專利名稱：：FcRn受體的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及(例如，單克隆)抗體及其書f生物的生成，甚至更具體地，涉及治療性和診斷性抗體及其衍生物的生成。
背景技術(shù)：
：利用單克隆抗體(mAb)的免疫治療已經(jīng)開始成為一種重要的用于癌癥、免疫缺陷、免疫調(diào)節(jié)和自身免疫的治療方法(綜述見L2)?？贵w治療的一個(gè)重要優(yōu)勢是極具選擇性地靶向引起疾病的致病因子的能力。此外，治療性抗體可與免疫細(xì)月包相互作用并激活補(bǔ)體，而補(bǔ)體顯著促進(jìn)它們的治療效果。Drs.K6hkr和Milstein3在1975年開發(fā)了生成單克隆抗體的4支術(shù)，并由于該發(fā)現(xiàn)而一皮4受予1984年的諾貝爾獎(jiǎng)。1986年美國食品與藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)了第一個(gè)治療性單克隆抗體(OKT3)，用來逆轉(zhuǎn)(reverse)急性腎移才直氺卜斥。該抗體來源于小鼠，在人體內(nèi)i秀導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，這限制了該藥的^f吏用，因?yàn)樗荒茉诙唐趦?nèi)安全應(yīng)用。為了避免這個(gè)問題，生產(chǎn)了嵌合的(70%人源)和人源化(~80-95%人源)抗體。后期的技術(shù)可利用噬菌體展示纟支術(shù)而實(shí)現(xiàn)合成性人源抗體的生成，這種抗體更加適于在人體內(nèi)應(yīng)用。隨著基因工程性人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的開發(fā)出現(xiàn)，現(xiàn)在已可能生成全人源抗體，因此能夠重復(fù)給藥而實(shí)現(xiàn)人體內(nèi)更加有效的治療L2。FDA批準(zhǔn)用于腫瘤治療的第一個(gè)US抗體是嵌合抗體利妥昔單抗(Rituximab),它針對(duì)B細(xì)胞上的CD20靶標(biāo)，已證實(shí)在非霍奇金'淋巴瘤的治療中非常有效，還證實(shí)了抗體治療可成功抵御實(shí)體瘤，如曲妥單抗(Trastuzumab)i正明的，該藥物刮-對(duì)Her-2/neu(c-erbB2),而Her-2/neu(c-erbB2)在~30%的乳腺癌中過量表達(dá)?？贵w治療在臨床上還用于抵抗傳染性病原體(帕利珠單抗(Synagis),針對(duì)呼吸道合胞病毒)、抑制器官移植后的排斥反應(yīng)(賽尼哌(Zenapax)和舒萊(Simulect))以及4十只t自身免疫性疾病如克隆氏病(Crohn'sdisease)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(TNF-oc特異的抗體英利昔單抗(Remicade))L2。目前，USFDA已批準(zhǔn)了18種抗體用于臨床應(yīng)用(表l)4，超過400種用于臨床應(yīng)用的抗體正在被開發(fā)。該頗具前途的新型療法的一個(gè)缺點(diǎn)是每個(gè)患者必須反復(fù)給予大量抗體(每個(gè)患者達(dá)到克級(jí))以及高額生產(chǎn)費(fèi)用(相對(duì)于小分子)。高額治療費(fèi)用限制了治療性抗體的廣泛應(yīng)用，且引發(fā)了其在選4奪性患者群中應(yīng)用的〗侖理問題。我們預(yù)期，新沖支術(shù)和方法可縮4豆生產(chǎn)時(shí)間和/或增加產(chǎn)量，將使抗體藥物更加節(jié)約成本且對(duì)于臨床應(yīng)用更加方便可獲得。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供提高產(chǎn)量和/或質(zhì)量以及/或者縮短生產(chǎn)時(shí)間和/或降<氐生產(chǎn)成本的方法和方式。其中，本發(fā)明4皮露了FcRn受體蛋白和/或其表達(dá)增加可促進(jìn)抗體生成細(xì)胞周圍的液體中形成更高的抗體濃度，不受理i侖的限制，我們i人為這至少部分是由于抗體生成細(xì)胞所分泌的抗體增加所致。因此，在第一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種用于在細(xì)胞內(nèi)生成抗體或者其功能性部分、衍生物和/或類似物的方法，包括提供能夠利用FcRn受體蛋白生成所述抗體的細(xì)胞以及培養(yǎng)所述細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)所述抗體的生成。關(guān)于術(shù)語"生成"，應(yīng)注意上述步驟不<又<又用于抗體生成，所述步艱《還可用于增加抗體產(chǎn)量的方法中。在后一種情況下，所述細(xì)胞已能生成(小量)抗體，通過誘導(dǎo)或增加所述細(xì)胞表達(dá)的FcRn受體蛋白的量可增加產(chǎn)量。通常，抗體(或免疫5求蛋白；本文中所述術(shù)語可互換應(yīng)用)被描述成一種其單體為"Y"形分子的蛋白，該分子由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈組成，鏈之間通過二硫鍵連接。每一條重鏈均具有一個(gè)恒定區(qū)(其在同一類的所有免疫球蛋白中是相同的)以及一個(gè)可變區(qū)(其在不同B細(xì)胞的免疫球蛋白之間是不同的，但在相同B細(xì)胞的全部免疫球蛋白中則是相同的)。根據(jù)特異的抗體同種型，所述重《連具有由三個(gè)或四個(gè)結(jié)構(gòu)i或組成的恒定區(qū)。4壬4可重《連的可變部分區(qū)域都是由一個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。每一條輕《連均具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)i戈一個(gè)恒定區(qū)和一個(gè)可變區(qū)?？贵w由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，所述抗體可分成兩個(gè)Fab(抗原結(jié)合片段)段和一個(gè)Fc(可結(jié)晶片段)段。該Fc段是"Y"的莖，由兩條重鏈組成，其中，隨抗體類別不同每條重鏈貢獻(xiàn)兩個(gè)或三個(gè)恒定區(qū)。其中，盡管根據(jù)本發(fā)明所述的方法是基于FcRn可促進(jìn)IgG生成細(xì)胞分泌IgG的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明并不限于(天然)IgG抗體，因?yàn)楸绢I(lǐng)域的當(dāng)前發(fā)展水平已經(jīng)達(dá)到了嵌合抗體、抗體衍生物、抗體等價(jià)物、抗體類似物和抗體片段的生產(chǎn)。所述嵌合物、衍生物、等價(jià)物、類似物和片段的實(shí)例將在下文詳細(xì)討論。因此，本發(fā)明還提供了用于生成抗體的功能性部分、衍生物和/或類似物的方法或者增加其產(chǎn)量的方法。本文中，"功能性"是指能夠以刺激IgG-FcRn結(jié)合性能的方式結(jié)合于FcRn受體蛋白。根據(jù)目前的^口"i只，IgG的Fc(以及白蛋白)結(jié)合于FcRn受體蛋白。而且，已知Fc的CH2和CH3之間的界面與FcRn受體蛋白相互作用5-7。因此，包含IgG的Fc或包含至少Fc的CH2-CH3界面的抗體嵌合物、衍生物、等價(jià)物、類似物以及片段也包括于本發(fā)明中?？贵w功能性部分的實(shí)例是基本上包括至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)以及FcRn結(jié)合部分的IgG分子，即基本上已經(jīng)去除了全部非抗原結(jié)合部分以及全部非FcRn結(jié)合部分?？贵w書f生物的一個(gè)實(shí)例是由受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(即CD40配體)和IgG抗體的FcRn結(jié)合部分(CD40L-Fc)組成的嵌合分子，即所謂的IgG半分子。類似物的實(shí)例如某種人IgG抗體(或者其一部分或衍生物)的鼠源類似物或另一種以刺激IgG的方式結(jié)合FcRn的分子在pH6.5和更低時(shí)為高/中度親和結(jié)合，但在生理pH7.4時(shí)不結(jié)合或低結(jié)合(即白蛋白)。其所有部分、書亍生物和/或類^f以物必須至少包4舌一個(gè)FcRn結(jié)合部分例如IgG抗體的全長Fc片段或其功能性部分即能夠結(jié)合FcRn的部分(種類上是，lt量上不一定)，例如Fc的CH2-CH3界面。因此，5見在申i青的發(fā)明不4又在例如單克隆4元體的生成中有用，而且還可用于雙特異性抗體、小分子免疫藥物(SMIPs)的生成、單克隆坤支術(shù)3。細(xì)月包雜交瘤和/或寡克隆(oligoclonics)^支術(shù)的所有變形以及所有具有與IgG類似的FcRn結(jié)合特性的所有分子(低pH時(shí)結(jié)合，在高于7的生理性pH下不結(jié)合或低結(jié)合)的生成。還可以通過交4奐iU奮飾FcRn的細(xì)月包外結(jié)合區(qū)但J呆留FcRn的細(xì)月包內(nèi)尾巴和功能而應(yīng)用，以適于提高新型分子的產(chǎn)量。根據(jù)目前用于這些分子的生成方法，人們可以例如處理可產(chǎn)生所述分子的細(xì)月包，-使其還能生成FcRn或者生成更多/其他FcRn。隨后所述FcRn的存在可促進(jìn)所述分子的生成。一類IgG受體是新生兒FcyR(FcRn)受體，由獨(dú)特的a鏈和P2-孩i5求蛋白((32M)組成，^f戈表主要組織相容性I類(MHC-I)同系物8，已發(fā)現(xiàn)其存在于上皮細(xì)胞、胎盤合胞體滋養(yǎng)層以及內(nèi)皮細(xì)胞中。在這些細(xì)胞中，已表明FcRn分別與IgG^爭粘膜細(xì)胞8'9轉(zhuǎn)運(yùn)(從母體至胎兒1。)以及IgG半衰期的調(diào)節(jié)"—14有關(guān)。在這些組織中，F(xiàn)cRn結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)IgG，為新生兒提供體液免疫并延長IgG的壽命。最近，我們鑒定FcRn在吞噬細(xì)胞上表達(dá)，其中，它與"經(jīng)典"白細(xì)胞FcYR—起發(fā)揮作用，介導(dǎo)IgG包裹的耙標(biāo)的內(nèi)化(吞噬)15。最近的研究結(jié)果表明FcRn在白蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)中起作用16，并介導(dǎo)IgG至粘膜表面的轉(zhuǎn)運(yùn)以及粘膜抗原攝取9。本發(fā)明不僅包括FcRn受體蛋白的用途還包括其功能性部分、衍生物和/或類似物的用途。在本文中，術(shù)語"功能性"是指所述部分、衍生物和/或類似物必須還能夠結(jié)合IgG分子的Fc段(或白蛋白)，優(yōu)選具有相同或可比擬/類似的pH依賴性。甚至更優(yōu)選地，所述FcRn的功能部分、衍生物和/或類似物還包括溶酶體與細(xì)胞膜間運(yùn)輸所有必需的元件，例如恰當(dāng)?shù)男盘?hào)序列和重新環(huán)化信號(hào)。FcRn的晶體結(jié)構(gòu)是已知的5'17，18，且有報(bào)道稱人和大鼠FcRn的晶體結(jié)構(gòu)類似5，7。此外，F(xiàn)c結(jié)合位點(diǎn)也極具同源性5，7，18,因此熟練才支術(shù)人員具有開發(fā)FcRn功能部分、書f生物和/或類似、物所必需的全部4言息，而無過度負(fù)擔(dān)。檢測FcRn受體蛋白功能部分、衍生物和/或類似物的功能性的一種非限定性方式是通過在pH6.5和7.4時(shí)測定其與例如Fc或白蛋白的結(jié)合能力。在pH6.5左右，所述功能部分、書f生物和/或類似物與其所述Fc或白蛋白應(yīng)該發(fā)生結(jié)合，而在pH7.4左右則不結(jié)合。允許本發(fā)明所述方法中的細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基中生長或存活足夠長的時(shí)間(即所述細(xì)胞在適宜條件下培養(yǎng)或孵育，該條件可隨采用的特殊細(xì)胞而異)，以實(shí)現(xiàn)抗體的生成。FcRn受體蛋白的存在促進(jìn)抗體生成細(xì)胞分泌抗體，因此可提供和/或增強(qiáng)抗體生成?？蛇x地，所生成的抗體通過本領(lǐng)域、技術(shù)人員已知的4支術(shù)例如可4安照廠家的"i兌明書(Amersham，Uppsala,Sweden)通過蛋白A或蛋白G親和純化而收集和/或純化。才艮據(jù)所需抗體的量，4艮據(jù)本發(fā)明所述的方法可從'J、規(guī)模成比例擴(kuò)大至中或大規(guī)模。不同規(guī)模涉及不同的培養(yǎng)系統(tǒng)，從T培養(yǎng)瓶(小)、4爭弁瓦、細(xì)月包系(CellLine)(IntegraBiosciences,Chur，Switzerland)埃倫邁爾燒并瓦(中)至更大(定制)的發(fā)酵罐系統(tǒng)(大)。本發(fā)明所述方法中采用的細(xì)月包即能夠產(chǎn)生抗體的細(xì)月包可以是多種方式獲得/來源的。例如人們可以采用其本身即能產(chǎn)生抗體的細(xì)胞例如B細(xì)胞或B細(xì)胞來源的細(xì)胞(NS-O,SP2/0)或雜交瘤細(xì)胞。然而，人們還可采用在天然條件下不產(chǎn)生抗體^f旦經(jīng)(遺傳性)處理可產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，例如中華倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、幼年倉鼠腎細(xì)胞、293細(xì)胞及其衍生物或者其他表達(dá)腺病毒El的細(xì)胞系如PER,C6。要求這種細(xì)胞是能夠提供FcRn功能環(huán)境的真核細(xì)胞。"功能環(huán)境"是指FcRn在該細(xì)胞內(nèi)是有功能的(能夠轉(zhuǎn)運(yùn))，即該細(xì)胞必須表達(dá)必要的分子結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，這種細(xì)胞具有編碼抗體或者其功能部分、衍生物和/或類似物的核酸。甚至更優(yōu)選地，將所述核酸功能性地連"^妻于調(diào)節(jié)性序列如啟動(dòng)子序列和增強(qiáng)子序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述細(xì)胞是一種細(xì)胞系的部分，優(yōu)選永生化或不死性細(xì)胞系。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，這種細(xì)胞具有FcRn。如下文將更加詳細(xì)闡述的，在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明提供(例如人)細(xì)胞的內(nèi)源性FcRn啟動(dòng)子被強(qiáng)(組成性)啟動(dòng)子或可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子取4戈，或者細(xì)月包的內(nèi)源性FcRn啟動(dòng)子已經(jīng)祐j秀導(dǎo)。所述FcRn蛋白受體分子可以蛋白形式或以編石馬所述FcRn受體蛋白(或者其功能部分、衍生物和/或類似物)的核酸的形式提供。如果FcRn受體蛋白以蛋白形式提供，優(yōu)選其通過蛋白轉(zhuǎn)染試劑(例如Chariot,ActiveMotif，Carlsbad,CA)而遞送，或偶聯(lián)于轉(zhuǎn)運(yùn)基團(tuán)/蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽(其能夠使所述基團(tuán)/肽與所述FcRn的融合體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi))。這種基團(tuán)/肽的實(shí)例是HIV-TAT蛋白。然而，為了建立更加穩(wěn)定的情形，優(yōu)選所述FcRn受體蛋白以核酸形式^是供。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種用于在細(xì)胞內(nèi)生成抗體或者其功能部分、衍生物和/或類似物的方法，包括提供能夠利用FcRn受體蛋白生成所述抗體的細(xì)力包以及培養(yǎng)或孵育所述細(xì)月包，以實(shí)現(xiàn)所述抗體的生成，其中所述細(xì)胞具有編碼所述FcRn受體蛋白的核酸。盡管可能將所述編碼FcRn蛋白受體的核酸維持為染色體外物質(zhì)，但優(yōu)選將所述核酸整合入該細(xì)胞的基因組中。這一點(diǎn)通過例如編碼FcRn的核酸與所采用細(xì)胞(系)染色體之間的同源重組而實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地，以革巴向方式進(jìn)行重組，以確保將編碼FcRn的核酸整合入染色體的轉(zhuǎn)錄活性部分中。顯然，對(duì)本領(lǐng)域的熟練4支術(shù)人員來說，可將所述編碼FcRn的核酸功能性連接于調(diào)節(jié)序列例如啟動(dòng)子，以及可選地連接于增強(qiáng)子序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，F(xiàn)cRn受體蛋白在所采用的細(xì)胞內(nèi)過量生成。過量表達(dá)可通過例如提供功能性偶聯(lián)于調(diào)節(jié)序列的多拷貝FcRn和/或通過纟是供連接于強(qiáng)調(diào)節(jié)性啟動(dòng)子(例如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子或其變體)的有限拷貝(例如一個(gè)或兩個(gè)拷貝)或其纟且合而實(shí)5見。1顯然，對(duì)本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來說，除了提供具有FcRn受體蛋白(以蛋白形式或以編碼所述FcRn受體蛋白(或者其功能部分、衍生物和/或類似物)的核酸的形式)的細(xì)胞，還可能例如誘導(dǎo)或增加已包含涉及FcRn遺傳信息的細(xì)胞內(nèi)FcRn受體蛋白表達(dá)。這可通過例如向所述細(xì)胞中加入"i秀導(dǎo)劑、FcRn(oc鏈)基因前的啟動(dòng)子和/或(32微球蛋白基因前的啟動(dòng)子而實(shí)現(xiàn)。在另一個(gè)實(shí)施例中，F(xiàn)cRn受體蛋白通過例如用強(qiáng)啟動(dòng)子或可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子取代a鏈前的內(nèi)源性啟動(dòng)子而提供。如果技術(shù)人員愿意在人FcRn受體蛋白的存在下在人細(xì)胞內(nèi)生成人抗體或增加其產(chǎn)量，則可利用標(biāo)準(zhǔn)的(以及為人熟知的)分子生物學(xué)4支術(shù)而實(shí)現(xiàn)內(nèi)源性FcRn啟動(dòng)子的i秀導(dǎo)或者用強(qiáng)或可i秀導(dǎo)性啟動(dòng)子取^R內(nèi)源性啟動(dòng)子。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種用于在細(xì)胞內(nèi)生成抗體或者其功能性部分、衍生物和/或類似物的方法，包括提供能夠利用FcRn受體蛋白生成所述抗體的細(xì)胞以及培養(yǎng)所述細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)所述抗體的生成，其中所述抗體來自一個(gè)物種，所述細(xì)月包來自相同或不同物種。后面一種情形的實(shí)例是在小鼠體內(nèi)或鼠細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生人類抗體。顯然，對(duì)熟練才支術(shù)人員來i兌，可以制備導(dǎo)入的FcRna《連以及FcRnP2微球蛋白與可選性已存在于所述細(xì)胞內(nèi)的FcRn鏈的多種組合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種用于在細(xì)胞內(nèi)生成抗體或者其功能性部分、衍生物和/或類似物的方法，包括提供能夠利用FcRn受體蛋白生成所述抗體的細(xì)胞以及培養(yǎng)所述細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)所述抗體的生成，其中至少提供或過量生成FcRn受體蛋白的a鏈。如果該細(xì)胞的(32微球蛋白表達(dá)對(duì)于所述細(xì)胞不是一種限制性因素，則這種方法特別有用。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包括提供或過量生成(32微球蛋白，其中(32微球蛋白(質(zhì)/量)是限制性的。顯然，導(dǎo)入FcRn的哪個(gè)特定部分，很大程度上依賴于所采用的細(xì)胞類型。通常細(xì)胞將包括足夠的P2M，因此不需要導(dǎo)入p2M。如果細(xì)月包不包括(32M或不包括足夠量P2M,則也必須導(dǎo)入P2M。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述cc鏈和/或所述(32孩O求蛋白來自相同物種。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施例中，所采用的細(xì)胞也來自相同物種，即如果所述細(xì)胞是人源，則所述細(xì)胞優(yōu)選具有或過量生成人FcRn的cc鏈，可選地，以及(32微球蛋白。在另一個(gè)甚至更優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明才是供一種用于生成抗體的方法，其中所述細(xì)胞生成的抗體來自與所述FcRn受體a鏈相同的物種，或者來自所述物種的功能性類似物。在所闡述的實(shí)例中，這將意味著所述抗體也是人源的。所述物種的功能類似物的實(shí)例是來自相同種屬的抗體。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述ot鏈和/或|32M以及所述抗體來自相同物種，而所述細(xì)胞來自另一個(gè)物種。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述a鏈和/或P2M以及所述抗體均來自人，所采用的細(xì)力包是嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選中華倉鼠或鼠細(xì)胞。如上文已經(jīng)闡述的，才艮據(jù)本發(fā)明所述方法的其中一個(gè)重要應(yīng)用是生成用作治療性化合物的人源抗體，因此在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所產(chǎn)生的抗體來自人。甚至更優(yōu)選地，在人FcRn存在的情況下，所述人源抗體在人細(xì)胞內(nèi)生成。在這種情況下，F(xiàn)cRn前面的內(nèi)源性啟動(dòng)子被誘導(dǎo)，或者FcRn前面的啟動(dòng)子被強(qiáng)(組成性)啟動(dòng)子取代或^皮可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子耳又代。另一個(gè)重要應(yīng)用是在"^斷性抗體的領(lǐng)域，其中所生成的抗體優(yōu)選是小鼠抗體，其中所述抗體在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生。顯然，對(duì)熟練技術(shù)人員來說，可以采用不同種類的細(xì)胞，例如來自不同物種(人、鼠等)的細(xì)胞。而且，所述細(xì)胞本身可能夠或不能夠生成抗體。顯然，得到大量生成IgG的細(xì)胞最便捷的途徑是通過為天然能夠生成抗體的細(xì)胞(例如B細(xì)胞來源的細(xì)胞)提供具有編碼一種抗體的核酸，因?yàn)檫@種細(xì)胞已經(jīng)具有抗體生成所需的分子結(jié)構(gòu)，而天然不生成抗體的細(xì)胞則不是這樣(或不足夠)的情況。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明l是供一種用于在細(xì)胞內(nèi)生成抗體或者其功能性部分、書于生物和/或類似物的方法，包括4是供能夠利用FcRn受體蛋白生成所述抗體的細(xì)胞以及培養(yǎng)所述細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)所述抗體的生成，其中所述細(xì)胞來自人或嚙齒類動(dòng)物，優(yōu)選嚙齒類動(dòng)物是中華倉鼠或小鼠。恰當(dāng)?shù)男∈蠹?xì)胞的實(shí)例是來源于可產(chǎn)生小鼠IgG的正常小鼠的雜交瘤細(xì)胞，或來自可產(chǎn)生人IgG的轉(zhuǎn)基因小鼠。用于一種方法中的細(xì)胞不^f又可存在于細(xì)月包收集物中(即存在于細(xì)月包培養(yǎng)物中)，還可是非人動(dòng)物的一部分。恰當(dāng)?shù)姆侨藙?dòng)物的實(shí)例是母牛、山羊、小鼠、大鼠、兔、豬或羊等。另外，雞及其卵也是合適的生成平臺(tái)。挑選一種特異性轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)用于生產(chǎn)抗體(或者上述其衍生物中的一種)的選擇依賴于幾個(gè)因素，包括遺傳特征、動(dòng)物大小、奶或血液的體積、傳代的難易度、組織特異性表達(dá)的可行性、所生成抗體的質(zhì)量(穩(wěn)定性、功能性、半衰期)。熟練技術(shù)人員可以根據(jù)關(guān)于這些因素的公開可得到的信息，很方便的選擇最恰當(dāng)?shù)姆侨藙?dòng)物。轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物可以多種方式得到，其中包括通過前核顯樣i注射和核移植。獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法優(yōu)選以可實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性基因轉(zhuǎn)移的方式實(shí)施。轉(zhuǎn)染色體非人動(dòng)物也包括在本發(fā)明中。優(yōu)選這種非人動(dòng)物具有編碼所需抗體(或者其功能性部分、衍生物和/或類合乂物)的核@吏，在更4尤選的實(shí)施例中，所述動(dòng)物還具有編碼FcRn(或者其功能性部分、衍生物和/或類似物)的核酸。例如，如果小鼠A包括編碼抗體的核酸，小鼠B包括編碼FcRn的核酸，那么包括兩種核酸的小鼠可通過例如小鼠A和B的交配育種而得到。因此在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明提供包括編碼FcRn(或者其功能性部分、書f生物和/或類似物)的核酸的非人動(dòng)物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，如果與所述動(dòng)物中天然存在的核酸序列相比，所述核酸是異源性的，例如小鼠體內(nèi)編碼人FcRn的a鏈的核酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明提供包括涉及FcRn啟動(dòng)子取代的非人動(dòng)物，例如，用強(qiáng)(組成性)啟動(dòng)子或可"i秀導(dǎo)性啟動(dòng)子取^內(nèi)源性FcRn啟動(dòng)子。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明提供包括誘導(dǎo)的內(nèi)源性FcRn啟動(dòng)子的非人動(dòng)物。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明4是供一種包4舌編碼FcRn(或者其功能性部分、衍生物和/或類似物)的核酸的植物。優(yōu)選地，這種轉(zhuǎn)基因植物包括編碼FcRn的cc鏈的核酸以及編碼P2M的核酸。甚至更優(yōu)選地，這種4直物還具有編碼抗體(或者其上述衍生物中任何一種)的核酸。在另一個(gè)實(shí)施例中，產(chǎn)生不同抗體收集物的細(xì)胞用于才艮據(jù)本發(fā)明所述的方法中，因此可得到抗體混合物(多克隆混合物或全克隆混合物，即由單個(gè)純種細(xì)月包系生成的多種抗體)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，才艮據(jù)本發(fā)明所述的方法采用產(chǎn)生單一類型抗體的細(xì)胞，因此該方法可產(chǎn)生單克隆抗體，例如鼠單克隆抗體或人單克隆抗體或者其功能性片段、衍生物和/或類似物。在另一個(gè)實(shí)施例中，人源類似物用于本發(fā)明所述的4壬4可一種方法中，例如來自靈長類的抗體或來自靈長類的oc鏈和/或(32微球蛋白。顯然，本發(fā)明可用于生成靈長類或靈長化抗體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所產(chǎn)生的抗體是IgG。如同(32M和FcRn的oc《連，免疫J求蛋白的重《連和輕《連均^皮合成并分泌入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，若是FcRn在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中組裝成完全功能性的異二聚體或者若是IgG組裝成異二聚體的二聚體(兩條重鏈和兩條輕鏈)。如上文已經(jīng)概括論述的，IgG-半分子以及IgG衍生物和/或其類似物也包括在本發(fā)明中，雙特異性抗體、SMIP、細(xì)胞雜交瘤的抗體(全克隆系，輕鏈相同而重鏈不同)只要如上所述以pH依賴性方式結(jié)合FcRn或其變體(所述被改變的FcRn保留正常的FcRn胞內(nèi)傳導(dǎo)機(jī)制)也包括在本發(fā)明中?，F(xiàn)在將討論另外兩種常用細(xì)胞類型。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明才是供一種用于在細(xì)胞內(nèi)生成抗體或者其功能性部分、衍生物和/或類似物的方法，包括々是供能夠利用FcRn受體蛋白生成所述抗體的細(xì)胞以及培養(yǎng)所述細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)所述抗體的生成，其中所述細(xì)胞是雜交瘤細(xì)力包或4t染瘤細(xì)月包。雜交瘤細(xì)胞是B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞之間的融合體。這種雜交瘤細(xì)胞具有的優(yōu)勢即所得到的細(xì)胞系是永生化的，因此可基本保證單克隆抗體的一直生成。產(chǎn)生IgG的雜交瘤細(xì)"包的生成涉及到體外和體內(nèi)階^殳。首先用耙抗原免疫4妻種小鼠，隨后將B細(xì)胞(通常來自脾臟或淋巴結(jié))與"融合伴倡，，(例如NS-1或SP2/0纟田月包)融合以永生化。隨后，在單細(xì)力包水平上篩選所得到的細(xì)胞，并通過其分泌抗把抗原的抗體的能力進(jìn)行鑒定。FcRn可以在所述融合之前或之后提供。已經(jīng)建立的雜交瘤細(xì)胞系在所述細(xì)胞融合之后具有FcRn，但尚未融合的細(xì)胞在與骨髓瘤細(xì)胞融合時(shí)可以已經(jīng)具有FcRn(例如，所述融合伴倡已經(jīng)具有FcRn)。在本文中，轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞是一種已經(jīng)具有編碼抗體或者其功能性部分、衍生物和/或類似物的核酸的細(xì)胞。這種轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞的實(shí)例是CHO、BHK或NS-0細(xì)胞，其已經(jīng)具有編碼抗體或者其功能性部分、書亍生物和/或類似、物的核酸。FcRn可在用編；馬所述抗體或者其功能性部分、衍生物和/或類似物的核酸轉(zhuǎn)染該細(xì)胞之前、轉(zhuǎn)染時(shí)或轉(zhuǎn)染后提供。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，將編碼所述抗體或者其功能性部分、書f生物和/或類似物的核酸偶聯(lián)于調(diào)節(jié)序列如啟動(dòng)子以及可選的還有增強(qiáng)子序列。才元體生成系鄉(xiāng)充可以基于體外或體內(nèi)系纟克。顯然，體外方法比專交容易生存和繁殖。然而，體內(nèi)系統(tǒng)的優(yōu)勢在于其可誘導(dǎo)而增加所收集的IgG的產(chǎn)量。因此本發(fā)明提供一種用于生成抗體或用于增加抗體產(chǎn)量的方法，所述方法是體內(nèi)系統(tǒng)(例如小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的腹水)或體外系統(tǒng)(例如永生化細(xì)胞系)。如上文已經(jīng)討i侖的，體內(nèi)系統(tǒng)優(yōu)選借助于轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物(其包含編碼FcRn的(其他)(異源性)核酸)而實(shí)施。恰當(dāng)?shù)姆侨藙?dòng)物的實(shí)例是母牛、小鼠、大鼠、豬、雞、兔或羊。本發(fā)明進(jìn)一步提供能夠生成抗體的細(xì)胞，該細(xì)胞具有FcRn或具有至少一個(gè)額外拷貝的編碼FcRn的核酸。這種FcRn分子(或其核酸)的存在，〗昔助于標(biāo)準(zhǔn)的生物化學(xué)和/或分子生物學(xué)4支術(shù)可以4艮輕易確定。甚至更優(yōu)選地，本發(fā)明4是供一種具有至少一個(gè)編碼FcRn的(額外)拷貝的核酸的非人動(dòng)物。這種動(dòng)物的實(shí)例是小鼠或倉鼠。這種小鼠可通過例如將包含編碼人IgG的核酸的小鼠與oc鏈FcRn敲除的小鼠(以及優(yōu)選地，雙敲除小鼠，還缺乏功能性小鼠(32微球蛋白)雜交而得到，所述oc鏈FcRn敲除小鼠具有編碼人FcRn的核酸。得到的小鼠包括編碼人IgG的核酸以及編碼人FcRn的核酸，可以i人為其為高人IgG表達(dá)動(dòng)物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述FcRn受體蛋白和所述抗體來源于一個(gè)物種以及相同物種(例如人)，所述動(dòng)物來源于另一個(gè)物種(例如小鼠)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述FcRn受體蛋白包括來自一個(gè)物種的變體，其更適合與另一物種(例如人)的IgG共同發(fā)揮作用，所述動(dòng)物來自與FcRn相同的物種(例如小鼠)。本發(fā)明還提供FcRn受體蛋白(或者其功能性部分、衍生物和/或類似物)用于提供在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(或增加表達(dá))抗體(或者其功能性部分、書f生物和/或類似物)的用途。FcRn受體蛋白(或者其功能性部分、衍生物和/或類似物)可以蛋白或編碼所述受體蛋白的核酸的形式4是供。如果所討i侖的細(xì)月包的確已經(jīng)包含用于生成所需抗體(或者其功能性部分、衍生物和/或類似物)的信息，則不需要再提供編碼所述抗體的核酸。如果該細(xì)胞不含有所述信息，則還需要提供編碼所述抗體的核酸給所述細(xì)胞?？贵w生成細(xì)胞(例如B細(xì)胞)，同其他細(xì)胞一樣，通過胞々大作用吸收液相組分。在內(nèi)皮細(xì)胞(以及其他表達(dá)FcRn的細(xì)胞)中，利用該方法吸收的多數(shù)蛋白被降解。然而，由于FcRn,IgG分子不被溶酶體降解，并循環(huán)回周圍介質(zhì)中n'12。FcRn介導(dǎo)的IgG循環(huán)在體內(nèi)是可.飽和的4'12,因此不僅IgG生成細(xì)胞的IgG分泌可能依賴于FcRn，其循環(huán)可能也依賴于FcRn。為了實(shí)驗(yàn)性驗(yàn)證該觀點(diǎn)，我們進(jìn)行了竟?fàn)幮匝芯浚渲性跓o外源性多克隆人IgG或其含量遞增的情況下，我們分別培養(yǎng)數(shù)量相等的人293細(xì)胞(其表達(dá)內(nèi)源性FcRn)。已i正實(shí)外源添加的IgG可抑制這些細(xì)力包的IgG分泌，與通過FcRn的IgG循環(huán)的可飽和性是一致的。這些數(shù)據(jù)表明細(xì)胞的IgG生成受負(fù)反饋機(jī)制的調(diào)節(jié)。從所生成的IgG上清中連續(xù)吸收，增加了細(xì)力包IgG的生成水平，乂人而增加了產(chǎn)量。因此在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種用于在細(xì)胞內(nèi)生成抗體的方法，包括培養(yǎng)所述細(xì)胞以及從所述培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中(半連續(xù)性)收集抗體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，通過所述連續(xù)性收集將所述培養(yǎng)基中的抗體濃度保持在低于FcRn所介導(dǎo)的循環(huán)的功能性飽和水平。熟練技術(shù)人員通過及時(shí)確定所分泌抗體(IgG)的量并對(duì)19這兩個(gè)變量作圖，可以4艮輕易確定細(xì)月包的々包和水平。如果分泌4元體的量達(dá)到了一個(gè)平臺(tái)^直，即可確定々包和7K平。例如，^f于包含天然FcRn的細(xì)胞以及已經(jīng)具有至少一個(gè)額外拷貝的FcRn的(相同種類)細(xì)月包，均可確定該々包和水平。一旦確定了所述々包和7K平，即可實(shí)施上述方法，以4更不會(huì)達(dá)到々包和水平。因此，可增加所生成抗體的量。這種方法的效果可通過例如在封閉于孩史孔力莫(Transwell-system,Corning,0.1-12juM濾膜)的后方的結(jié)合IgG的瓊脂糖-蛋白A珠子(AmershamBiosciences,直4圣45-165jum)存在的十青況下，比4交IgG的體外產(chǎn)量，所述方法適合所分泌的IgG滲透該濾膜，此時(shí)IgG將-波蛋白A阻留。以這種方式，我們通過避免IgG生成細(xì)胞內(nèi)的"FcRn飽和"而干擾負(fù)反饋機(jī)制?？蛇x地，本發(fā)明的這個(gè)部分可與前述發(fā)明相結(jié)合，即本發(fā)明進(jìn)一步4是供一種用于在細(xì)胞內(nèi)生成抗體或者其功能性部分、衍生物和/或類似物的方法，包括提供能夠利用FcRn受體蛋白生成所述抗體的細(xì)胞以及培養(yǎng)所述細(xì)力包，以實(shí)現(xiàn)所述抗體的生成，其中抗體是乂人所述培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中(半)連續(xù)性收集的。優(yōu)選地，通過所述連續(xù)性收集的方法將所述培養(yǎng)基中的抗體濃度保持在低于FcRn所介導(dǎo)循環(huán)的功能性々包和水平。這可通過例如采用蛋白G/蛋白A-瓊脂糖過濾裝置而實(shí)現(xiàn)。既然本發(fā)明披露了FcRn在抗體分泌中發(fā)揮作用，則熟練才支術(shù)人員可容易地選l奪其他適于,人培養(yǎng)物中除去所生成4元體的系統(tǒng)。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種抗體制備物，可通過才艮據(jù)本發(fā)明所述的方法而獲得。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種包含這種抗體制備物的藥物組合物。此外，上述抗體制備物在治療諸如癌癥或者炎癥性或傳染性疾病或者免疫缺陷、自身免疫或免疫調(diào)節(jié)等疾病時(shí)非常有用。因此，癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克隆氏病、啤喘、4艮屑病、病毒性呼吸疾病或多發(fā)性硬化等疾病的藥物中的應(yīng)用?？芍委煱┌Y的實(shí)例是非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、急性骨髓性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病或直腸癌。既然我們已經(jīng)證實(shí)FcRn在抗體分泌中發(fā)揮作用，該發(fā)現(xiàn)也可用來增加體內(nèi)抗體產(chǎn)量，因此本發(fā)明進(jìn)一步提供一種用于上調(diào)患者血液中抗體水平的方法，包括上調(diào)所述患者細(xì)胞內(nèi)FcRn受體的表達(dá)。才艮據(jù)本發(fā)明所述的方法不限于抗體的生成，還可用來生成包含感興趣蛋白與Fc段的融合蛋白。因此本發(fā)明提供一種用于增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)蛋白生成的方法，包括提供給所述細(xì)胞所述蛋白與Fc段的禹蟲合體以及提供給所述細(xì)胞FcRn受體蛋白，以及培養(yǎng)所述細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)蛋白-Fc融合產(chǎn)物的生成。優(yōu)選地，所述Fc,殳來自IgG。如上所述，F(xiàn)c辜殳一個(gè)有用的功能部分是所述CH2-CH3界面(interface)。優(yōu)選將所述融合蛋白以核酸形式提供給可選的已經(jīng)具有FcRn受體蛋白(或者其功能性部分、衍生物和/或類似物)的細(xì)胞。所述融合產(chǎn)物生成后，F(xiàn)cRn受體蛋白將促進(jìn)該融合產(chǎn)物分泌入培養(yǎng)基中，因此，所述融合產(chǎn)物將易于收集和純化。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，通過連4妻子將感興趣蛋白與Fc分開。為了某些應(yīng)用，優(yōu)選可用酶切除所述連接子，甚至更優(yōu)選地，利用所述酶的切割使得無額外氨基酸殘基連接于感興趣的蛋白。融合體的實(shí)例是(合成的)感興趣蛋白與IgG的Fc或者IgA與IgG的Fc的嵌合體等(例如CD40與IgGFc的融合體2Q，肺瘤壞死因子受體(TNF-R)與Fc的融合體21)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述感興趣蛋白是治療性分子。本發(fā)明還提供FcRn受體蛋白(或者其功能性部分、衍生物和/或類似物)在提供(或增加)細(xì)胞內(nèi)的抗體(或者其功能性部分、書亍生物和/或類4以物)表達(dá)方面的應(yīng)用。FcRn受體蛋白(或者其功能性部分、衍生物和/或類似物)可以蛋白或者編碼所述受體蛋白的核酸的形式才是供。如果所討論的細(xì)胞的確已經(jīng)包含用于生成所需抗體(或者其功能性部分、衍生物和/或類似物)的信息，則不需要再提供編碼所述抗體的核酸。如果該細(xì)胞不含有所述信息，則可給所述細(xì)胞額外提供編碼所述抗體的核酸。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種用于增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)蛋白生成的方法，包括4是供給所述細(xì)胞所述蛋白與白蛋白的融合體并4是供給所述細(xì)胞FcRn受體蛋白，以及培養(yǎng)所述細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)蛋白-白蛋白融合產(chǎn)物的生成。如已討論的，白蛋白也與FcRn受體蛋白相互作用。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種用于增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)蛋白生成的方法，包括提供給所述細(xì)胞所述蛋白(或分子)與結(jié)合IgG—部分和白蛋白一部分的分子的融合體或者所述蛋白(或分子)與能夠結(jié)合FcRn的合成分子的融合體。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種用于增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)蛋白生成的方法，包括提供給所述細(xì)胞白蛋白以及提供給所述細(xì)胞FcRn受體蛋白，以及培養(yǎng)所述細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)白蛋白的生成。在下面的說明書中，將更詳細(xì)地闡述本發(fā)明，但它并不限制本發(fā)明。圖1FcRn表達(dá)與體外IgGl產(chǎn)量增加相關(guān)。BHK細(xì)胞用抗奈瑟腦膜炎球菌(7Ve/Men'awew/wg"/cfa)PorinA的IgGl(pNUT，金屬石克蛋白啟動(dòng)子)22轉(zhuǎn)染，穩(wěn)定表達(dá)IgGl的單克隆隨后用人FcRn(pcDNA3.1,CMV啟動(dòng)子)轉(zhuǎn)染。在將同等量細(xì)胞接種入T培養(yǎng)瓶后第3天收集上清后，F(xiàn)cRn的表達(dá)通過FACS分析利用單克隆IgG3而確定，上清中的IgGl水平則利用PorA特異性ELISA而測定。每一個(gè)點(diǎn)均4戈表單個(gè)亞克隆的FcRn和IgGl的生成K平。IgG生成水平以初始空載體與轉(zhuǎn)染克隆(4.9jug/ml=100%)的生成％來表示。相關(guān)系數(shù)『=0.964，p(雙向)=0.036。圖2外源添力o的IgG抑制293細(xì)胞的IgG生成，表明這些細(xì)胞內(nèi)由FcRn介導(dǎo)的IgG循環(huán)是可飽和的。將生成抗肺炎球菌23的人IgGl的293細(xì)胞在純化的多克隆IgG(靜脈內(nèi)免疫^求蛋白，IVIG，Sanquinproducts,Amsterdam)存在的情況下進(jìn)行孵育。在所標(biāo)明的時(shí)間點(diǎn)耳又上清樣品，并利用抗原特異性ELISA測定抗肺炎球菌6B抗體23(未公布數(shù)據(jù)，n=3)。圖3用于B細(xì)胞或轉(zhuǎn)染瘤內(nèi)IgG生成的才莫型。la)編碼IgG輕《連和重《連的多肽鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)上翻譯，并在分子伴侶包括BiP的輔助下進(jìn)4亍組裝。編碼FcRn的oc《連的多肽鏈以及(32M也在ER上翻i奪并通過單體和二聚體相變而組裝，隨后其與P2M纟且裝在一起。FcRn在與P2M組裝之前或之后均可結(jié)合IgG25，26。2)完全組裝后，在有或無負(fù)荷(IgG)的情況下，通過分選內(nèi)涵體或溶酶體而轉(zhuǎn)運(yùn)FcRn，3)從內(nèi)涵體或溶酶體，F(xiàn)cRn可將IgG運(yùn)送至表面，在pH>7.4時(shí)釋放。4)當(dāng)FcRn飽和時(shí)，即不能再結(jié)合IgG，在所述溶酶體進(jìn)一步成熟后其成為降解對(duì)象27'28。如果不能有效運(yùn)出ER，新合成的IgG29，3G和FcRn25'26'31也將被降解。圖4液相IgG將被液相吞々欠，隨后被降解。1)細(xì)胞通過吞飲:懾取IgG,隨后在溶酶體pH(《6.5)時(shí)IgG可結(jié)合于FcRn。2)未結(jié)合IgG(無FcRn或FcRn凈皮々包和)在溶酶體內(nèi)降解。3)結(jié)合于FcRn的IgG則循環(huán)回細(xì)胞表面，隨后在中性pH下釋放入漿膜/上清。4)循環(huán)的IgG可^皮細(xì)月包(其4也細(xì)月包或相同細(xì)月包)吞飲。5)所述循環(huán)過禾呈以及隨后的降解，可通過蛋白G/蛋白A-瓊脂糖過濾裝置而克服。圖5IgG"捕獲裝置"。設(shè)置該裝置是為了研究在體外利用蛋白A通過微孔膜捕獲由IgG生成細(xì)胞所分泌的IgG的可行性，該孩丈孔膜適于IgG通過^f旦細(xì)胞或蛋白A瓊脂糖J朱子不能通過。因此，上清中的IgG不太可能達(dá)到細(xì)胞內(nèi)的飽和水平，且不太可能被IgG生成細(xì)胞吞飲攝取(否則其可能成為降解對(duì)象)。具體參見正文和圖5。圖6FcRn過表達(dá)或不過表達(dá)時(shí)，IgG分泌的預(yù)期動(dòng)力學(xué)。如果A)FcRn僅與IgG循環(huán)相關(guān)，與分泌不相關(guān)B)如果FcRn僅與分泌相關(guān)。野生型細(xì)胞實(shí)線，過表達(dá)FcRn的細(xì)胞粗線。點(diǎn)線利用IgG捕獲裝置的系統(tǒng)的預(yù)期產(chǎn)量(見上文的圖5)。具體實(shí)施例方式材料和方法重逸拔沐。本研究中采用的人抗肺炎球菌血清型6A/BGDobl抗體和重組抗腦膜炎^求菌PorA抗體在體外和體內(nèi)的生成和功能鑒定之前已經(jīng)在參考文獻(xiàn)22,23中詳細(xì)描述過。」換照廠家的i兌明書，用整合所述特異性突變的CH3特異性引物，通過Quickchange定點(diǎn)_秀變試劑盒(Stratagene,CA)突變y1重鏈而得到突變的IgGlGDobl變異體。通過測序(ABI373Stretch自動(dòng)化測序4義，AppliedBiosystems,FosterCity,CA)馬^S正突變石威基(i亥突變引起4354立纟且氨酸至纈氨酸的相應(yīng)氨基酸變化)的正確整合后，所述重鏈與相應(yīng)輕鏈一起轉(zhuǎn)染、生成并純化，如22,23中所述?？贵w量通過夾心ELISA法(通過兔抗k抗血清捕獲所述重組抗體，采用石咸性-粦酸酶軛合的兔抗IgG(Fc特異性)抗血清檢測，如參考文獻(xiàn)22中所述)以及抗原特異性ELISA法(如在參考文獻(xiàn)23中詳細(xì)描述的)定量?！獣?huì)測抗體。蛋白G分離的才元FcRn(MAb1G3)oc鏈的小鼠IgGl可乂人ATCC(Manassas,VA)4尋到24。通過用構(gòu)成FcRnoc鏈纟田月包內(nèi)尾巴的肽鏈免疫balb/c小鼠而提高小鼠的IgMMAb22H4C11?？谷薋cRn的兔抗血清由Dr.NeilSimister(BrandeisUniversity,Waltham,MA)惠贈(zèng)。利用Fitc標(biāo)i己的羊抗鼠IgG的F(ab，)2-片段(Protos，Burlingame，CA)在FACS實(shí)驗(yàn)中檢測小鼠IgGl。用生物素標(biāo)記的豬抗兔IgGF(ab，)2-片,殳(DAKO,Glostrup,Denmark)以及隨后的抗生凈勿素蛋白《連菌素Alexa555,olecularProbes'Leide攻，TheNefcherfands)檢測兔抗血清。Fciw謬導(dǎo)表這。用IgGl(pNUT,金屬硫蛋白啟動(dòng)子，DHFR/曱氨蝶呤選擇標(biāo)記物)轉(zhuǎn)染且穩(wěn)定表達(dá)抗奈瑟腦膜炎球菌PorinA的IgGl的單克隆BHK細(xì)胞，用人FcRn(pcDNA3.1,CMV啟動(dòng)子/zeocin選擇標(biāo)記物)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并通過zeocin耐受性以及限制性稀釋而篩選既表達(dá)IgGl又表達(dá)FcR的單克隆。FcRn表達(dá)通過FACS分析利用單克隆IgG3確定，上清中的IgGl水平則利用PorA特異性ELISA而測定(如上文"重組抗體，，中所述，在將同等量細(xì)胞4妄種入T培養(yǎng)瓶后第3天收集上清)。/gG乂,/gG^成的^《錄^影詢293細(xì)胞用含或不含外源性添加的IgG多克隆IgG(IVIG，CLB)的GDoblIgG(如上所述)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在標(biāo)明的時(shí)間點(diǎn)取上清樣品，并通過抗原特異性ELISA如參考文獻(xiàn)23所述而測定抗肺炎5求菌6B抗體。統(tǒng)計(jì)分析利用GraphPadPrismversion4.00forWindows(GraphPadSoftware,SanDiegoCA,USA,http:〃www.graphpad.com)進(jìn)行/>^^。"相關(guān)分析。顯著性水平設(shè)為p<0.05。結(jié)果Fciw乂f強(qiáng)拔體^:威i恥敏力的/gG^:成。為了才企測FcRn是否影響IgG生成細(xì)月包的IgGl生成，我們將人FcRn轉(zhuǎn)染至一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)IgGl的BHK克隆。FcRn轉(zhuǎn)染后篩選克隆，并利用FACS分析比較克隆之間的FcRn表達(dá)。還研究了上清內(nèi)IgGl的生成情況。我們觀察到高的FcRn水平與^R高的IgGl產(chǎn)量顯著相關(guān)(圖1)。因此，將高水平人FcRn導(dǎo)入生成人IgG的細(xì)月包內(nèi)，可方侵J也增加抗體產(chǎn)量。/gG^成^T受^《^批斜諷蘆。FcRn介導(dǎo)的IgG循環(huán)在體內(nèi)是可飽和的4'12，因此不僅在體外IgG生成細(xì)胞的IgG分泌可能依賴于FcRn,其循環(huán)可能也依賴于FcRn。為了實(shí)-驗(yàn)-瞼^正該XC點(diǎn)，我們進(jìn)行了竟?fàn)幮匝芯?，其中在無外源性多克隆人IgG或其含量遞增的情況下，我們分別培養(yǎng)數(shù)量相等的人293細(xì)胞(其表達(dá)內(nèi)源性FcRn)。已證實(shí)外源添力。的IgG可抑制這些細(xì)胞的IgG分泌(圖2)，與通過FcRn的IgG循環(huán)的可飽和性一致。參考文獻(xiàn)1vanDijk,M.A,andVidarsson,G.(2002)Monoclonalantibody-basedPharmaceuticals.Ini%annaceiiicaZBiofec/inotogy:A/i7hiroduc^o;i/orjPharmocisfsandP/iarmacei^icaZScien《is《s(Crom邁elin,D.J.A,andSindelar,R.D.,eds.)，pp.283-297'Taylor&Francis2vanDijk.,M.A.andvandeWinkel，J.G.(2001)Humanantibodiesasnextgenerationtherapeutics.CitrrQp"C%em胸Z5(4)，368-374.3Kohler,G.andMilstein,C,(1975)Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity.iVbfitre256(5517),495-4974Lobo，E.D.etal.(2004)Antibodypharmacokineticsandpharmacodynamics,<7Ptor肌Sci93(11)，2645-26685West,A.P.，Jr.andBjorkman,P.J.(2000)CrystalstructureandimmunoglobulinGbindingpropertiesofthehuman邁ajorhistocompatibilitycomplex-relatedFcreceptor('),BiochewWry39(32),9698-97086Shields,R丄.etal.(2001)HighresolutionmappingofthebindingsiteonhumanIgGlforFcgammaRI,FcgammaRII，F(xiàn)cgammaRIII，andFcRnanddesignofIgGlvariantswithimprovedbindingtotheFcga邁maR,c/J5ioZC7iem276(9)，6591-6604.7Martin,W丄.etal.(2001)Crystalstructureat2.8AofanFcRn/heterodi邁ericFccomplex:mechanismofpH-dependentbinding.M)ZCeH7(4),挑7-877,8Simister,N.E.andMostov,K,E.(1989)AnFcreceptorstructurallyrelatedtoMHCclassIantigens.iVatore337(6203),184-187.9Yoshida,M.etal,(2004)HumanneonatalFcreceptormediatestransportofIgGintoluminalsecretionsfordeliveryofantigenstomucosaldendriticcells.Jn7n1m"y20(6)，769-78310Story,C.M.etal.(1994)AmajorhistocompatibilitycomplexclassI-likeFcreceptorclonedfiromhumanplacenta:possibleroleintransferofimmunoglobulinGfrommothertofetus.J"Med180(6),2377-2381.11Roopenian，D,C.etal.(2003)TheMHCClassI-LikeIgGReceptorControlsPerinatalIgGTransport,IgGHomeostasis,andFateofIgG-Fc-CoupledDrugs.JJ聽謹(jǐn)Z170(7),3528-3533.12Junghans,R.P.andAnderson,C.L,(1996)TheprotectionreceptorforIgGcatabolismisthebeta2-microglobulin-containingneonatalintestinaltransportreceptor.ProciVaHAcadSci93(11),5512-551613Ghetie,V.etal.(1996)Abnormallyshortserumhalf-livesoflgGinbeta2-microglobulin-deficientmice.Eur</i)n藝ioZ26(3),690-696.14Israel,E,J.etal.(1996)IncreasedclearanceofIgGinmicethatlackbeta2-microglobulin:possibleprotectivei'oleofFcRn.iw饑w/W)fog;y89(4),573-578.15Vidarsson,G.etal.(2005)TheMHCclass-Iho咖log'FcRn,facilitatesIgG-mediatedphagocytosis.Su^mi"ed16Chaudhury,C.etal.(2003)Themajorhistocompatibilitycomplex-relatedFcreceptorforIgG(FcRn)bindsalbuminandprolongsitslifespan.~Afed197(3),315-322,17Burmeister,W.P.etal.(1994)Crystalstructureat2.2AresolutionoftheMHC-relatedneonatalFcreceptor.胸wre372(6504),336-343.18Burmeister,W.P.etal.(1994)CrystalstructureofthecomplexofratneonatalFcreceptorwithFc,JVatore372(6504),379-38319Saphire,E.O.etal.(2001)CrystalstructureofaneutralizinghumanIGGagainstHIV-1:atemplateforvaccinedesign.Science293(5532),1155-115920Noelle,R.J.etal.(1992)A39-lcDaproteinonactivatedhelperTcellsbinds'CD40andtransducesthesignalforcognateactivationofBcells.^fVociVa"AcadSd[/SA89(14),6550-655421Sandalon,Z.etal.(2004)SecretionofaTNFR:Fcfusionproteinfollowingpulmonaryadministrationofpseudotypedadeno-associatedvirusvectors.J78(22),12355-1236522Vidarsson,G.etal.(2001〉A(chǔ)ctivityofHumanIgGandIgASubclassesinImmuneDefenseAgainstNeisseriameningitidisSerogroupB.i"m/n肌of166(10)'6250-6256.23Saeland，E.etai.(2003)CentralRoleofComplementinPassiveProtectionbyHumanIgGlandIgG2Anti-pneumococcalAntibodiesinMice.J"J肌mimoZ170(12),6158-6164.24Raghavan,M.etal.(1994)InvestigationoftheinteractionbetweentheclassIMHC-relatedFcreceptoranditsimmunoglobulinGligand.Jm肌im";y1(4),303-31525'Praetor,A.andHunziker，W.(2002)beta(2)-MicroglobulinisimportantforcellsurfaceexpressionandpH-dependentIgGbindingofhu邁anFcRn.J"Ce"Sci115(Pt11),2389-239726Zhu，X.etal.(2002)TheheavychainofneonatalFcreceptorforIgGissequesteredinendoplasmicreticulumbyformingoligomersintheabsenceofbeta2-microglobulinassociation.孜oc/iemJ"367(Pt3),703-71427Ober,R,J.etal.(2004)ExocytosisoflgGasmediatedbythereceptor,FcRn:ananalysisatthesingle-moleculelevel.fVociVaWAcctdSciL7SA101(30)，11076-1108128Ober,R.J.etal.(2004)VisualizingthesiteanddynamicsofIgGsalvagebytheMHCclassI-relatedrec印tor,FcRn.JJmmimoZ172(4),2021-202929Leitzgen,K.etal.(1997)Assemblyofimmunoglobulinlightchainsasaprerequisiteforsecretion.Amodelforoligomerization-dependentsubunitfolding.J胸Chem272(5),3117-312330Wiens,G.D.etal.(2001)MutationofasingleconservedresidueinVHcomplementarity-deterniiningregion2resultsinasevereIgsecretiondefect.J"J畫隱Z167(4)，2179-218631Praetor,A.etal.(2002)Membrane-anchoredhumanFcRncanoligomerizeintheabsenceofIgG.JiMW壓oZ321(2)，277-28429表1:FDA已糸匕準(zhǔn)的治療性抗體<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>繊ott/CATHtamiraTM類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎2002PD[BiogenWec/GenentechZevaMn非霍奇金淋巴瘤2002M{Novartis/Genentech/TanoxXolair譯喘2003HGenentechyXomaRaptiva銀屑病2003HCorixa/GlaxoSmithKlineBexxar非霍奇金淋巴瘤2003MG冊6ntech/Roch6Avastin直腸癌2004HiSBMS/ImCIcmeSystemsErbitux直腸癌2004CBiogenIdeeTysabri多發(fā)性硬化2004HH:人源化的，M:小鼠，C:嵌合的，PD:噬菌體展示(人)權(quán)利要求1.一種用于在細(xì)胞內(nèi)生成抗體或者其功能性部分、衍生物和/或類似物的方法，包括提供能夠利用FcRn受體蛋白生成所述抗體的細(xì)胞以及培養(yǎng)所述細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)所述抗體的生成。2.才艮據(jù)一又利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞具有編碼所述FcRn受體蛋白的核酸。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，包括在所述細(xì)胞內(nèi)過量生成所述FcRn受體蛋白。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體來源于第一種物種，而所述細(xì)月包來源于不同的物種。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中至少提供或過量生成所述FcRn受體蛋白的oc鏈。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，進(jìn)一步包括提供或過量生成(32-微球蛋白。7.才艮據(jù)纟又利要求5或6所述的方法，其中所述oc4連和/或所述(32-獨(dú)U求蛋白來源于相同的物種。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述a鏈和/或所述P2-孩吏if求蛋白與所述細(xì)月包來源于相同的物種。9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中由所述細(xì)胞生成的抗體與所述FcRn受體a鏈來源于相同的物種或來源于所述物種的功能類似、物。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述功能類似物的物種來源于相同的屬。11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體來源于人類。12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞來源于嚙齒動(dòng)物，優(yōu)選中華倉鼠或小鼠。13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞是雜交瘤細(xì)力包或4t染瘤細(xì)月包。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞是已具有編碼所述抗體的核酸的細(xì)胞，以獲得能夠生成所述抗體的細(xì)胞。16.—種用于在細(xì)胞內(nèi)生成抗體的方法，包括培養(yǎng)所述細(xì)胞以及從所述培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中(半連續(xù)性)收集抗體。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中在所述培養(yǎng)基中的抗體濃度保持在低于FcRn所介導(dǎo)循環(huán)的功能性々包和水平。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中通過所述連續(xù)性收集將所述培養(yǎng)基中的抗體濃度保持在低于FcRn所介導(dǎo)循環(huán)的功能性飽和水平。19.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體是從所述培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中(半)連續(xù)性收集的。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中通過所述連續(xù)性收集的方法將所述培養(yǎng)基中的抗體濃度保持在低于FcRn所介導(dǎo)循環(huán)的功能性飽和水平。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中通過所述連續(xù)性收集的方法將所述培養(yǎng)基中的抗體濃度保持在低于FcRn所介導(dǎo)循環(huán)的功能性飽和水平。22.—種抗體制備物，可通過才艮據(jù)4又利要求1至15或19至21中任一項(xiàng)所述的方法而獲得。23.—種藥物組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求22所述的抗體制備物。24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的抗體制備物在制備用于治療癌癥、炎癥、傳染性疾病、免疫*夾陷、自身免疫或免疫調(diào)節(jié)的藥物中的應(yīng)用。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的應(yīng)用，其中所述癌癥是非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、急性骨髓性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病或直腸癌。26.—種用于上調(diào)患者血液中抗體水平的方法，包括上調(diào)所述患者細(xì)月包內(nèi)FcRn受體的表達(dá)。27.—種用于增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)蛋白生成的方法，包括提供給所述細(xì)胞所述蛋白與Fc段的融合體和提供給所述細(xì)胞FcRn受體蛋白，以及培養(yǎng)所述細(xì)月包以實(shí)現(xiàn)蛋白-Fc融合產(chǎn)物的生成。28.—種用于增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)蛋白生成的方法，包括提供給所述細(xì)胞所述蛋白與白蛋白的融合體和提供給所述細(xì)胞FcRn受體蛋白，以及培養(yǎng)所述細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)蛋白-白蛋白融合產(chǎn)物的生成。29.—種用于增強(qiáng)細(xì)月包內(nèi)白蛋白生成的方法，包4舌才是供能夠利用FcRn受體蛋白生成白蛋白的細(xì)胞，以及培養(yǎng)所述細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)白蛋白的生成。全文摘要本發(fā)明涉及生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及(單克隆)抗體的生成，甚至更具體地，涉及治療性和診斷性抗體的生成。本發(fā)明提供一種用于在細(xì)胞內(nèi)生成抗體或者其功能性部分、衍生物和/或類似物的方法，包括提供能夠利用FcRn受體蛋白生成所述抗體的細(xì)胞以及培養(yǎng)所述細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)所述抗體的生成。文檔編號(hào)C07K14/705GK101316927SQ200680043714公開日2008年12月3日申請日期2006年11月23日優(yōu)先權(quán)日2005年11月23日發(fā)明者格斯圖爾·維達(dá)爾松,約翰內(nèi)斯·赫拉爾杜斯·約瑟夫·范德溫克爾申請人:Umc烏得勒支控股有限公司