制性實施方案中，功能結構域是聚脯氨酸識別結構 域，例如SH3結構域。
復合多肽的每個獨立區(qū)域(即，功能區(qū)和表面吸附區(qū))可以通過 溶液相合成、固相合成或適當宿主有機體的基因工程來單獨合成。 溶液相合成是用于生產目前市場上批準的大部分肽藥物的方法。N
末端表面吸附區(qū)(l)、 C末端表面吸附區(qū)(2)和功能區(qū)(3)可以單獨合 成(圖14)。溶液相方法可以用來合成相對長的肽和甚至小的蛋白 質。通過溶液相方法制備的最長的肽是降鈣素(32mers)。更普遍地， 該方法用來以多達數百千克的量制備小或中長度的肽?？梢栽谧裱?良好生產規(guī)范的工廠里生長這么大量的所需肽。
或者，各個獨立區(qū)域可以一起作為單個多肽通過溶液相合成、固 相合成或適當宿主有機體的基因工程而合成。任何具體情況下的方 法選擇將依據方便或經濟。
如果各個功能區(qū)和表面吸附區(qū)被單獨合成則例如通過離子交換 色譜后高效液相色譜純化后，它們通過肽鍵合成而結合。例如，N 末端表面吸附區(qū)(1)、功能基序(3)和C末端表面吸附區(qū)(3)可以單獨 合成，然后結合生成復合多肽(3)(圖15)。該方法類似于所謂的雜 交合成，其中帶有完全保護側鏈的肽片斷通過固相技術合成，然后 通過溶液相或固相方法的肽鍵而結合。這種雜交方法已經用來合成 T20， 一種36個氨基酸殘基的肽，但是它還沒有被廣泛利用。
圖17描述了包含2個表面吸附區(qū)(120和130)和1個功能區(qū)(110) 的"復合"多肽的實施方案。120是N末端表面吸附區(qū)。130是C末 端吸附區(qū)。每個表面吸附區(qū)包含一個或多個基序。"復合"多肽是 表面吸附區(qū)和功能區(qū)在單個多肽鏈中的獨特組合。連接體肽序列 (140)可以用來產生在單個多肽鏈中包含多個功能區(qū)的復合多肽。在 一個實施方案中，功能區(qū)110可以是包含約50至約130個氨基酸殘 基的小功能區(qū)，并且具有約2nm的直徑。在替代實施方案中，功能 區(qū)110可以是包含約250個氨基酸殘基的大功能區(qū)并且具有約4nm 的直徑。16個氨基酸殘基在伸展構型時的長度為約5. 5 nm。
圖18 (200和300)描述了與表面(150)連接的包含2個表面吸附 區(qū)(120禾Q 130)和1個功能區(qū)(lll， 112)的"復合"多肽的實施方 案。圖18的實施方案200描述了與表面(150)連接的包含2個表面 吸附區(qū)(120和130)和1個功能區(qū)(1U)的"復合"多肽，其中功能 區(qū)1U代表包含約50至約130個氨基酸殘基的小功能區(qū)，并且具有
約2 nm的直徑。小功能區(qū)111可以是短肽序列，例如RGD。 120是N 末端表面吸附區(qū)。130是C末端吸附區(qū)。
圖18 (300)進一步描述了包含2個表面吸附區(qū)(120和130)和1 個功能區(qū)(112)的"復合"多肽，其中功能區(qū)112代表包含約250個 氨基酸殘基的大功能區(qū)，并且具有約4nm的直徑。大功能結構域112 可以是蛋白質的結構域，例如張力蛋白的PTP結構域。120是N末端 表面吸附區(qū)。130是C末端吸附區(qū)。
構建復合肽的模擬方法的優(yōu)點包括利用了之前所述的氨基酸序 列基序技術，使風險最小化。其他優(yōu)點包括有關幾乎任何可以想象 的功能區(qū)方法的共性；以及含有相同或不同功能區(qū)和相同或不同表 面吸附區(qū)的具有相同符號電荷的化學上不同的肽可以同時被吸附， 產生了所需要的單功能或多功能表面。作為單個構建塊合成表面吸 附區(qū)和功能區(qū)的優(yōu)點包括預制備和實際不確定地保存(通過凍干) 單個構建塊，以準備待用；通過使用大量制備的保存的構建塊低成 本生產特定功能性的復合肽；與直接固相、溶液相或生物合成相比 較，快速制備復合肽；因為模擬合成方法而對有關功能區(qū)的新發(fā)展 做出快速反應；以及使用基于完全合成的肽和多肽層材料作為最小 化微生物污染的方式，從而簡化了美國食品藥品監(jiān)督管理局對產品 的審批。
C.使用本發(fā)明方法設計的多肽的用途
如上所述適當的設計的多肽是用于ELBL的優(yōu)良材料使用ELBL 制造的多肽薄膜結構將有用于許多不同類型的應用。使用本發(fā)明方 法設計的多肽已經表明有用于薄膜結構的ELBL，用于在生物醫(yī)學技 術、食品技術和環(huán)境技術中可能的應用。例如，這種多肽能夠被用 來制造人工紅細胞。
6.人工紅細胞
許多不同的方法己經被用于紅細胞替代物的開發(fā)。 一種方法涉及 全氟化碳的使用。全氟化碳乳劑包含能夠結合氧并傳遞它至組織的 合成的氟代烴。然而，該方法增加了網狀內皮細胞阻斷。全氟化碳 能夠在網狀內皮系統(tǒng)中被捕捉，其可以導致不利后果。
另外一種方法關注于抗原偽裝，其涉及使用被稱為聚乙二醇
(PEG)的生物相容性聚合物來包裹紅細胞。PEG分子在所述細胞表
面形成永久的共價鍵，以便血液受體的抗體不將所述細胞識別為異
質的。例如，具有A型血液的正常人的免疫系統(tǒng)將天然地具有識別B 型紅細胞表面抗原的抗體，導致細胞破壞。PEG與B型紅細胞表面的 連接"偽裝"了細胞的表面，以便它的表面抗原不能再被免疫系統(tǒng)識 別且抗原性的異質紅細胞將不會被迅速摧毀(參見Pargaonkar， N.A. ， G. Sharma和K. K. Vistakula. (2001) "Artificial Blood: Current Research R印ort〃，其由此通過引用被整體并入本文)。
包括珠蛋白生成障礙性貧血在內的需要重復的血液輸入的許多 疾病常常并發(fā)于針對"較小"紅細胞抗原的抗體的發(fā)風該"同種致敏" 能夠致使這些患者幾乎不可能輸血，致使威脅生命的境地。在體外 測試中，PEG修飾的紅細胞表現出不觸發(fā)同種致敏并還可能有用于同 種致敏已經發(fā)生的臨床表現(見Scott， M.D.等人(1997) "Chemical camouflage of antigenic determinants: Stealth erythrocytes, 〃尸roc 7fe〃. ^cad 5bZ USA. 94 (14) : 7566—7571， 其由此通過引用整體并入本文)。
其他方法涉及純化的血紅蛋白。未經修飾的無細胞的血紅蛋白具 有已知的局限性。這些包括對于有效的組織氧合作用而言過高的氧 親和力、對于臨床有效而言過短的血管內腔中的半衰期和經歷結果 為腎臟管狀損傷和毒性的分解成二聚體的趨勢。因為這些局限性， 被用來制備無細胞的紅細胞替代物的血紅蛋白必須被修飾。許多修 飾技術已經被開發(fā)。血紅蛋白能夠使用如戊二醛的試劑被交聯(通 過化學修飾形成兩個分子間的共價鍵)并聚合。這種修飾導致P5。(所 有氧合位點的50%被占有時的氧分壓)比正常血紅蛋白高的產物并增 加血漿半衰期至30小時。用于此目的的血紅蛋白的來源可以是人類 (過時的捐贈血液)、?；蛉祟愔亟M體。經修飾的血紅蛋白的溶液 從高度純化的血紅蛋白制備并通過各種生化過程提取以清除磷脂、 內毒素和病毒污染物(見Nester， T.和Simpson, M (2000) 〃Transfusion medicine update, 〃 WJoc^ 6^Z s^z.tt/z^51， 其由]t匕通過引用整體并入本文)。Biopure公司(Cambridge, MA)己經使用修飾 的血紅蛋白用于他們的產品Hemopure。
修飾的血紅蛋白溶液的主要的潛在不良作用是全身和肺循環(huán)血 管阻力的增加，其可以導致心臟指數的降低。心臟指數的降低可以 損害最佳的氧傳遞并超過氧運送溶液的優(yōu)點(見Kasper S. M.等人. (1998) 〃The effects of increased doses of bovine hemoglobin on hemodynamics and oxygen transport in patients undergoing preoperative hemodilution for elective abdominal aortic surgery, 〃 細化87: 284-91 ，其由此通過引用整體并
入本文)。 一項研究已經檢驗了這些溶液在不穩(wěn)定床上患者的急性復 蘇相中的效用。然而，研究的設計是差的，且溶液在影響最終患者 結果中的任何作用是不清楚的(見Koenigsberg D.等人.(1999) "The efficacy trial of diaspirin cross-linked hemoglobin in the treatment of severe traumatic hemorrhagic shock, 〃 Jcsd ^77e2^. #ed 6: 379-80，其由此通過引用整體并入本文)。
無細胞的血紅蛋白的許多問題可以通過使用人工膜包裹它而被 克服。脂質體正在被用來包裹作為血液替代物而使用的血紅蛋白。 該方法在技術上是具挑戰(zhàn)性的，因為不僅必須血紅蛋白被制備，而 且它必須以相對高的濃度和收率被包裹。最終產物必須是無菌的并 且脂質體必須在尺寸上相對均一。
包裹的血紅蛋白比無細胞的血紅蛋白具有幾個優(yōu)點。首先，人工 細胞膜保護血紅蛋白免受血漿中的降解和氧化力。第二，所述膜保 護脈管內皮免受血紅蛋白的毒性作用。這些作用涉及亞鐵血紅素的 丟失、02游離基的生成和恥結合的血管收縮作用。第三，包裹大大 增加了血紅蛋白的循環(huán)持續(xù)性。而且，包裹的血紅蛋白能夠被冷凍 千燥用于方便儲存。
脂質體包裹涉及磷脂，如在細胞膜中的磷脂。然而與脂質體包裹 相關的一個主要問題是很難調節(jié)脂質體的平均尺寸和分布。另一個 問題是不像紅細胞，脂質體通常是非常不穩(wěn)定的，由于他們通常缺 乏有組織的細胞骨架。而另外一個問題是脂質體通常由磷脂的多層
組成(近期關于血液替代物發(fā)展的綜述出現于Stowell等人(2001) Progress in the development of RBC substitutes, 7hm9/l/57'o/ 41:287-299，其由此通過引用整體并入本文。還參見Chang, T. 1998 "Modified hemoglobin- based blood substitutes: cross linked, recombinant and encapsulated hemoglobin" ， Arti/!z'"'a2 /J 5Y//^2 2:233-41,其由此通過引用整體并入本文)。
采用了使用本發(fā)明方法設計的多肽的紅細胞替代物相對于現有 技術中已知的紅細胞替代物開發(fā)方法應提供幾個優(yōu)點，包括但不限 于優(yōu)良的氧和二氧化碳結合功能性、較低的生產成本(大規(guī)模并因 此低成本的生產是可能的，因為細菌可以被用來大量生產肽并因為 肽ELBL能夠被自動化)、使用適當的血紅蛋白制備方法作為ELBL 模板的可能性、多肽的生物可降解性、基于血液蛋白結構的設計的 多肽的免疫"惰性"和設計的多肽薄膜所展現的超越脂質體的結構穩(wěn) 定性。多肽ELBL組裝生成了半多孔薄膜，最小化了形成包裹方法和 使葡萄糖、氧、二氧化碳和各種代謝產物能夠通過作為脂雙層的薄 膜自由擴散所需的材料量。相反，可能適合此目的的其他聚合物具 有不想要的不良作用一例如，多乳酸化合物降解成乳酸、導致肌肉 痛性痙攣的物質和聚(苯乙烯磺酸)不是生物相容性的。
微囊可以由設計的多肽制造以包括血紅蛋白來作為紅細胞替代 物。血紅蛋白多肽微囊還可以被設計以包括酶，包括通常對紅細胞 功能是重要的超氧化物岐化酶、催化酶和高鐵血紅蛋白還原酶。而 且，納米加工的微囊可以被預測性地脫水，表明如這里描述制成的 人工紅細胞可以被脫水而無功能損失，特別因為血紅蛋白可以被低 壓凍干(即冷凍干燥)并被重新溶解而無功能損失，且聚離子薄膜 對于脫水作用是穩(wěn)定的。這對長期儲存、血液替代物運輸、戰(zhàn)場應 用(特別是在遠的地方)和空間探索是重要的。
使用本發(fā)明方法設計的多肽還能用于藥物傳輸。
7.藥物傳輸
"晶體"形式的適當的治療性物質的微米大小的"核心"可以被設 計的多肽包裹，生成的微囊可以用于藥物傳輸。所述核心必須在某
些條件下(例如高PH或低溫)是不溶的并在某些條件下(其中將出 現控制釋放)是可溶的。晶體上的表面電荷可以通過；電勢測量(用 于測定液體介質中膠體顆粒上靜電單元中的電荷)來測定。微囊內 含物從微囊內部釋放至外周環(huán)境的速率將取決于許多因素，包括包 裹外殼的厚度、外殼中使用的多肽、二硫鍵的存在、肽的交聯程度、 溫度、離子強度和用來組裝肽的方法。通常，膠囊越厚，釋放時間 越長一原理類似于凝膠過濾色譜。
己經做了一些關于從ELBL微囊緩釋釋放的工作(見Antipov， A.， Sukhorukov， G, B. ， Donath， E.和Miihwald， H. (2001) /C/ e瓜 B， 105:2281—2284和Freemantle, M. (2002) Polyelectrolyte multilayers, C力e瓜Ay^. 7\fe^， 80: 44-48，兩者在這里通過引用 整體并入本文)。已經被使用的聚電解質是PSS、 PAH、 PAA、 PVS、 PEI 和PDM。
使用本發(fā)明方法設計的多肽應該提供許多有關藥物傳輸方面的 優(yōu)點，包括但不限于對微囊的物理、化學和生物學特征的控制； 制備直徑小于lmm的膠囊的能力，使膠囊適合于注射；引發(fā)免疫應 答的低的可能性；膠囊的普遍高的生物相容性；如下所述通過改變 所述層的厚度和使用半胱氨酸對微囊擴散性質的控制；通過使用半 胱氨酸(如現有技術中已知的，游離巰基基團、游離氨基基團和游 離羧基基團是用于特異性靶向的分子可以被連接的位點)中高反應 性的巰基基團修飾微囊表面或者通過在多肽設計中包括特異功能性 結構域來耙向特定位點的能力；和微囊被細胞利用內吞或胞飲而吸 收的能力。
使用本發(fā)明方法設計的多肽還能用于抗微生物涂層。 8.抗微生物涂層
本發(fā)明的方法能夠用來生產包括抗微生物肽的薄膜。例如， 一種 適當的序列可以是存在于人類中的富組蛋白5:
Asp Ser His:Ala Lys Arg His His Gly Tyr Lys Arg Lys His Glu Lys His His Ser His Arg Gly Tyr (SEQ ID NO: 8)。
在弱堿性pH下的正電荷優(yōu)勢使該序列非常適合于ELBL。它可以 附加至使用本發(fā)明方法設計的肽，產生適合于在ELBL中使用的抗微 生物肽。該肽能夠被用作抗生物污垢涂層。例如，所述肽能夠被用 來在用于植入的裝置上形成涂層。
使用本發(fā)明方法設計的多肽還能在許多其他領域應用。
9.其他用途
關于使用本發(fā)明方法設計的肽的其他可能的用途包括但不限于 食品蓋、包裝和分離層；食品箱、包、袋和標簽；食品涂層；食品 成分微囊；藥物涂層、膠囊和微囊； 一次性食品供給商品(盤子、 杯子、刀叉餐具)；垃圾袋；用于肥料和殺蟲劑的水溶性袋；用于 肥料和殺蟲劑的微囊；農業(yè)覆蓋物；紙涂層；釋放-充填包裝； 一次 性醫(yī)療產品難(如手套和大衣)；和一次性尿布。
B.制造
一旦氨基酸序列基序已經從使用上面(A) (1)部分討論的方法所 識別的序列基序被選擇或者被重新設計，則使用現有技術中已知的 方法合成所設計的多肽，如使用固相合成和F-moc化學或異源表達 基因克隆和轉化。設計的多肽可以由肽合成公司(例如SynP印公司 (Dublin, California))合成，或者使用肽合成儀在實驗室生成， 或者通過重組方法生成。
在一個實施方案中，設計的多肽(例如，第一層多肽)包含多個 隨機結合生成一個多肽鏈的單個氨基酸序列基序。在設計用于ELBL 的多肽中，同樣的基序可以被重復，或者不同的基序可以被連接。 而且，如上所述，可以包括功能性結構域。氨基酸例如甘氨酸或脯 基酸可以被用來連接序列基序，以便保持多肽的整體電荷性質，艮P， 多肽上每個殘基的凈電荷強度為0.4。在一個實施方案中，連接體包 含l-4個氨基酸殘基，例如卜4甘氨酸或脯氨酸殘基。另外，不同 于20種普通氨基酸的氨基酸可以被包括在基序本身中，取決于多肽 所需要的性質。使用現有技術中已知的方法，其他性質同樣可以由 設計要求所指定。例如，脯氨酸可以被包括用于轉角形成，甘氨酸 用于鏈靈活性，和組氨酸用于在接近中性pH下的pH敏感的電荷性
質。"疏水性的"氨基酸也可以被包括一疏水性殘基內含物能夠在組 裝行為中起作用并通過類似球形蛋白的疏水穩(wěn)定化的方式促進層的 穩(wěn)定性。
在一個實施方案中，第一層多肽包含一個或多個氨基酸序列基 序，其中所述多肽長度為至少15個氨基酸，并且在pH 7.0下，相 同符號荷電殘基的數目減去相反符號的殘基數目，與多肽總殘基數
目的比值大于或等于0.4。換言之，多肽上每個殘基的凈電荷強度大 于或等于0.4。在另一實施方案中，在pH 7.0下，相同符號荷電殘 基的數目減去相反符號的殘基數目，與多肽總殘基數目的比值大于 或等于0. 5。換言么多肽上每個殘基的凈電荷強度大于或等于0. 5。
在一個實施方案中，設計的多肽長度大于或等于15個氨基酸， 在其他實施方案中，設計的多肽長度大于18， 20， 25， 30， 32或35 個氨基酸。此原因是，每分子的熵損失對于短聚合物來說是如此在 熱力學上不利的，以至于對荷相反電荷的表面的吸附被抑制，即使 多肽具有每單位長度1個電荷；長的聚電解質比短的吸附更好。這 在圖12中有所描述。被用于長度依賴性研究的肽的平均分子量是 1500-3000 Da (聚L-谷氨酸， 〃小的〃)、3800 Da (聚L-賴氨酸，〃 小的〃)、17000 Da(聚L-谷氨酸， 〃中的〃)、48100 Da (聚L-賴氨酸， 〃中的〃)、50300 Da (聚L-谷氨酸， 〃大的〃)和222400 Da (聚L-賴 氨酸， 〃大的〃)。圖12中顯示的數據清楚表明ELBL依賴肽的長度。 Cys的加入使相對小的肽能夠用于ELBL，因為巰基基團能夠被用來 在多肽間形成二硫化物交聯。
C.薄膜組裝
制備設計多肽多層膜的方法包括在模板上沉積多層帶相反電荷 的化學物質，其中至少一層包含設計的多肽。成功沉積的聚電解質 將具有相反的凈電荷。在一個實施方案中，設計多肽(或其他聚電 解質)的沉積包括在下述pH下使基質暴露于包含設計多肽(或其他 聚電解質)的水溶液其具有適合于ELBL的凈電荷。在其他實施方 案中，設計多肽或其他聚電解質在基質上的沉積通過相繼噴霧帶相
反電荷的多肽溶液而實現。在其他實施方案中，在基質上的沉積通 過同時噴霧帶相反電荷的聚電解質溶液而實現。
在生成多層膜的ELBL方法中，相鄰層的相反電荷與抗衡離子釋 放至溶液后的熵增加， 一起提供了組裝的驅動力。相對層中聚電解 質具有相同凈線性電荷密度不是關鍵的，而只要相對層具有相反電
荷。標準的膜組裝過程包括在聚離子為離子化的pH(即，pH4-10)
下生成聚離子水溶液，提供帶有表面電荷的基質，和將基質交替浸 入帶電聚電解質溶液。基質任選在交替層沉積之間被洗滌。 本領域普通技術人員容易確定適合沉積聚離子的聚離子濃度。示
例性濃度為0. 1至10 mg/mL。通常，產生的層厚度基本上與沉積過 程中處于上述范圍內的聚離子溶液濃度無關。對于典型的非肽聚電 解質例如聚丙烯酸和聚(鹽酸丙烯胺)，通常的層厚度為約3至約 5A，取決于溶液的離子強度。短聚電解質通常形成比長聚電解質更 薄的層。對于薄膜厚度，聚電解質薄膜厚度取決于濕度以及層數和 薄膜組成。例如，50 nm厚的PLL/PLGA薄膜在氮干燥后收縮至1. 6 nm，通常，可以形成1-2 nm至100 nm或更大厚度的薄膜，取決于 薄膜的水合狀態(tài)和組裝中采用的聚電解質分子量。
另外，形成穩(wěn)定的聚電解質多層膜所需要的層數將取決于薄膜中 的聚電解質。對于僅含有低分子量多肽層的薄膜，薄膜通常具有4 個或更多個帶相反電荷的多肽雙層。對于含有高分子量聚電解質例 如聚丙烯酸和聚(鹽酸丙烯胺)的薄膜，包含一個帶相反電荷的聚 電解質雙層的薄膜可以是穩(wěn)定的。
D.實驗
1.實例1 一基于人類血液蛋白序列的多肽的設計以及它們在 多肽薄膜制造中的應用
為此工作，使用上面(A) (l)部分中描述的方法選擇氨基酸序列以 識別人類血液蛋白的一級結構中的序列基序補體C3 (gi|68766) 是陰離子序列基序的來源，而乳鐵傳遞蛋白(gi 14505043)是陽性序 列基序的來源。如上所討論的，血液蛋白序列被用來最小化涉及所 述多肽的裝置(包括，例如人工紅細胞)可能被引入其中的患者的免
疫應答。原則上，該方法應該可應用于任何具有免疫系統(tǒng)的生物體；
它不限于人類。多肽由SynP印公司(Dublin, California)合成。所 述多肽序列為
TyrGluGluAspGluCys Gin Asp Gly Glu Glu AspGlu Cys
GinAspGlyGluGluAsp Glu Cys Gin Asp Gly GluGlu Asp
GluCysGinAsp
(SEQ ID NO: 2)
TyrArgArgArgArgSer Val Gin Gly Arg Arg ArgArg Ser
ValGinGlyArgArgArg Arg Ser Val Gin Gly ArgArg Arg
ArgSerValGin
(SEQ ID NO: 1)
TyrGluGluAspGluCys Gin Asp Gly Glu Glu AspGlu Cys
GinAspGlyGluGluAsp Glu Cys Gin Asp Gly GluGlu Asp
GluCysGinAspGlyGlu Glu Asp Glu Cys Gin AspGly Glu
GluAspGluCysGinAsp
(SEQ ID NO: 4)
TyrArgArgArgArgSer Val Gin Gly Arg Arg ArgArg Ser
ValGinGlyArgArgArg Arg Ser Val Gin Gly ArgArg Arg
ArgSerValGinGlyArg Arg Arg Arg Ser Val GinGly Arg
ArgArgArgSerValGin
(SEQ ID NO: 3)
氨基酸殘基由上述給定的三字母表示。 一個甘氮酸在各7殘基基 序之間被引入以抑制二級結構的形成。甘氨酸被選擇用于此目的， 因為它允許在雙面角的結合中最大的可變性(見Ramachandran， G.N. 禾口 Saisekharan， V. (1968)， A/r.尸rotej77 23:283，其
通過引用整體并入本文)并具有低螺旋傾向性(0. 677)和低折疊傾向
性(0.766)。或者，根據計算的結構傾向性脯氨酸可以取代基序間的 甘氨酸。另外，單個酪氨酸被包括在每個肽的N末端用于通過濃度 測定，通過在280nm處的UV吸收。SEQ ID N0:2在pH 7時的凈電荷 強度為20/32 (0. 625); SEQ ID N0:1的凈電荷強度為16/32 (0. 5); SEQ IDN0:4在pH7時的凈電荷強度為30/48 (0.625);而SEQ IDN0:3 在pH 7時的凈電荷強度為24/48 (0.5)。在所有情況中，pH7時的
凈電荷強度大于或等于約第一層多肽總長度的1/2。
多肽被分別命名為SN1(SEQ ID NO: 2)、 SP2 (SEQ ID NO: 1)、 LN3(SEQ ID NO: 4)和LP4 (SEQ ID NO: 3)，表示短陰性、短陽性、 長陰性和長陽性。這些序列非常不同于聚賴氨酸(一般在現有技術 中作為聚陽離子使用)和聚谷氨酸(一般在現有技術中作為聚陰離 子使用)，盡管其可商業(yè)獲得且不昂貴，但其在溫和PH的條件下具 有高度a-螺旋傾向性且重要的是免疫反應性的。在中性pH下，設計 的肽上計算的每單位長度的電荷對于SP和LP是0. 5靜電單位以及 對于SN和LN是0. 6靜電單位。陽性肽在某種程度上比陰性肽更具 疏水性，歸因于纈氨酸和精氨酸側鏈長烴的存在(如上所述，多肽 層間的疏水性相互作用能夠穩(wěn)定薄膜至一定程度)。所述長度與己 公開的研究一致，表明聚離子必須有大于20的荷電基團(即天冬氨 酸和谷氨酸；賴氨酸、精氨酸和組氨酸)以適合于ELBL(見K油anov， V.禾口Zezin， A. (1984)尸wr^4; p丄C/ e瓜56:343禾口 Kabanov， V. (1994)尸o^f瓜36: 143，兩者在這里通過引用整體并入本文)。 a.實驗說明 i.材料
鍍銀的QCM電極(USI-System, Japan)具有在每側上的表面積 0.16 士 0.01 cm2、共振頻率9 MHz (AT-cut)和長期穩(wěn)定性土2 Hz。 通過電噴射質譜證實了多肽分子量。肽純度大于70 %。多肽緩沖液 為10 mM磷酸鈉或10 mM Tris-HC1， 1 mM DTT， 0. 1 mM疊氮化鈉，pH 7.4。所有不同于多肽的化學物質均購自Sigma-Aldrich (USA)。
ii. 方法
使用成對的設計的多肽(一個陰性， 一個陽性)進行實驗。使用
標準ELBL技術將由至少5個如上識別的SP2、 SN1、 LP4和LN3雙層 所組成的多層薄膜沉積在QCM共振器上(雙層由一層多聚陽離子和 一層多聚陰離子組成)。用于層吸附的多肽濃度是2 mg-mL—、已知 聚離子層的厚度對聚電解質濃度的依賴性不強(見Lvov, Y.和 Decher， G. (1994) Crj^^3^og 39:628，其在這里通過引用
整體并入本文)；在0.1-5 mg-mL—'的濃度范圍內，雙層厚度近乎獨 立于用于PSS/PAH的濃度。相反，多肽薄膜顯得比那些使用高分子 量PSS/PAH(使用利用已知的Sauerbrey方程的A/數據計算的質量) 制造的薄膜厚度小很多；見Lvov, Y.和Decher，G. (1994) Cry"aU^". 39:628。這緊隨根據沉積的質量計算薄膜厚度，
如在現有技術中通常對蛋白質所進行的。圖3(c)中顯示的為設計的 多肽組裝所計算的厚度大于用于制造薄膜的肽的點對點長度。。DTT 以lmM被包括以抑制二硫鍵的形成。吸附時間為20分種。
在后續(xù)吸附循環(huán)之間共振器在純水中被沖洗1分種(去除大約 10-15%的弱吸附物質)并在N2氣流中干燥。然后，通過QCM直接測
量沉積肽的質量。質量測量包括一些水(盡管干燥)和低質量離子 如K+、 Na+和C1—。肽的相鄰層的部分相互滲透是很可能的(見Decher， G. (1997) 6"".e騰227:1232; Schmitt等人(1993)船cr,JecWes 26:7058;和Korneev等人.(1995)尸力j^ 'ca萬214:954);這對二硫 鍵"鎖定"效率可能是重要的。
iii. 結果
在多肽吸附以及沖洗和干燥QCM共振器之后，測定共振器的共振 頻率。這實現了在吸附上的頻率轉換和在吸附質量中的變化的計 算。頻率的降低表明吸附質量的增加。結果在圖3 (a)和3 (b)中被 提供。圖3 (a)顯示了在不同緩沖液(10mM磷酸鈉，pH 7. 4， 1 mM DTT 和10 mM Tris-HC1, pH 7. 4， 1 mM DTT)中對LP4和LN3的吸附數據 的比較。根據這些數據，顯然吸附數據更依賴于肽的性質而非使用 的緩沖液的特定性質。圖3(b)顯示了SP2、 SN1、 LP4和LN3的不同
組合(即SP2/SN1、 SP2/LN3、 LP4/SN1和LP4/LN3)在10mM磷酸鈉(pH 7. 4和1 mM DTT)中的共振器頻率與吸收層(線只連接實驗數據點)。 如ELBL所要求的，這些組合的每一個都包括一個陽性多肽和一個陰 性多肽。圖3(c)顯示了 SN1和LP4在10 mM Tris-HCl (pH 7. 4和1 mM DTT)中計算的吸附質量與層數的圖(使用Sauerbrey方程從實 驗數據計算的)?？偽劫|量(約5嗎)大致相當于l mnol的肽。 用于此計算的方程是Am二一0.87，10—9A/，其中m是質量克，/是頻 率Hz (見Lvov, Y. ， Ariga， K. ， Ichinose， L，和Kunitake, T. (1995) j瓜O e瓜5bc. 117:6117和Sauerbrey， G. (1959) Z尸A7幻A 155:206，兩者在這里通過引用并入本文)。薄膜厚度d被估計為d = —0.016A/， 其中d是nm(見Yuri Lvov, "Electrostatic Layer—by—Layer Assembly of Proteins and Polyions〃 in尸ro力ei/ Arc力itect"re: i"z ter/acj'a2 /J/cJecwJar 爿5^e/aW7 朋c/ /腳Z^^"。"腸tec力/7c^o^j， (Y. Lvov & H. Miihwald編輯，2000) (New York: Dekker， 2000) pp. 125-167，其通過引用并入本文)。 圖3(c)中的線是對實驗數據點的線性匹配。數據的線性是吸附過程
中精確規(guī)則的組裝以及各吸附層中多肽大致均一密度的合適的指 標。吸附伴隨一610 ± 60 Hz (陽離子)或一380 ± 40 Hz (陰離子)
的頻移而發(fā)生。沉積多肽質量的線性增長表明組裝過程中初期吸附 步驟的重復和多層制造過程的普遍成功。 iv.結論
以上結果顯示使用本發(fā)明方法設計的多肽適合于ELBL，不管來 自PSS和PAH顯著的定性差別，靈活的同聚物在pH 7. 4下每單位長 度具有1個電荷。聚L-賴氨酸和聚L-谷氨酸上每單位長度的電荷在 pH 7. 4下為1，如PSS和PAH具有的，但這些多肽在各種條件下都 具有顯著的形成a-螺旋結果的傾向，使它們在需要對薄膜結構進行 控制時明顯不適合于多層組裝。然而，本發(fā)明的單分散的多肽使實 施者能夠非常精確地知道正在被用于ELBL的材料的結構。而且，聚 L-賴氨酸、聚L-谷氨酸、PSS和PAH的普通商業(yè)制劑在人類中引起 免疫應答(即，是免疫原性的)。
因為如實驗所證明的，設計的多肽容易被吸附在相反電荷的表面 之上，所以沒有對"前體"層的需求。如現有技術已知的，"前體"層被 沉積在基質上以提高弱吸附性物質的吸附。前體層的缺乏提高了聚 離子薄膜的生物相容性(因為通常作為前體使用的聚合物是免疫原 性的)或允許比設計的多肽更低精確的對聚合物結構或薄膜結構的 控制。
設計的多肽的多層在人類血液pH (7.4)下是穩(wěn)定的。因此，所 述多層應該有用于廣泛的生物學應用。設計的多肽(每個多肽的每 個殘基少于1個電荷)的吸附在2 mg/mL和低離子強度下基本在少 于10分種之內完成。這意味著這些多肽能夠被用來快速并相對容易 地形成多層薄膜。在各層沉積之后使用N2 w干燥所述肽薄膜沒有影 響組裝。干燥的進行是為了得到準確的QCM頻率測量，但不是組裝 所需要的。
薄膜組裝實驗在比血液低的離子強度下完成但該過程產生與在 較高離子強度下性質上類似的結果。主要的差別每個吸附層沉積的 肽的量一離子強度越高，沉積的肽的量越大。這由圖7中的圖所描 述，其顯示了沉積的物質的量作為離子強度的函數一所使用的肽是 聚L-谷氨酸和聚L-賴氨酸。QCM共振頻率是針對吸附層標繪的。聚 L-谷氨酸的平均分子量是84600 Da，而聚L-賴氨酸的平均分子量是 84000 Da。用于組裝的肽濃度是2 mg/mL。數據表明鹽濃度(溶液的 離子強度)影響了薄膜組裝。通常，每層沉積的物質的量隨0-100mM NaCl范圍內的離子強度而增加。由于在相對高的每單位長度凈電荷 和低離子強度條件下使用設計的多肽的ELBL的基本特征似乎不依賴 于緩沖液的選擇，在人類血液的離子強度下預期有在性質上的類似 結果。因此，緩沖液的選擇應該不根本改變多層在其靶環(huán)境中的穩(wěn) 定性。然而，即使緩沖的選擇不影響多層的穩(wěn)定性，"鎖定"機制作 為穩(wěn)定膠囊的設計特征將是可獲得的。
陽性多肽比陰性多肽更大明顯的沉積可以產生于陽性多肽在pH 7. 4下的每單位長度的較高電荷。沉積在每層中的物質很可能符合為
中和下面的表面的電荷所需要的物質。疏水相互作用也能夠幫助解 釋吸附行為的這一特征。
對于蛋白質和其他聚合物的普通薄膜厚度的計算很可能對于短
多肽(計算的厚度是60-90 rnii但10個多肽的累積長度約為120 nm) 是無效的。這很可能起因于相對短的多肽在吸附表面上的包裹的高 密度；該結果也符合薄膜厚度隨離子強度變化的發(fā)現，由于聚合物 的結構性質將發(fā)生變化并且經由離子的電荷篩選將減少吸附肽之間 的層內電荷斥力。這里討論的設計的多肽薄膜的厚度被估計為20-50 nm0
設計和制造循環(huán)的許多方面能夠被自動化。例如， 一種計算機算 法可以被用來優(yōu)化用于ELBL的肽的一級結構，通過比較預測的肽性 質和觀察到的物理性質，包括溶液中結構、吸附行為和薄膜在極端 pH下的穩(wěn)定性。而且， 一旦各個步驟的細節(jié)已經被基本確定，多肽 薄膜組裝過程能夠被機械化。
實例2—涉及含有半胱氨酸的重新設計的多肽的實驗
b.多肽
使用的多肽為
Tyr Lys Cys Lys Gly Lys Val Lys Val Lys Cys Lys Gly Lys Val Lys Val Lys Cys Lys Gly Lys Val Lys Val Lys'Gys Lys Gly Lys Val Lys
(SEQ ID NO: 5)
Tyr Glu Cys Glu Gly Glu Val Glu Val Glu Cys Glu Gly Glu Val Glu Val Glu Cys Glu Gly Glu Val Glu Val Glu Cys Glu Gly Glu Val Glu
(SEQ ID NO: 6)
不同于在這里描述的實驗中使用的其他多，jt這兩個不是使用人
類基因組信息設計的多肽；它們被設計的唯一目的是評價在多肽薄 膜穩(wěn)定化中二硫鍵形成的作用。SEQ ID N0:5的在pH7時的凈電荷強 度為16/32 (0.5);而SEQ ID N0:6在pH7時的凈電荷強度16/32 (0.5)。在這兩種情況下，pH7時的凈電荷強度大于或等于約第一層 多肽總長度的1/2。
c. 操作
所有實驗在室溫下進行。
所有使用QCM的組裝實驗在相同條件下進行，除了使用空氣代替 氮氣來干燥即將經歷氧化的樣品。組裝條件是10mMTris-HCl， 10 mM DTT， pH 7.4。額定的肽濃度是2mg/ml。形成的層數是14。
用于氧化樣品的二硫化物鎖定條件是10 raM Tris-HC1， 1% DMSO， 使用空氣飽和水，PH 7.5。"鎖定"步驟持續(xù)6小時。用于還原樣品 的條件是10 mM Tris-HCl， 1 mM DTT，使用氮氣飽和水，pH 7.5。 該步驟持續(xù)6小時。
所有使用QCM的分解實驗在相同條件下進行，除了使用空氣代替 氮氣干燥氧化樣品。分解條件是10 mM KC1, pH2.0。在干燥前使用 D.I.水沖洗樣品30秒鐘。
三個不同類型的實驗被進行(1)還原一無處理在組裝后立即 進行分解(2)還原一6小時，如上所述用于還原樣品；和(3)氧化一6 小時，如上所述用于氧化樣品。
d. 結果
結果在圖10中描述。在首先的兩個實驗(都是還原)中，所有 的沉積物質(100 %)在50分種內分解。相反，在氧化實驗中，在肽 薄膜包被的QCM共振器在pH 2下保持5小時之后大量物質保留。多 肽薄膜在酸性pH下的穩(wěn)定性由組裝條件決定；這樣，薄膜或膠囊的 穩(wěn)定性是通過使用多肽作為ELBL的聚電解質而成為可能的設計特 征。
e. 結論
靜電力在一起保持電荷相反的設計的多肽層中起關鍵作用。在酸 性pH下，在一個肽上的凈電荷被中和且多肽薄膜由于靜電排斥而分 解。還原條件防止二硫鍵的形成。因此，層間的靜電吸引是在這些 條件下用于穩(wěn)定層的唯一的結合力。相反，在氧化條件下，二硫鍵
形成。在酸性pH下，二硫鍵抑制薄膜分解。結果表明酸性pH下的
層穩(wěn)定性直接受層內和/或層間的二硫鍵的形成一即同一層中的分
子間，相鄰層的分子間，或兩者一的影響。這通過圖io中顯示的結
果被描述一由于二硫化物鎖定，超過30 %的薄膜在酸性pH下保持穩(wěn) 定，不管在相對低的離子強度下的靜電排斥。具有更多半胱氨酸殘 基的肽被期望以進一步提高二硫化物鎖定效率。而且，肽組裝條件 的調節(jié)將是設計具有所需物理以及化學和生物學性質的薄膜的重要 方面。
實例3—涉及含有半胱氨酸的設計的多肽的實驗 f.材料
該實驗的基本要素是石英晶體微量平衡儀器；鍍銀的共振器(9 MHz共振頻率)；陰性48-殘基肽(LN3) (SEQ ID NO: 4);和下述序 列的稱為"SP5"的陽性48-殘基肽
Tyr Lys Gly Lys Lys Ser Cys His Gly Lys Gly Lys Lys Ser Cys His Gly Lys Gly Lys Lys Ser Cys His Gly Lys Gly Lys Lys Ser Cys His
(SEQ ID NO: 7)
像上面(D) (l)部分中討論的其他設計的月fc使用上面(D) (l)中描 述的方法設計SP5以分析人類血液蛋白乳鐵傳遞蛋白(gi I 4505043) 的氨基酸序列。ELBL緩沖液是10 mM Tris、 pH 7.4、 10 mM NaCl 和1 mM DTT。分解緩沖液是10 mM KCl、 pH 2。通過將4mg各肽加 入2mL上述緩沖溶液并調節(jié)各溶液至pH7. 4制備SP5和LN3的2mL 肽溶液；所述肽濃度為2 mg-ML一1。
g. 用于監(jiān)測多肽層在QCM共振器上組裝的操作 還原操作如下(1)在肽吸附之前檢測并記錄共振器的頻率；(2)
共振器被浸泡入SP5肽溶液中持續(xù)20分種(3)共振器被浸泡入SP5 沖洗溶液中持續(xù)30秒鐘；(4)共振器從沖洗溶液中移出并使用氮氣 干燥；(5)記錄共振器的QCM共振頻率；(6)共振器被浸入LN3肽 溶液中持續(xù)20分種；(7)共振器被浸入LN3沖洗溶液中持續(xù)30秒 鐘；(8)共振器1從沖洗溶液中移出并使用氮氣干燥；(9)記錄共 振器的QCM共振頻率；(10)重復步驟2至9直至16層被吸附至共 振器上。
氧化操作與還原操作相同，除了共振器在D. I.水而非SP5緩沖 液或LN3緩沖液中沖洗，且在每次測量前使用空氣代替氮氣干燥。
h. 鎖定操作
還原操作如下共振器被至于含有1 mM DTT的水溶液中持續(xù)6 小時。DTT， 一種還原劑，抑制了二硫鍵的形成。
氧化操作如下共振器被至于空氣飽和的含有1 % DMSO的水溶 液中持續(xù)6小時。匿SO， 一種氧化劑，促進了二硫鍵的形成。
i. 共振器上的分解
i. 溶液
還原條件如下10 mM KC1， 1 mM DTT， pH 2。 氧化條件如下10 mM KC1， 20% DMSO， pH 2。
ii. 用于分解的操作
還原操作如下(1)通過QCM測定并記錄共振器的初始共振頻 率；(2)共振器被浸泡入還原分解溶液5分種；(3)共振器在還原 緩沖溶液中沖洗30秒鐘；(4)共振器使用氮氣干燥；(5)通過QCM 測定并記錄共振器的共振頻率；(6)重復步驟2至5用于在5、 10、 15、 20、 30、 60和90分種的時間讀數。
氧化操作與還原操作相同除了共振器的沖洗在空氣飽和的D. L 水而非還原緩沖液中進行。
丄結果
圖8顯示了在SP5和LN3的薄膜組裝過程中沉積的大致線性的質 量增加。兩個共振器都顯示了在組裝過程中幾乎相同的質量沉積， 不論組裝條件的差異。
圖9顯示薄膜組裝過程中保留的材料的比例。經受氧化條件的層 在酸性pH下顯示了最小的材料損失，有接近90-95%的質量保留。相 反，經受還原條件的層在暴露于酸性pH的前5分種之內損失了接近 全部的胞膜材料。
k.結論
結果表明，在酸性pH下，二硫鍵防止了層退化并保持層牢固地 在一起。在酸性pH下的層穩(wěn)定性直接受層內和/或層間二硫鍵的形 成的影響。二硫鍵形成依賴于相互間半胱氨酸殘基的濃度和親近。 增加多肽每單位鏈長的濃度將因此直接影響二硫鍵的形成和薄膜穩(wěn) 定性。增加用于薄膜組裝的緩沖溶液的離子強度通過增加每吸附循 環(huán)的沉積物質的量和每層的厚度來影響薄膜中的半胱氨酸濃度。單 層中增加的半胱氨酸數目將以該方式增加形成的二硫鍵的數目并經 氧化增加薄膜穩(wěn)定性。
實例4.包含RGD功能結構域的多肽薄膜，其中每個殘基的線性 電荷密度強度約0.75。
在一個實施方案中，復合多肽的功能區(qū)是RGD序列，其中復合肽 的電荷密度約0. 75。 RGD序列結合受體蛋白整聯蛋白的細胞外部分， 由此促進細胞粘附。樣品肽設計如下
KKKAKKKGKKKAKKKGRGDKKKAKKKGKKKAKKKY (SEQ ID NO: 8) EEEAEEEGEEEAEEEGRGDEEEAEEEGEEEAEEEY (SE0 ID NO: 9)
在該實例中，多肽SEQ ID NO: 8是帶正電荷的多肽，具有RGD 功能區(qū)、第一表面吸附區(qū)KKKAKKKGKKKAKKKG (SEQ ID NO: 10)和第 二表面吸附區(qū)KKKAKKKGKKKAKKKY (SEQ ID NO: 11)。該復合肽在pH7 下的凈電荷強度/殘基為+26/35或+0. 74。多肽SEQ ID NO: 9是帶負
電荷的多肽，具有RGD功能區(qū)、第一表面吸附區(qū)EEEAEEEGEEEAEEEG (SEQ ID NO: 12)和第二表面吸附區(qū)EEEAEEEGEEEAEEEY (SEQ ID NO: 13)。該復合肽在pH7下的凈電荷強度/殘基為—26/35或一O. 74。
已經合成了各種含有RGD序列的St并且研究了它們對多層膜組 裝的適應性。還研究了多肽多層膜中包括RGD序列對不同哺乳動物 細胞連接和繁殖的影響。包含5個(陽性序列)和(陰性序列)雙 層的多層膜沉積在石英板上。用于層吸附的復合多肽在PH7水溶液 中的濃度為2mg-ml/、吸附時間為20分鐘。石英板在隨后吸附循環(huán) 之間用純水沖洗，以除去弱結合物質。在每層吸附之后，用于薄膜 組裝的基質以N2氣流干燥。然后，通過UV分光光度法測量沉積肽的 光學質量。圖16比較了用于制備多層膜的肽中包括RGD對細胞繁殖 的影響。該技術可能用于為再生藥物的長期目的的體外細胞和組織 培養(yǎng)。
實例5:包含RGD功能結構域的多肽薄膜，其中每個殘基的線性 電荷密度強度約0. 4。
在一個實施方案中，復合多肽的功能區(qū)包含RGD序列，其中復合 肽的電荷密度約 0.4。樣品肽設計如下
AAKAKAKGKAKAKAKGRGDKAKAKAKG薩AKAAY (SEQ ID NO: 14) AAEAEAEGEAEAEAKGRGDKAEAEAEGEAEAEAAY (SEQ ID NO: 15)
在該實例中，多肽SEQ ID NO: 14是帶正電荷的多肽，具有RGD 功能區(qū)、第一表面吸附區(qū)AAKAKAKGKAKAKAKG (SEQ ID NO: 16)和第 二表面吸附區(qū)KAKAKAKGKAKAKAAY (SEQ ID NO: 17)。該復合肽在中 性pH下的凈電荷強度/殘基為+14/35或+0.4。多肽SEQ ID M): 15 是帶負電荷的多肽，具有RGD功能區(qū)、第一表面吸附區(qū)AAEAE AEGE AEAEAEG (SEQ ID NO: 18)和第二表面吸附區(qū)EAEAEAEGE八EAEAAY (SEQ ID NO: 19)。該復合肽在pH7下的凈電荷強度/殘基為-14/35或-0. 4
要注意，復合肽的凈電荷強度/殘基可以通過改變表面吸附區(qū)和 功能區(qū)的結構來測定。在本實例中，前述實例的復合肽的凈電荷通 過改變僅表面吸附區(qū)的結構來改變。原則上，可以使用相同的方法 來控制任何復合肽的凈電荷強度/殘基。但是，該方法中，表面吸附 區(qū)和功能區(qū)都應該獨立適合使復合肽為可溶性的。
實例6:其中功能區(qū)包含兩個功能結構域的復合肽，其中存在N 末端的表面吸附區(qū)和C末端的功能區(qū)。
在該實例中，功能結構域是Src同源區(qū)2(SH2)結構域(例如來 自人張力蛋白)和磷酸酪氨酸結合(PTB)結構域(例如來自人張力蛋 白)。這些結構域結合在酪氨酸上磷酸化的特定蛋白。整合了人張 力蛋白指定結構域的復合肽的實例如下
KKXAKKXGKKXAKKKGKYWYKPEISREQAIALLKDQEPGAFIIRDSHSFRGAYGLA MKVSSPPPTIMQQNKKGDMTHELVRHFLIETGPRGVKLKGCPNEPNFGSLSALVYQH SIIPLALPCKLVIKYWYKPEISREQAIALLKDQEPGAFI工RDSHSFRGAYGLAMKVSSP PPTIMQQNKKGDMTHELVRHFLIETGPRGVKLKGCPNEPNFGSLSALVYQHSIIPLALP CKLVIKXKAKKKGKKKAKKKY (SEQ ID NO:20)
SEQ ID N0:10和SEQ ID NO: 11中的表面吸附區(qū)相同。SH2結構 域和PTB結構域序列可從National Center for Biotechnology Information訪問NP—072174:
SH2 = KYWYKPEISR EQAIALLKDQ EPGAFIIRDS HSFRGAYGLA MKVSSPPPTI MQQNKKGDMT HELVRHFLIE TGPRGVKLKG CPNEPNFGSL SALVYQHS工工 PLALPCKLVI (SEQ ID NO: 21)
PTB = VLFVNSVDME SLTGPQAISK ATSETLAADP TPAATIVHFK VSAQGITLTD NQRKLFFRRH YPLNTVTFCD LDPQERK麗K TEGGAPAKLF GFVARKQGST TDNACHLFAE LDPNQPASAI VNFVSKVMLN AGQKR (SEQ ID NO:22)
我們已經合成了對應于人張力蛋白SH2結構域的基因和對應于 人張力蛋白PTB結構域的基因，并將所述基因克隆入細菌宿主，過 表達所述基因，純化重組蛋白，表征所述結構域的各種物理性質。 在一個實施方案中，包含5個指定生物活性肽和聚(L-谷氨酸)雙 層的多層膜沉積在硅晶片上用于表面鑒定，并沉積在石英板上用于 監(jiān)測薄膜組裝。用于層吸附的多肽在pH7水溶液中的濃度為2 mg-ML—'。吸附時間為20分鐘?；|在隨后吸附循環(huán)之間用水沖洗1 分鐘，以除去弱結合的物質。在每層吸附之后，基質用N2氣流干燥。 然后，通過UV分光光度法測量石英上沉積的肽的光學質量，并通過 原子力顯微鏡檢查法鑒定硅晶片上薄膜的表面形態(tài)。該技術可能用 于為再生藥物的長期目的的體外細胞和組織培養(yǎng)。SH2結構域整合入 本文所定義的生物活性肽，能夠使多層膜與磷酸酪氨酸肽結合。該 技術可能用于診斷目的。
實例7:在多肽N末端包含一個功能區(qū)和一個表面吸附區(qū)的復合 多肽
該實例中，功能區(qū)是已知的蛋白質功能結構域，例如人輔助蛋白 的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)結構域
KKKAKKKGKKKAKKKGLKDTLKDTSSRVIQSVTSYTKGDLDFTYVTSRITVMSFPLD NVDIGFRNQVDDIRSFLDSRHLDHYTVYNLSPKSYRTAKFHSRVSECSWPIRQAPSLH NLFAVCR麗Y麗LLQNPKNVCWHCLDGRAASSILVGAMFIFCNLYSTPGPAIRLL YAKRPGIGLSPSHRYLGYMCDLLA (SEQ ID NO:23)
表面吸附區(qū)與SEQ ID NO'. 10相同。PTP結構域的序列可獲自 National Center for Biotechnology Information, 訪問號075061: PTP結構域
LKDTLKDTSSRVIQSVTSYTKGDLDFTYVTSRIIVMSFPLDNVDIGFRNQVDDIRSFLD SRHLDHYTVYNLSPKSYRTAKFHSRVSECSWPIRQAPSLHNLFAVCR應YNWLLQN
YMCDLLA (SEQ ID NO:24)
實例8:包含兩個功能區(qū)的復合多肽，其中存在三個表面吸附 區(qū)， 一個在復合肽的N末端， 一個在C末端，還一個在兩個功能區(qū) 之間，并且其中存在兩個不同的糖基化功能區(qū)。
代表性的肽結構如下
SAR-功能區(qū)-SAR-功能區(qū)-SAR
其中，如前，SAR是基序并因此適合表面吸附例如RRRARRR (SEQ 工DN0:25)， 一個功能區(qū)含有N聯糖基化的識別位點，例如GGNVSGG (SEQ ID N0:26)，另一功能區(qū)含有0聯糖基化的識別位點，例如 PPSSSPP (SEQ TD N0:27)。
代表性復合肽的氨基酸序列為
RRRARRRGGNVSGGRRRARRRPPSSSPPRRRARRR (SEQ ID NO:28)
復合多肽在pH7時的凈電荷強度/殘基為+18/35^+0.5。這種情 況下的多層膜由指定的陽性肽和適當的陰性肽構成，例如
EEEAEEEGEEEAEEEGEEEAEEEGEEEAEEEY (SEQ ID NO:29)
實例9:具有一個功能區(qū)的復合肽，其中復合肽C末端存在一個 表面吸附區(qū)，并且其中存在包含己知具有抗微生物活性的肽序列的 一個功能區(qū)。
代表性肽結構如下
功能區(qū)-SAR，其中如前，SAR是適當的表面吸附區(qū)，例如 KKKAKKKGKKKAKKKY (SEQ ID NO: 11)，并且該功能區(qū)含有富組蛋白5 的序列，即，DSHAKRHHGYKRKFHEKHHSHRGY(SEQ ID NO: 30)。代表性 復合肽的氨基酸序列為
RRRARRRGGNVSGGRRRARRRPPSSSPPRRRARRR (SEQ工D NO:31)
該代表性復合肽在pH 5.5時的凈電荷強度/殘基為+24/39 二 +0.6。該例中的多層膜由指定的陽性肽和適當的陰性肽構成，例如 SEQ ID NO:29。
實例10:具有一個功能區(qū)的復合肽，其中存在兩個表面吸附區(qū)， 一個在功能區(qū)的N末端， 一個在C末端，并且其中功能區(qū)包含兩個 特定蛋白酶識別位點和兩個連接體每個連接體是單個甘氨酸殘基。 在一個實施方案中，蛋白酶識別位點針對腸激酶和凝血酶-SAR-腸激酶識別-連接體-凝血酶識別-連接體-SAR 在每種情況下，SAR代表適當的表面吸附區(qū)，例如SEQ ID NO: 10 和SEQ ID NO: 11。例如，功能區(qū)被編碼為DDDDKGLVPRGSG (SEQ ID N0:32)，其中DDDDK (SEQ ID NO: 33)是腸激酶的識別位點，G是連 接體，LVPRGS (SEQ ID NO: 34)是凝血酶的識別位點，G是連接體。 代表性復合肽的氨基酸序列為
KKXAKKXGKKKAKKKGDDDDKGLVPRGSGKKKAKKKGKKXAKKKY (SEQ ID NO:35)
復合肽在中性pH下的凈電荷強度/殘基為+22/46&+0. 5。該例種 的多層膜由指定的陽性肽和適當的陰性肽構成，例如SEQ ID NO: 29。
實例11 :具有兩個功能區(qū)的復合B;t其中存在三個表面吸附區(qū)， 一個在復合肽的N末端， 一個在C末端， 一個在兩個功能區(qū)之間， 并且其中存在兩個相同的功能區(qū)，用于形成天然肽交叉連接。
代表性的肽結構如下
SAR-功能區(qū)-SAR-功能區(qū)-SAR
其中如前，SAR是適當的表面吸附區(qū)，例如EEEAEEE (SEQ ID N0:36)，且該功能區(qū)含有特定數目的Cys殘基，例如GGCGGCGG (SEQ ID N0:37)。代表性復合肽的氨基酸序列為
EEEAEEEGGCGGCGGEEEAEEEGGCGGCGGEEEAEEEY (SEQ ID NO:38)
復合肽在pH 7時的凈電荷強度/殘基為-0. 5。該例中的多層膜由 指定的陰性肽和適當的陽性肽構成，例如
KKKAKJOLGK阻KKKGKKKAKKKGKKKAKKKY (SEQ ED NO :39)
實例12:在多肽C末端包含一個功能區(qū)和一個表面吸附區(qū)的復 合多肽
該實例中，功能區(qū)是已知的蛋白質功能結構域，例如National Center for Biotechnology Information訪問號AAP06461的BAG 結構域
BAG序列-EEEAEEEGEEEAEEEY (SEQ ID NO :40)
其中〃BAG序列〃代表來自日本血吸蟲(Schistosoma japonicum) 的假設蛋白的BAG結構域的氨基酸序列 BAG序歹!j
SLQPEIDRFDGTPHSKEFKCLMENLEQLILSLDNLETDGNVEFRTMRRDAVKEIQ QLM EMLDYRSLISSQNDEVLAD (SEQ ID NO:41)
表面吸附區(qū)與SEQ ID NO: 13相同。
術語"一個"和"一種"和"所述"以及類似指示詞的使用(特 別是在下述權利要求的上下文中)將解釋為包括單數和復數，除非 本文以其他方式指明或與上下文明顯矛盾。本文使用的術語第一、 第二等不是要指任何特定排序，而僅是為了方便表示多個例如層。
除非另有指明，術語"包含"、"具有"、"包括"和"含有"要 解釋為開放型術語(即，表示"包括但不限于")。除非本文另有 說明，范圍值的描述僅預期作為單獨指落入所述范圍內的每個單獨 值的速記方法，并且如果每個單獨值在本文單獨敘述，則它被并入 本說明書。所有范圍的端點包括在所述范圍內，并可獨立結合。本 文描述的所有方法可以以適當順序進行，除非本文另有指明或者以 其他方式與上下文明顯矛盾。除非另有聲明，任何和所有實施例或 示例性語言(例如，"例如")的使用，預期僅為了更好地描述本 發(fā)明，并不對本發(fā)明范圍產生限制。如本文使用的，本說明書的語 言都不應解釋為表示任何為實施本發(fā)明所必需的非要求要素。
本發(fā)明的其他實施方案是可能的且可以做出調整而不偏離本發(fā) 明的構思和范圍。因此，上面的詳細描述不是要限制本發(fā)明。而且， 本發(fā)明的范圍通過所附權利要求來限定。
權利要求
1.一種生產多層薄膜的方法，所述膜包含第一層和第二層，其中相鄰層包含帶相反電荷的聚電解質，所述方法包括共價結合一個或多個表面吸附區(qū)與一個或多個功能區(qū)，以生成復合多肽，其中所述復合多肽和所述一個或多個表面吸附區(qū)具有相同極性，其中所述一個或多個表面吸附區(qū)包含一個或多個氨基酸序列基序，所述基序由5至15個氨基酸殘基組成并且在中性pH下具有大于或等于0.4的凈電荷強度/殘基，并且其中所述一個或多個功能區(qū)包含3至約250個氨基酸殘基，其中所述復合多肽不是均聚物，長度至少為15個氨基酸殘基，并且在pH 4至10范圍內具有大于50μg/mL的水溶解度；以及將所述復合多肽沉積在基質或所述第二層上，以形成第一層；其中所述第二層包含第二層聚電解質，所述第二層聚電解質包含聚陽離子材料或聚陰離子材料，所述聚陽離子材料或聚陰離子材料具有大于1,000的分子量和每個分子至少5個電荷，以及一個與所述第一層聚電解質相反的電荷。
2. 權利要求1的方法，其中沉積步驟包括將所述復合多肽沉積 在基質上，并且進一步包括將所述第二層聚電解質沉積在所述第一 層上。
3. 權利要求1的方法，其中所述一個或多個表面吸附區(qū)和一個 或多個功能區(qū)通過溶液相合成、固相合成或重組肽生成而產生。
4. 權利要求l的方法，其中所述復合多肽具有大于或等于約1 mg/mL的水溶解度。
5. 權利要求1的方法，其中所述功能區(qū)包含功能基序，所述功 能基序包含3至約50個氨基酸殘基，并且其中所述復合多肽在中性 pH下每個殘基具有大于或等于0. 4的凈電荷強度。
6. 權利要求l的方法，其中所述功能區(qū)是包含約50至約250個氨基酸殘基的功能結構域。
7. 權利要求6的方法，其中所述功能結構域在pH 4至10下具 有大于50網/mL的水溶解度。
8. 權利要求6的方法，其中所述功能結構域在pH 4至10下具 有大于1 mg/mL的水溶解度。
9. 權利要求l的方法，其中所述聚陽離子材料包含聚胺。
10. 權利要求1的方法，其中所述聚陰離子材料包括核酸、藻 酸鹽、角叉菜膠、帚叉藻聚糖、果膠、黃原膠、透明質酸、肝素、 硫酸肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸葡聚糖、聚甲基丙烯酸、 氧化纖維素、羧甲基纖維素、酸性多糖和含有側鏈羧基的交聯羧甲 基纖維素、合成聚合物和共聚物，以及包含一種或多種上述聚陰離 子材料的組合形式。
11. 權利要求l的方法，其中所述膜是微囊形式。
12. 權利要求ll的方法，其中所述微囊包含核心，并且所述核 心包含蛋白質、藥物或其組合。
全文摘要
本文公開了包含兩層或更多層聚電解質的多層膜，其中相鄰層包含帶相反電荷的聚電解質。第一層聚電解質包含復合多肽，所述復合多肽包含與一個或多個功能區(qū)共價連接的一個或多個表面吸附區(qū)，所述功能區(qū)生成單個多肽鏈。所述表面吸附區(qū)包含一個或多個由5至15個氨基酸殘基組成的氨基酸序列基序。所述一個或多個功能區(qū)包含3至約250個氨基酸殘基。
文檔編號C07K17/00GK101365724SQ200680039950
公開日2009年2月11日 申請日期2006年10月25日 優(yōu)先權日2005年10月25日
發(fā)明者D·T·海尼 申請人:路易斯安那科技大學研究基金會