專(zhuān)利名稱(chēng)：：用于產(chǎn)生結(jié)合配體的多聚體捕獲試劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及在表面制造二聚體或更高級(jí)多聚體捕獲試劑的新方法，通過(guò)新方法產(chǎn)生的捕獲試劑，和所述捕獲試劑的陣列。
背景技術(shù)：
：分子如肽的組合產(chǎn)生是公知的。該技術(shù)提供了有效的工具，能夠產(chǎn)生可以用在如高通量篩選技術(shù)中的分子的大型文庫(kù)。這些技術(shù)的實(shí)例以及它們?cè)阼b定目的分子的應(yīng)用公幵在例如J.Org.Chem(有機(jī)化學(xué)雜志).,63,8696，(1998)中，其中3-mers的1,000-肽文庫(kù)在水中與丹酰'鑷子'分子反應(yīng)。3%的文庫(kù)與'鑷子，結(jié)合。在J.Comb.Chem.(組合化學(xué)雜志)，5，794,(2003)中，描述了用于分裂和混合合成的三腳cyclotriveratrylene支架，并且描述了具有~2,000個(gè)成員的文庫(kù)。NatureBiotechnology(自然生物技術(shù))，22，568,(2004),DarioNeri等描述了具有連接的DNA標(biāo)記的有機(jī)分子粘合劑的兩個(gè)文庫(kù)。DNA互補(bǔ)性用于制備更高級(jí)多樣性的文庫(kù)。使用三鏈體形成還建立了進(jìn)一步的文庫(kù)。將24mer寡聚物用于復(fù)合組裝。通過(guò)對(duì)連接的DNA標(biāo)記進(jìn)行測(cè)序或通過(guò)結(jié)合于寡核苷酸陣列完成了有機(jī)分子消巻積。對(duì)于蛋白質(zhì)產(chǎn)生具有nM親和性的粘合劑。BioconjugateChem(生物綴合物化學(xué)).，12,346,(2001)，描述肽微陣列和小分子微陣列的制備。該文獻(xiàn)還公開(kāi)了關(guān)于肽和玻片表面可以使用化學(xué)選擇性連接。在該技術(shù)中，N端半胱氨酰殘基與在玻片表面上的a酮醛反應(yīng)以得到噻唑烷環(huán)。其它人使用了在游離硫羥基和馬來(lái)酰亞胺之間的自由基邁克爾加成。此外，Chem.Commun.(化學(xué)通信)，581，(2005)描述了在表面上通過(guò)光刻法合成建立環(huán)肽的復(fù)合文庫(kù)的策略。將不同的保護(hù)策略用于將側(cè)鏈組合添加到預(yù)先制備的核心上。為了獲得有義文庫(kù)所需要的必要的多樣性，已知方法需要采取大量的合成酶，因此增加了需要的時(shí)間，和產(chǎn)生所述文庫(kù)所需的費(fèi)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供生產(chǎn)具有需要的多樣性的分子的文庫(kù)的快速廉價(jià)的方法。根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供用于制備結(jié)合配體的多聚體捕獲試劑的方法，所述捕獲試劑包含至少第一和第二單體單元。所述第一單體單元還包含第一配體結(jié)合部分,第一反應(yīng)基和連接部分，所述第二單體單元還包含第二配體結(jié)合部分，和第二反應(yīng)基，其中反應(yīng)基對(duì)于每個(gè)單體單元可以是相同或不同的，所述方法包括下列步驟；a)使第一單體單元與第二單體單元反應(yīng)從而使在單體單元上的反應(yīng)基反應(yīng)以形成多聚體部分；和b)在基底上通過(guò)連接部分固定第一單體單元，其中，步驟a)可以在步驟b)之前，同時(shí)或在其后進(jìn)行。優(yōu)選地，將所述捕獲試劑組裝在基底上。在圖i，2和3中顯示制備根據(jù)本發(fā)明的捕獲試劑的可能的方法的圖解表示，并且在實(shí)施例1中進(jìn)行描述。在本發(fā)明的備選實(shí)施方案中，還提供制備用于結(jié)合配體的多聚體捕獲試劑的方法，所述捕獲試劑包含至少第一和第二單體單元，所述第一單體單元還包含第一配體結(jié)合部分，第一反應(yīng)基和連接部分，所述第二單體單元還包含第二配體結(jié)合部分，和第二反應(yīng)基，其中對(duì)于每個(gè)單體單元，反應(yīng)基可以是相同或不同的，所述方法包括下列步驟；a)使第一單體單元與第二單體單元反應(yīng)從而使在單體單元上的反應(yīng)基反應(yīng)以形成多聚體捕獲試劑。優(yōu)選地，該備選實(shí)施方案還包括將捕獲試劑固定在基底上的步驟?，F(xiàn)在，還將進(jìn)一步描述本發(fā)明。在下面的部分中，更詳細(xì)地定義本發(fā)明的不同的實(shí)施方案。這樣定義的每個(gè)實(shí)施方案可以與任何其它的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案組合，除非另外清楚地相反地指出。具體而言，可以將指出的優(yōu)選的或有利的任何特征與指出的優(yōu)選的或有利的任何其它一個(gè)或多個(gè)特征組合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第一和第二單體單元是共價(jià)連接的。要理解的是，連接部分可以包含用于將捕獲試劑固定在基底上的任何適合的方式。要理解的是，固定可以是，例如通過(guò)共價(jià)，離子，疏水，極性，鏈霉抗生物素-生物素，抗生物素蛋白-生物素，或其它高親和性非共價(jià)相互作用進(jìn)行的。優(yōu)選地，連接部分包含用于將捕獲試劑固定在基底上的共價(jià)或疏水方式。要理解的是，單體單元可以是任何適合類(lèi)型的分子。優(yōu)選地，單體單元是核苷酸或氨基酸。更優(yōu)選地,單體單元是多核苷酸或多肽。最優(yōu)選地,單體單元是多肽。所謂多核苷酸和多肽,分別指2個(gè)或更多核苷酸或氨基酸的鏈。優(yōu)選地,第一和第二單體單元是合成的。更優(yōu)選地，第一和第二單體單元在固相上合成并且可以是相同或不同的，甚至更優(yōu)選地，單體單元在用于根據(jù)第一方面的方法前從固相上裂解下來(lái)。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員，多核苷酸和多肽的合成是公知的。肽和它們的鹽和衍生物的合成，包括固相和溶液相肽合成是充分建立的。見(jiàn)，例如Stewart，等(1984)SolidPhasePeptideSynthesis(2ndEd.)(固相肽合成(第2版))；和Chan(2000)"FMOCSolidPhasePeptideSynthesis,APracticalApproach,(FMOC固相肽合成，實(shí)用方法)，，OxfordUniversityPress(牛津大學(xué)出版社)。肽可以使用自動(dòng)肽合成儀(例如，PioneerTM肽合成儀，應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems),福斯特城，加利福尼亞)進(jìn)行合成。例如，肽可以使用FMOC固相肽合成在Rink酰胺樹(shù)脂上進(jìn)行制備并且隨后進(jìn)行三氟乙酸(95%)去保護(hù)并從樹(shù)脂上裂解下來(lái)。容易理解的是當(dāng)捕獲試劑包含肽多聚體時(shí)，所述第一肽和第二肽可以具有相同或不同的一級(jí)氨基酸序列。另外顯而易見(jiàn)的是第一肽和第二肽可以從第一和第二氨基酸組進(jìn)行合成并且每個(gè)氨基酸組可以是相同的或不同的。優(yōu)選地，第一肽和第二肽為2-100個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，更優(yōu)選地為2-50個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，最優(yōu)選地長(zhǎng)度為5-25個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。優(yōu)選地，形成配體結(jié)合部分的每個(gè)氨基酸選自基本由少于20個(gè)氨基酸，更優(yōu)選地少于12個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選地少于6個(gè)氨基酸和最優(yōu)選地4個(gè)氨基酸組成的組。要理解的是，在所述組中的每個(gè)氨基酸可以是L-氨基酸，D-氨基酸，氨基酸模擬物，間隔氨基酸，3氨基酸或任何其他手性氨基酸單體。優(yōu)選地，所述氨基酸是L-氨基酸和/或D-氨基酸。優(yōu)選地，在所述組中的每個(gè)氨基酸基本上是對(duì)映體純的。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的方法中的第一肽和第二肽分別包含10個(gè)或更少的配體結(jié)合殘基，更優(yōu)選地，8個(gè)或更少，更優(yōu)選地，6個(gè)或更少，甚至更優(yōu)選地4或更少，和最優(yōu)選地3個(gè)或更少的配體結(jié)合殘基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，反應(yīng)基可以在肽合成的過(guò)程中被保護(hù)并且在用于生產(chǎn)根據(jù)第一方面的捕獲試劑前進(jìn)行去保護(hù)。所述技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，例如標(biāo)準(zhǔn)基于FMOC的固相肽組裝。在該技術(shù)中，產(chǎn)生具有被保護(hù)的側(cè)鏈和游離氨基末端的樹(shù)脂結(jié)合肽。接著，N端氨基基團(tuán)可以與任何相容的羧酸反應(yīng)基綴合物在標(biāo)準(zhǔn)的肽合成條件下反應(yīng)。例如，可以結(jié)合具有三苯甲基或甲氧基三苯甲基保護(hù)的硫羥基的半胱氨酸。用三氟乙酸進(jìn)行的去保護(hù)在溶液中產(chǎn)生未受保護(hù)的肽。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的任何實(shí)施方案的所述反應(yīng)基選自，但不限于，硫羥基，馬來(lái)酰亞胺，環(huán)戊二烯，疊氮化物，膦硫酯(phosphinothioesters)，硫酯和(硝基)硫代吡啶基活化的硫羥基。更優(yōu)選地，反應(yīng)基是硫羥基。優(yōu)選地，當(dāng)所述反應(yīng)基是硫羥基時(shí)，至少一個(gè)硫羥基是活化的硫羥基。優(yōu)選地，所述硫羥基用硫代硝基吡啶基或硫代吡啶基活化。在圖4中概括的反應(yīng)路線(xiàn)顯示產(chǎn)生包括各種反應(yīng)基的肽的可能的路線(xiàn)。要理解的是，可以將任何適合的反應(yīng)用在本發(fā)明的方法中以形成多聚體捕獲試劑，例如在環(huán)戊二烯基官能化的肽和馬來(lái)酰亞胺官能化的肽之間的第爾斯阿爾德反應(yīng)，在硫羥基官能化的肽和馬來(lái)酰亞胺官能化的肽之間官能化的肽和包含活化的硫羥基(用例如(硝基)硫代吡啶部分活化)的肽之間形成二硫鍵的反應(yīng)，在疊氮化物官能化的肽和硫酯官能化的肽之間的斯托丁格連接，和在硫酯和N端半胱氨酸之間的天然化學(xué)連接。顯而易見(jiàn)的是，根據(jù)在肽中存在的氨基酸殘基，捕獲試劑具有不同的特征。例如，側(cè)鏈可以為配體結(jié)合提供正電荷。優(yōu)選地，正電荷由賴(lài)氨酰殘基(在肽鏈和正電荷之間的四個(gè)CH2基團(tuán))，鳥(niǎo)氨酰殘基(在肽鏈和正電荷之間的三個(gè)CH2基團(tuán))或最優(yōu)選地二氨基丁酰殘基(在肽鏈和正電荷之間的兩個(gè)CH2基團(tuán))提供。氨基酸可以備選地提供羥基基團(tuán)，其能夠充當(dāng)配體結(jié)合的氫鍵供體和/或受體。優(yōu)選地，羥基基團(tuán)由絲氨酰殘基(在肽鏈和OH基團(tuán)之間的一個(gè)CH2基團(tuán))，或更優(yōu)選地高絲氨酰殘基(在肽鏈和OH基團(tuán)之間的兩個(gè)CH2基團(tuán))提供。氨基酸可以為配體結(jié)合提供疏水部分。優(yōu)選地，丙氨酰殘基(在肽鏈和甲基基團(tuán)之間沒(méi)有CH2基團(tuán))或更優(yōu)選地，氨基丁酰殘基(在肽鏈和甲基之間具有一個(gè)CH2基團(tuán))提供疏水部分。備選地，氨基酸可以為配體結(jié)合提供負(fù)電荷。優(yōu)選地，負(fù)電荷由谷氨酰殘基(在肽鏈和羧酸根基團(tuán)之間存在兩個(gè)CH2基團(tuán))，或更優(yōu)選地，天冬氨酰殘基(在肽鏈和羧酸根基團(tuán)之間存在一個(gè)CH2基團(tuán))提供。優(yōu)選地，肽由氨基酸組以組合方式產(chǎn)生，如本領(lǐng)域所公知，從而可以在所述組中產(chǎn)生存在的氨基酸的所有可能組合，例如，如果在所述組中存在N氨基酸并且所述肽的長(zhǎng)度是L，那么完整的組包含NL個(gè)肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用可以從任何給定的氨基酸組中產(chǎn)生的可能的組合肽的子集。所述子集可以通過(guò)在肽的合成中包含具體的規(guī)則進(jìn)行確定，例如可以提供在所述組中每個(gè)氨基酸的最大和最小水平，或可以提供結(jié)合的百分比疏水氨基酸的最大和最小水平。本發(fā)明的方法導(dǎo)致產(chǎn)生具有增加的多樣性的捕獲試劑。這來(lái)自這樣的事實(shí)，即通過(guò)所述方法產(chǎn)生的組合制備的捕獲試劑是多聚體。例如，如果多聚體捕獲試劑是二聚體，由于兩條肽鏈的存在，對(duì)于任何給定長(zhǎng)度的配體結(jié)合部分的可能的多樣性被平方。因此，進(jìn)行減少數(shù)量的起始合成是必要的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，肽被固定從而將側(cè)鏈以對(duì)于配體結(jié)合有利的方式位于空間中。當(dāng)所述捕獲試劑通過(guò)共價(jià)相互作用被固定時(shí)，這可以通過(guò)例如合成具有交替的L-和D-氨基酸的肽實(shí)現(xiàn)，如在圖5中所顯示。備選地，所述肽可以使用包含P氨基酸的組進(jìn)行合成，如在圖6中顯示，或可以使用任何其他手性氨基酸單體進(jìn)行合成，其中每個(gè)肽重復(fù)單元具有相等數(shù)目的原子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽是合成的從而使在配體結(jié)合區(qū)僅每隔一個(gè)氨基酸改變，如在圖7中顯示。該實(shí)施方案的有利之處在于側(cè)鏈以對(duì)于配體結(jié)合最天然和有利的方式配置。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，每個(gè)肽可以包含一個(gè)或多個(gè)上述類(lèi)型的氨基酸并且所用的具體組合影響包含不同的肽鏈的捕獲試劑的特征。當(dāng)捕獲試劑固定在基底是通過(guò)共價(jià)連接進(jìn)行時(shí)，捕獲試劑可以排列在基底上，并且所述陣列可以采取任何方便的形式。因此，本發(fā)明的方法可應(yīng)用于所有類(lèi)型的"高密度"陣列，包括單分子陣列。優(yōu)選地,通過(guò)第一方面的方法產(chǎn)生的共價(jià)固定的捕獲試劑在空間上不連續(xù)的位于陣列上的編碼位置上。優(yōu)選地，在陣列的給定位置的所有的所述捕獲試劑包含相同的肽對(duì)。更優(yōu)選地，在陣列上的每個(gè)位置包含不同的捕獲試劑。當(dāng)指將分子(例如肽)固定于基底上時(shí)，將術(shù)語(yǔ)"固定"和"連接"在本文交替使用并且在該實(shí)施方案中，兩個(gè)術(shù)語(yǔ)傾向于直接或間接涵蓋共價(jià)連接，除非另外清楚地或通過(guò)上下文指出。本發(fā)明的某些實(shí)施方案可以使用包含惰性基底或基質(zhì)(例如載玻片，聚合物珠等)的基底，其已經(jīng)被"官能化"，例如通過(guò)應(yīng)用包含反應(yīng)基的中間體物質(zhì)的層或涂層，所述反應(yīng)基容許共價(jià)連接于生物分子如肽上。這些支持物的實(shí)例包括，但不限于，支持在惰性基底如玻璃上的聚丙烯酰胺水凝膠。在這些實(shí)施方案中，所述生物分子(例如肽)可以直接共價(jià)連接于中間體物質(zhì)(例如水凝膠)，但是所述中間體物質(zhì)其本身可以非共價(jià)連接于基底或基質(zhì)(例如，玻璃基底)。因此，術(shù)語(yǔ)"共價(jià)連接于基底"被相應(yīng)解釋為包括這種類(lèi)型的排列。在多個(gè)肽陣列中，在陣列上的獨(dú)立區(qū)域包括多個(gè)肽分子。優(yōu)選地，在陣列上的每個(gè)位點(diǎn)包括一個(gè)單獨(dú)的肽二聚體的多個(gè)拷貝。對(duì)于將捕獲試劑共價(jià)連接于基底的優(yōu)選的反應(yīng)路線(xiàn)包括，但不限于，在巰基和馬來(lái)酰亞胺衍生的表面之間的反應(yīng)，在馬來(lái)酰亞胺衍生的表面和二烯官能化捕獲試劑之間的第爾斯-阿爾德反應(yīng)，疊氮化物和乙炔3+2環(huán)加成，噻唑烷環(huán)形成，和修飾的斯托丁格連接。備選地，可以以反轉(zhuǎn)方式實(shí)現(xiàn)捕獲試劑與基底的共價(jià)連接，例如通過(guò)在硫羥基衍生化的表面和馬來(lái)酰亞胺取代的肽之間的反應(yīng)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，將在硫酯-衍生化的捕獲試劑和半胱氨酸衍生化的表面之間存在于氨基和半胱氨酸巰基之間的天然化學(xué)連接用于將捕獲試劑共價(jià)連接于基底。最優(yōu)選的反應(yīng)路線(xiàn)使用在具有N-端半胱氨酸的捕獲試劑和硫酯衍生的表面之間的天然化學(xué)連接，如在圖8中所顯示。天然化學(xué)連接產(chǎn)生在肽的N-端半胱氨酸和表面連接的硫酯之間的肽鍵。本發(fā)明的該實(shí)施方案的特別的優(yōu)勢(shì)是不需要肽側(cè)鏈的保護(hù)。本發(fā)明的該實(shí)施方案的另外的特別的優(yōu)勢(shì)是得到的表面連接肽具有內(nèi)部半胱氨酸，其被研究用于通過(guò)二硫鍵形成，或在硫羥基和馬來(lái)酰亞胺官能化的肽之間的反應(yīng)形成二聚體受體。用于制備硫酯官能化玻璃表面的優(yōu)選的反應(yīng)路線(xiàn)顯示在圖9中。如果將捕獲試劑組裝在基底表面，優(yōu)選的反應(yīng)路線(xiàn)顯示在圖10中。在該實(shí)施方案中，第一肽通過(guò)在硫酯基團(tuán)和N端半胱氨酸殘基通過(guò)天然化學(xué)連接的反應(yīng)共價(jià)結(jié)合于官能化的基底。通過(guò)在肽之間形成二硫鍵產(chǎn)生多聚體捕獲試劑。用于制備硫酯表面的更優(yōu)選的路線(xiàn)包括在胺化的表面和下面所顯示類(lèi)型的thiolane2,4-二酮之間的反應(yīng)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>硫酯表面還可以通過(guò)用下面顯示類(lèi)型的硫酯甲硅烷基氯綴合物衍生化羥基化表面而制備。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>當(dāng)通過(guò)共價(jià)鍵將捕獲試劑固定在基底時(shí)，可以構(gòu)建二聚體，其中第一肽和第二肽分別具有硫羥基團(tuán)(其可以被活化或可以不被活化)，其位于肽序列中這樣的位點(diǎn)上，所述位點(diǎn)在配體結(jié)合位點(diǎn)的N端側(cè)，或在配體結(jié)合位點(diǎn)的C端側(cè)或位于由兩部分構(gòu)成的配體結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)部。在這些實(shí)施方案的任一個(gè)中，清楚的是所述硫羥基團(tuán)部分可以具有與配體結(jié)合殘基相同或相反的定向，并且在第一肽和第二肽中的每個(gè)硫羥基團(tuán)的定位是獨(dú)立的。在備選的實(shí)施方案中，所述捕獲試劑通過(guò)捕獲試劑和基底之間的疏水相互作用被固定在基底上。在該實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法制備的捕獲試劑包括至少兩個(gè)單體單元，所述第一和第二單體單元分別包含至少一個(gè)疏水部分，至少一個(gè)反應(yīng)基和至少一個(gè)配體結(jié)合部分。優(yōu)選地，根據(jù)所述方法制備的捕獲試劑包括至少兩個(gè)肽，所述第一肽和第二肽分別包含至少一個(gè)疏水氨基酸殘基，至少一個(gè)反應(yīng)基，和至少一個(gè)配體結(jié)合部分，其中所述至少一個(gè)疏水氨基酸殘基和至少一個(gè)配體結(jié)合部分位于肽一級(jí)結(jié)構(gòu)中從而導(dǎo)致得到疏水面，和基本上非疏水的配體結(jié)合面。要理解的是，在本發(fā)明方法的該實(shí)施方案中，肽的疏水面形成連接部分。優(yōu)選地，每個(gè)肽包含形成連接部分的多種疏水氨基酸。優(yōu)選地，用于本發(fā)明方法的第一肽包含4-40個(gè)疏水氨基酸殘基，更優(yōu)選地6-25個(gè)和最優(yōu)選地6-12個(gè)疏水氨基酸殘基。優(yōu)選地，配體結(jié)合部分包含至少一個(gè)氨基酸。更優(yōu)選地，配體結(jié)合部分包含多種氨基酸。要理解的是，位于配體結(jié)合面上的氨基酸還可以包括疏水殘基，例如,氨基丁酸酯殘基。優(yōu)選地，用于該實(shí)施方案的每個(gè)肽包含含有交替的疏水和非疏水氨基酸殘基的一級(jí)結(jié)構(gòu)，如在圖11中所顯示。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是可以容易地設(shè)計(jì)導(dǎo)致側(cè)鏈分布從而產(chǎn)生疏水和基本非疏水面的其它的肽序列，例如在疏水殘基之間可能存在三種非疏水氨基酸殘基或奇數(shù)氨基酸的任何組合。備選地，所述肽可以包含例如L-，D-，和3氨基酸的組合從而導(dǎo)致疏水和基本非疏水面。優(yōu)選地，被定位從而位于配體結(jié)合面上的每個(gè)氨基酸選自基本由下列各項(xiàng)組成的組少于20個(gè)氨基酸，更優(yōu)選地少于12個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選地少于6個(gè)氨基酸和最優(yōu)選地4個(gè)氨基酸。優(yōu)選地，用于該實(shí)施方案的每個(gè)肽包含10%-90%的疏水氨基酸殘基，更優(yōu)選地，20%-80%,甚至更優(yōu)選地，30%-70%,和最優(yōu)選地40%-60%的疏水氨基酸殘基。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一肽包含50%疏水氨基酸殘基。優(yōu)選地，疏水氨基酸選自由下列各項(xiàng)組成的組亮氨酸，異亮氨酸，正亮氨酸，纈氨酸，正纈氨酸，甲硫氨酸，酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸。更優(yōu)選地，疏水氨基酸是苯丙氨酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述捕獲試劑位于疏水基底上從而使得基本非疏水配體結(jié)合面易于配體結(jié)合。要理解的是，用在所述方法中的基底可以是任何適合的疏水基底，例如通過(guò)疏水有機(jī)硫醇處理修飾的金，通過(guò)表面處理修飾的玻璃，或塑料。.優(yōu)選地，所述基底是塑料。備選地，所述基底可以在疏水化合物中涂布，其容許捕獲試劑在基本水性溶劑的存在下固定在其上。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的該實(shí)施方案中的第二肽包含比第一肽更少的氨基酸，并且包含更少的疏水殘基從而使肽和疏水面之間的相互作用相對(duì)更弱。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，第一肽和第二肽的長(zhǎng)度以及被需要將它們保留在基底上的疏水氨基酸殘基的數(shù)目將取決于表面的疏水性和在第一肽和第二肽中存在的疏水氨基酸，另外取決于結(jié)合的配體的性質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還容易顯而易見(jiàn)的是在基底保持的肽的量取決于對(duì)基底進(jìn)行洗滌的嚴(yán)格性。優(yōu)選地，在固定肽后，基底用例如在10mMtris-HCl(pH8.0)中的1.0MNaCl進(jìn)行洗滌。優(yōu)選地，第二肽在疏水面上包含1-6個(gè)疏水氨基酸殘基，更優(yōu)選地,2-5個(gè),和最優(yōu)選地2-4個(gè)疏水氨基酸殘基。優(yōu)選地，配體結(jié)合殘基位于基本非疏水配體結(jié)合面上。當(dāng)通過(guò)疏水相互作用將捕獲試劑固定在基底上時(shí)，可以將反應(yīng)基置于在第一肽和第二肽的一級(jí)肽結(jié)構(gòu)的任意適合位置，例如可以將反應(yīng)基位于一級(jí)肽序列中從而使它們位于肽的基本非疏水配體結(jié)合面并且位于配體結(jié)合位點(diǎn)的N端側(cè)上。備選地，所述反應(yīng)基可以位于第一肽和第二肽的一級(jí)肽結(jié)構(gòu)中從而使它們位于肽的基本非疏水配體結(jié)合面上，并且在第一肽中，位于配體結(jié)合位點(diǎn)的N端側(cè)上，和在第二肽中，在配體結(jié)合位點(diǎn)的C端側(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，反應(yīng)基可以位于第一肽和第二肽的一級(jí)肽結(jié)構(gòu)中從而使在第一肽中，其位于肽的基本非疏水配體結(jié)合面上并在配體結(jié)合位點(diǎn)的N-端側(cè)，并且在第二肽中，其位于配體結(jié)合位點(diǎn)相對(duì)(疏水)面并且在配體結(jié)合位點(diǎn)的C端側(cè)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在第一肽上的反應(yīng)基位于在基本非疏水配體結(jié)合面的一級(jí)氨基酸結(jié)構(gòu)中，并且位于配體結(jié)合位點(diǎn)的N-端側(cè)，并且在第二肽中，在疏水面中并且在配體結(jié)合位點(diǎn)的N-端側(cè)，如在圖10中所顯示。優(yōu)選地，在該實(shí)施方案中，捕獲試劑結(jié)合于基底從而產(chǎn)生陣列。要理解的是所述陣列可以采取任何方便的形式。因此，本發(fā)明的方法可應(yīng)用于所有類(lèi)型的"高密度"陣列，包括單分子陣列。優(yōu)選地，所述陣列包含許多不連續(xù)的可尋址空間編碼位置。優(yōu)選地,在陣列上的每個(gè)位置包含不同的捕獲試劑，和更優(yōu)選地，每個(gè)位置包含多個(gè)拷貝的捕獲試劑。當(dāng)提及將分子(例如肽)固定于基底上時(shí)，將術(shù)語(yǔ)"固定"和"連接"在本文交替使用并且兩個(gè)術(shù)語(yǔ)傾向于包括疏水相互作用，除非另外清楚地或通過(guò)上下文指出。通常，所需要的是分子(例如，肽)在這樣的條件下保持固定或連接于基底，在所述條件中傾向于使用所述基底，例如在需要肽配體結(jié)合的應(yīng)用中。本發(fā)明的某些實(shí)施方案可以應(yīng)用包含惰性基底或基質(zhì)(例如玻璃載玻片，聚合物珠等)的固體支持物，其已經(jīng)被官能化，例如通過(guò)應(yīng)用包含反應(yīng)基的中間體物質(zhì)的層或涂層，其容許生物分子如肽的疏水連接。在多個(gè)肽陣列中，在所述陣列上的獨(dú)立區(qū)域包含多個(gè)肽分子。優(yōu)選地，在所述陣列上的每個(gè)位點(diǎn)包含一個(gè)單獨(dú)的肽的多個(gè)拷貝。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一肽具有在SEQIDNol中提出的結(jié)構(gòu)；(Phe-Gly)n-Phe-Cys-Phe-X-Phe-Y-Phe畫(huà)Z-Phe-Gly-Phe其中X，Y，和Z是配體結(jié)合殘基并且Cys提供用于二聚體形成的親核硫羥基。所述第二肽具有在SEQIDNo2中提出的優(yōu)選結(jié)構(gòu)；CysS(N)P-X，-Phe-Y，-Phe陽(yáng)Z，-Phe其中X',Y',和Z'是配體結(jié)合殘基并且CysS(N)P是用于二聚體形成的活化的硫羥基(最優(yōu)選地用硫代硝基吡啶基團(tuán)或硫代吡啶基團(tuán)活化)。要理解的是采用前述優(yōu)選實(shí)施方案僅是舉例而不是限制。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是可以將許多其它反應(yīng)基和活化基團(tuán)用于本發(fā)明的方法中。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法制備的捕獲試劑被分配在適合的基底上以形成在組合上多樣的二聚體的可尋址的空間編碼陣列。優(yōu)選地，使用非接觸的分配器(PiezorraySystem,PerkinElmerLAS)將所述肽單獨(dú)分配在基底上并原位組裝。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供根據(jù)本發(fā)明的第一方面的方法制備的捕根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供在其上固定至少一種根據(jù)第一方面的方法制備的捕獲試劑的基底。優(yōu)選地，捕獲試劑通過(guò)共價(jià)或疏水相互作用固定。本發(fā)明還提供包含根據(jù)本發(fā)明的方法制備的多聚體捕獲試劑和用于固定的適合的基底的試劑盒。備選地，所述試劑盒可以包含被產(chǎn)生用于本發(fā)明方法的第一和第二單體單元。優(yōu)選地，所述試劑盒還包含適合的基底。根據(jù)本發(fā)明，還提供鑒定結(jié)合目標(biāo)配體的根據(jù)本發(fā)明的方法制備的多聚體捕獲試劑的方法，所述方法包括產(chǎn)生根據(jù)任何前述方面的組合捕獲試劑的陣列，使目的配體與陣列接觸，和鑒定配體結(jié)合的捕獲試劑。當(dāng)在任何實(shí)施方案中提及配體與固定的肽的結(jié)合時(shí)，術(shù)語(yǔ)結(jié)合傾向于包括直接或間接，共價(jià)或非共價(jià)連接，除非另外清楚地或通過(guò)上下文指出。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以?xún)?yōu)選共價(jià)連接，但是通常所需要的是在這樣的條件下配體仍然結(jié)合于固定的肽，在所述條件中傾向于使用基底，例如在需要另外的配體受體相互作用的應(yīng)用中。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的是可以以本領(lǐng)域已知的多種方式鑒定配體與捕獲試劑的結(jié)合，例如，配體或捕獲試劑可以被標(biāo)記從而可以鑒定配體結(jié)合于所述陣列的位置。該標(biāo)記可以是，例如放射性或使用例如熒光團(tuán)的熒光標(biāo)記。備選地，目的配體與捕獲試劑的結(jié)合可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種其它技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，所述技術(shù)例如，量熱法，吸收光譜法，NMR法，原子力顯微鏡和掃描隧道顯微鏡，電泳或色譜法，質(zhì)譜法，毛細(xì)管電泳，表面等離子體共振檢測(cè)，表面聲波傳感和許多基于微支架(microcantilever)的方法。要理解的是，可以將通過(guò)本發(fā)明方法生產(chǎn)的多聚體捕獲試劑和多聚體捕獲試劑陣列用于鑒定任何選擇的分析物，因?yàn)閷⒂刹东@試劑結(jié)合的具體的配體將取決于形成捕獲試劑的肽的長(zhǎng)度和序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述配體包括真核細(xì)胞，原核細(xì)胞，病毒，噬菌體，朊病毒，孢子，花粉粒，變應(yīng)原，核酸，蛋白質(zhì)，肽，碳水化合物，脂質(zhì)，有機(jī)化合物或無(wú)機(jī)化合物。所述配體優(yōu)選地是生理或藥理學(xué)代謝物，并且最優(yōu)選地是在人或動(dòng)物體液中的生理或藥理代謝物，其可以用作診斷或預(yù)后的醫(yī)療保健標(biāo)記。本發(fā)明的另外的目標(biāo)，特點(diǎn)和重點(diǎn)將通過(guò)下面的說(shuō)明書(shū)變得清楚。此外，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)將參考附圖從下面的解釋中變得顯而易見(jiàn)。附圖簡(jiǎn)述參考下列實(shí)驗(yàn)例和附圖將進(jìn)一步理解本發(fā)明，其中圖1顯示制備根據(jù)本發(fā)明的捕獲試劑的第一種方法的圖解表示。圖2顯示制備根據(jù)本發(fā)明的捕獲試劑的第二種方法的圖解表示。圖3顯示制備根據(jù)本發(fā)明的捕獲試劑的另外的方法的圖解表示。圖4顯示用于產(chǎn)生包含各種反應(yīng)基的肽的可能的路徑。圖5顯示包含交替的L-和D-氨基酸的肽。圖6顯示包含P氨基酸的肽。圖7顯示其中每隔一個(gè)氨基酸被改變的肽。圖8圖解顯示在具有N端半胱氨酸的捕獲試劑和硫酯衍生的表面之間的天然化學(xué)連接的方法。圖9顯示用于制備硫酯官能化玻璃的優(yōu)選的反應(yīng)路線(xiàn)。圖10顯示用于在基底表面制備二聚體捕獲試劑的優(yōu)選的反應(yīng)路線(xiàn)。圖11顯示包含交替的疏水和非疏水氨基酸的肽。圖12顯示具有疏水面和基本非疏水配體結(jié)合面的二聚體捕獲試劑的實(shí)例。圖13是顯示各種疏水捕獲試劑在96孔板的定位的圖解表示。圖14顯示指示各種肽在孔中的存在的圖11的96孔板的熒光圖像。圖15顯示圖14的400V掃描的量化結(jié)果的圖解表示。圖16A顯示指示多肽Pl-l到P1-5和P2-1到P2-2在聚丙烯表面上的保留的熒光圖像。圖16B顯示指示多肽Pl-l到Pl-5和P2-l到P2-2在聚丙烯表面上的保留的熒光圖像。圖17顯示圖16A，B的量化結(jié)果的圖解表示。圖18顯示指示在聚丙烯疏水表面上沉積的肽2DOS-2的pH抗性的熒光圖像。圖19顯示圖18的300V掃描的量化結(jié)果的圖解表示。圖20顯示指示在水性緩沖液存在下，在聚丙烯疏水表面上沉積的肽2DOS-2的時(shí)間依賴(lài)性持續(xù)性的熒光圖像。圖21顯示圖20的300V掃描的結(jié)果的圖解表示。圖22是顯示被加入平底和V底聚丙烯96孔板的各種疏水肽的位置的圖解表示。圖23顯示圖22的板的熒光圖像，其顯示在洗滌和未洗滌時(shí)疏水肽的保留。圖24是對(duì)于V底板的圖23的500V掃描的結(jié)果的圖解表示。圖25是對(duì)于平底板的圖23的500V掃描的結(jié)果的圖解表示。圖26是顯示被加入聚丙烯和聚苯乙烯V底96孔板的各種疏水肽的定位的圖解表示。圖27顯示圖26的板的熒光圖像，其顯示在洗滌和未洗滌時(shí)疏水肽的保留。圖28是圖解表示，其顯示在洗滌后，在圖26的聚丙烯和聚苯乙烯板中的各種肽的百分比保留。圖29A顯示來(lái)自使用'液相方法'的實(shí)驗(yàn)的微量滴定板的熒光圖像。圖29B是來(lái)自在表21中顯示的熒光圖像的數(shù)據(jù)的圖解表示。圖30A顯示來(lái)自使用'共干燥'方法的實(shí)驗(yàn)的微量滴定板的熒光圖像。圖30B是來(lái)自在表22中顯示的熒光圖像的數(shù)據(jù)的圖解表示。圖31顯示指示在聚丙烯板上產(chǎn)生二聚體形成的熒光圖像。圖32顯示肽二聚體的256元件的微陣列的熒光圖像。實(shí)施本發(fā)明的最佳方式用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)間隔氨基酸指氨基酸，合成氨基酸，氨基酸類(lèi)似物或氨基酸模擬物，其中側(cè)鏈在配體結(jié)合中沒(méi)有作用。用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)捕獲試劑指具有這樣的結(jié)構(gòu)的多聚體分子從而使當(dāng)配體與捕獲試劑接觸時(shí)，其結(jié)合于捕獲試劑。用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)肽指包含兩個(gè)或更多氨基酸殘基，合成氨基酸，氨基酸類(lèi)似物或氨基酸模擬物，或其任何組合的鏈。術(shù)語(yǔ)肽，寡肽和多肽在說(shuō)明書(shū)中交替使用。用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)寡核苷酸和多核苷酸指在該說(shuō)明書(shū)中交互使用的兩個(gè)或多個(gè)核苷酸的鏈。用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)基本對(duì)映體純的指殘基包含基本上一種類(lèi)型的異構(gòu)體，其中任何其它異構(gòu)體形式僅作為雜質(zhì)存在。用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)以有利于配體結(jié)合的方式定位于空間中指組成多聚體捕獲試劑的肽的側(cè)鏈這樣定位從而使它們能夠接觸并與配體相互作用。用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)基本非疏水意為包含的親水性殘基基本上比疏水殘基更多。實(shí)施例1圖1顯示根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)捕獲試劑的方法的圖解表示。在固相上制備第一組單體單元(A)。所述單體單元包括配體結(jié)合部分(Rl-R4)和反應(yīng)基X。如果需要，X可以在合成過(guò)程中被保護(hù)，接著在使用前去保護(hù)。第二組單體單元(B)在固相上制備。這些單體單元包括配體結(jié)合部分(R'l-R'4),和反應(yīng)基Y,其可以在合成過(guò)程中被保護(hù)，接著在使用前去保護(hù)，和連接部分Z。如果需要，Z也可以在合成過(guò)程中被保護(hù)，并接著在使用前去保護(hù)。在組(A)中的每個(gè)單體單元被從固體支持物上裂解下來(lái)以在溶液中得到單體單元(C)。在組(B)中的每個(gè)單體單元從固體支持物上被裂解下來(lái)以在溶液中得到單體單元(D)。接著，在組D中的每個(gè)單體單元與固體支持物(E)的表面在陣列中空間編碼的位置接觸，從而使Z被用于與所述表面連接。接著進(jìn)行反應(yīng)，其中來(lái)自組D的表面結(jié)合的單體單元(F)與過(guò)量或等摩爾量的給定溶液相單體單元(C)反應(yīng)從而使殘基X與殘基Y反應(yīng)以形成與固相結(jié)合的二聚體結(jié)構(gòu)(G)。接著，可以將排列的和空間編碼的二聚體結(jié)構(gòu)(G)用于結(jié)合將以適合的親和性和選擇性結(jié)合的目的配體。圖2顯示根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)捕獲試劑的另外的方法的圖解表示。在該實(shí)施方案中，在固相上制備第一組單體單元(A)。所述單體單元包含配體結(jié)合部分(Rl-R4)和反應(yīng)基X，其可以在合成過(guò)程中被保護(hù)，接著在使用前去保護(hù)。還在固相上制備第二組單體單元(B)。這些單體單元包含配體結(jié)合部分(R'l-R'4)和反應(yīng)基Y,其可以在合成過(guò)程中被保護(hù)，接著在使用前去保護(hù),和連接部分Z。如果需要，Z也可以在合成過(guò)程中被j呆護(hù)并接著在使用前去保護(hù)。每個(gè)單體單元(B)從固體支持物上裂解下來(lái)以在溶液中得到單體單元(C)。接著進(jìn)行反應(yīng)，其中來(lái)自組(A)的給定的固相結(jié)合單體單元與過(guò)量的給定的溶液相單體單元(C)反應(yīng)從而使殘基X與殘基Y反應(yīng)以形成與固相結(jié)合的二聚體結(jié)構(gòu)(D)。接著將結(jié)合于固相的每個(gè)二聚體結(jié)構(gòu)(D)從固體支持物上裂解下來(lái)以得到溶液相二聚體結(jié)構(gòu)(E)。最終每個(gè)溶液相二聚體結(jié)構(gòu)(E)與固體表面(F)在陣列中空間編碼的位置接觸，從而使組Z被用于將二聚體結(jié)構(gòu)連接于所述表面。接著，可以將排列的和空間編碼的二聚體結(jié)構(gòu)(G)用于結(jié)合將以適合的親和性和選擇性結(jié)合的目標(biāo)配體。X,Y，和Z在圖中的位置僅是舉例說(shuō)明的并且應(yīng)該不被視為對(duì)本發(fā)明的限制。圖3顯示根據(jù)第三個(gè)方面生產(chǎn)捕獲試劑的另外的方法的圖解表示。在固相上制備第一組單體單元(A)。所述單體單元包含配體結(jié)合部分(Rl-R4)和反應(yīng)基X。如果需要，X可以在合成過(guò)程中被保護(hù)，并接著在使用前去保護(hù)。第二組單體單元(B)在固相上制備。這些單體單元包含配體結(jié)合部分(R'l-R'4)，反應(yīng)基Y，其可以在合成過(guò)程中被保護(hù)，接著在使用前去保護(hù),和連接部分Z。如果需要，Z也可以在合成過(guò)程中被保護(hù)并接著在使用前去保護(hù)。在組(A)中的每個(gè)單體單元從固體支持物上裂解下來(lái)，以在溶液中得到單體單元(C)。在組(B)中的每個(gè)單體單元從固體支持物上裂解下來(lái)以在溶液中得到單體單元(D)。接著，將在組D中的每個(gè)單體單元與過(guò)量或等摩爾量的給定的溶液相單體單元(C)和固體支持物(E)的表面在陣列中空間編碼的位置接觸從而可以將Z用于連接到所述表面并且使殘基X與殘基Y反應(yīng)從而形成與固相結(jié)合的二聚體結(jié)構(gòu)(G)?？梢越又鴮⑴帕械暮涂臻g編碼的二聚體結(jié)構(gòu)(G)用于結(jié)合以適合的親和性和選擇性結(jié)合的目標(biāo)配體。本發(fā)明最顯著的優(yōu)勢(shì)是通過(guò)在陣列表面組合連接成對(duì)(或更多的數(shù)量的)單體單元來(lái)使序列多樣性'平方'(或升高到更高的冪)。實(shí)施例2合成下面系列的肽從而示范將肽自我裝配為有機(jī)溶劑層或裝配在疏水表面上，所述自我裝配是通過(guò)與所述有機(jī)溶劑層或疏水表面接觸的水性溶劑中的熵效應(yīng)驅(qū)動(dòng)的。所有的肽用羅丹明染料TAMRA在N端標(biāo)記。將5-TAMRA和6-TAMRA異構(gòu)體的混合物用于標(biāo)記。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>在下述中，在紙平面前突出的殘基側(cè)鏈表示組合變化的'配體結(jié)合面，。在紙平面后突出的殘基側(cè)鏈表示'疏水面'(或陰性對(duì)照殘基)。在肽2DOS-l到2DOS-8組中，已經(jīng)使用了四種側(cè)鏈(天冬氨酰，丙氨酰，絲氨酰，和賴(lài)氨酰)的混合物。在肽2DOS-9到2DOS-16的組中，已經(jīng)使用了四條親水性(天冬氨酰)鏈。在肽2DOS-l到2DOS-4的組和肽2DOS-9到2DOS-12的組中，已經(jīng)將五種殘基側(cè)鏈用于'疏水面'(或陰性對(duì)照殘基)。在肽2DOS-5到2DOS-8的組和肽2DOS-13到2DOS-16的組中，已經(jīng)將三種殘基側(cè)鏈用于'疏水面，(或陰性對(duì)照殘基)。對(duì)于肽2DOS-l，2DOS-5，2DOS-9，和2DOS-13,已經(jīng)將正亮氨酰殘基用于'疏水面，。對(duì)于肽2DOS-2，2DOS-6,2DOS-10,和2DOS-14，己經(jīng)將苯丙氨酰殘基用于'疏水面'。對(duì)于肽2DOS-3,2DOS-7，2DOS-ll,和2DOS-15,將絲氨酰殘基用作'疏水面，的弱陰性對(duì)照。對(duì)于肽2DOS-4,2DOS-8，2DOS-12,和2DOS-16，已經(jīng)將天冬氨酰殘基用作'疏水面，的強(qiáng)陰性對(duì)照。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>使用標(biāo)準(zhǔn)的FMOC化學(xué)方法(奧塔生物科學(xué)(AltaBioscience))以2limol等級(jí)合成肽并且在50%(v/v)的水性乙腈中溶解到10pM。接著研究肽2DOS-l到2DOS-16在疏水表面上的保留(聚丙烯微量滴定板的孔)。將在50%(v/v)水性乙腈中的10mMtris-HCl(pH8.0)用作肽和TAMRA的溶劑。將100pl等分試樣的10pM肽2DOS-l到2DOS-16和10pMTAMRA置于Costar微量滴定板的孔中，如在圖13中所顯示將微量滴定板在200pm的解析度在TyphoonTrioPlus可變模式圖像儀(阿莫仙生物科學(xué)(AmershamBiosciences))上成像，所述圖像儀具有綠色(532nm)激光和580BP30濾光器，成像在下面所指出的PMT電壓和普通的靈敏性上進(jìn)行。將掃描高度設(shè)定在+3mm并且在掃描過(guò)程中擠壓樣口叩o使肽在黑暗中過(guò)夜蒸發(fā)到干燥并再次將微量滴定板如上所述進(jìn)行掃描。接著，用250pi的水將孔洗滌10次。最終，將殘余的表面結(jié)合的肽重新懸浮在50。/。(v/v)水性乙腈中的100^的10mMtris-HCl(pH8.0)中并再次如上所述掃描微量滴定板。使用ImageQuantTLv2003.03(阿莫仙生物科學(xué)(AmershamBiosciences))分析熒光圖像。在實(shí)驗(yàn)的三個(gè)階段，在600V，500V，400V,和300V的PMT電壓掃描微量滴定板的熒光圖像顯示在圖14中。將定量的數(shù)據(jù)(使用來(lái)自400V掃描的數(shù)據(jù))在表2中給出并且在圖15中圖解顯示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>在使用前，將聚丙烯板用50%(>/力的水性乙腈擦拭。使用Piezorray系統(tǒng)(PerkinElmer(鉑爾金愛(ài)爾默)LAS)將8x重復(fù)的20nl體積的在二甲亞砜(DMSO)中的1,肽Pl-l到Pl畫(huà)5和P2-l到P2隱2和TAMRA以1mm間隔分散在3"xl"xlmm聚丙烯板中。使用'附帶槽(sideshoot)，選項(xiàng)將500滴預(yù)先分配并將調(diào)諧設(shè)定在72V30ps。將玻片在TyphoonTrioPlus可變模式圖像儀(阿莫仙生物科學(xué)(AmershamBiosciences))上以10pm解析度成像，其具有綠色(532nm)激光和580BP30濾光器，在600V的PMT電壓和普通靈敏性上進(jìn)行。在壓盤(pán)(platen)中設(shè)定掃描高度并且在掃描過(guò)程中擠壓樣品。使用ImageQuantTLv2003.03(阿莫仙生物科學(xué)(AmershamBiosciences))分析熒光圖像。接著，將玻片的下半部分(包含測(cè)試陣列)在包含10mMtris-HCl(pH8.0)的100ml1MNaCl中洗滌1分鐘，并如上所述進(jìn)行再次掃描。接著，將玻片的相同的半部分在包含lOmMtris-HCl(pH8.0)的100ml的1MNaCl中洗漆第二次達(dá)30分鐘并如上所述再次掃描。接著，將玻片的相同的半部分在100ml水中洗滌第三次達(dá)30分鐘并如上所述再次掃描。將對(duì)于各種測(cè)定的熒光圖像顯示在圖16A,B中。將在圖16A,B中顯示的各種排列的肽的熒光值顯示在下面的表4-6中在第一次洗滌后表4a對(duì)照陣列，肽平均熒光校正的信號(hào)244,263,013..97,571,3"1200,280,129.53,588,457Pl-3192,743,46946,051,796Pl-4187,287,63040,595,958Pl-5199,347,48352,655,810平均玻片背景=146,69i,673,29表4b<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>第二次洗滌后:表5a<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表5b<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>在第三次洗滌后:表.<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表6b<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>這些結(jié)果在圖17中圖解顯示。這些圖清楚地顯示對(duì)于肽增加的保留的梯度與增加的肽鏈長(zhǎng)度相關(guān)。如可以清楚地觀察到，具有19個(gè)氨基酸的鏈長(zhǎng)度的肽Pl-5具有最高的保留。實(shí)施例3研究在聚丙烯疏水表面上沉積的肽2DOS-2(見(jiàn)上)的pH抗性將12個(gè)50pi的在50%(v/v)水性乙腈中的10mMtris-HCl(pH8,0)中的肽2DOS-2的等分試樣在Costar微量滴定板的孔中干燥。使肽樣品在黑暗中容許蒸發(fā)到干燥。根據(jù)在表3中顯示的路線(xiàn)，將在最前面11個(gè)孔中的干燥的肽樣品在室溫用200pl的100mM磷酸緩沖液一起溫育30分鐘表7孔下列nl數(shù)的100mMNaH2PO4下列Hi數(shù)的100mMNa2HPO—4觀察到的pH11,00004.51'2900謂5.653BOO2006.024700300'6.255600徹6.4765005006.627權(quán)6006."83007006-9892008007.181010D900'7..471101,0008.52移去全部上清液，并將所有12個(gè)孔中的殘留表面結(jié)合肽最終重新懸浮在50^的在50%(v/v)水性乙腈中的10mMtris-HCl(pH8.0)中并且在TyphoonTrioPlus可變模式圖像儀(阿莫仙生物科學(xué)(AmershamBiosciences))上以200解析度使微量滴定板成像，所述圖像儀具有綠色(532nm)激光和580BP30濾光片，所述成像在下面指出的PMT電壓和普通的靈敏性進(jìn)行。將掃描高度設(shè)定在+3mm并且在掃描過(guò)程中擠壓樣叩o使用ImageQuantTLv2003.03(阿莫仙生物科學(xué)(AmershamBiosciences))分析熒光圖像。在圖19中顯示這樣的熒光圖像，其中顯示在聚丙烯上沉積的2DOS-2的pH抗性在表8中給出肽2DOS-2保留的量化數(shù)據(jù)(使用來(lái)自300V掃描的數(shù)據(jù))并且在圖19中圖解地顯示孔洗滌pH未處理的熒光保留的熒光.保留百分比14.51815,706681,01525-65815,706■582,482-7136.02815,706548,329674S.25815,706542,5956756.47815,706589,5287266.62815,706566,4966976.79815,706576,6557186.9881.5,706570,653'70.7.18815,706586,08372107.,7'815,70661"02875118，52'815,706661,781.81所述結(jié)果顯示肽2DOS-2在聚丙烯表面上的保留因此在寬泛范圍的PH值上是穩(wěn)定的，其中最大保留在低和高的pH上并且最小保留在約pH6.5。實(shí)施例4研究在存在水性緩沖液時(shí)，沉積在聚丙烯疏水表面上的肽2DOS-2(見(jiàn)上)的時(shí)間依賴(lài)性的持續(xù)性，如下面所顯示將12個(gè)100pl的在75%(v/v)的水性乙腈中的5mMtris-HCl(pH8.0)中的5肽2DOS-2的等分試樣分配在Costar微量滴定板的頂排的孔中使肽樣品在黑暗中蒸發(fā)到干燥。將在孔1-10中的干燥的肽樣品與250pl的在10niMtris-HCl(pH8.0)中的1MNaCl在室溫一起溫育，溫育的時(shí)間如下面所指示。溫育后，將全部上清液上下吸移8次，接著移去上清液，并將其置于微量滴定板的底排的孔中。最終，將在全部12個(gè)孔中的殘余表面結(jié)合的肽重新懸浮在50pi的在50%(v/v)水性乙腈中的10mMtris-HCl(pH8.0)中并在TyphoonTrioPlus可變模式圖像儀(阿莫仙生物科學(xué)(AmershamBiosciences))上以200拜的解析度使微量滴定板成像，所述圖像儀具有綠色(S32nm)激光和580BP30濾光片，所述成像在下面指出的PMT電壓和普通的靈敏性進(jìn)行。將掃33描高度設(shè)定在+3mm，并且在掃描過(guò)程中擠壓樣品。使用ImageQuantTLv2003.03(阿莫仙生物科學(xué)(AmershamBiosciences))分析熒光圖像。在圖20中顯示在存在水性緩沖液時(shí)，在聚丙烯疏水表面上沉積的肽2DOS-2的時(shí)間依賴(lài)性持續(xù)性的熒光數(shù)據(jù)在表9和圖21中顯示對(duì)于肽2DOS-2保留的量化數(shù)據(jù)(使用來(lái)自300V掃描的數(shù)據(jù))表9<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>所述結(jié)果顯示在延長(zhǎng)的時(shí)間階段，在1MNaCl/10mMtris-HCl(pH8.0)中，肽2DOS-2在疏水聚丙烯表面上的保留是穩(wěn)定的。實(shí)施例5研究了肽2DOS-l到2DOS-16(見(jiàn)上)在不同幾何形狀的聚丙烯孔上的保留將在50%(v/v)水性乙腈中的10mMtris-HCl(pH8.0)用作肽和TAMRA的溶劑。按照如在圖22中所顯示的下述路線(xiàn)，將1^等分試樣的10肽2DOS-l到2DOS-16和10TAMRA移到CostarV底聚丙烯微量滴定板和Greiner平底聚丙烯微量滴定板的孔中使肽樣品在黑暗中蒸發(fā)到干燥。接著在室溫，在250pl的在10mMtris-HCl(pH8.0)中的1MNaCl中將微量滴定板的頂部?jī)膳胖械碾臉悠窚赜?5分鐘。溫育后，在去除上清液前，將洗滌緩沖液在孔中上下吸移8次。接著，將洗滌的和未處理的肽樣品在50的在50%(v/v)水性乙腈中的10mMtris-HCl(pH8.0)中重新懸浮。將微量滴定板在TyphoonTrioPlus可變模式圖像儀(阿莫仙生物科學(xué)(AmershamBiosciences))上，以200(im解析度成像，所述圖像儀具有綠色(532nm)激光和580BP30濾光片，成像在下面指出的PMT電壓上和普通靈敏性上進(jìn)行。在壓板設(shè)定掃描高度并且在掃描過(guò)程中擠壓樣品。使用ImageQuantTLv2003.03(阿莫仙生物科學(xué)(AmershamBiosciences))分析熒光圖像。將在600V和500V的PMT電壓掃描的板的熒光圖像顯示在圖23中。將對(duì)于V底孔的量化數(shù)據(jù)(使用來(lái)自500V掃描的數(shù)據(jù))顯示在表10和圖24中。<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>17,471,866998,3206將對(duì)于平底孔的量化數(shù)據(jù)(使用來(lái)自500V掃描的數(shù)據(jù))顯示在表ll35和圖25中。表11<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>所述結(jié)果顯示肽2DOS-l5U2DOS-16在不同幾何形狀的聚丙烯孔上的保留是相當(dāng)?shù)模f(shuō)明保留并不依賴(lài)具有V底幾何形狀的孔中的干燥。實(shí)施例6比較肽2DOS-l到2DOS-16(見(jiàn)上)在聚丙烯和聚苯乙烯表面上的保留將在75%(v/v)水性乙腈中的5mMtris-HCl(pH8.0)用作肽和TAMRA的溶劑。按照?qǐng)D26中顯示的路線(xiàn)，將20^等分試樣的5^iM肽2DOS-l到2DOS-16和5pMTAMRA吸移到CostarV底聚丙烯微量滴定板，GreinerV底聚丙烯微量滴定板和GreinerV底聚苯乙烯微量滴定板的孔中容許肽樣品在黑暗中蒸發(fā)到干燥。接著，在室溫將在微量滴定板的頂部?jī)膳胖械碾臉悠吩?50^的在10mMtris-HCl(pH8.0)中的lMNaCl中溫育15分鐘。溫育后，在去除上清中上下吸移8次。接著，將洗滌和未處理的肽樣品重新懸浮在50)il的在50%(v/v)水性乙腈中的10mMtris-HCl(pH8.0)中。在具有綠色(532nm)激光和580BP30濾光片的TyphoonTrioPlus可變模式圖像儀(阿莫仙生物科學(xué)(AmershamBiosciences))上，以200|im解析度，在下面指定的PMT電壓和普通靈敏性上使微量滴定板成像。將掃描高度設(shè)定在+3mm并且在掃描過(guò)程中擠壓樣品。使用ImageQuantTLv2003.03(阿莫仙生物科學(xué)(AmershamBiosciences))分析熒光圖像。將在600V,500V,和400V的PMT電壓掃描的玻片的熒光圖像顯示在圖27中已經(jīng)洗滌了板的上半部分的肽樣品并且在板的下半部分的肽樣品沒(méi)有經(jīng)過(guò)處理。將對(duì)于Costar聚丙烯V底孔的量化數(shù)據(jù)(使用來(lái)自400V掃描的數(shù)據(jù))顯示在表12中表12肽.未處理的熒光保留的熒光恢復(fù)百分比2DOS-16,458,3643,366,403'522DOS.-25,692,1345,349,601942DOS-3,5,660,618673,9401.2.2DOS-45,661,18174,1"12DOS".5,331,7631,651,850312DOS-65,733,0461,256,204'222DOS-75,139,578326,32862DOS-86,587,74193,4551.2DOS-97,102,2511,184,64817■2DOS-106,043,21/31,439,3752DOS-115,327,435102,04022DOS-124,432,09018,18002DOS-134,886,617387,73882DOS-.145,331,894595,959112DOS-156,488,13050,58412DOS-165,387,85016,194.0TAMRA11,786,211386,629.337將對(duì)于Greiner聚丙烯V底孔的量化數(shù)據(jù)(使用來(lái)自400V掃描的數(shù)據(jù))顯示在表13中表13<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>將對(duì)于Greiner聚苯乙烯V底孔(使用來(lái)自4Q0V掃描的數(shù)據(jù))的量化數(shù)據(jù)顯示在表14中表14<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>將這些數(shù)據(jù)圖解顯示在圖28中該結(jié)果顯示在所有的三種表面上觀察到類(lèi)似的肽表現(xiàn)，說(shuō)明保留是肽的序列特異性性質(zhì)而不是對(duì)于一種具體的塑料表面特有的性質(zhì)。實(shí)施例7合成包含由7個(gè)苯丙氨酰殘基組成的'表面-結(jié)合面，的四種肽。這些肽還包含由帶電的和不帶電的殘基和可變的倒數(shù)第二個(gè)殘基組成的中心區(qū)。所述可變的倒數(shù)第二個(gè)殘基是丙氨酰，絲氨酰，半胱氨?；蛳趸亮蚧?nitropyridylthio)活化的半胱氨酰。還合成另外的四種TAMRA-標(biāo)記的熒光肽，其包含連接于甘氨酰殘基的N端TAMRA熒光團(tuán)，所述甘氨酰殘基連接于可變的C端殘基?？勺兊腃端殘基是丙氨酰，絲氨酰，半胱氨?；蛳趸亮蚧罨陌腚装滨！@示在實(shí)施例1中的5-TAMRA和6-TAMRA異構(gòu)體的混合物用于標(biāo)記。將全部的8種肽的組顯示于表15和16中表15<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>表16<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>使用肽SB-l到SB-4和TLSP-1到TLSP-4以研究二聚體形成。使用兩種不同的方法。在"液相，方法中，在聚丙烯表面上干燥SB肽。接著，在洗滌所述孔并分析保留的熒光物質(zhì)之前在水溶液中加入TLSP肽。在'共干燥，方法中，將SB肽與TLSP肽混合并且接著在洗滌所述孔和分析保留的熒光物質(zhì)前，將兩者都在聚丙烯表面上進(jìn)行干燥。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地實(shí)現(xiàn)另一種方法，其中將SB肽與TLSP肽在水溶液中混合并且使其反應(yīng)以產(chǎn)生肽二聚體，接著將所述肽二聚體在聚丙烯表面上干燥。根據(jù)在表17中顯示的方案，在'液相，方法中，將50^的在50%(v/v)水性乙腈中的1mMNaH2p04中的10|jM肽SB-l到SB-4加入CostarV底微量滴定板的孔中<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>將所述樣品在黑暗中，在室溫進(jìn)行溫育l小時(shí)。去除上清液并且將所述孔用200^的在10mMtris-HCl(pH8.0)中的1MNaCl洗滌2次。最終，將50jil的在50%(v/v)水性乙腈中的10mMtris-HCl(pH8.0)加入所述孔中。在具有綠色(532nm)激光和580BP30濾光片的TyphoonTrioPlus可變模式圖像儀(阿莫仙生物科學(xué)(AmershamBiosciences))上，以200解析度，在500V的PMT電壓和普通靈敏性上使微量滴定板成像。將掃描高度設(shè)定在+3mm并且在掃描過(guò)程中擠壓樣品。使用ImageQuantTLv2003,03(阿莫仙生物科學(xué)(AmershamBiosciences))分析熒光圖像。根據(jù)在表19中顯示的方案，在'共干燥'方法中，將50^的在50%(v/v)水性乙腈中的1mMNaH2P04中的10肽SB-l到SB-4加入CostarV底微量滴定板的孔中表19SB-lSB-2SB-3SB-4-——-——-SB-lSB-2SB-3SB-4————-—-—SB-lSB-2SB-3SB-4—-一—-一—一SB-lSB-2SB-3SB-4-———-一—-SB-lSB-2SB-3SB-4一———一一—-接著，根據(jù)在表20中顯示的方案，將5(^1在50%(v/v)水性乙腈中的lmMNaH2P04中的lOOjiM肽TLSP-1到TLSP-4加入孔中表20TTjSP-1TLSP-1——-—-一-TliSP-2TXSP-2TIjSP-2TLSP-2TLSP-2———-—-—TLSP-3TLSP-3TIiSP-3TLSP-3TTjSP-3-—————TLSP-4TLSP-4TLSP-4TLSP-4TLSP-4——-一—————-j-—-———-—--————-一—-——-———--——-——--——-————————將樣品在黑暗中干燥過(guò)夜。接著，將所述孔用200^的在10mMtris-HCl(pH8.0)中的1MNaCl洗滌2次。最終，將S0jil的在50。/。(v/v)水性乙腈中的10mMtris-HCl(pH8.0)加入孔中。在具有綠色(532nm)激光和580BP30濾光片的TyphoonTrioPlus可變模式圖像儀(阿莫仙生物科學(xué)(AmershamBiosciences))上，以200解析度，在500V的PMT電壓和普通靈敏性上使微量滴定板成像。將掃描高度設(shè)定在+3mm并且在掃描過(guò)程中擠壓樣品。使用ImageQuantTLv2003.03(阿莫仙生物科學(xué)(AmershamBiosciences))分析熒光圖像。將來(lái)自使用'液相'方法的實(shí)驗(yàn)的微量滴定板的熒光圖像顯示在圖29A43中。將'液相，方法的熒光數(shù)據(jù)在表21中給出:表21<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>將所述結(jié)果圖解顯示在圖29B中將來(lái)自使用'共干燥，方法的實(shí)驗(yàn)的微量滴定板的熒光數(shù)據(jù)顯示在圖30A中。將'共干燥'方法的熒光數(shù)據(jù)在下面的表22中給出表22<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>將結(jié)果圖解顯示在圖30B中通過(guò)熒光標(biāo)記的肽的保留分析二聚體的產(chǎn)生，所述熒光標(biāo)記的肽的保留受未標(biāo)記的肽的存在調(diào)節(jié)，所述未標(biāo)記的肽可以結(jié)合于聚丙烯表面和熒光標(biāo)記的肽。與'共干燥方法'相比，對(duì)于'液相方法'，二聚體產(chǎn)率更低，但是對(duì)于二聚體形成的化學(xué)特異性更好。當(dāng)表面肽具有游離硫羥基團(tuán)并且溶解肽(solutionpeptide)具有S-硝基吡啶基活化的硫羥基時(shí)，觀察到最大二聚體形成。當(dāng)表面肽具有S-硝基吡啶基活化的硫羥基團(tuán)并且所述溶解肽也具有S-硝基吡啶基活化的硫羥基團(tuán)時(shí)；當(dāng)表面肽具有游離硫羥基團(tuán)并且溶解肽也具有游離硫羥基團(tuán)時(shí)；并且當(dāng)表面肽具有S-硝基吡啶基活化的硫羥基團(tuán)并且溶解肽具有游離硫羥基團(tuán)時(shí)，也觀察到二聚體形成游離硫羥基與游離硫羥基的偶聯(lián)可能是由于簡(jiǎn)單的需氧氧化，形成二硫鍵。S-硝基吡啶基活化的硫羥基與S-硝基吡啶基活化的硫羥基的偶聯(lián)可能是由于不完全硫羥基活化的結(jié)果，使一些游離硫羥基能夠與余下的s-硝基吡啶基活化的硫羥基反應(yīng)，或由一些其它的機(jī)制引起。共干燥方法的結(jié)果與上述那些類(lèi)似。用這種方法的二聚體產(chǎn)量通常更高，但是非特異性結(jié)合也更高。具體而言，在與表面連接的羥基化肽和包含游離硫羥基團(tuán)和s-硝基吡啶基活化的硫羥基團(tuán)的溶解肽之間觀察到一些反應(yīng)性。實(shí)施例8在該實(shí)施例中，使用壓電陣列(Piezorray)(PerkinElmer(鉑爾金愛(ài)爾默)LAS)非接觸分配器在平面的塑料表面上制備肽二聚體。壓電陣列(PerkinElmer(鉑爾金愛(ài)爾默)LAS)進(jìn)行了特殊的設(shè)計(jì)以將毫微升(nanolitre)體積吸移到密集陣列中。通過(guò)壓電頭(tip)控制液體體積。所述壓電陣列系統(tǒng)包含源板固定器，超聲波洗盆，計(jì)算機(jī)和監(jiān)測(cè)器，和用于系統(tǒng)液體的瓶。聚丙烯板獲自SBA塑料(http:〃www.sba.co.uk/,PropylexNatural聚丙烯板2440x1220x1mm)并且在使用前用50%(v/v)水性乙腈進(jìn)行擦拭。根據(jù)表23中顯示的方案，使用壓電陣列系統(tǒng)將6個(gè)5nl的在50%(v/v)水性乙腈中的lmMNaH2P04中的lOO^M肽SB-1和SB-3的10x10陣列或溶劑對(duì)照分散到被切成3"xl"的1mm聚丙烯板。表23在50*(v/v)水性乙腈中的lmMNaH2P04在50%(v/v)ZK性乙腈中的1mMNaH2P04月太SB-1肽SB-1肽SB-3肽SB-345接著，根據(jù)表24中顯示的方案，在以前的位置中，使用壓電陣列系統(tǒng)，分配6個(gè)5nl的在50%(v/v)水性乙腈中的1mMNaH2P04或在50%(v/v)水性乙腈和10%(v/v)甘油中的1mMNaH2P04中的100肽TLSP-4的10x10陣列。表24_<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>將所述樣品在黑暗中在室溫溫育30分鐘。接著將玻片在100ml的在10mMtris-HCl(pH8.0)中的50mMNaCl中進(jìn)行洗滌，隨后用自來(lái)水流過(guò)玻片1分鐘。在具有綠色(532nm)激光和580BP30濾光片的TyphoonTrioPlus可變模式圖像儀(阿莫仙生物科學(xué)(AmershamBiosciences))上，以10pm解析度，在400V的PMT電壓和普通靈敏性上使微量滴定板成像。在壓板設(shè)定掃描高度，并且在掃描過(guò)程中擠壓樣品。使用ImageQuantTLv2003.03(阿莫仙生物科學(xué)(AmershamBiosciences))分析熒光圖像。將聚丙烯玻片的熒光圖像顯示在圖31中通過(guò)熒光標(biāo)記的肽的保留分析二聚體的產(chǎn)生，所述熒光標(biāo)記的肽的保留受未標(biāo)記的肽的存在調(diào)節(jié)，所述未標(biāo)記的肽可以結(jié)合于聚丙烯表面和熒光標(biāo)記的肽二者。因此，當(dāng)表面肽具有游離硫羥基團(tuán)并且溶解肽具有S-硝基吡啶基活化的硫羥基團(tuán)時(shí)，觀察到二聚體形成。簡(jiǎn)單的方法(沒(méi)有防止蒸發(fā)的甘油)產(chǎn)生更高產(chǎn)量的二聚體。實(shí)施例9在該實(shí)施例中，平行制備20個(gè)包含肽L1-P1-1到16和Ll-P2-1到16的二聚體的256個(gè)元件的微陣列。使用前，將1mm聚丙烯板切成136mmx80mm，用玻璃紙輕輕摩擦，并用50%(v/v)水性乙腈進(jìn)行擦拭。使用壓電陣列系統(tǒng)(PerkinElmer(鉑爾金愛(ài)爾默)LAS)，如在表25中所指示，將18x6nl等分試樣的Pl肽沿聚丙烯玻片的欄以0.72mm的間隔排列。表25<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>L1-P1-8.Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-GI乂-Phe^Gly-Phe-Gly-Phe-GiyTphe-Gly-Phe"Cys-Phe^Hse-Phe-Asp-Phe-Gly-PheL1-P1-9Phe-Gly-Phe-Gly-Ph&Giy-Phe-Gly-Phe-Gly'-Phe-Gly-Phe^Gly-Ph^Cys-Phe-Abu-PhB-DAB-Phe-Gly-PheU-P1-11Phe-Gly-PheGly-Ph&-Gly-Phe-G，y-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gty-Phe-Cys-Phe-Abu-Phe-Abu-Phe-C3ly-PheL1-P1-12Ph&>Gly-Phe-Gly-PheGly-PheGly-Phe-Gty-Phe-(^y-Phe-Gy-Phe~Cys-Phe-Abu-Phe-Asf>-Phe:Gly-PheL1-P1-14Phe-Gly-Phe-Gly-Phe"Giy-Phe^(3ly-Ph&-Gly-Phe"ply-Phe-Gly-—he-Cys-Phe-Asp-Phe-Hset-Phe-Gly-PhePhe-Gly-Ph6"G^Ph—Gty-Phe-Gly-Ph屮Gly-Phe"Gly-Phe-t3ly隱Phe^Cys-Phe-Asp"Phe^Abu陽(yáng)Phe'-G-Phe在樣品蒸發(fā)后，使用壓電陣列系統(tǒng)(PerkinElmer(鉑爾金愛(ài)爾默)LAS)，如表26所顯示，將90%(v/v)DMSO，1mMtris陽(yáng)HCl(pH8.0)中的18x12nl等分試樣的Ll-P2肽沿聚丙烯玻片的排以0.72mm的間隔排列。表26<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>P2肽的序列:丄P2-1CysSTP-DAB-Phe-DAB-Phe-GIy-PheLl-P2.-2CysSTP-DAB-Phe-Hse-Phe-Qly-PheLl-P2--3CysSTP-DAB-Phe-Atm-Phe-Gly-PheLl-P2--4CysSTP-DAB-Phe-Asp-Phe-Gly-PheLl-5CysSTP-Hse-Phe'-DAB-Ifhe-Gly-Phe-P2--6CysSTP-Hse-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe-P2--7CysST.P-Hse-Phe-Abu-Phe二Gly-Phe-P2-■8CysSTP-Hse-Phe-Asp-Phe-Gly-Pheu--P2-.9CysSTP-Abu-Phe二DAB-Phe-Gly-Piie-P2-.10CysSTP-Abu-Phe-Hse-Phe-Giy-PheLl--P2-■11CysSTP-Abu-Phe-Abu-P.he-Gly-PheU'-P2-12.C"STP-Abu-Phe-Asp-Phe-Gly-PheU--P2-13CysSTP-Asp-Phe-DAB-Phe-Gly陽(yáng)PheLl--P2-14CysSTP-Asp-Phe-Hse-Phe-Gly-PheLl--P2-15CysSTP-Asp-Phe-Abu-Phe-G'y-Phe-14.-P2-16CysSTP-Asp-Phe-Asp-Phe-Gly-PheLl--P2-17TAMRA-CysSTP-DAB-Phe-DAB-Phe-Gly，PheLl--P2-18TAMRA-CysSTP-Hse-Phe-Hse-Phe-Gly-PheLl--P2-19TAMRA-CysSTP-Abu-Phe-Abu-Phe-Gly-PheLl--P2-20TAMRA-.CysSTP-Asp-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe樣品蒸發(fā)后，將玻片在50ml的包含0.1%(v/v)吐溫-20的10mMtris-HCl(pH8.0)中洗滌10分鐘。在具有綠色(532nm)激光和580BP30濾光片的TyphoonTrioPlus可變模式圖像儀(阿莫仙生物科學(xué)(AmershamBiosciences))上，以lOiim解析度，在500V的PMT電壓和普通靈敏性上使玻片成像。在壓板設(shè)定掃描高度。使用ImageQuantTLv2003.03(阿莫仙生物科學(xué)(AmershamBiosciences))分析熒光圖像。將一個(gè)18x18的二聚體陣列和對(duì)照點(diǎn)的熒光圖像顯示在圖32中?？捎^察到分配在陣列中的每個(gè)Ll-Pl肽欄的熒光信號(hào)。這說(shuō)明每個(gè)Ll-Pl肽己經(jīng)成功分配，并且能夠進(jìn)行二聚體形成。還可以觀察到分配到陣列中的每個(gè)L1-P2肽排的熒光信號(hào)。這說(shuō)明，每個(gè)L1-P2肽己經(jīng)成功分配并且能夠進(jìn)行二聚體形成。與對(duì)于用未標(biāo)記的P2肽和TAMRA-標(biāo)記的P2肽制備的16x16陣列的二聚體熒光比較，僅具有TAMRA-標(biāo)記的P2肽的樣品的二聚體熒光更大，所述未標(biāo)記的P2肽和TAMRA-標(biāo)記的P2肽與L1-P1肽硫羥基團(tuán)競(jìng)爭(zhēng)。這說(shuō)明所有的L1-P2肽已經(jīng)成功地與它們的TAMRA-標(biāo)記的負(fù)體競(jìng)爭(zhēng)并且因此成功地在所有的16種U-P1肽和所有的16種Ll-P2肽之間形成肽二聚體。因此對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，清楚的是相同的方法可以以許多方式而不同。這樣的變化并不被視為背離本發(fā)明的精神和范圍，并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的是意欲將所有的這樣的修飾包含在下面的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明提供具有增加的序列多樣性的合成捕獲試劑。所述捕獲試劑可以使各種表面，例如玻璃或硅官能化，從而容許配體與表面結(jié)合或形成各種類(lèi)型的陣列。50權(quán)利要求1.一種制備結(jié)合配體的多聚體捕獲試劑的方法，所述捕獲試劑包含至少第一和第二單體單元，所述第一單體單元還包含第一配體結(jié)合部分，第一反應(yīng)基和連接部分，所述第二單體單元還包含第二配體結(jié)合部分，和第二反應(yīng)基，其中所述反應(yīng)基對(duì)于每個(gè)單體單元可以是相同或不同的，所述方法包括下列步驟；a)使所述第一單體單元與所述第二單體單元反應(yīng)從而使在所述單體單元上存在的反應(yīng)基反應(yīng)以形成多聚體捕獲試劑。b)通過(guò)連接部分將所述第一單體單元固定在基底上，其中可以將步驟a)在步驟b)之前，同時(shí)或之后進(jìn)行。2.—種制備用于結(jié)合配體的多聚體捕獲試劑的方法，所述捕獲試劑包含至少第一和第二單體單元，所述第一單體單元還包含第一配體結(jié)合部分，第一反應(yīng)基和連接部分，所述第二單體單元還包含第二配體結(jié)合部分，和第二反應(yīng)基，其中對(duì)于每個(gè)單體單元，所述反應(yīng)基可以是相同或不同的，所述方法包括；使所述第一單體單元與所述第二單體單元反應(yīng)從而使在所述單體單元上的反應(yīng)基反應(yīng)以形成多聚體捕獲試劑。3.權(quán)利要求2的方法，其還包含將所述多聚體捕獲試劑通過(guò)連接部分固定在基底上的步驟。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述至少第一和第二單體單元是合成的。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一和第二單體單元是肽。6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述第一肽和第二肽分別從第一和第二氨基酸組產(chǎn)生。7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中每個(gè)氮基酸組是不同的。8.根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的方法，其中每個(gè)氨基酸殘基是基本上對(duì)映體純的。9.根據(jù)權(quán)利要求5-8中任一項(xiàng)的方法，其中每個(gè)基本上對(duì)映體純的氨基酸選自由少于20個(gè)氨基酸組成的組。10.根據(jù)權(quán)利要求5-9中任一項(xiàng)的方法，其中每個(gè)基本上對(duì)映體純的氨基酸選自由4個(gè)氨基酸組成的組。11.根據(jù)權(quán)利要求5-10中任一項(xiàng)的方法，其中每個(gè)基本對(duì)映體純的氨基酸選自由L-氨基酸，D-氨基酸，氨基酸模擬物，間隔氨基酸，P氨基酸或任何其它手性氮基酸單體組成的組。12.根據(jù)權(quán)利要求5-11任一項(xiàng)的方法，其中所述基本對(duì)映體純的氨基酸是L-氨基酸和/或D-氨基酸。13.根據(jù)權(quán)利要求5-12任一項(xiàng)的方法，其中所述第一肽和第二肽具有不同的氨基酸序列。14.根據(jù)權(quán)利要求5-13任一項(xiàng)的方法，其中所述第一肽和第二肽分別包含2-50個(gè)氨基酸。15.根據(jù)權(quán)利要求5-14任一項(xiàng)的方法，其中所述反應(yīng)基選自由硫羥基，馬來(lái)酰亞胺，環(huán)戊二烯，疊氮化物，膦硫酯，硫酯和(硝基)硫代吡啶基活化的硫羥基組成的組。.16.根據(jù)權(quán)利要求5-15任一項(xiàng)的方法，其中所述反應(yīng)基是硫羥基。17.根據(jù)權(quán)利要求5-16任一項(xiàng)的方法，其中所述硫羥基用硫代硝基吡啶基或硫代吡啶基活化。18.根據(jù)權(quán)利要求5-17任一項(xiàng)的方法，其中所述捕獲試劑共價(jià)連接于基底。19.根據(jù)權(quán)利要求5-18任一項(xiàng)的方法，其中所述肽是合成的從而使在結(jié)合配體的捕獲試劑的區(qū)域中，僅每隔一個(gè)氨基酸是改變的。20.根據(jù)權(quán)利要求5-19任一項(xiàng)的方法，其中所述捕獲試劑通過(guò)在硫酯衍生的捕獲試劑和半胱氨酸衍生的表面之間的天然化學(xué)連接連接于基底。21.根據(jù)權(quán)利要求5-19任一項(xiàng)的方法，其中所述捕獲試劑通過(guò)在具有N端半胱氨酸的捕獲試劑和硫酯衍生的表面之間的天然化學(xué)連接連接于基底。22.根據(jù)權(quán)利要求5-17任一項(xiàng)的方法，其中所述捕獲試劑通過(guò)疏水相互作用固定在基底上。23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述第一肽和第二肽分別包含至少一個(gè)疏水氨基酸殘基，其中所述疏水氨基酸殘基和配體結(jié)合部分位于所述肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)上從而產(chǎn)生具有疏水面和基本非疏水配體結(jié)合面的捕獲試劑。24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述第一肽和第二肽的疏水面形成所述連接部分。25.根據(jù)權(quán)利要求22-24任一項(xiàng)的方法，其中每個(gè)肽包含多個(gè)形成所述連接部分的疏水氨基酸。26.根據(jù)權(quán)利要求23-25任一項(xiàng)的方法，其中所述第一肽包含4-40個(gè)疏水氨基酸殘基。27.根據(jù)權(quán)利要求23-26任一項(xiàng)的方法，其中所述第一肽包含6-12個(gè)疏水氨基酸殘基。28.根據(jù)權(quán)利要求23-27任一項(xiàng)的方法，其中所述第一肽包含20%-80%的疏水氨基酸。29.根據(jù)權(quán)利要求23-28任一項(xiàng)的方法，其中所述第一肽包含含有交替的疏水和非疏水氨基酸殘基的一級(jí)結(jié)構(gòu)。30.根據(jù)權(quán)利要求23-29任一項(xiàng)的方法，其中所述第二肽包含1-6個(gè)疏水氨基酸殘基。31.根據(jù)權(quán)利要求23-30任一項(xiàng)的方法，其中所述疏水氨基酸選自由下列各項(xiàng)組成的組亮氨酸，異亮氨酸，正亮氨酸，纈氨酸，正纈氨酸，甲硫氨酸，酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸。32.根據(jù)權(quán)利要求23-31任一項(xiàng)的方法，其中所述疏水氨基酸是苯丙氨酸。33.根據(jù)權(quán)利要求23-32任一項(xiàng)的方法，其中在所述第一肽上的反應(yīng)基位于基本非疏水配體結(jié)合面的一級(jí)氨基酸結(jié)構(gòu)中并且在配體結(jié)合位點(diǎn)的N-端側(cè)，在所述第二肽中反應(yīng)基位于疏水面中并且位于配體結(jié)合位點(diǎn)的N-端側(cè)。34.根據(jù)權(quán)利要求5-33任一項(xiàng)的方法，其中所述第一肽包含10個(gè)或更少的配體結(jié)合殘基。35.根據(jù)權(quán)利要求5-34的任一項(xiàng)的方法，其中所述第二肽包含10個(gè)或更少的配體結(jié)合殘基。36.根據(jù)權(quán)利要求21-35任一項(xiàng)的方法，其中所述第一肽具有在SEQIDNo1中描述的序列。37.根據(jù)權(quán)利要求21-36任一項(xiàng)的方法，其中所述第二肽具有在SEQIDNo2中描述的序列。38.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述捕獲試劑組裝在基底上。39.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法生產(chǎn)的捕獲試劑。40.—種基底，其上固定至少一種根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的捕獲試劑。41.一種陣列，其上固定多種根據(jù)權(quán)利要求1-38任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的捕獲試劑。42.根據(jù)權(quán)利要求41的陣列，其中所述陣列包含許多不連續(xù)的可尋址空間編碼的位置。43.權(quán)利要求41或權(quán)利要求42的陣列，其中在所述陣列上的給定位置的基本所有的所述捕獲試劑基本上是相同的。44.權(quán)利要求43的陣列，其中在所述陣列上的每個(gè)位置包含不同的捕獲試劑。45.產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求41-44任一項(xiàng)的陣列的方法，其包括將根據(jù)權(quán)利要求1-38任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的捕獲試劑分配到適合的基底上以形成可尋址的空間編碼陣列。46.—種鑒定結(jié)合目標(biāo)配體的多聚體捕獲試劑的方法，所述方法包括生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1-38任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的組合捕獲試劑的陣列，使目標(biāo)配體與陣列接觸，和鑒定配體結(jié)合的捕獲試劑。47.—種試劑盒，其包含根據(jù)權(quán)利要求2和4到17的任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的多聚體捕獲試劑，和用于固定的適合的基底。48.—種試劑盒，其包含根據(jù)權(quán)利要求1，2和4-17任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的第一和第二單體單元。49.權(quán)利要求48的試劑盒，其還包含適合的基底。全文摘要本發(fā)明涉及制備結(jié)合配體的多聚體捕獲試劑的方法，所述捕獲試劑包含至少第一和第二單體單元，所述第一單體單元還包含第一配體結(jié)合部分，第一反應(yīng)基和連接部分，所述第二單體單元還包含第二配體結(jié)合部分，和第二反應(yīng)基，其中對(duì)于每個(gè)單體單元反應(yīng)基可以是相同或不同的，所述方法包括下列步驟a)使第一單體單元與第二單體單元反應(yīng)從而使在單體單元上存在的反應(yīng)基反應(yīng)以形成多聚體捕獲試劑。b)將第一單體單元通過(guò)連接部分固定在基底上，其中所述步驟a)可以在步驟b)之前，同時(shí)或之后進(jìn)行。文檔編號(hào)C07K1/04GK101331400SQ20068004700公開(kāi)日2008年12月24日申請(qǐng)日期2006年12月19日優(yōu)先權(quán)日2005年12月20日發(fā)明者薩莉·安德森,邁克爾·A·里夫申請(qǐng)人:夏普株式會(huì)社