專(zhuān)利名稱(chēng)：具有增強(qiáng)的抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性活性的抗體及其生產(chǎn)方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有增強(qiáng)的抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC)活性的抗體、其生產(chǎn)方法及女使用方法。
背景技術(shù)：
在疾病治療的軍火庫(kù)中，單克隆抗體是一種重要的武器。例如， ADCC是抗癌抗體有效性的主要貢獻(xiàn)者。介導(dǎo)ADCC的關(guān)鍵受體是
FcyIIIa( CD16 )受體---種表達(dá)于自然殺傷(NK)細(xì)胞上的針對(duì)IgG
的低親和力受體.缺乏此受體的小鼠對(duì)利妥昔(rituximab )單抗的抗腫 瘤應(yīng)答顯著更低(Clynes等，2000, Nat. Med 6: 443-446)。在小鼠中， FcyIIIa受體在介導(dǎo)腫瘤的細(xì)胞毒性中發(fā)揮作用(Clynes等，1998，PNAS 95: 652-656 )。編碼FcyIIIa受體的FCGR3A基因t 158位纈氨酸代替 苯丙氨酸的多態(tài)性更緊密的結(jié)合IgG，賦予NK細(xì)胞以增強(qiáng)的ADCC活 性(Wu等，1997， J Clin Invest 100: 1059-1070)。 FCGR3A基因的此 基因型——FCGR3A-158V/V——在應(yīng)答于利妥昔單抗的非何杰金淋巴 瘤(Carton等，2002， Blood 99: 754-758)、 Waldenstrom's巨球蛋白 血癥(Treon等，2005， J Clin Oncol 23: 474-481)以及自身免疫病系統(tǒng) 性紅斑狼掩(systemic lupus erythematosus, SLE ) (Anolik等，2003,Arthritis Rheum 48， 455-459 )患者中具有正效應(yīng)。相同的多態(tài)性還與克 羅恩病中對(duì)另一種抗體英利昔單抗(infliximab)的較好生物學(xué)應(yīng)答相 關(guān)(Louis等，2004， APharTherl9: 511國(guó)519)'這些發(fā)現(xiàn)示例了 ADCC 在人類(lèi)中單克隆抗體的治療作用中發(fā)揮了重要的作用。因此提高治療性 抗體促進(jìn)ADCC活性的能力具有潛在的治療價(jià)值。
人抗體具有兩個(gè)糖基化位點(diǎn)，相同的重鏈上各有一個(gè)。使用糖基化 和碳水化合物加工抑制劑的早先實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在受到抑制的雜交瘤克隆中 產(chǎn)生的抗體具有增強(qiáng)的ADCC活性(Rothman， 1989)。其它工作顯示， 抗體的糖基化狀態(tài)和ADCC活性都受到產(chǎn)生該抗體的細(xì)胞系的影響 (Lifely， 1995)。 一些研究小組已經(jīng)證明，在重鏈糖基化上缺乏1,6-巖 藻糖的抗體具有對(duì)FcyRIII受體增強(qiáng)的結(jié)合親和力以及增強(qiáng)的ADCC活 性(Shields等，2002; Shinkawa等，2002 )。另外，已經(jīng)建立了對(duì)FqRIII 受體的結(jié)合親和力與ADCC活性之間的相關(guān)性(Okazaki， 2004; Dall,Ozzo， 2004)。
已經(jīng)建立了缺乏"FUT8" ——a-l,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(其催化此巖 藻糖的轉(zhuǎn)移)的細(xì)胞系。這些敲除細(xì)胞可用于產(chǎn)生具有較高ADCC活 性的抗體。例如，已經(jīng)建立了缺乏FUT8的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞 (Yamane-Ohnuki等，2004)。小干擾RNA ( siRNA)也已經(jīng)用于阻斷 FUT8基因的表達(dá)(Mori等，2004)。大鼠細(xì)胞系已經(jīng)用于產(chǎn)生具有增 強(qiáng)的ADCC活性的抗體(Niwa等，2004， 2005)。除了活性更高之外， 低巖藻糖IgGl不依賴(lài)于FqRIII多態(tài)性，由此缺乏野生型細(xì)胞中使用 曲妥珠單抗(trastuzumab )或利妥昔單抗可見(jiàn)的差異(Niwa等，2004b， vol 10 Clin Cane Res )。
盡管之前已經(jīng)在多種表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生了抗體，但是從未認(rèn)識(shí)到在哺 乳動(dòng)物的乳腺上皮細(xì)胞(例如經(jīng)改造在其乳中分泌所述抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng) 物的哺乳動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞)中產(chǎn)生的抗體具有增強(qiáng)的ADCC活性。

發(fā)明內(nèi)容
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與來(lái)源于細(xì)胞培養(yǎng)物的材料相比，在哺乳動(dòng)物乳腺上皮 細(xì)胞(例如經(jīng)改造在其乳中分泌所述抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的哺乳動(dòng)物乳腺 上皮細(xì)胞)中產(chǎn)生的抗體具有增強(qiáng)的ADCC活性和增強(qiáng)的對(duì)CD16的結(jié)合。對(duì)乳來(lái)源抗體糖基化的研究顯示，在乳來(lái)源的抗體中巖藻糖含量較 低。因此，本文提供抗體及其組合物。所提供的抗體是在哺乳動(dòng)物乳腺 上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體。還提供了產(chǎn)生所述抗體的方法及其使用方法。
具有增強(qiáng)的ADCC活性的抗體通過(guò)在哺乳動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞中表 達(dá)該抗體來(lái)產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞是經(jīng)改造 在其乳中表達(dá)抗體的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物的乳腺上皮細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，所述乳腺上皮細(xì)胞是轉(zhuǎn)染了編碼抗體序列并能使所述抗體在 乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá)的核酸(例如DNA)構(gòu)建體的培養(yǎng)細(xì)胞。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面中，提供了包含乳腺上皮細(xì)胞來(lái)源抗體 的組合物，其中所述抗體具有增強(qiáng)的抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)活 性。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中提供了包含乳來(lái)源抗體的組合物，其中所 述乳來(lái)源抗體具有增強(qiáng)的抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)活性。在一個(gè) 實(shí)施方案中，所述抗體的ADCC活性是細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)源抗體的ADCC 活性的至少兩倍。在另一實(shí)施方案中，所述抗體的ADCC活性是細(xì)胞 培養(yǎng)物來(lái)源抗體的ADCC活性的至少3倍、4倍、5倍、7倍或10倍。 在一個(gè)實(shí)施方案中，從其中獲得乳來(lái)源抗體的乳是來(lái)自經(jīng)改造以表達(dá)所 述抗體的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，如果IgGl抗體缺乏發(fā)現(xiàn)附著在Fc區(qū) Asn297糖基化位點(diǎn)的核心巖藻糖(例如連接到二天線(xiàn)結(jié)構(gòu)基部(the base of the biantennary structure )的巖藻糖)，那么所述抗體Fc區(qū)的結(jié)合增 強(qiáng)。在一些方面中，本發(fā)明的抗體缺乏此核心巖藻糖。在其它一些方面 中，乳產(chǎn)生的單克隆抗體主要是高甘露糖和雜合結(jié)構(gòu)。 一般地，本發(fā)明 的抗體可更緊密地結(jié)合FcRIII受體，并且可導(dǎo)致增強(qiáng)的ADCC。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，所述抗體經(jīng)修飾具有如本文所提供的糖 基化模式，因而具有增強(qiáng)的ADCC活性。所述修飾是產(chǎn)生所述抗體的 結(jié)果，使得它在本文所提供的哺乳動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá)。
所提供的組合物中的抗體就其糖基化而言可以是同質(zhì)或異質(zhì)的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體的至少一條鏈已經(jīng)過(guò)修飾而不含有巖 藻糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體的一條鏈已經(jīng)過(guò)修飾而不含有巖藻糖。在另一實(shí)施方案中，所述抗體的一條鏈或至少一條鏈不含有1,6-巖藻糖。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體的至少一條鏈經(jīng)修飾從而不含 有巖藻糖，而且該抗體還經(jīng)過(guò)修飾從而含有甘露寡糖(oligomannose ) 或額外的甘露寡糖(additional oligomannose )。所述含有甘露寡糖的鏈 可以是不含有巖藻糖的同一鏈，但是并不必需如此。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，所述抗體的氨基酸序列經(jīng)過(guò)修飾，然后在哺乳動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞中 表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體的氨基酸序列經(jīng)過(guò)了修飾。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體(例如抗CD137抗體)的氨基酸序列具有 Asn297的氨基酸替換.在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述替換是替換為一個(gè) 不會(huì)被巖藻糖基化的氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，Asn297被替換為 Gln。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所提供的抗體已經(jīng)修飾而含有甘露寡糖或額 外的甘露寡糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體經(jīng)過(guò)修飾以使得至少 30%的所述抗體含有至少一個(gè)甘露寡糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗 體經(jīng)過(guò)修飾以使得至少40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或者更多 的抗體含有至少一個(gè)甘露寡糖.在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體經(jīng)過(guò)修 飾以使得少于50。/。、 40%、 30%、 20%、 10%或更少的抗體在一條或至 少一條鏈上不含有巖藻糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體經(jīng)過(guò)修飾以 使得至少40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或者更多的抗體含有至 少一個(gè)甘露寡糖，并且少于50%、 40%、 30%、 20%、 10%或更少的抗 體在一條或至少一條鏈上含有巖藻糖。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體的碳水化合物經(jīng)過(guò)修飾以顯示出高 甘露糖的糖基化模式。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體經(jīng)過(guò)修飾以使得 所述抗體的至少 一條鏈含有甘露寡糖并且是非巖藻糖基化的。在又一個(gè) 實(shí)施方案中，所述抗體經(jīng)過(guò)修飾以使得抗體的主要碳水化合物是非巖藻 糖基化的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述主要碳水化合物是非巖藻糖基化甘 露寡糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述主要碳水化合物是非巖藻糖基化 Man5。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體經(jīng)過(guò)修飾以使得抗體中少于40% 的碳水化合物含有巖藻糖。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體經(jīng)過(guò)了修飾 使得抗體少于30%、 20%、 10。/?；蚋俚奶妓衔锖袔r藻糖。在一 個(gè)實(shí)施方案中，所述巖藻糖是l,6-巖藻糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述 抗體經(jīng)過(guò)修飾以使得抗體中至少60。/。的碳水化合物是非巖藻糖基化甘露寡糖，并且所述抗體中少于40。/。的碳水化合物含有巖藻糖。在又一個(gè) 實(shí)施方案中，所述抗體經(jīng)過(guò)修飾以使得抗體中63%的碳水化合物是非巖 藻糖基化甘露寡糖，所述抗體中16%的碳水化合物是含有核心巖藻糖的 G1F，并且所述抗體中21。/。的碳水化合物是含有核心巖藻糖的G2F。
本發(fā)明的另 一個(gè)方面中，具有增強(qiáng)ADCC活性的抗體事實(shí)上不是由 本文提供的手段修飾的，而是針對(duì)上述糖基化模式選擇出來(lái)的抗體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是單克隆抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 所述抗體是多克隆抗體。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是嵌合抗體、 人源化抗體或全人抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是全長(zhǎng)抗體。 在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是全長(zhǎng)單鏈抗體。在又一個(gè)實(shí)施方案中， 所述全長(zhǎng)抗體包含重鏈和輕鏈。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是抗體 片段。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體片段是Fc融合多肽的一部分。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，所述抗體由轉(zhuǎn)基因DNA構(gòu)建體編碼， 所述構(gòu)建體含有包含N-連接寡糖的Fc區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗 體產(chǎn)生于非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳中。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體具有 如本文所述的糖基化模式，
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是IgG、 IgA或IgD同種型。在又一 個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是IgG同種型。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗 體是IgGl或IgG2同種型。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是抗體片 段。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了具有改進(jìn)特征(例如ADCC特征) 的本發(fā)明抗體的人源化形式。
所述抗體可以抗任何抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是針對(duì) CD3、 CD4、 CD5、 CD8、 CD14、 CD15、 CD16、 CD19、 CD20、 CD21、 CD22、 CD23、 CD25、 CD32B、 CD30、 CD33、 CD37、 CD38、 CD40、 CD40L、 CD46、 CD52、 CD54、 CD59、 CD74、 CD80、 CD126、 CD138、 CD137或GPIIbIIIa。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體^:針對(duì)HM1.24、 HLA誦DR、 MUC1、生腱蛋白(tenascin)、 PIGF、 VEGF、癌基因、癌基 因產(chǎn)物、壞死抗原、17-Al抗原、IL-2、 TlOl、 TAC、 IL-6、 TRAIL-R1、 GD3、神經(jīng)節(jié)苷脂(ganglioside)或TRAIL-R2。在一個(gè)實(shí)施方案中，所 述抗體是抗CD137抗體。在本文所提供的任何組合物和方法中，所述抗體是抗CD137抗體.
在一個(gè)實(shí)施方案中，包含所提供抗體的組合物可另外包含可藥用載 體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所提供的組合物可另外包含其它治療劑。在 一個(gè)實(shí)施方案中，所述其它治療劑是抗癌劑或免疫調(diào)節(jié)劑。
應(yīng)該注意，本發(fā)明的一些實(shí)施方案包括藥物組合物，所述藥物組合 物包含一定量的目的轉(zhuǎn)基因蛋白、其藥物前體或者所述化合物或所述藥 物前體的可藥用鹽，以及可藥用賦形劑、稀釋劑或載體。
所提供的組合物可用于許多治療方法。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供 了治療受試者的方法，其包括對(duì)受試者以在該受試者中有效增強(qiáng)ADCC 的量施用本文所提供的組合物。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了治療受 試者的方法，其包括對(duì)有此需要的受試者以有效治療疾病的量施用本文 所提供的組合物，所述疾病是受試者所患疾病或者有患病風(fēng)險(xiǎn)的疾病. 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疾病是癌癥。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體 可提供有益療效的具體適應(yīng)癥包括治療實(shí)體瘤；黑色素瘤；以及乳腺癌、 結(jié)腸癌、卵巢癌、腎癌、前列腺癌和肺癌。推測(cè)所述治療可能是因?yàn)樗?述抗體會(huì)幫助提供有效的免疫調(diào)節(jié)治療因而有效，但本發(fā)明并不受限于 此。
因此，具體靶標(biāo)還可包括抗CD3抗體(例如非何杰金淋巴瘤；自身 免疫病-SLE )、抗CD16抗體(例如FcRIII )、抗CD19 (例如非何杰金 淋巴瘤)、抗CD20、抗CD32B抗體(例如FcRIIB和變態(tài)反應(yīng))、抗 CD30 (例如何杰金病)、抗GPIIbIIIa (例如血檢癥)、抗TNF-a (例如 類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和克羅恩病)、用于腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物的抗TEM抗體(例如 用于控制血管發(fā)生-抗癌)等等。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述疾病是淋巴增生性疾病。在又一個(gè)實(shí)施 方案中，所述疾病是自身免疫病。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā) 明的ADCC抗體在治療自身免疫來(lái)源的腦-脊髄炎、系統(tǒng)性紅斑狼掩、 以及其它抗CD137可提供某些益處的疾病上是有效的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，施用給受試者的抗體量是約0.01 mg/kg/天至約 50 mg/kg/天.在另一個(gè)實(shí)施方案中，還對(duì)所述受試者施用了其它治療劑。在一個(gè) 實(shí)施方案中，所述其他治療劑是抗癌劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述其
它治療劑是免疫調(diào)節(jié)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫調(diào)節(jié)劑是IL-1、 IL畫(huà)2、 IL-3、 IL-6、 IL-IO、 IL-12、 IL-18、 IL-21、干擾素、紫杉醇、TNF-a 或者其組合.在另一個(gè)實(shí)施方案中，還對(duì)受試者施用了 IL-2。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，還對(duì)受試者施用了 IL-12。在另一個(gè)實(shí)施方案中，還對(duì)受試者 施用了抗癌劑和免疫調(diào)節(jié)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，還對(duì)受試者施用了免疫 調(diào)節(jié)劑和曲妥珠單抗。在又一個(gè)實(shí)施方案中，還對(duì)受試者施用了 IL-21和 曲妥珠單抗。在一個(gè)實(shí)施方案中，乳腺上皮細(xì)胞來(lái)源的抗CD137抗體 與IL-21和曲妥珠單抗聯(lián)合4吏用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗CD137抗 體是缺乏核心巖藻糖的高甘露糖抗體。因此，在一些實(shí)施方案中，所述 抗體與免疫調(diào)節(jié)劑一起使用，所述免疫調(diào)節(jié)劑在縮小實(shí)體瘤及防止其復(fù) 發(fā)方面是有效的。在另 一些實(shí)施方案中，所述抗體與其它抗癌治療劑(例 如IL-21、 IL-12和/或曲妥珠單抗) 一起使用。
所述受試者可以是任何期望ADCC活性的受試者。在一個(gè)實(shí)施方案 中，所述受試者是人。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述受試者是狗、貓、馬、 牛、豬、綿羊、山羊或靈長(zhǎng)類(lèi)。
本文還提供了通過(guò)^務(wù)飾抗體來(lái)產(chǎn)生ADCC活性增強(qiáng)的抗體的方法。 這些方法包括通過(guò)在哺乳動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生所述抗體來(lái)修飾所 述抗體的糖基化.在一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞是經(jīng) 改造以在其乳中表達(dá)所述抗體的非人哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，所述哺乳動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞是培養(yǎng)物中的哺乳動(dòng)物乳腺上皮細(xì) 胞。
本發(fā)明的一個(gè)方面提供了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因抗體及其變體和片段的方法， 所述方法包括在非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳中表達(dá)由核酸構(gòu)建體編碼的 轉(zhuǎn)基因抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生本發(fā)明抗體的方法包括
(a) 用編碼所期望轉(zhuǎn)基因抗體的轉(zhuǎn)基因DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染
非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞；
(b ) 選擇其基因組中已經(jīng)插入所述轉(zhuǎn)基因DNA構(gòu)建體的
細(xì)胞；和(C) 實(shí)施第一次核移植操作，以產(chǎn)生對(duì)于所期望轉(zhuǎn)基因抗
體而言屬雜合的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，所述抗體可在 其乳中表達(dá)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括
(a) 提供經(jīng)改造而表達(dá)抗體的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，
(b) 在所述非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳中表達(dá)所述抗體；和
(c) 分離乳中所表達(dá)的所述抗體。
在其它一些實(shí)施方案中，所述方法還包括誘導(dǎo)泌乳的步驟和/或測(cè)定 所得抗體的ADCC活性的步驟。在又一些實(shí)施方案中，所述方法還包 括額外的分離和/或純化步驟。在又一些實(shí)施方案中，所述方法還包括 比較所得抗體與細(xì)胞培養(yǎng)物中所產(chǎn)生抗體的ADCC活性的步驟。在另 一些實(shí)施方案中，所述方法還包括比較所得抗體與非乳腺上皮細(xì)胞所產(chǎn) 生抗體的ADCC活性的步驟。這些細(xì)胞可以是細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，可通過(guò)從如本文所述產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳中 收集所述抗體來(lái)獲得所述抗體，或者從所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的后代中收集。
在一些實(shí)施方案中，由至少一個(gè)p酪蛋白啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)編碼所期望 抗體(或抗體融合多肽)的構(gòu)建體。在另一些實(shí)施方案中，所述非人轉(zhuǎn)
基因哺乳動(dòng)物是有蹄動(dòng)物。在又一些實(shí)施方案中，所述非人轉(zhuǎn)基因哺乳 動(dòng)物是山羊。
在一些實(shí)施方案中，通過(guò)轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物產(chǎn)生的抗體以至少1克/ 升所產(chǎn)乳的水平產(chǎn)生。
在又一個(gè)方面，提供了增強(qiáng)抗體ADCC活性的方法，其包括通過(guò)本 文所述方法修飾所述抗體的糖基化。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體經(jīng)修 飾以使得所述抗體的至少一條鏈中不含有巖藻糖.在另一個(gè)實(shí)施方案 中，所述抗體經(jīng)修飾以使得所述抗體的一條鏈中不含有巖藻糖。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體經(jīng)修飾以使其含有甘露寡糖或額外的甘露寡 糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體經(jīng)修飾以使其含有甘露寡糖或額外 的甘露寡糖。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體經(jīng)修飾以使所述抗體的碳水化合物 表現(xiàn)出高甘露糖的糖基化模式.在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體經(jīng)修飾以 使所述抗體的至少 一條鏈中含有甘露寡糖并且是非巖藻糖基化的。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體經(jīng)修飾以使所述抗體的一條鏈含有甘露寡糖 并且是非巖藻糖基化的。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體經(jīng)修飾以使所 述抗體的主要碳水化合物是非巖藻糖基化的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述 主要碳水化合物是非巖藻糖基化的甘露寡糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所
述主要碳水化合物是非巖藻糖基化Man5。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述 抗體經(jīng)修飾以使所述抗體中少于40%的碳水化合物含有巖藻糖。在一個(gè) 實(shí)施方案中，所述抗體經(jīng)修飾以使所述抗體中少于30%、 20%、 10%或 更少的碳水化合物含有巖藻糖。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體經(jīng)修飾 以使至少30%的所述抗體帶有至少一個(gè)甘露寡糖。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述抗體經(jīng)1奮飾以4吏至少40%、 50%、 60%、 70%、 80%、卯％或更多 的所述抗體帶有至少一個(gè)甘露寡糖。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體經(jīng) 修飾以使至少40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90。/?；蚋嗟目贵w含有 至少一個(gè)甘露寡糖并且少于50%、 40%、 30%、 20%、 10%或更少的抗 體在一條鏈或至少一條鏈上含有巖藻糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗 體經(jīng)修飾以使抗體中至少60%的碳水化合物是非巖藻糖基化的甘露寡 糖，并且所述抗體中少于40%的碳水化合物含有巖藻糖。在又一個(gè)實(shí)施 方案中，所述抗體經(jīng)修飾以使抗體中63%的碳水化合物是非巖藻糖基化 的甘露寡糖，所述抗體16%的碳水化合物是含有核心巖藻糖的G1F， 以及所述抗體21%的碳水化合物是含有核心巖藻糖的G2F。
在本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供了產(chǎn)生抗體的方法，其包括從經(jīng)改造 而在其乳中表達(dá)所述抗體的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳中收集所述抗體 以及測(cè)定所述抗體的ADCC活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包 括比較所收集抗體與細(xì)胞培養(yǎng)物中所表達(dá)抗體的ADCC活性。在又一 個(gè)實(shí)施方案中，所述非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物是山羊、綿羊、野牛、駱駝、 牛、豬、兔、水牛、馬、大鼠、小鼠或美洲駝(llama)。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了產(chǎn)生抗體的方法，其包括從經(jīng)改造 以表達(dá)所述抗體的乳腺上皮細(xì)胞中收集所述抗體以及測(cè)定所述抗體的 ADCC活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括比較所收集抗體與非 乳腺上皮細(xì)胞中所表達(dá)抗體的ADCC活性。
18在本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供了這樣的方法，其包括按照本文所述
方法獲得抗體以及比較所述抗體與其它抗體組的ADCC活性。在一個(gè) 實(shí)施方案中，所述其它抗體組是獲得自細(xì)胞培養(yǎng)物的抗體。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，所述其它抗體組是獲得自培養(yǎng)的非乳腺上皮細(xì)胞的抗體。在 又一個(gè)實(shí)施方案中，所述其它抗體組是獲得自培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞的抗 體。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述其它抗體組是獲得自體液或身體組織的 抗體。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述其它抗體組是獲得自哺乳動(dòng)物乳的抗 體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是經(jīng)改造以在其乳中表達(dá)所述其 它抗體組的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明的每個(gè)限定可包含本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案。因此，預(yù)期本發(fā) 明涉及任一要素或要素組合的每個(gè)限定可包含在本發(fā)明的每個(gè)方面中。


圖1提供了糖基化抗CD137抗體的N-連接寡糖的MALDI-TOF謙。 通過(guò)PNG酶F釋放聚糖。圖1A提供了小鼠乳來(lái)源抗體的圖鐠；圖1B 提供了細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)源抗體的圖鐠；圖1C提供了山羊乳來(lái)源抗體的圖 傳，
圖2提供了通過(guò)使用熒光檢測(cè)(2-AA標(biāo)記的)從糖基化抗體所釋 放寡糖的HPLC獲得的寡糖圖的比較。圖2A提供了與小鼠乳來(lái)源抗體 的比較；圖2B提供了與使用EndoH處理過(guò)的小鼠乳來(lái)源抗體的比較； 圖2C提供了與細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)源抗體的比較；圖2D提供了與使用Endo H處理過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)源抗體的比較；圖2E提供了與山羊乳來(lái)源抗 體的比較；圖2F提供了與使用Endo H處理過(guò)的山羊乳來(lái)源抗體的比 較。
圖3舉例說(shuō)明了釋放自小鼠乳來(lái)源抗CD137抗體的主要寡糖的 Endo H敏感性。用Endo H過(guò)夜處理來(lái)自圖2的樣品。圖3A提供了小 鼠乳來(lái)源抗體的結(jié)果；圖3B提供了使用Endo H處理過(guò)的小鼠乳來(lái)源 抗體的結(jié)果；圖3C提供了細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)源抗體的結(jié)果；圖3D提供了 使用EndoH處理過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)源抗體的結(jié)果。
圖4顯示抗體的伴刀豆球蛋白A ( concanavalin A， Con A)結(jié)合。將A蛋白純化的抗體上樣到Con A柱，用含a甲基甘露糖苷酶的緩沖 液洗脫。以280 nm處的吸光度監(jiān)測(cè)級(jí)分。圖4A顯示Con A柱上糖基 化抗CD137抗體的結(jié)果；圖4B顯示Con A柱上非糖基化抗CD137抗 體的結(jié)果。
圖5證明了抗體與786-0細(xì)胞的結(jié)合。每種抗體的結(jié)合通過(guò)FACS 分析進(jìn)行測(cè)定，并覆蓋了陰性對(duì)照抗體(抗2，4-二硝基苯酚 (dinitrophenol， DNP ))和抗HER2.圖5A顯示小鼠乳來(lái)源非糖基化 (aglycosylated )抗體的結(jié)果；圖5B顯示小鼠乳來(lái)源糖基化抗體的結(jié) 果；圖5C顯示細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)源糖基化抗體的結(jié)果；圖5D顯示山羊乳 來(lái)源糖基化抗體的結(jié)果。
圖6舉例說(shuō)明在ADCC測(cè)定中通過(guò)乳來(lái)源抗體增強(qiáng)對(duì)786-0細(xì)胞的 殺傷。方塊小鼠乳來(lái)源；倒三角山羊來(lái)源；菱形細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)源； 圓形非糖基化小鼠乳來(lái)源；空心方塊曲妥珠單抗；三角抗DNP 抗體。
圖7提供了用于抗體乳表達(dá)的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的一般性示意圖。目的 基因替換了山羊P酪蛋白(一種乳特異性基因)的編碼區(qū)。將6.2kb的 啟動(dòng)子區(qū)與IgG H或L鏈的編碼區(qū)連接，其后是非翻譯的山羊p酪蛋 白3，序列以及下游元件。黑色長(zhǎng)方形H和L外顯子；條紋長(zhǎng)方形基 因組內(nèi)含子；箭頭轉(zhuǎn)錄方向。
圖8提供了由轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生的抗體上存在或不存在的碳水化合物 的分解。
圖9提供了一個(gè)生產(chǎn)方法實(shí)例的一般性示意圖。
圖10舉例說(shuō)明了顯示核心巖藻糖物理位置的抗體空間填充模型。
圖11證明了抗體與表達(dá)CD137的CHO細(xì)胞的結(jié)合。圖IIA提供 了無(wú)CD137的CHO細(xì)胞的結(jié)果(陰性對(duì)照)；圖11B提供了表達(dá)CD137 的CHO細(xì)胞的結(jié)果。每張圖上的實(shí)心曲線(xiàn)是用無(wú)關(guān)抗DNP抗體染色的。
圖12舉例說(shuō)明了在ADCC測(cè)定中通過(guò)乳來(lái)源抗體來(lái)增強(qiáng)對(duì)表達(dá) CD137的CHO細(xì)胞的殺傷，圖13提供了 IgGl-sFcgRIIIa結(jié)合的生物傳感器分析結(jié)果。圖13A 顯示來(lái)自山羊乳的抗體的結(jié)果；圖13B顯示來(lái)自小鼠乳的抗體的結(jié)果； 圖13C顯示來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)物的抗體的結(jié)果；圖13D顯示來(lái)自小鼠乳的 非糖基化抗體的結(jié)果。
圖14舉例說(shuō)明了包含具有增強(qiáng)ADCC活性的抗體的試劑盒。
發(fā)明詳述
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳中所產(chǎn)生的抗體相對(duì)于通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng) 物產(chǎn)生的重組抗體而言具有增強(qiáng)的ADCC活性。還已經(jīng)評(píng)估了具有增 強(qiáng)ADCC活性的抗體的糖基化模式。提供了乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗 體的組合物及其生產(chǎn)和使用方法。
在本發(fā)明的一個(gè)方面中，所述抗體具有增強(qiáng)的ADCC活性。本文使 用的"增強(qiáng)的ADCC活性"意為當(dāng)通過(guò)改變其糖基化模式的方法產(chǎn)生時(shí)， 抗體或其組合物所顯示的ADCC活性高于當(dāng)通過(guò)不改變其糖基化模式 的方法產(chǎn)生時(shí)，或者高于通過(guò)本文提供的方法改變其糖基化模式之前所 具有的ADCC活性水平。具有增強(qiáng)的ADCC活性的抗體包括在改變之 前不顯示任何ADCC活性的抗體。本文所使用的"糖基化模式"指存在 于單種抗體或抗體組之上的碳水化合物組?？赏ㄟ^(guò)改變一種抗體或一組 抗體的糖基化來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)糖基化模式的改變?？贵w組合物糖基化模式的改 變旨在包括以下情況單個(gè)抗體、組合物中的抗體亞組或者組合物中所 有抗體發(fā)生了改變?？赏ㄟ^(guò)許多本領(lǐng)域已知的許多方法確定糖基化模 式。例如，分析蛋白質(zhì)上碳水化合物的方法描述于美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào) 11/107982和序列號(hào)11/244826。分析蛋白質(zhì)上碳水化合物的方法通過(guò)參 考并入本文。
糖基化對(duì)于治療性糖蛋白的正確折疊、靶向、生物活性以及清除是 重要的。隨著例如轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為表達(dá)系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到不同的 遺傳背景導(dǎo)致了所產(chǎn)生蛋白質(zhì)的不同表達(dá)和糖基化水平。從山羊乳中分 離的轉(zhuǎn)基因來(lái)源蛋白質(zhì)的糖基化不同于從細(xì)胞培養(yǎng)物中收獲的蛋白質(zhì) 的糖基化(Denman等，1991 L ^基因產(chǎn)生的A4imifaJl中，糖基 化的類(lèi)型是位點(diǎn)依賴(lài)性的。巖藻糖基化、唾液酸化(sialylated)寡糖可 見(jiàn)于Asn96和Asnl92位置，而Asnl55具有甘露寡糖(Edmunds等，1998)。位點(diǎn)依賴(lài)性糖基化還可見(jiàn)于小鼠乳中產(chǎn)生的Y干擾素中(James 等，1995),
糖基化是能產(chǎn)生多種自然狀態(tài)最終蛋白質(zhì)形式的翻譯后修飾。IgG 分子在Fc區(qū)中CH2結(jié)構(gòu)域的Asii297殘基處被糖基化。碳水化合物結(jié)構(gòu) 的某些改變也可影響抗體的功能或治療有效性。例如，在例如類(lèi)風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎的疾病中，高于正常發(fā)生率的非半乳糖基化結(jié)構(gòu)(其似乎是IgG Fc相關(guān)碳水化合物特異性的)已有報(bào)道(Parekh等1985; Rademacher 等1988a).已經(jīng)提出，這種非糖基化結(jié)構(gòu)比此區(qū)域通常所見(jiàn)的結(jié)構(gòu)更易 移動(dòng)，因此可誘導(dǎo)糖蛋白四級(jí)結(jié)構(gòu)的變化、促進(jìn)所述抗體的免疫原性， 或者其自身可對(duì)異?？贵w功能有貢獻(xiàn)(Rademacher等1988b; Axford 等1992 )。但是，在疾病狀態(tài)下此結(jié)構(gòu)僅是所觀察到的眾多糖型 (glycoform)中的一種.
在一些實(shí)施方案中，本文所提供的抗體具有至少兩倍于非乳腺上皮 細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)源抗體的ADCC活性.在其它一些實(shí)施方案中，所述抗 體的糖基化通過(guò)所提供的方法進(jìn)行修飾，經(jīng)修飾抗體的ADCC活性是 相同抗體的未修飾形式的至少兩倍。在一些實(shí)施方案中，所述抗體具有 至少3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 20、 25或30倍高的ADCC活性。 所提供的抗體獲得自在哺乳動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)。在本文中這些 抗體也稱(chēng)為乳腺上皮細(xì)胞來(lái)源抗體。在一些實(shí)施方案中，所述抗體獲得 自在非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳中的表達(dá)。在本文中這些抗體也被稱(chēng)為"乳來(lái)源 抗體"。本文所使用的"轉(zhuǎn)基因"指細(xì)胞，所述細(xì)胞包含了人工插入細(xì)胞 或其祖先(ancestor)中并成為該細(xì)胞所發(fā)育出的動(dòng)物基因組一部分的 核酸分子。該術(shù)語(yǔ)也用于指代含有人工插入其細(xì)胞或基因組中的核酸分 子的動(dòng)物。
一般地，在一些實(shí)施方案中，所述糖基化顯示出高甘露糖的糖基化 模式。本文所使用的"高甘露糖的糖基化模式"意指含有至少一個(gè)甘露寡 糖的抗體，或者其中至少30%的所述抗體含有至少一個(gè)甘露寡糖的抗體 組合物。在一些實(shí)施方案中，所述抗體中至少30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、卯％或者更多的碳水化合物是甘露寡糖。在一些實(shí)施方案 中，所述抗體中至少30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或者 更多的碳水化合物是非巖藻糖基化的甘露寡糖。在另一些實(shí)施方案中，所述抗體中少于50%、 40%、 30%、 20%、 10%、 5。/c或更少的碳水化 合物含有巖藻糖。在又一些實(shí)施方案中，所述抗體是低巖藻糖且高甘露 寡糖的.因此，在另一些實(shí)施方案中，所述抗體中至少30%、40%、50%、 60%、 70%、 80%、 90%或者更多的碳水化合物是甘露寡糖，并且所述 抗體中少于50%、 40%、 30%、 20%、 10%或5%的碳水化合物含有巖 藻糖。因此在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體中至少30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或者更多的碳水化合物是非巖藻糖基化的甘露 寡糖，并且所述抗體中少于50%、 40%、 30%、 20%、 10%或5%的碳 水化合物含有巖藻糖.本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及具有增強(qiáng)的ADCC 活性且重鏈不含有1，6-巖藻糖的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，如果抗體缺 乏發(fā)現(xiàn)附著在Fc區(qū)Asn297糖基化位點(diǎn)上的核心巖藻糖(例如連接到二 天線(xiàn)結(jié)構(gòu)基部的巖藻糖)，則增強(qiáng)了所述抗體Fc區(qū)與單核細(xì)胞、巨噬細(xì) 胞和自然殺傷細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的FqRIII受體的結(jié)合。
在本文的實(shí)施例中描述了具有特定糖基化模式的其它一些抗體。如 本文中所使用的，當(dāng)討論抗體的組合物時(shí)，所述組合物在糖基化方面可 以是同質(zhì)或異質(zhì)的。
可針對(duì)其結(jié)合受體或其它蛋白質(zhì)(例如參與疾病過(guò)程和/或ADCC 的蛋白質(zhì))的能力來(lái)選擇所述抗體。所述抗體可以針對(duì)任何細(xì)胞標(biāo)志物， 其中提供針對(duì)該細(xì)胞標(biāo)志物并具有ADCC活性的抗體會(huì)提供治療益處。 所述抗體包括可結(jié)合乾抗原(例如腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物)的抗體。細(xì)胞標(biāo)志 物實(shí)例及本文所考慮的示例性疾病包括CD3、 CD4、 CD5、 CD8、 CD14、 CD15、 CD16、 CD19、 CD20、 CD21、 CD22、 CD23、 CD25、 CD32B、 CD30、 CD33、 CD37、 CD38、 CD40、 CD40L、 CD46、 CD52、 CD54、 CD59、 CD74、 CD80、 CD126、 CD138、 CD137或GPIIbIIIa。在一些實(shí) 施方案中，所述抗體可以針對(duì)HM1.24、 HLA-DR、 MUC1、生腱蛋白、 PIGF、 VEGF、癌基因、癌基因產(chǎn)物、壞死抗原、17-Al抗原、IL-2、 TlOl、 TAC、 IL-6、 TRAIL-R1、 GD3神經(jīng)節(jié)苷脂或TRAIL-R2。其它扭標(biāo)包括 抗CD3抗體(例如非何杰金淋巴瘤；自身免疫病-SLE)、抗CD16抗體
(例如FcRIII )、抗CD19(例如非何杰金淋巴瘤)、抗CD20、抗CD32B 抗體(例如FcRIIB和過(guò)敏)、抗CD30 (例如何杰金病)、抗GPIIbIIIa
(例如血栓癥)、抗TNF-ot (例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和克羅恩病)、用于腫瘤 內(nèi)皮標(biāo)志物的抗TEM抗體(例如用于控制血管發(fā)生-抗癌)。 一旦結(jié)合腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物，本發(fā)明的抗體可募集單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞
來(lái)攻擊腫瘤細(xì)胞。因此，具有增強(qiáng)的ADCC的抗體可被認(rèn)為是能有效縮小 實(shí)體瘤并阻止其JJL的免疫調(diào)節(jié)劑。
廣泛的研究證明，通過(guò)其天然配體或激動(dòng)性抗體刺激CD137增強(qiáng)了抗 腫瘤應(yīng)答，使得在多個(gè)模型中抑制已建立的小鼠腫瘤。CD137(也稱(chēng)為 4-1BB)是在數(shù)種淋巴細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)的膜糖蛋白。已有報(bào)道針對(duì)小鼠 CD137的激動(dòng)性單克隆抗體在體內(nèi)縮小小鼠腫瘤并且阻止其復(fù)發(fā)。通過(guò)其 天然配體或激動(dòng)性抗體刺激CD137可通過(guò)刺激腫瘤反應(yīng)性效應(yīng)T細(xì)胞和 增強(qiáng)了調(diào)節(jié)性NK活性而增強(qiáng)體內(nèi)抗腫瘤免疫應(yīng)答。全身性單獨(dú)施用或與 其它治療方式聯(lián)合施用抗小鼠CD137單克隆抗體在小鼠中誘導(dǎo)了對(duì)大腫 瘤的完全抑制，例如弱免疫原性的AGF104A肉瘤和高致瘤性的P815肥大 細(xì)胞瘤，以及EL4胸腺瘤、K1735黑色素瘤、B10.2和87肉瘤、RENCA 腎癌、J558漿細(xì)胞瘤、MCA205肉瘤、JC乳腺癌、MCA26結(jié)腸癌和GL261 神經(jīng)膠質(zhì)瘤。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可克隆抗CD137抗體并作為基因組"小 基因(mini-gene)"在數(shù)個(gè)品系的轉(zhuǎn)基因小鼠和山羊的乳中表達(dá)。此基因 的表達(dá)處于山羊P酪蛋白調(diào)控元件的控制下。在小鼠和山羊中均已建立 了所述抗體變體的實(shí)質(zhì)性表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有 增強(qiáng)的ADCC活性并因此具有增強(qiáng)的治療特性的抗CD137抗體。根據(jù) 本發(fā)明并使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生的抗CD137抗體作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例， 開(kāi)發(fā)了非人人嵌合單克隆抗體(即小鼠人)激動(dòng)劑抗CD137。預(yù)計(jì) 抗CD137抗體的人源化可增強(qiáng)其用于接受免疫治療的患者或者用于其 它適應(yīng)癥的用途。基于所觀察到的氨基酸序列同一性，將VL和VH區(qū) 的互補(bǔ)決定區(qū)(complementary determining region, CDR)移植到人抗 DNA相關(guān)獨(dú)特型免疫球蛋白克隆上。通過(guò)竟?fàn)幮訣LISA觀察到，與小 鼠單克隆抗體相比，本發(fā)明的重組嵌合抗體顯示出相似的生物活性譜。 在測(cè)定時(shí)，所述抗CD137抗體在介導(dǎo)抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性和補(bǔ)體依賴(lài) 性細(xì)胞毒性中都是有效的。預(yù)計(jì)本發(fā)明抗體序列的人源化會(huì)消除任何不 需要的人抗小鼠抗體應(yīng)答，允許對(duì)人重復(fù)進(jìn)行靜脈內(nèi)施用。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)"抗體"指包含通過(guò)二硫鍵相互連接的至少兩條 重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的糖蛋白，即包含由不同基因編碼的兩條相同Ig H鏈和兩條相同L鏈的共價(jià)異源四聚體。每條重鏈由重鏈可變 區(qū)(本文縮寫(xiě)為HCVR或VH)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個(gè) 結(jié)構(gòu)域CH1、 CH2和CH3構(gòu)成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(本文縮寫(xiě)為 LCVR或Vl)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域CL構(gòu)成. VH和區(qū)可以進(jìn)一步細(xì)分為被相對(duì)保守的區(qū)域(稱(chēng)為構(gòu)架區(qū) (framework region, FR ))分隔開(kāi)的高變區(qū)(稱(chēng)為互補(bǔ)性決定區(qū) (complementarity determining region, CDR))。毎個(gè)Vh和Vl區(qū)由3 個(gè)CDR和4個(gè)FR組成，從氨基端至羧基端的排列順序如下FRl、 CDR1、 FR2、 CDR2、 FR3、 CDR3、 FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有 與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可介導(dǎo)該免疫球蛋白與宿 主組織或因子的結(jié)合，包括與免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞)和 經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一成員(Clq)的結(jié)合。當(dāng)兩種蛋白質(zhì)以化學(xué)計(jì)量性 的量(stoichiometric quantity)表達(dá)并以正確的構(gòu)型自組裝時(shí)，可形成 成熟的功能性抗體分子。
術(shù)語(yǔ)抗體旨在包括其抗原結(jié)合片段。本文所使用的抗體的"抗原結(jié) 合片段，，指抗體中保持特異性結(jié)合抗原的能力的一個(gè)或多個(gè)部分。已經(jīng) 顯示，抗體的抗原結(jié)合功能可通過(guò)全長(zhǎng)抗體的片段來(lái)實(shí)現(xiàn).包括在術(shù)語(yǔ) 抗體的"抗原結(jié)合片段"中的結(jié)合片段實(shí)例包括(i)Fab片段，由Vl、 Vh、 Ct和CHl結(jié)構(gòu)域組成的一價(jià)片段；(ii) F(ab，)2片段，包含通過(guò)在 鉸鏈區(qū)的二硫橋相連的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(iii)由Vh和CH1 結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由單個(gè)抗體臂的Vl和VH結(jié)構(gòu)域組成的 Fv片段，(v)由Va結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward等，(1989 ) 7V"似^ 341: 544-546);以及(vi)分離的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)。另外，盡管 Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域V和VH由不同的基因編碼，但是可以使用重組方 法通過(guò)合成接頭將它們相連，所述接頭使得它們可以作為單個(gè)蛋白質(zhì)鏈 產(chǎn)生，其中Vl和VH配對(duì)形成一價(jià)分子(稱(chēng)為單鏈Fv (scFv);參閱如 Bird等(1988 ) 5Wew" 242: 423-426;和Huston等(1988 )A^A 5W. tASJ 85:5879-5883 )。這些單鏈抗體還旨在涵蓋于術(shù)語(yǔ)抗體的 "抗原結(jié)合部分"之中。這些抗體片段使用常規(guī)操作獲得，例如J. Goding: Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 98-118頁(yè)(N. Y. Academic Press 1983)(通過(guò)參考并入本文)中所述的蛋白水解性片段化操作以及 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它技術(shù).以與完整抗體相同的方式篩選片段的效用。
優(yōu)選的抗原結(jié)合片段包括Fab片段、F(ab，)2片段和Fv片段CDR3。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體片段是Fc融合多肽的一部分。例如，所述抗體片段是含有N連接S^t的Fc區(qū)。
本文所使用的"分離的抗體"指基本不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體。但是，特異性結(jié)合抗原的^^位、同工型或變體的分離的抗體
可能與其它相關(guān)抗原(例如來(lái)自其它物種的抗原)交叉反應(yīng)。另外，分離的抗體可基本不含其它細(xì)胞材料和/或化學(xué)物質(zhì)，本文所使用的"特異性結(jié)合"指結(jié)合預(yù)定抗原的抗體。通常，抗體結(jié)合的親和力至少兩倍于其結(jié)合除預(yù)定抗原或密切相關(guān)抗原之外的非特異性抗原的親和力。因此，在一些實(shí)施方案中本文所提供的抗體特異性結(jié)合靶抗原。
在一些實(shí)施方案中，所述抗體是IgG、 IgA或IgD同種型。在另一些實(shí)施方案中，所述抗體選自IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgM、 IgAl、 IgA2、IgAsec、 IgD、 IgE,或者具有IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgM、 IgAl、IgA2、 IgAsec、 IgD或IgE的免疫球蛋白恒定和/或可變結(jié)構(gòu)域。在另一些實(shí)施方案中，所述抗體是雙特異性或多特異性抗體。在又一些實(shí)施方案中，所述抗體是重組抗體、多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體或嵌合抗體，或者其混合物。在一些實(shí)施方案中，所述嵌合抗體是非人(如小鼠、大鼠、兔)抗體部分與人抗體部分的遺傳工程融合物。在一些實(shí)施方案中，所述嵌合抗體可>^有約33%的非人蛋白質(zhì)和67%的人蛋白質(zhì)。就小鼠嵌合體而言，可開(kāi)發(fā)它們以降低小鼠抗體所引發(fā)的HAMA應(yīng)答，因?yàn)樗鼈兛梢詫⑿∈罂贵w的特異性與人抗體的高^(guò)tA免疫系統(tǒng)相互作用結(jié)合在一起。
在其它一些實(shí)施方案中，所述抗體是重組抗體。本文所使用的術(shù)語(yǔ)"重組抗體"旨在包括通過(guò)重組手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體，例如從轉(zhuǎn)入了另一物種免疫球蛋白基因的動(dòng)物中分離的抗體、使用轉(zhuǎn)染進(jìn)宿主細(xì)胞的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體、從重組的組合抗體文庫(kù)中分離的抗體，或者通過(guò)任何其它涉及將免疫球蛋白基因序列與其它DNA序列進(jìn)行剪接的手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。
在其它一些實(shí)施方案中，所述抗體可以是嵌合抗體或人源化抗體，本文所使用的"嵌合抗體，，指將小鼠可變區(qū)或高變區(qū)與人恒定區(qū)或恒定和可變構(gòu)架區(qū)組合在一起的抗體。本文所使用的術(shù)語(yǔ)"人源化抗體"指只保留了與
A^j架區(qū)相關(guān)聯(lián)的來(lái)自親本抗體的抗原結(jié)合CDR的抗體(參見(jiàn)Waldmann，1991， 252:1657 )。這些保留了小鼠抗體結(jié)合特異性的嵌合或人源化
抗體預(yù)計(jì)在根據(jù)本發(fā)明以診斷、預(yù)防或治療用途體內(nèi)施用時(shí)預(yù)期具有降低的免疫原性。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是具有提高的ADCC活性的人源化抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，此抗體是CD137。人源化(也被稱(chēng)為改形(reshaping)或CDR移植)是用于降低來(lái)自異種來(lái)源(例如小鼠)的單克隆抗體免疫原性的成熟技術(shù)?？赏ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)生成人源化抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，這包括將嚙齒動(dòng)物互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)移植到A^架中。但是，此技^M艮大程度上是一種反復(fù)性方法，當(dāng)設(shè)計(jì)人源化抗體時(shí)有多種要素參與CDR的長(zhǎng)度、人構(gòu)架以及將來(lái)自嚙齒動(dòng)物mAb的a^替換ii^架區(qū)(回復(fù)突變).
治療性小鼠mAb對(duì)于人類(lèi)應(yīng)用經(jīng)常是不理想的，因?yàn)镠AMA (人抗小鼠抗體，human anti-mouse antibody )應(yīng)答中和了所述抗體，并JLiSti^將其從循環(huán)中清除，在最壞的情況下，還誘導(dǎo)嚴(yán)重的變應(yīng)性超^lt!l應(yīng)。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了 一些策略用于使用人序列替換大部分的小鼠Ig序列，使得在保持效力的同時(shí)副作用更小。 一種用于開(kāi)發(fā)人治療性mAb的策略是使用人的區(qū)域替換小鼠重鏈(H)和輕鏈(L)恒定區(qū)(分別為Ch和Cl)，或者一般地替換非人鏈，以使所得的嵌合抗體除了抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域仍為非人的之外主要由人IgG蛋白序列組成。此策略被用于開(kāi)發(fā)美羅華(Rituxan) (利妥昔抗人CD20單抗，Genentech),它是第一個(gè)在美國(guó)獲得批準(zhǔn)的單克隆抗體，用于治療非何杰金淋巴瘤。據(jù)估計(jì)，提供帝有人Ch和Cl序列的治療性mAb將減少小鼠抗體蛋白約90%的免疫原性。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了非人:人嵌合單克隆抗體(即小鼠人)抗CD137抗體。將小鼠抗體的Vl和Vh區(qū)的互樸決定區(qū)(CDR)移植到人抗DNA相關(guān)獨(dú)特型免疫球蛋白克隆上。通過(guò)竟?fàn)幮訣LISA，本發(fā)明的重組嵌合抗體顯示出與小鼠單克隆抗體類(lèi)似的生物活性譜。所述抗CD137抗體在介導(dǎo)抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC )和補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性中均有效。
根據(jù)一個(gè)替代性實(shí)施方案，本發(fā)明的單克隆抗體可被修飾成雙特異性抗體或者多特異性抗體的形式。術(shù)語(yǔ)"雙特異性抗體"旨在包括任何具有兩種不同結(jié)合特異性的物質(zhì)(例如蛋白質(zhì)、肽、或者蛋白質(zhì)或肽的復(fù)
合物)，其與(a)細(xì)胞表面抗原和(b)效應(yīng)細(xì)胞表面的Fc受體結(jié)合或相互作用。術(shù)語(yǔ)"多特異性抗體"旨在包括任何具有兩種以上不同結(jié)合特異性的物質(zhì)(例如蛋白質(zhì)、肽、或者蛋白質(zhì)或肽的復(fù)合物)，其與(a)細(xì)胞表面抗原，(b)效應(yīng)細(xì)胞表面的Fc受體，和(c)至少一種其它成分結(jié)合或相互作用。因此，本發(fā)明包括但不限于針對(duì)細(xì)胞表面抗原并針對(duì)效應(yīng)細(xì)胞上Fc受體的雙特異性、三特異性、四特異性以及其它多特異性抗體。術(shù)語(yǔ)"雙特異性抗體，，還包括雙抗體(diabody)。雙抗體是二
價(jià)雙特異性抗體，其中VH和V^結(jié)構(gòu)域表達(dá)于單個(gè)多肽鏈上，但是使用
了短到不允許同一條鏈上兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)的接頭，由此迫使所述結(jié)構(gòu)域與另 一條鏈上的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，形成了兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見(jiàn)，例如Holliger， P.，等(1993)7V"汰Z75L4 90:6444-6448; Poijak，RJ.，等(1994)及m"MM 2:1121-1123 )。
在一些實(shí)施方案中，所述抗體是人抗體。本文所使用的術(shù)語(yǔ)"人抗體，，旨在包括具有來(lái)源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體可包含不由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過(guò)體外隨機(jī)或定點(diǎn)誘變或者通過(guò)體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)。但是，本文所使用的術(shù)語(yǔ)"人抗體，，不旨在包括其中將來(lái)源于另一種哺乳動(dòng)物物種種系(如小鼠)的CDR序列移植到人構(gòu)架區(qū)序列上的抗體(本文稱(chēng)之為"人源化抗體，，)。使用帶有人免疫系統(tǒng)部分而非鼠免疫系統(tǒng)部分的轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生人抗體。
也可通過(guò)免疫針對(duì)大部分人免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因座而言為轉(zhuǎn)基因的小鼠來(lái)制備全人單克隆抗體。參閱如美國(guó)專(zhuān)利5,591,669，5,598,369， 5,545,806, 5,545,807, 6,150,584以及其中所引參考文獻(xiàn)，其內(nèi)容通過(guò)參考并入本文。這些動(dòng)物經(jīng)過(guò)了遺傳修飾，從而功能性缺失了內(nèi)源(例如小鼠)抗體的產(chǎn)生。所述動(dòng)物被進(jìn)一步修飾以含有所有或部分人種系免疫球蛋白基因座，使得對(duì)這些動(dòng)物進(jìn)行的免疫產(chǎn)生抗目的抗原的全人抗體。在免疫這些小鼠(例如XenoMouse( Abgenix )、 HuMAb小鼠(Medarex/GenPharm))之后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體。這些單克隆抗體具有人免疫球蛋白M酸序列，因此在施用于人時(shí)不會(huì)^L人抗小鼠抗體(HAMA)應(yīng)答。像本文所提供的其它抗體那樣，人抗體可以是單克隆抗體、多克隆抗體或者單克隆抗體和多克隆抗體的混合物。
在一些實(shí)施方案中，所述抗體是全長(zhǎng)抗體。在一些實(shí)施方案中，所述全長(zhǎng)抗體包含重鏈和輕鏈。
產(chǎn)生多克隆抗體的操作是公知的。例如，通過(guò)對(duì)已取血以獲得免疫前血清的新西蘭白兔皮下施用抗原來(lái)產(chǎn)生抗體?？梢栽诹鶄€(gè)不同部位以總體
積100jil/部位注射所述抗原，通常有一個(gè)或多個(gè)調(diào)整。接著在初次注射兩周后從所述兔子取血，每六周使用相同抗原定期加強(qiáng)3次。每次加強(qiáng)后十天收集血清樣品。從血清中回收多克隆抗體，優(yōu)選通過(guò)使用抗原捕獲所述抗體的親和層析來(lái)回收。用于產(chǎn)生多克隆抗體的這種^t作及其它操作/^開(kāi)于E. Harlow等編輯，Antibodies: A Laboratory Manual (1988),其通過(guò)參考并入本文。
為了產(chǎn)生單克隆抗體，多次注射小鼠(參見(jiàn)上文)，取出小鼠脾并重懸于磷酸緩沖鹽水(PBS)中。脾細(xì)胞作為淋巴細(xì)胞的來(lái)源，其中的一些產(chǎn)生具有合適特異性的抗體。然后，將其與永生化骨髄瘤伴侶細(xì)胞融合，將融合產(chǎn)物鋪在存在選擇劑(例如HAT)的多個(gè)組織培養(yǎng)孔中。然后通過(guò)ELISA篩選這些孔以鑒定含有產(chǎn)生有用抗體的細(xì)胞的孑L。然后，重新鋪板.在生長(zhǎng)一段時(shí)間后，再次篩選這些孔以鑒定產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。實(shí)施若干克隆操作直至超過(guò)90%的孔含有抗體產(chǎn)生為陽(yáng)性的單克隆。在此操作中建立了產(chǎn)生所述抗體的穩(wěn)定克隆系。然后可通過(guò)使用A蛋白瓊脂糖的親和層析、離子交換層析以及這些技術(shù)的變型和組合來(lái)純化所述單克隆抗體(參閱如美國(guó)專(zhuān)利6,998,467 )。
開(kāi)發(fā)mAb產(chǎn)物的一種替代性策略是在轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生所述抗體，在所述小鼠中整個(gè)天然Ig庫(kù)已被替換為人Ig基因。這些小鼠產(chǎn)生全人抗體蛋白。以這種方式可產(chǎn)生嵌合、人源化或全人抗體，均為本發(fā)明的實(shí)施方案。這些抗體均會(huì)具有效應(yīng)子功能，且可用于治療癌癥和癌損傷。本發(fā)明的嵌合抗體實(shí)施方案保留了原始的小鼠可變(抗原結(jié)合)序列，因此應(yīng)保留其結(jié)合及功能特性。
所述抗體可具有如本文任一處所述的糖基化模式，所^基化模式為抗體提供了或增強(qiáng)了 ADCC活性。本發(fā)明包括所有產(chǎn)生具有如本文所提供的增強(qiáng)ADCC活性的抗體的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括產(chǎn)生全人單克隆抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括使用轉(zhuǎn)基因小鼠， 或者其它非人動(dòng)物受試者，它們的抗體基因^基因替換，并且響應(yīng)于目 的抗原免疫而產(chǎn)生"人源化"抗體。在又一個(gè)實(shí)施方案中，可使用噬菌體展 示來(lái)^it嗟菌體，以在其表面展示全人單克隆抗體。通過(guò)上述任一方法產(chǎn) 生的抗體可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，這通過(guò)將編碼所述
抗體的DNA構(gòu)建體插入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基因組來(lái)進(jìn)行。
本發(fā)明的一個(gè)方面是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(包括小鼠和山羊)所產(chǎn)生的可包含 大量含有甘露寡糖的抗體的乳。這些含有甘露寡糖的抗體具有增強(qiáng)的 ADCC鐠，并發(fā)揮單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞靶受體的優(yōu)選靶標(biāo) 的功能。提供了用于重組產(chǎn)生本文所述抗體以使它們?cè)诓溉閯?dòng)物乳腺上皮 細(xì)胞中產(chǎn)生的方法。這可在細(xì)胞培養(yǎng)物中完成。這也可通it^轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 的乳中表達(dá)抗體來(lái)完成。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞已被改造為在所述轉(zhuǎn) 基因動(dòng)物(如小鼠或山羊)的乳中表達(dá)所述抗體。例如，此基因的表達(dá)處 于山羊p酪蛋白調(diào)控元件的控制之下。在小鼠和山羊中均已建立了所述 抗體的實(shí)質(zhì)性表達(dá)?？赏ㄟ^(guò)共轉(zhuǎn)染含有H和L鏈的不同構(gòu)建體或者同 時(shí)含有兩條鏈的一種構(gòu)建體來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，兩 種轉(zhuǎn)基因都插入到相同的染色體位點(diǎn)，使得所述基因 一起轉(zhuǎn)移到后代 中，并且蛋白質(zhì)表達(dá)是受到共同調(diào)控。在一些實(shí)施方案中，針對(duì)產(chǎn)生乳 蛋白的各個(gè)乳腺管上皮細(xì)胞對(duì)所述表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化。所述動(dòng)物可以是例如 乳品動(dòng)物(例如山羊和牛)或小鼠。
例如，為了產(chǎn)生含有構(gòu)建體(例如編碼嵌合抗人CD137)的原代細(xì) 胞系以用于通過(guò)核移植產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因山羊，可將重鏈和輕鏈構(gòu)建體轉(zhuǎn)染進(jìn) 原代山羊皮膚上皮細(xì)胞，其進(jìn)行了無(wú)性擴(kuò)增并完全表征以評(píng)估轉(zhuǎn)基因拷 貝數(shù)、轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)完整性和染色體整合位點(diǎn)。本文所使用的"核移植"指 將來(lái)自供體細(xì)胞的核移植到除去細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中的克隆方法。
目的蛋白質(zhì)的編碼序列可通過(guò)篩選基因組材料文庫(kù)或者通過(guò)逆轉(zhuǎn) 錄來(lái)自所選動(dòng)物(如?；蛐∈?的信使RNA得到、從例如NCBI、 Genbank的序列數(shù)據(jù)庫(kù)得到或者通過(guò)獲得抗體序列得到等?？蓪⑺鲂?列克隆進(jìn)合適的質(zhì)粒載體，并在合適的宿主生物(例如大腸桿菌)中擴(kuò) 增。在擴(kuò)增所述栽體之后，可切下DNA構(gòu)建體，將其從載體的其余部分中純化出來(lái)，并引入到可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的表達(dá)載體中.所述轉(zhuǎn) 基因動(dòng)物將具有整合進(jìn)其基因組中的期望的轉(zhuǎn)基因蛋白。
在擴(kuò)增所述載體之后，可將所述DNA構(gòu)建體與合適的5，和3，控制 序列一起切下，將其從載體的其余部分中純化出來(lái)，并用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因 動(dòng)物，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有整合進(jìn)其基因組中的期望的非糖基化相關(guān)轉(zhuǎn) 基因蛋白。相反，使用一些栽體(例如酵母人工染色體(yeast artificial chromosome, YAC))時(shí)，不需要將組裝的構(gòu)建體從栽體中移出；在這 些情況下所擴(kuò)增的栽體可直接用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。所述編碼序列可與 使該編碼序列能夠在非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳中表達(dá)的控制序列有效 連接。
適于將產(chǎn)生導(dǎo)向至轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳中的DNA序列可攜帶來(lái)自天然來(lái) 源乳蛋白的5，啟動(dòng)子區(qū)。由此該啟動(dòng)子處于激素和組織特異性因子的控 制之下，在泌乳的乳腺組織中活性最高。在一些實(shí)施方案中，所述啟動(dòng) 子是山羊P酪蛋白啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子可與指導(dǎo)蛋白質(zhì)前導(dǎo)序列產(chǎn)生的 DNA序列有效連接，所述前導(dǎo)序列指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因蛋白穿過(guò)乳腺上皮細(xì)胞 分泌到乳中。在一些實(shí)施方案中，可添加來(lái)源于天然分泌乳蛋白的3， 序列以改善mRNA的穩(wěn)定性。
本文所使用的"前導(dǎo)序列"或"信號(hào)序列"是編碼蛋白質(zhì)分泌信號(hào)的 核酸序列，其在與編碼轉(zhuǎn)基因蛋白的下游核酸分子有效連接時(shí)指導(dǎo)分 泌。所述前導(dǎo)序列可以是天然人前導(dǎo)序列、人工來(lái)源的前導(dǎo)序列，或者 可得自與用于指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因編碼序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子相同的基因，或者來(lái)自 通常從細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞)中分泌出來(lái)的另一個(gè)蛋白質(zhì)。
在一些實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是乳特異性啟動(dòng)子。本文所使用的 "乳特異性啟動(dòng)子"是天然地指導(dǎo)基因在將蛋白質(zhì)分泌進(jìn)乳的細(xì)胞(如乳 腺上皮細(xì)胞)中表達(dá)的啟動(dòng)子，并包括如酪蛋白啟動(dòng)子如a酪蛋白啟動(dòng) 子(如a S-l酪蛋白啟動(dòng)子和a S2-酪蛋白啟動(dòng)子)、p酪蛋白啟動(dòng)子(如 山羊P酪蛋白基因啟動(dòng)子(DiTullio BIOTECHINOLOGY 10:74-77， 1992)、 Y-酪蛋白啟動(dòng)子、K-酪蛋白啟動(dòng)子、乳清酸性蛋白(whey acidic protein, WAP)啟動(dòng)子(Gorton等，BIOTECHNOLOGY 5: 1183-1187， 1987)、 p-乳球蛋白啟動(dòng)子(Clark等,BIOTECHNOLOGY 7: 487-492， 1989 )和a乳白蛋白啟動(dòng)子(Soulier等，F(xiàn)EBS LETTS. 297:13， 1992 )。此定義中還包括在乳腺組織中特異性激活的啟動(dòng)子，例如小鼠乳腺腫瘤
病毒(mouse mammary tumor virus, MMTV)的長(zhǎng)末端重復(fù)(long terminal repeat, LTR)啟動(dòng)子。
如本文所使用的，當(dāng)編碼序列和調(diào)控序列以下述方式共價(jià)連接時(shí)被 稱(chēng)為"有效連接"，所述方式使得該編碼序列的表達(dá)或轉(zhuǎn)錄處于該調(diào)控序 列的影響或控制之下。為了使編碼序列翻譯成功能性蛋白質(zhì)，將編碼序 列與調(diào)控序列有效連接。如果誘導(dǎo)5，調(diào)控序列中的啟動(dòng)子引起編碼序列 轉(zhuǎn)錄并且兩個(gè)DNA序列間的連接性質(zhì)不出現(xiàn)下述情況，那么兩個(gè)DNA 序列被稱(chēng)為有效連接，所述情況為(1)引入移碼突變，(2)干擾啟動(dòng) 子區(qū)指導(dǎo)編碼序列轉(zhuǎn)錄的能力，或者(3)干擾相應(yīng)RNA轉(zhuǎn)錄物翻譯成 蛋白質(zhì)的能力。因此，如果啟動(dòng)子區(qū)能夠?qū)崿F(xiàn)DNA序列的轉(zhuǎn)錄以使所 得轉(zhuǎn)錄物可翻譯成期望的蛋白質(zhì)或多肽，則所述啟動(dòng)子區(qū)與編碼序列有 效連接，
本文所使用的"載體"可以是多種核酸中的任一種，在所述核酸中可 通過(guò)限制性處理及連接來(lái)插入期望的序列，用于在不同遺傳環(huán)境之間進(jìn) 行運(yùn)送或者用于在宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。盡管RNA栽體也可以使用， 但是載體通常由DNA組成.載體包括但不限于質(zhì)粒和噬粒.克隆載體 是能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制的栽體，并且進(jìn)一步表征為一個(gè)或多個(gè)核酸內(nèi) 切酶限制性位點(diǎn)，在這些位點(diǎn)處可以以預(yù)定的方式切割所述載體，并可 連接進(jìn)期望的DNA序列，以使新的重組載體保留在宿主細(xì)胞中復(fù)制的 能力。在質(zhì)粒的情況下，所期望序列的復(fù)制可隨著質(zhì)粒在宿主細(xì)菌中拷 貝數(shù)的增加而發(fā)生許多次，或者可隨著宿主通過(guò)有絲分裂增殖而每個(gè)宿 主僅發(fā)生一次。在噬菌體的情況下，復(fù)制可在溶解期主動(dòng)發(fā)生，或者在 溶原期被動(dòng)發(fā)生.表達(dá)載體是可通過(guò)限制性處理和連接將期望的DNA 序列插入其中，以使所述DNA序列與調(diào)控序列有效連接并可表達(dá)為 RNA轉(zhuǎn)錄物的載體。載體可另外含有一個(gè)或多個(gè)適用于鑒定細(xì)胞是否 已被所述栽體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的標(biāo)記序列。標(biāo)記包括如編碼提高或降低對(duì)抗 生素或其它化合物的抗性或敏感性的蛋白質(zhì)的基因、編碼其活性可通過(guò) 本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定檢測(cè)的酶(例如p半乳糖苷酶或堿性磷酸酶)的 基因，以及可見(jiàn)地影響所轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞、宿主、集落或菌斑表型的基 因。優(yōu)選栽體是能夠自主復(fù)制并表達(dá)與其有效連接的DNA區(qū)段中存在 的結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)物的栽體。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因抗體及其變體和片段的方法， 所述方法包括在非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳中表達(dá)由核酸構(gòu)建體編碼的
轉(zhuǎn)基因抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生本發(fā)明抗體的方法包括
(a) 用編碼期望的轉(zhuǎn)基因抗體的轉(zhuǎn)基因DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染
非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞；
(b ) 選擇其基因組中已經(jīng)插入所述轉(zhuǎn)基因DNA構(gòu)建體的
細(xì)胞；和
(c) 實(shí)施第一次核移植操作以產(chǎn)生就所期望的轉(zhuǎn)基因抗 體而言為雜合的、并能將其在乳中表達(dá)的非人轉(zhuǎn)基因 哺乳動(dòng)物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括
(a) 提供經(jīng)改造而表達(dá)抗體的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，
(b) 在所述非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳中表達(dá)所述抗體；和
(c) 分離乳中所表達(dá)的所述抗體。
這些方法還可包括誘導(dǎo)泌乳的步驟以及確定所得抗體的ADCC活 性的步驟。所述方法還可包括額外的分離和/或純化步踝。所述方法還 可包括將所得抗體的ADCC活性與細(xì)胞培養(yǎng)物中所產(chǎn)生的抗體進(jìn)行比 較的步驟。在一些實(shí)施方案中，可將所得抗體的ADCC活性與非乳腺 上皮細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體進(jìn)行比較。這些細(xì)胞可以是細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞。 用于評(píng)估所述抗體ADCC活性的實(shí)驗(yàn)技術(shù)可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 或本文提供的任何技術(shù)，例如下文實(shí)施例中的技術(shù)。在一些實(shí)施方案中， 可通過(guò)從如本文所述產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳中或者從所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 的后代收集抗體來(lái)獲得所述抗體。
在一些實(shí)施方案中，通過(guò)至少一個(gè)p酪蛋白啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)編碼所期 望抗體(或抗體融合多肽)的構(gòu)建體。在另一些實(shí)施方案中，所述非人 轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物是有蹄動(dòng)物。在又一些實(shí)施方案中，所述非人轉(zhuǎn)基因哺 乳動(dòng)物是山羊。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物產(chǎn)生的抗體以至少1克/ 升所產(chǎn)乳的水平產(chǎn)生。
也可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生能夠重組表達(dá)抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物
(參見(jiàn)如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，945，577)。適于轉(zhuǎn)基因表達(dá)的動(dòng)物包括但不限于 山羊、綿羊、野牛、駱駝、牛、豬、兔、水牛、馬、大鼠、小鼠或美洲 駝。合適的動(dòng)物還包括牛、山羊、綿羊和豬，其分別涉及多個(gè)物種的牛、 山羊、綿羊和豬。合適的動(dòng)物還包括有蹄動(dòng)物。本文所使用的"有蹄動(dòng) 物，，是或者涉及有蹄的通常食草的四足哺乳動(dòng)物，其包括但不限于綿羊、 豬、山羊、牛和馬.在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)用含有重鏈和輕鏈的獨(dú)立 載體共轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生所述動(dòng)物。然后將這些細(xì)胞用于核移植?；?br> 者，如果使用顯微注射產(chǎn)生所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，共注射所述構(gòu)建體。如果 在一個(gè)實(shí)施方案中需要改變糖基化水平，那么可使用定點(diǎn)誘變。
克隆將得到多種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，每種能夠產(chǎn)生抗體或其它目的基因 構(gòu)建體。生產(chǎn)方法包括使用所克隆的動(dòng)物及其后代。在一些實(shí)施方案中， 所克隆動(dòng)物是豬、?；蛐∈?。克隆還包括胚胎核移植、核移植、組織和 器官移植以及產(chǎn)生嵌合體后代。
克隆方法的一個(gè)步驟包括將含有目的轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞基因組移植到 去掉核的卵母細(xì)胞中。本文所使用的"轉(zhuǎn)基因"指任一段人工插入到細(xì)胞 或其祖先中的核酸分子，并且其成為細(xì)胞所發(fā)育成的動(dòng)物基因組的一部 分。這樣的轉(zhuǎn)基因可包括對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來(lái)說(shuō)部分或完全外源(即外來(lái)的) 的基因，或者可代表與動(dòng)物內(nèi)源基因具有同一性的基因。
卵母細(xì)胞的合適的哺乳動(dòng)物來(lái)源包括山羊、綿羊、牛、豬、兔、 豚鼠、小鼠、倉(cāng)鼠、大鼠、非人靈長(zhǎng)類(lèi)等。優(yōu)選地，卵母細(xì)胞獲得自有 蹄動(dòng)物，最優(yōu)選山羊或牛。分離卵母細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域公知的。基本 上，所述方法包括從哺乳動(dòng)物(例如山羊)的卵巢或生殖道分離卵母細(xì) 胞。方便可用的有蹄動(dòng)物卵母細(xì)胞來(lái)源是激素誘導(dǎo)的雌性動(dòng)物。為了成 功應(yīng)用例如遺傳工程、核移植和克隆的技術(shù)，卵母細(xì)胞在其用作核移植 的受體細(xì)胞之前和由精細(xì)胞受精發(fā)育成胚胎之前可以在體內(nèi)成熟。已在 體內(nèi)成熟的減數(shù)分裂II期卵母細(xì)胞已成功地用于核移植技術(shù)?；旧?， 在發(fā)情期開(kāi)始后數(shù)小時(shí)或者注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, hCG)或類(lèi)似激素后數(shù)小時(shí)，通過(guò)手術(shù)從非超排卵或超排卵動(dòng)物中收集成熟的減數(shù)分裂II期卵母細(xì)胞。
用于預(yù)測(cè)重組蛋白在乳腺中表達(dá)的質(zhì)和量的一個(gè)工具是通過(guò)誘導(dǎo)
泌乳來(lái)實(shí)現(xiàn)(EbertKM, 1994)。誘導(dǎo)泌乳允許從轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的早期開(kāi) 始表達(dá)和分析蛋白質(zhì)，而不是從至少一年后懷孕所導(dǎo)致的笫一次天然泌 乳開(kāi)始.誘導(dǎo)泌乳可通過(guò)激素或手動(dòng)進(jìn)行。多種泌乳操作(尤其是激素 誘導(dǎo)泌乳)有可能影響乳腺中糖基化轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。除了 NenGc 含量之外，來(lái)自多個(gè)所克隆動(dòng)物泌乳樣品的N連接寡糖是相似的。來(lái)自 天然泌乳的轉(zhuǎn)基因抗體生產(chǎn)中的碳水化合物含有比其它泌乳操作更多 量的NeuGc，盡管來(lái)自不同泌乳的樣品中總唾液酸含量相當(dāng)。類(lèi)似地， 山羊乳中產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因蛋白看來(lái)也由各個(gè)蛋白質(zhì)種類(lèi)的復(fù)雜混合物組 成(Zhou， 2005)。
在體外分析從來(lái)自每個(gè)品系的合并乳樣品中分離的A蛋白純化的 IgG級(jí)分，以表征抗體結(jié)合特異性和親和力以及T細(xì)胞增殖的劑量依賴(lài) 性增強(qiáng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，是原始GW mAb的乳來(lái)源糖基化和非糖 基化嵌合制備物。
建立了具有正常生長(zhǎng)和繁殖特征以及合理的生物活性抗體水平 (>lmg/ml)的健康轉(zhuǎn)基因小鼠。在帶有給定構(gòu)建體的小鼠生產(chǎn)可以是 在如山羊或牛的物種中大規(guī)模產(chǎn)生的前提。嵌合抗CD137的產(chǎn)生和表 征引起在小鼠模型中測(cè)試一種或多種這些制備物以證明體內(nèi)抗腫瘤活 性。其后，糖基化和非糖基化嵌合抗體構(gòu)建體均用于產(chǎn)生在其乳中表達(dá) 抗CD137的轉(zhuǎn)基因山羊。
通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)修飾動(dòng)物基因組的能力為生產(chǎn)具有修飾的糖基化 模式的重組蛋白提供了新的替代方法。在轉(zhuǎn)基因農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物的乳中產(chǎn)生人 重組藥物解決了許多與微生物生物反應(yīng)器相關(guān)(例如缺乏翻譯后修飾、 不正確的蛋白質(zhì)折疊、高純化成本)或與動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器相關(guān)(例 如高成本、培養(yǎng)基昂貴、低產(chǎn)率)的問(wèn)題。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明 包括抗體的轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)在優(yōu)化抗體分子糖基化模式的期望基因?yàn)榧兒?的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳中的用途.
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，靶分子的糖基化模式可以例如通 過(guò)改變非人哺乳動(dòng)物的喂食來(lái)修飾(Kerr等，2003)。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)抗體的方法，其包括從經(jīng)改造以在其乳中表 達(dá)所述抗體的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的乳中收集所述抗體，以及測(cè)定所述抗體
的ADCC活性。在一些實(shí)施方案中，將其ADCC活性與細(xì)胞培養(yǎng)物中 所表達(dá)抗體的ADCC活性進(jìn)行比較。在另一個(gè)實(shí)施方案中，從經(jīng)改造 以表達(dá)所述抗體的培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞中收集抗體，并測(cè)定所述抗體的 ADCC活性。在一些實(shí)施方案中，將其ADCC活性與細(xì)胞培養(yǎng)物中所 表達(dá)抗體的ADCC活性進(jìn)行比較。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng) 物中的細(xì)胞是非乳腺上皮細(xì)胞。用于評(píng)估ADCC活性的測(cè)定在下文實(shí) 施例中提供，并且也是本領(lǐng)域已知的。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)"基本上純的"指蛋白質(zhì)基本不含其它物質(zhì)，其 程度使其預(yù)期用途可行且適當(dāng)。特別地，所述蛋白質(zhì)是充分純的并且充 分地不含宿主細(xì)胞的其它生物成分，以使得可用于例如蛋白質(zhì)測(cè)序或生 產(chǎn)藥物制劑。因此，在一些實(shí)施方案中，所述抗體是基本上純的。
本文中就多肽而言所使用的"分離的"指從其天然環(huán)境中分離，并 且以足以允許其鑒定或應(yīng)用的量存在。當(dāng)指蛋白質(zhì)或多肽時(shí)，分離的意 為，例如(i)通過(guò)表達(dá)克隆選擇性產(chǎn)生或者(ii)通過(guò)如層析或電泳 進(jìn)行純化。分離的蛋白質(zhì)或多肽可以是(但不必然是)基本上純的。由 于在藥物制劑中分離的多肽可以與可藥用栽體混合，因此所述多肽可只 占該制劑的一小部分重量百分比。無(wú)論怎樣，所述多肽是都分離的，因 為它已經(jīng)與在活系統(tǒng)中可與之相關(guān)的物質(zhì)分離開(kāi)，即從其它蛋白質(zhì)中分 離。因此，在一些實(shí)施方案中，所述抗體是分離的。
所述抗體表現(xiàn)出增強(qiáng)的ADCC活性，ADCC活性是在治療中成功 應(yīng)用單克隆抗體的重要因素。同時(shí)結(jié)合本發(fā)明抗體的恒定或Fc區(qū)可誘 導(dǎo)生物應(yīng)答。這些應(yīng)答之一是在靶細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或ADCC. ADCC通過(guò)Fc區(qū)與Fcy受體的結(jié)合起作用，所述受體位于單核細(xì)胞、 巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的表面。 一旦結(jié)合所述受體，這些細(xì)胞就被活基。
因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及具有增強(qiáng)的ADCC活性并因此具 有增強(qiáng)治療特性的抗體制劑。所提供的組合物可用于治療ADCC活性 會(huì)賦予至少某些醫(yī)學(xué)益處的受試者。因此，所提供的組合物可用于治療患病的受試者.在一些實(shí)施方案中，所述抗體可用于通過(guò)施用該抗體來(lái)
增強(qiáng)受試者中的ADCC活性，從而治療受試者。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)"治療"包括阻止性(例如預(yù)防性)和姑息性治療。
所提供組合物可提供有益療效的具體適應(yīng)癥包括癌癥，例如對(duì)實(shí) 體瘤、黑色素瘤以及乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、腎癌、前列腺癌和肺癌 的有效免疫調(diào)節(jié)治療。
本文所使用的"癌癥"指干擾身體器官和組織的正常功能的細(xì)胞非 受控生長(zhǎng)。從原發(fā)部位轉(zhuǎn)移并波及重要器官的癌癥可通過(guò)患病器官的功 能性衰退最終導(dǎo)致該受試者死亡.癌癥包括何杰金淋巴瘤、非何杰金淋 巴瘤、萆樣肉芽腫/塞扎里綜合征、組織細(xì)胞增多病X、慢性淋巴細(xì)胞白 血病、毛細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髄瘤、Waldenstrom's巨球蛋白血癥、 冷球蛋白血癥和重鏈病.造血系統(tǒng)癌癥(例如白血病)能夠在竟?fàn)幹袆?過(guò)受試者中正常的造血對(duì)應(yīng)物，由此導(dǎo)致造血障礙(為貧血、血小板減 少和嗜中性粒細(xì)胞減少的形式)，最終導(dǎo)致死亡。
轉(zhuǎn)移是由于癌細(xì)胞從原發(fā)腫瘤傳播到身體其它部分而產(chǎn)生的不同 于原發(fā)腫瘤部位的癌細(xì)胞區(qū)域。在診斷原發(fā)腫瘤塊時(shí)，可監(jiān)測(cè)受試者中 轉(zhuǎn)移的存在情況。除了監(jiān)測(cè)具體癥狀以外，最經(jīng)常通過(guò)單獨(dú)或聯(lián)合^^用 磁共振成像(MRI)掃描、計(jì)算機(jī)斷層(CT)掃描、血及血小板計(jì)數(shù)、 肝功能研究、胸部X射線(xiàn)和骨掃描來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)移。
本文所使用的癌癥包括下述癌癥類(lèi)型乳腺癌、膽管癌、膀胱癌、 腦癌(包括成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和成神經(jīng)管細(xì)胞瘤)、宮頸癌、絨膜癌、結(jié)腸 癌、子宮內(nèi)膜癌、食管癌、胃癌、白血病、血液瘤(包括急性淋巴細(xì)胞 白血病和髓性白血病)、T細(xì)胞急性淋巴母細(xì)胞白血病/淋巴瘤、毛細(xì)胞 白血病、慢性髄性白血病、多發(fā)性骨髄瘤、AIDS相關(guān)白血病和成人T 細(xì)胞白血病淋巴瘤、上皮內(nèi)瘤(包括鮑恩病和佩吉特病)、肝癌、肺癌、 淋巴瘤(包括何杰金病和淋巴細(xì)胞性淋巴瘤)、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、口癌(包 括扁平上皮細(xì)胞癌)、卵巢癌(包括發(fā)生于上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、生殖 細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞的癌)、胰腺癌、前列腺癌、直腸癌、肉瘤(包括平 滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤和骨肉瘤)、皮膚癌(包括黑色素瘤、卡波西肉瘤、基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌)、睪丸癌(包括 生殖細(xì)胞瘤例如精原細(xì)胞瘤、非精原細(xì)胞瘤(畸胎瘤、絨膜癌)、基質(zhì)
癌和生殖細(xì)胞癌；胸腺癌(包括胸腺腺癌和髓癌)以及腎癌(包括腺癌 和腎母細(xì)胞瘤)。其它癌癥是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括肥大細(xì)胞瘤、 胸腺瘤、漿細(xì)胞瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤。
本發(fā)明的組合物也可用于治療免疫疾病。"免疫疾病"包括成人呼 吸窘迫綜合征、動(dòng)脈硬化、哮喘、靜脈硬化、膽嚢炎、硬化病、克羅恩 病、糖尿病、肺氣肺、嗜酸性粒細(xì)胞增多癥(hypereosinophilia)、炎癥、 腸易激綜合征、多發(fā)性硬化、重癥肌無(wú)力、心肌炎或心包炎、骨關(guān)節(jié)炎、 骨質(zhì)疏松癥、胰腺炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病和結(jié)腸炎(參見(jiàn)如美國(guó) 乂>開(kāi)專(zhuān)利申請(qǐng)2003/0175754 )。
本發(fā)明的組合物還可用于治療自身免疫病，包括但不限于系統(tǒng)性 紅斑狼瘡、狼瘡腎炎、糖尿病、炎性腸病、乳糜瀉、自身免疫性甲狀腺 疾病、阿狄森氏病、Sjogren綜合征、小舞蹈癥(Sydenham's chorea )、 高安動(dòng)脈炎、韋氏肉芽肝病、自身免疫性胃炎、自身免疫性肝炎、皮膚 自身免疫病、自身免疫性擴(kuò)張性心肌病、多發(fā)性硬化、心肌炎、重癥肌 無(wú)力、惡性貧血、多肌痛、銀屑病、急進(jìn)性腎小球腎炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎、潰瘍性結(jié)腸炎、脈管炎、肌肉自身免疫病、睪丸自身免疫病、卵巢 自身免疫病和眼自身免疫病。
在另 一個(gè)實(shí)施方案中，具有增強(qiáng)ADCC活性的抗體在治療自身免 疫所產(chǎn)生的腦脊髄炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及其它疾病方面是有效的。
本文所提供的抗體可與其他治療劑組合?？赏瑫r(shí)或依次施用所述 抗體和其它治療劑。當(dāng)所述其它治療劑同時(shí)施用時(shí)，它們可以在相同或
不同制劑中施用，但是在同一時(shí)間施用。當(dāng)所述其它治療劑與所述抗體 的施用在時(shí)間上分開(kāi)時(shí)，所述其它治療劑彼此依次施用，并與所述抗體 依次施用。這些化合物的施用之間的時(shí)間間隔可以是數(shù)分鐘或者可以更 長(zhǎng)。
其它治療劑包括例如但不限于抗癌療法。抗癌療法包括癌癥藥物、 放射和手術(shù)操作。本文所使用的"癌癥藥物，，指出于治療癌癥的目的而施 用于受試者的藥劑。本文所使用的"治療癌癥"包括預(yù)防癌癥發(fā)生、減少癌癥癥狀和/或抑制已形成癌癥的生長(zhǎng)。在其他一些方面，對(duì)有發(fā)生癌 癥風(fēng)險(xiǎn)的受試者施用所述癌癥藥物，以降低發(fā)生癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。本文描述 了用于治療癌癥的多種藥物類(lèi)型。就本^L明書(shū)而言，癌癥藥物分為化療 劑、免疫治療劑、癌癥疫苗、激素治療和生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑。
化療劑可選自氨甲喋呤、長(zhǎng)春新堿、阿霉素、順鉑、不含糖的氯
乙基硝基脲類(lèi)、5-氟尿嘧啶、絲裂霉素C、博來(lái)霉素、多柔比星、達(dá)卡 巴嗪、紫杉醇、fragyline、葡甲胺GLA、戊柔比星、卡莫司汀和聚苯丙 生、MMI270、 BAY 12-9566、 RAS法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、法呢基轉(zhuǎn)移 酶抑制劑、MMP、 MTA/LY231514、 LY264618/洛美曲索、Glamolec、 CI-994、 TNP-470、和美新/托泊替康、PKC412、伐司樸達(dá)/PSC833、米 托蒽醌/Mitroxantrone、 Metaret/蘇拉明、巴馬司他、E7070、 BCH-4556、 CS-682、 9國(guó)AC、 AG3340、 AG3433、 Incel/VX-710、 VX-853、 ZD0101、 ISI641、 ODN698、 TA 2516/Marmistat、 BB2516/Marmistat、 CDP845、 D2163 、 PD183805 、 DX8951f 、 Lemonal DP 2202 、 FK 317 、 Picibanil/OK-432、 AD32/戊柔比星、美他特龍/鍶衍生物、泰道/替莫唑 胺、Evacet/脂質(zhì)體多柔比星、Yewtaxan/紫杉醇、泰素/紫杉醇、希羅達(dá) /卡培他濱、氟鐵龍/去氧氟尿苷、Cyclopax/口服紫杉醇、口服紫杉烷、 SPU隱077/順鈿、HMR 1275/flavopirido1、 CP-358 (774)/EGFR、 CP-609 (754)/RAS癌基因抑制劑、BMS-182751/口服鉑、UFT(替加氟/尿嘧啶)、 爾吉咪唑/左旋咪唑、恩尿嘧咬(Eniluracil) /776C85/5FU增強(qiáng)劑、開(kāi) 普拓/左旋咪峻、Camptosar/伊立替康、Tumodex/Ralitrexed、 Leustatin/ 克拉屈濱、Paxex/紫杉醇、Doxil/脂質(zhì)體多柔比星、Caelyx/脂質(zhì)體多柔 比星、Fludara/氟達(dá)拉濱、Pharmarubicin/表柔比星、DepoCyt、 ZD1839、 LU 79553/二萘二亞胺(Bis國(guó)Naphtalimide )、 LU 103793/多拉司他汀、 Caetyx/脂質(zhì)體多柔比星、Gemzar/吉西他濱、ZD 0473/Anormed、 YM 116、碘粒、CDK4和CDK2抑制劑、PARP抑制劑、D4809/Dexifosamide、 Ifes/Mesnex/異環(huán)磷酰胺、威猛/替尼泊苦、伯爾定/卡鈿、Plantinol/順鉑、 Vepeside/依托泊苷、ZD 9331、泰索帝/多西紫杉醇、鳥(niǎo)嘌呤阿拉伯糖苷 前藥、紫杉烷類(lèi)似物、亞硝基脲、烷化劑例如美法侖和環(huán)磷酰胺、氨魯 米特、門(mén)冬酰胺酶、白消安、卡鉑、苯丁酸氮芥、鹽酸阿糖胞苷、放線(xiàn) 菌素、鹽酸柔紅霉素、雌莫司汀磷酸鈉、依托泊苷(VP16-213)、氟尿嘧 咬脫氧核苷、氟尿嘧啶(5-FU)、氟他胺、羥基脲(hydroxycarbamide)、異環(huán)磷酰胺、干擾素a-2a、 a-2b、乙酸亮丙瑞林(LHRH-釋放因子類(lèi)似 物)、洛莫司汀(CCNU)、鹽酸氮芥(氮芥子氣)、巰嘌呤、美司鈉、米托 坦(o.p，-DDD)、鹽酸米托蒽醌、奧曲肽、普卡霉素、鹽酸丙卡巴肼、鏈 佐星、檸檬酸他莫昔芬、疏鳥(niǎo)嘌呤、塞替派、硫酸長(zhǎng)春堿、安吖啶 (m-AMSA)、阿扎胞苷、促紅細(xì)胞生成素、六曱嗜胺(HMM)、白介素2、 米托胍腙(甲基-GAG;甲基乙二醛丙酮雙脒腙；MGBG)、噴司他丁(2'脫 氧助間型霉素)、司莫司汀(甲基-CCNU)、替尼泊苷(VM-26)和硫酸長(zhǎng)春 地辛，但不限于此。
免疫治療劑可選自Ributaxin、赫賽、汀、Quadramet、 Panorex、 IDEC國(guó)Y2B8、 BEC2、 C225、 Oncolym、 SMART M195、 ATRAGEN、 Ovarex、百克沙、LDP國(guó)03、 ior t6、 MDX誦210、 MDX-ll、 MDX國(guó)22、 OV103、 3622W94、抗VEGF 、賽尼哌、MDX國(guó)220 、 MDX-447 、 MELIMMUNE-2 、 MELIMMUNE畫(huà)1 、 CEACIDE 、 Pretarget 、 NovoMAb-G2、 TNT、 GIiomab曙H、 GNI-250、 EMD國(guó)72000、 LymphoCide、 CMA676、 Monopharm-C、 4B5、 ioregf.r3、 iorc5、 BABS、抗FLK-2、 MDX畫(huà)260、 ANA Ab、 SMART 1D10 Ab、 SMART ABL 364 Ab和 ImmuRAIT-CEA,但不限于此。
癌癥疫苗可選自EGF、抗獨(dú)特型癌癥疫苗、Gp75抗原、GMK黑 色素瘤疫苗、MGV神經(jīng)節(jié)苷脂綴合疫苗、Her2/neu、 Ovarex、 M-Vax、 O國(guó)Vax、 L-Vax、 STn-KHL theratope、 BLP25 (MUC-1)、脂質(zhì)體獨(dú)特型 疫苗、Melacine、肽抗原疫苗、毒素/抗原疫苗、基于MVA的疫苗、PACIS、 BCG疫苗、TA國(guó)HPV、 TA國(guó)CIN、 DISC病毒和ImmuCyst/TheraCys, 但不限于此。
所述其它的治療劑還可以是免疫調(diào)節(jié)劑?？墒┯玫拿庖哒{(diào)節(jié)劑實(shí) 例有IL國(guó)1、 IL-2、 IL國(guó)3、 IL-6、 IL畫(huà)IO、 IL- 12、 IL- 18、 IL畫(huà)21、千擾素、 紫杉醇、TNF-a或其組合，但不限于此。本發(fā)明的抗體還可與免疫調(diào)節(jié)劑 和/或其它的抗癌劑(例如IL-21、 IL-12和/或曲妥珠單抗)聯(lián)合施用。
有效量的所提供組合物是有用的。術(shù)語(yǔ)"有效量"指實(shí)現(xiàn)期望的生 物效應(yīng)所必需或足夠的量。結(jié)合本文所提供的教導(dǎo)，通過(guò)在多種活性化合 物和權(quán)重因子(例如效力、相對(duì)生物利用率、患者體重、不良副作用的嚴(yán) 重程度和優(yōu)選的給藥模式)之間進(jìn)行選擇，可設(shè)計(jì)出不帶來(lái)顯著毒性但仍 有效治療特定受試者的有效的預(yù)防性或治療性治療方案.任一具體應(yīng)用的有效量可才艮據(jù)以下因素而變化，例如所治療的疾病或病癥、所施用的具體 組合物、受試者的身材或者疾病或病癥的嚴(yán)重程度。本領(lǐng)域技術(shù)人員可經(jīng) 驗(yàn)性地確定具體組合物的有效量，而不需要過(guò)度實(shí)驗(yàn).一:fe優(yōu)選使用最大 劑量，即才艮據(jù)一些醫(yī)學(xué)判斷的最大安全劑量。可以考慮每天多次給藥以達(dá) 到合適的化合物全身水平.合適的全身水平可通過(guò)例如測(cè)量患者的藥物峰 值或持續(xù)血漿水平來(lái)確定。在本文中"劑量"和"給藥"可互換使用。
治療有效量的確定具g決于例如該藥劑的毒性和效力的因素?？?使用本領(lǐng)域乂i^P的方法確定毒性.可使用同樣的指導(dǎo)確定效力。因此，藥 用有效量是臨床醫(yī)師認(rèn)為具有可容忍毒性且有效的量。例如，可通過(guò)測(cè)量 靶組織處T淋巴細(xì)胞細(xì)胞毒性的誘導(dǎo)或顯著謙導(dǎo)或者把組織量的減小來(lái)測(cè) 定療效。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，預(yù)計(jì)合適的劑量為約1 mg/kg至10 mg/kg。
根據(jù)一些涉及對(duì)需要治療的受試者施用治療有效量的本發(fā)明抗體的 實(shí)施方案，"治療有效"表示抑制或逆轉(zhuǎn)疾病狀況(例如減少或抑制癌生長(zhǎng)) 所需的抗體量。 一些方法考慮與已知的癌癥藥物或療法(如化療，優(yōu)選4吏 用本文列出的化合物類(lèi)型，或放射)的組合療法。所述患者可以是人或非 人動(dòng)物。當(dāng)患有特征為促進(jìn)癌癥維持或增殖的受體水平提高的癌癥時(shí)，患 者通常是需要治療的。
一般地，活性化合物的每日經(jīng)口劑量將是約每天0.01亳克/kg至1000 亳克/kg。預(yù)計(jì)每日 一次或多次施用的0.5至50亳克/kg劑量會(huì)獲得期望的 結(jié)果。可適當(dāng)調(diào)整劑量以實(shí)現(xiàn)期望的藥物水平(局部或全身)，這取決于 給藥模式。例如，預(yù)計(jì)靜脈內(nèi)給藥將的每日劑量可低一個(gè)至幾個(gè)數(shù)量級(jí)。 如果在此劑量下受試者的應(yīng)答不足，那么可使用程度為患者的耐性所允許 的更高劑量(或者通過(guò)更為局部的不同遞送途徑實(shí)現(xiàn)的更高有效劑量)。 考慮每日多次給藥以iiJ，J合適的抗體全身水平。
在一些實(shí)施方案中，所提供的組合物用于體內(nèi)應(yīng)用。取決于預(yù)期 的體內(nèi)給藥模式，所使用的組合物劑型可以是固體、半固體或液體，例 如片劑、丸劑、粉劑、膠嚢劑、凝膠劑、軟骨劑、液體劑、混懸劑等。 優(yōu)選所述組合物以適于單次施用精確劑量的單位劑型施用。根據(jù)所期望 的制劑，所述組合物還可包含可藥用栽體或稀釋劑，其定義為通常用于 配制用于動(dòng)物或人類(lèi)施用的藥物組合物的水基載體。選擇所述稀釋劑以 使其不影響目的人重組蛋白的生物活性.這些稀釋劑的實(shí)例是蒸餾水、生理鹽水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和Hank，s溶液?？墒褂孟嗤♂?劑來(lái)重建凍干的目的人重組蛋白。另外，所述藥物組合物還可包含其它 藥用劑(medicianl agent )、藥劑(pharmaceutical agent )、栽體、佐劑、 非毒性、非治療性、非免疫原性的穩(wěn)定劑等等。這些稀釋劑或載體的有 效量是有效獲得就組分的溶解度、生物活性等方面而言可藥用制劑的 量。在一些實(shí)施方案中，本文提供的組合物是無(wú)菌的。
本文的組合物可經(jīng)口、胃腸外或局部施用以及全身性形式施用于 人，用于抗黑色素瘤、抗淋巴瘤、抗白血病和抗乳腺癌治療.本發(fā)明的 組合物還可用于治療多種自身免疫病，例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性狼 瘡、多發(fā)性硬化等。
在體內(nèi)治療過(guò)程中的施用可以通過(guò)任意種途徑實(shí)現(xiàn)，包括胃腸外 和經(jīng)口，但是優(yōu)選胃腸外?？墒褂脟皟?nèi)、靜脈內(nèi)、鞘內(nèi)和腹膜內(nèi)途徑的 施用， 一般優(yōu)選靜脈內(nèi).本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，給藥途徑根據(jù)所治療的 疾病而變4匕。
對(duì)于治療應(yīng)用，可通過(guò)任何將所述組合物遞送到預(yù)期表面的方式 對(duì)受試者施用有效量的所述組合物?？赏ㄟ^(guò)任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的 方式完成本發(fā)明藥物組合物的給藥。優(yōu)選的給藥途徑包括但不限于經(jīng) 口、胃腸外、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、舌下、氣管內(nèi)、吸入、眼、陰道和直腸的給 藥。
當(dāng)需要全身遞送時(shí)，可將所述化合物配制成用于通過(guò)注射(例如 通過(guò)推注或連續(xù)輸注)進(jìn)行胃腸外給藥。用于注射的制劑可以是單位劑 型，例如在安瓿中或在多劑量容器中，其中加入了防腐劑。所述組合物 可采取如混懸液、溶液或者油載體或水載體乳劑的形式，并可含有配制 劑，例如助懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。
用于胃腸外給藥的藥物制劑包括水溶性形式活性化合物的水溶 液。此外，活性化合物的混懸液可制備成合適的油性注射混懸液。合適 的親脂性溶劑或載體包括脂肪油(例如芝麻油)或合成的脂肪酸酯(例 如油酸乙酯或甘油三酸酯)或脂質(zhì)體。水性注射混懸液可含有增加混懸 液粘度的物質(zhì)，例如羧曱基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。任選地，所述 混懸劑還可含有合適的穩(wěn)定劑或增加所述化合物溶解度的物質(zhì)，以允許 制備更高濃度的溶液?；蛘?，所述活性化合物可以是在使用前與合適載體(例如無(wú)菌無(wú) 熱原的水)混合的粉末形式。
對(duì)于經(jīng)口給藥，藥物組合物可以采取片劑或膠嚢劑的形式，其通 過(guò)常規(guī)手段使用可藥用賦形劑來(lái)制備，所述賦形劑為例如粘合劑(如預(yù)
糊化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基曱基纖維素)；填充劑(如乳 糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤(rùn)滑劑(如硬脂酸鎂、滑石或硅石)；崩 解劑(如土豆淀粉或淀粉乙二醇酸鈉)；或潤(rùn)濕劑(如月桂基硫酸鈉)， 所述片劑可通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行包衣.用于經(jīng)口給藥的液體制劑 可采取例如溶液劑、糖漿劑或混懸劑的形式，或者它們可在使用前與水 或其它合適載體重建的干燥產(chǎn)物。這些液體制劑可使用可藥用添加劑通 過(guò)常規(guī)手段制備，所述添加劑為例如助懸劑(如山梨醇糖漿、纖維素衍 生物或氫化可食用脂)；乳化劑(如卵磷脂或阿拉伯膠)；非水載體(如 杏仁油、油性酯、乙醇或分級(jí)植物油)和防腐劑(如曱基或丙基對(duì)羥基 苯甲酸或山梨酸)。所述制備物在適當(dāng)時(shí)還可含有緩沖鹽、芳香劑、著 色劑和甜味劑。
可適當(dāng)?shù)嘏渲朴糜诮?jīng)口給藥的制劑，以提供活性化合物的受控釋 放。對(duì)于口給藥，所述組合物可采取以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑的形 式。
對(duì)于經(jīng)口給藥，例如可通過(guò)將活性抗體與本領(lǐng)域公知的可藥用載 體組合來(lái)簡(jiǎn)單地配制所述抗體。這些載體能夠?qū)⒈景l(fā)明配制成片劑、丸 劑、糖錠劑、膠嚢劑、液體劑、凝膠劑、糖漿劑、骨劑、混懸劑等，以 用于被所治療的受試者經(jīng)口消化?？勺鳛楣腆w賦形劑獲得用于經(jīng)口使用 的藥物制劑，任選地粉碎所得混合物，并且需要時(shí)在加入合適的輔料后 加工顆粒混合物，以獲得片劑或糖錠劑芯。具體地，合適的賦形劑是填 充劑，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素制劑，例如 玉米淀粉、小麥淀粉、水稻淀粉、土豆淀粉、明膠、黃芪膠、曱基纖維 素、羥丙基曱基纖維素、羧曱基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。 需要時(shí)可加入崩解劑，例如交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其 鹽，例如海藻酸鈉。任選地，經(jīng)口制劑還可在鹽水或緩沖液(即用于中 和內(nèi)在酸性條件的EDTA)中配制，或者可在無(wú)任何載體的情況下施用。
具體地，還考慮了所述抗體的經(jīng)口劑型。可對(duì)所述組分進(jìn)行化學(xué) 修飾，以使所述抗體的經(jīng)口遞送是有效的. 一般地，所考慮化學(xué)修飾是在抗體上附著至少一個(gè)部分，其中所述部分允許(a)抑制蛋白水解以 及(b)從胃或腸攝入到血流中。還期望所述抗體的總穩(wěn)定性提高，以 及在身體中的循環(huán)時(shí)間提高。這些部分的實(shí)例包括聚乙二醇、乙二醇 和丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯 烷酮和聚脯氨酸。Abuchowski和Davis， 1981， "Soluble Polymer-Enzyme Adducts" , Enzymes as Drugs, Hocenberg 和 Roberts 編輯, Wiley-Interscience, New York, NY， 367-383頁(yè)；Newmark,等，1982， J. Appl. Biochem. 4:185-189。其它可使用的聚合物是聚-l，3-二氧戊環(huán)和聚 -1,3,6-三氧八環(huán)。如上所述，優(yōu)選用于藥物應(yīng)用的是聚乙二醇部分。
所述組合物的釋放部位可以是胃、小腸(十二指腸、空腸或回腸) 或者大腸.本領(lǐng)域技術(shù)人員擁有不在胃中溶解而在十二指腸或腸的其它 位置釋放所述物質(zhì)的可用制劑。優(yōu)選地，所述釋放會(huì)避免對(duì)胃環(huán)境的有 害作用，這是通過(guò)對(duì)抗體的保護(hù)或者通過(guò)生物活性物質(zhì)在胃環(huán)境之外的 地方(例如腸)釋放來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
為了確保完全的胃抗性，在至少pH 5.0下不透的包衣是必需的。 更常見(jiàn)的用作腸衣的惰性成分實(shí)例是乙酸苯三甲酸纖維素(cellulose acetate trimellitate， CAT )、鞋丙基曱基纖維素鄰苯二曱酸酯 (hydroxypropyhnethylcellulose phthalate， HPMCP )、 HPMCP 50、 HPMCP55、癥乙烯乙酸鄰苯二甲酸酯(polyvinyl acetate phthalate, PVAP)、丙烯酸樹(shù)脂(Eudragit) L30D、 Aquateric、乙酸鄰苯二甲酸 纖維素(cellulose acetate ph也alate， CAP)、丙烯酸樹(shù)脂L、丙烯酸樹(shù)脂 S和蟲(chóng)膠。這些包衣可作為混合膜4吏用。
包衣或包衣的混合物還可用于不旨在提高胃保護(hù)的片劑上。這可 包括糖包衣或使得所述片劑易于吞咽的包衣。膠嚢可由用于遞送干燥治 療劑(如粉劑)的硬殼(例如明膠)組成；對(duì)于液體形式，可使用軟的 明膠殼。扁嚢劑的殼材料可以是粗淀粉或其它可食用紙。對(duì)于丸劑、錠 劑、模制片劑或研制片劑，可使用濕法聚集(massing)技術(shù)。
所述治療劑可作為細(xì)小的多顆粒(multi-particulate )包含在所述 制劑中，所述多顆粒為約lmm大小的顆?；蛐⊥璧男问?。用于膠嚢施 用的材料的制劑還可以是粉劑、輕微壓制的丸劑或甚至片劑。可通過(guò)壓 制來(lái)制備所述治療劑。著色劑和芳香劑都可包含在內(nèi).例如，可配制所述組合物(例如 通過(guò)脂質(zhì)體或微球封裝)，然后進(jìn)一步包含在可食用產(chǎn)品中，例如含有 著色劑和芳香劑的清涼飲料。
可使用惰性材料來(lái)稀釋治療劑或增大其體積。這些稀釋劑可包括
碳水化合物，尤其是甘露醇、a-乳糖、無(wú)水乳糖、纖維素、蔗糖、改性 葡聚糖和淀粉。 一些無(wú)機(jī)鹽也可用作填充劑，包括三磷酸鉀、碳酸鎂和 氯化鈉。 一些市售稀釋劑是Fast-Flo 、 Emdex 、 STA-Rx 1500 、 Emcompress 和Avicell。
崩解劑可包含固體劑型的治療制劑中。用作崩解劑的材料包括但 不限于淀粉，包括基于淀粉的商品崩解劑Explotab。淀粉乙醇酸鈉、 Amberlite、羧甲基纖維素鈉、ultramylopectin、藻酸鈉、明膠、桔皮、 酸性羧曱基纖維素、天然海綿和膨潤(rùn)土均可使用。另一種形式的崩解劑 是不溶性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。粉狀的樹(shù)脂可用作崩解劑和粘合劑，它們可 包括粉狀樹(shù)脂如瓊脂、卡拉牙膠或黃芪膠。海藻酸及其鈉鹽也可用作崩 解劑。
結(jié)合劑可用于將治療劑保持在一起以形成硬片劑，包括來(lái)自天然 產(chǎn)物的材料，如阿拉伯膠、黃芪膠、淀粉和明膠。其它的包括曱基纖維 素(methyl cellulose, MC )、乙基纖維素(ethyl cellulos ， EC)和羧曱 基纖維素(carboxymethyl cellulose, CMC )。聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinyl pyrolidone， PVP )和幾丙基曱基纖維素(hydroxypropylmethyl cellulose, HPMC)均可用于醇溶液中，以對(duì)治療劑進(jìn)行造粒。
抗摩劑(anti-frictional agent)可包含在治療制劑中，以防止配制 過(guò)程中的粘附。潤(rùn)滑劑可用作治療劑與模壁之間的層，它們可包括但不 限于硬脂酸包括其鎂鹽和鈣鹽、聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene， PTFE)、液體石蠟、植物油和蠟。也可以使用可溶性潤(rùn)滑劑，例如月桂 基硫酸鈉、月桂基疏酸鎂、多種分子量的聚乙二醇、Carbowax4000和 6000。
可以添加可改善藥物在配制過(guò)程中的流動(dòng)特性以及在壓制過(guò)程中 幫助重排的助流劑。所述助流劑可包括淀粉、滑石、熱解硅石和水合硅 鋁酸。
為了幫助治療劑溶解到水性環(huán)境中，可添加表面活性劑作為潤(rùn)濕劑。表面活性劑可包括陰離子去污劑例如月桂基硫酸鈉、琥珀酸二辛酯 磺酸鈉和二辛酯磺酸鈉?？墒褂藐?yáng)離子去污劑，可包括苯扎氯銨或千索 氯銨。可包括在制劑中作為表面活性劑的可能的非離子去污劑列表如
下聚桂醇400、硬脂酸聚烴氧40酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油IO、 50和 60、單硬脂酸甘油酯、聚山梨醇40、 60、 65和80、蔗糖脂肪酸酯、甲
合物存在于制劑中。
可經(jīng)口使用的藥物制劑包括明膠制成的壓出式(push-fit)膠嚢， 以及由明膠和增塑劑(例如甘油或山梨醇)制成的軟密封膠嚢。壓出式 膠嚢可含有與填充劑(例如乳糖)、粘合劑(例如淀粉)和/或潤(rùn)滑劑(例 如滑石或硬脂酸鎂)以及任選的穩(wěn)定劑相混合的活性成分。在軟膠嚢中， 活性化合物可以溶解或懸于合適液體(例如脂肪油、液體石蠟或液體聚 乙二醇)中。另外，可加入穩(wěn)定劑。也可使用配制成用于經(jīng)口給藥的微 球。這些微球是本領(lǐng)域中已經(jīng)充分定義過(guò)的。所有用于經(jīng)口給藥的制劑 均應(yīng)該是適于這種給藥的劑量。
對(duì)于口給藥，所述組合物可釆取常規(guī)方式制備的片劑或錠劑的形式。
對(duì)于吸入給藥，根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的化合物可方便地以氣霧劑的形 式遞送，所述氣霧劑來(lái)自加壓包或噴霧器，其使用了合適的推進(jìn)劑，例 如二氯二氟甲烷、三氯氟曱烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它適合的 氣體。在加壓氣霧劑的情況下，可以通過(guò)提供閥門(mén)來(lái)確定劑量單位，以 遞送計(jì)量的量。可將用于吸入器或吹入器的(例如明膠)膠囊和藥筒配
本文還考慮了肺遞送。所述組合物可在吸入時(shí)遞送到哺乳動(dòng)物的 肺，并穿過(guò)肺上皮細(xì)胞層達(dá)到血流。吸入分子的其它一些報(bào)道包括Adjei 等，19卯，Pharmaceutical Research, 7:565-569; Adjei等，1990, International Journal of Pharmaceutics, 63:135-144 (乙酸亮丙瑞林)； Braquet等,1989， Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13(suppl. 5):143-146 (內(nèi)皮素-l); Hubbard等，1989， Annals of Internal Medicine, Vol. HI, 206-212頁(yè)(al-抗胰蛋白酶)；Smith等，1989, J. Clin. Invest. 84:1145-1146 (a國(guó)l-蛋白酶)；Oswein等，19卯，"Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II，
。這些表面活性劑可單獨(dú)或作為不同比例的混Keystone, Colorado, March,(重組人生長(zhǎng)素)；Debs等，1988, J. Immunol. 140:3482-3488 (干擾素-g和肺瘤壞死因子a)和Platz等，美 國(guó)專(zhuān)利No. 5,284,656 (粒細(xì)胞集落刺激因子)。用于肺遞送藥物產(chǎn)生全身 性作用的方法和組合物描述于Wong等1995年9月19日授權(quán)的美國(guó)專(zhuān) 利號(hào)5,451,569。
考慮在本發(fā)明實(shí)踐中使用多種設(shè)計(jì)用于肺遞送治療物的機(jī)械裝 置，包括但不限于噴霧器、計(jì)量吸入器和粉末吸入器，所有這些都是本 領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。
適于實(shí)施本發(fā)明的市售裝置的一些具體實(shí)例為Mallinckrodt，Incv St. Louis, Missouri制造的Ultravent噴霧器；Marquest Medical Products, Englewood， Colorado制造的Acorn II噴霧器；Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina制造的Ventolin計(jì)量吸入器；和Fisons Corp., Bedford, Massachusetts制造的Spinhale粉末 S^器。
所有這些裝置都需要使用適于^L的制劑。通常，每種制劑對(duì)于所 使用的裝置類(lèi)型是特定的，除了治療中使用的常規(guī)稀釋劑、佐劑和/或載體 之外還可涉及使用合適的推進(jìn)劑材料。還考慮使用脂質(zhì)體、微膠囊或,、 包含*物或其它類(lèi)型的載體?；瘜W(xué)修飾的抗體也可制備成不同制劑，取 決于化學(xué)修飾的類(lèi)型或所用裝置的類(lèi)型。
適于使用噴霧器(噴射或超聲)的制劑通常包含溶解于水中的治療 劑，其溶解濃度為每亳升溶液約0.1至25 mg生物活性治療劑。所述制劑 還可包含緩沖劑和單糖(例如用于穩(wěn)定抗體和調(diào)節(jié)滲透壓)。噴霧器制劑 還可含有表面活性劑，以降低或防止在形成氣霧劑過(guò)程中溶液霧化導(dǎo)致的 表面誘導(dǎo)的治療劑聚集。
用于計(jì)量吸入裝置的制劑一般包^清細(xì)分割的粉末，其含有在表面 活性劑幫助下懸于推進(jìn)劑中的治療劑。推進(jìn)劑可以是任何用于此目的常規(guī) 材料，例如氯氟碳化合物、氫氯氟碳化合物、氫氟碳化合物或碳?xì)浠衔铮?其包括三氯氟甲烷、二氯二氟曱烷、二氯四氟乙烷、和l，l,l，2-四氟乙烷， 或其組合。合適的表面活性劑包括山梨聚糖三油酸酯和大豆印磷脂。油酸 也可用作表面活性劑。
用于從粉末pAX裝置中分歉的制劑會(huì)包含含有治療劑的精細(xì)分割干 粉，并且還可包含填充劑(例如乳糖、山梨醇、蔗糖或甘露糖)，其量促進(jìn)粉末從所述裝置中^t，例如制劑重量的50至卯％。所述治療劑可以 制備成平均粒徑小于10毫米(或微米)、最優(yōu)選0.5至5毫米的特定形式， 以最有效地遞送到遠(yuǎn)端肺。
還考慮了本發(fā)明藥物組合物的鼻遞送。鼻遞送允許本發(fā)明藥物組合 物在對(duì)鼻施用所述治療產(chǎn)品后直接傳遞到血流，而無(wú)需所述產(chǎn)品在肺中沉 積。用于鼻遞送的制劑包括含有葡聚糖糖或環(huán)糊精的制劑。
對(duì)于鼻給藥，可用裝置是附有計(jì)量噴霧器的小硬瓶。在一個(gè)實(shí)施方 案中，通過(guò)將本發(fā)明藥物組合物溶液吸到確定體積的腔室中來(lái)遞送計(jì)量藥 劑，所述腔室具有霧化氣霧劑所需的孔徑尺寸，所述霧化是通過(guò)當(dāng)在所述 腔室中液體被壓縮時(shí)形成噴霧來(lái)實(shí)現(xiàn)的.所述腔室被壓縮以施用本發(fā)明藥 物組合物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述腔室是活塞設(shè)置。這些裝置是市 售的。
或者，4吏用塑料 ，其具有尺寸為通it^擠壓時(shí)形成噴霧來(lái)霧化 氣霧劑所需的孔徑或開(kāi)口。所述開(kāi)口常見(jiàn)于所述瓶的頂部，所述頂部一般 是逐漸變細(xì)的以適合鼻道，以有效施用氣霧劑。優(yōu)選地，所述鼻^UV器提 供計(jì)量的氣霧劑，以施用定量的藥物。
所述化合物也可配制成直腸或陰道組合物，例如栓劑或保留灌腸劑， 例如含有常M^劑基質(zhì)如可可脂或其它甘油酯。
除了前述制劑以外，所述化合物還可配制成長(zhǎng)效制劑(d印ot preparation )。這些長(zhǎng)效制劑可使用下列項(xiàng)來(lái)配制合適的聚合或疏水材 料(例如可接受油中的乳劑)或離子交換樹(shù)脂，或者微^ f生物例如微溶 鹽。
所述藥物組合物還可包含合適的固體或^相的載體或賦形劑。這 些載體或賦形劑的實(shí)例包括但不限于碳酸釣、磷酸鉀、多種糖、淀粉、纖 維素衍生物、明膠以及聚合物例如聚乙二醇。
合適的液體或固體藥物制劑形式為例如用于^V的水或鹽水溶液、 微封裝的、螺旋狀的(encochleated )、涂敷在顯微金顆粒上的、脂質(zhì)體中 包含的、噴霧化的、氣霧劑、用于^v皮膚的小球、或者在用于劃破ii^ 皮膚的鋒利物體上干燥的。所述藥物組合物還可包括顆粒劑、粉劑、片劑、 包衣片劑、(微)膠囊劑、栓劑、糖漿劑、乳劑、混懸劑、霜?jiǎng)?、滴劑?活性化合物受保護(hù)釋放的制劑，其中制劑賦形劑和添加劑和/或輔料(例如崩解劑、粘合劑、包衣劑、溶脹劑、潤(rùn)滑劑、芳香劑、#劑或增溶劑如 上文所述常規(guī)J吏用。所述藥物組合物適用于多種藥物遞送系統(tǒng)。藥物遞送
方法的簡(jiǎn)要綜述可參見(jiàn)Langer， Science 249:1527-1533， 1990,其通過(guò)參考 并入本文。
所述抗體及任選的其它治療劑可以以自身(純的)施用，或者以可 藥用鹽的形式施用。當(dāng)用于藥物時(shí)，所述鹽應(yīng)該是可藥用的，但是非藥用 鹽可方便地用于制備其可藥用鹽。這些鹽包括但不限于由下述酸所制備的 鹽鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來(lái)酸、乙酸、水楊酸、對(duì)曱苯 磺酸、酒石酸、檸檬酸、甲烷磺酸、蟻酸、丙二酸、琥珀酸、秦2-磺酸和 笨承酸。這些鹽還可制備為堿金屬鹽或堿土金屬鹽，例如羧酸基的鈉、釬 或鈣鹽。
合適的緩沖劑包括乙酸及鹽(1-2% (重量/體積))；檸檬酸及鹽 (1-3%(重量/體積));硼酸及鹽(0.5-2.5%(重量/體積));磷酸及鹽(0.8-2% (重量/體積))。合適的防腐劑包括苯扎氯銨(0.003-0.03% (重量/體積))；
氯丁醇(0.3-0.9% (重量/體積));對(duì)羥基苯曱酸酯(0.01-0.25% (重量/
體積))和硫柳汞(0.004-0.02% (重量/體積)).
本發(fā)明的藥物組合物含有有效量的抗體以及任選的包含在可藥用載 體中的治療劑.術(shù)語(yǔ)可藥用載體指適于對(duì)人類(lèi)或其它脊推動(dòng)物施用的一種 或多種相容性固體或液體填充劑、稀釋劑或封裝物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)載體指天然或
合成的有機(jī)或無(wú)機(jī)成分，其與活性成分相組合以便于應(yīng)用。所述藥物組合
物的組分能夠以不顯著破壞所需藥物療效的方式與本發(fā)明的化合物混合，
并彼此混合'
所述治療劑(具體包括但不限于所述抗體)可以顆粒形式提供.本 文所^^用的顆粒指納米或微米顆粒(或者在一些情況下更大)，其可全部 或部分由抗體組成。所述顆?？稍诤诵暮兴鲋委焺?，所述核心被包衣 (包括但不限于腸衣)包圍.所述治療劑還可:^fc在整個(gè)顆粒中。所述治 療劑還可被吸附到顆粒中。所述顆粒可以是任何級(jí)的釋放動(dòng)力學(xué)情況，包 括零級(jí)釋放、一^1#放、二級(jí)釋放、延^#放、持續(xù)釋放、立刻釋沈良其 組合等。除了治療劑之外，所述顆粒還可包含常規(guī)用于藥劑和藥物領(lǐng)域的 任何材料，包括但不限于易蝕的、不易蝕的、可生物降解的或不可生物降 解的材料或其組合。所述顆?？梢允俏⒛z嚢，其含有溶液或半固體狀態(tài)的 抗體。所述顆?？梢曰緸槿魏涡螤?。不可生物降解的和可生物降解的聚合物均可用于制造用于遞送所述 治療劑的顆粒。這些聚合物可以是天然或合成聚合物。所述聚合物根據(jù)期
望的釋放時(shí)間進(jìn)行選擇。特別感興趣的生物粘附聚合物包括H.S. Sawhney， CP. Pathak和J.A. Hubell在Macromolecules， (1993) 26:581-587中描述的 生物易蝕7jca^，其教導(dǎo)并入本文。它們包括聚透明質(zhì)酸、i^蛋白、明膠、 明膠蛋白、聚酐、聚丙烯酸、藻酸、殼聚糖、聚(異丁烯酸曱酯)、聚(異 丁烯酸乙酯)、聚(異丁烯酸丁酯)、聚(異丁烯酸異丁酯)、聚(異丁烯 酸己酯)、聚(異丁烯酸異癸酯)、聚(異丁烯酸月桂酯)、聚(異丁烯酸 苯酯)、聚(丙烯酸曱酯)、聚(丙烯酸異丙酯)、聚(丙烯酸異丁酯)以 及聚(丙烯酸十八酯)。
所述治療劑可包含在受控釋放系統(tǒng)中.術(shù)語(yǔ)"受控釋放，，意指藥物從 制劑釋放的方式和特征譜受到控制的任何含有藥物的制劑。這是指立即釋 放和非立即釋放制劑，非立即釋放制劑包括但不限于持續(xù)釋放和延^#放 制劑。術(shù)語(yǔ)"持續(xù)釋放，，(也被稱(chēng)為"延長(zhǎng)釋放，，)以其常規(guī)意義使用，指提 供在延長(zhǎng)的時(shí)間中逐漸釋放藥物并優(yōu)選地(盡管不是必需的)導(dǎo)致在延長(zhǎng) 的時(shí)間內(nèi)基本恒定的藥物血液水平的制劑。術(shù)語(yǔ)"延^#放"以常規(guī)意義使 用，指在制劑的施用與藥物釋放之間有時(shí)間延遲的藥物制劑。"延^#放" 可涉及或不涉及藥物在長(zhǎng)期時(shí)間內(nèi)的逐漸釋放，因此可以是或不是"持續(xù)釋 放"。
長(zhǎng)期持續(xù)釋放#^物的應(yīng)用可特別適用于治療慢性病癥。本文所使 用的"長(zhǎng)期，，釋放指構(gòu)建并安置所述植入物以在至少7天、優(yōu)選30-60天中 遞送治療水平的活性成分。長(zhǎng)期持續(xù)釋放植入物是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知 的，其包括一些上文所述的釋放系統(tǒng)。
本文還提供了^^有所提供抗體的試劑盒。圖14顯示了這些試劑盒的 一個(gè)例子。試劑盒IO包含抗體12。試劑盒10還可含有一種或多種管或容 器14。所述試劑盒還包含用于對(duì)患有本文所述疾病(如癌癥)或具有此疾 病癥狀的受試者施用所述成分的說(shuō)明.
在一些實(shí)施方案中，試劑盒10可包含藥物制劑瓶、藥物制劑稀釋劑 瓶、以及所述抗體。含有用于藥物制劑的稀釋劑的瓶是任選的。所述稀釋 劑瓶含有稀釋劑例如生理鹽水，以稀釋所述抗體的濃溶液和凍干粉末。所 述"i兌明可包含混合特定量稀釋劑和特定量濃藥物制劑，由此制備用于注射 或輸注的最終制劑的說(shuō)明。所述說(shuō)明可包含在注射器或其它施用裝置中使用的說(shuō)明。說(shuō)明20可包含使用有效量的抗體來(lái)治療患者的說(shuō)明。還應(yīng)理解， 含有所述制劑的容器(無(wú)論所述容器是瓶、帶隔膜的瓶、帶隔膜的^、 灌注袋等)都可^^有標(biāo)記例如常規(guī)標(biāo)簽，其在所述制劑經(jīng)高壓滅菌或其它 滅菌時(shí)改變顏色。
"受試者"應(yīng)指人或脊推哺乳動(dòng)物，其包括但不限于狗、貓、馬、牛、 豬、綿羊、山羊或靈長(zhǎng)類(lèi)，如猴。
除非本文另外定義，與本發(fā)明相關(guān)所使用的科技術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域技 術(shù)人員通常所理解的含義.另外，除非上下文另外需要，單數(shù)術(shù)語(yǔ)包含復(fù) 數(shù)，復(fù)數(shù)術(shù)語(yǔ)包含單數(shù)。 一般地，根據(jù)本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法實(shí)施本發(fā)明 的方法和技術(shù)。 一般地，與本文所述的生物化學(xué)、酶學(xué)、分子和細(xì)胞生物 學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)和蛋白質(zhì)及核酸化學(xué)以及雜交相關(guān)使用的命名法和 技術(shù)是本領(lǐng)域公知且常規(guī)使用的。除非另有指出，本發(fā)明的方法和技術(shù)一 般根據(jù)本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法并如本說(shuō)明書(shū)中引用并討論的多個(gè)一般性 和較具體的參考文獻(xiàn)中所述來(lái)實(shí)施。
通過(guò)下述實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，所述實(shí)施例不應(yīng)以任何方式理 解為進(jìn)一步的限制。本申請(qǐng)中所引用的所有參考文獻(xiàn)(包括文獻(xiàn)、授權(quán)專(zhuān) 利、公開(kāi)的專(zhuān)利申請(qǐng)以及共同未決的專(zhuān)利申請(qǐng))的全部?jī)?nèi)容通過(guò)參考明確 地并入本文。
實(shí)施例
材料和方法
淑#^《挑W7VJ
使用Qiagen RNeasy Mini試劑盒(目錄號(hào)74104 )制備RNA。在 第4天，將13 ml培養(yǎng)物離心5分鐘，重懸于PBS。再次離心5分鐘。 將所得沉淀重懸于含6 jil n-ME的600 nl RNeasy RLT中。將裂解液5 次穿過(guò)22g針，加入600 nl 70% EtOH if混合。兩次將700 jU等分試樣 加到RNeasy柱，離心30秒，用700 jil RW1洗滌。用500 jil PPE洗滌 兩次，干燥1分鐘，用50nl水洗脫兩次。
使用寡聚dT引物，用Promega逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(目錄號(hào)A3500 )對(duì) 2 nl RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)物在42'C孵育1小時(shí)，然后加熱到95'C保 持5分鐘。然后用水將反應(yīng)物稀釋到100 nl。用引物對(duì)1 jil cDNA等分 試樣進(jìn)行PCR，所述引物選自N端或5，或端之一以及C端或3，末端之一。使用僅來(lái)自恒定區(qū)的引物進(jìn)行PCR作為陽(yáng)性對(duì)照。
使用Qiagen QiaQuick PCR純化試劑盒(目錄號(hào)28104 )來(lái)純化 PCR產(chǎn)物。進(jìn)行另外的洗脫以使終體積為100 jil。測(cè)定260 nm處的吸 光度。濃度在10-26 ng/jil變化，取出100 ng與PCR所用的N端引物 一起用于測(cè)序。
因?yàn)樗冒被艘锸强贵w氨基端編碼序列的一部分，所以它們 可在所述序列中引入突變。使用所得序列，從小鼠基因組鑒定種系基因。 然后合成這些基因末端的引物，用于從cDNA中PCR得到完整編碼序 列。以這種方式獲得了所述抗體的完整編碼序列，而不含任何PCR引 物所貢獻(xiàn)的序列。因?yàn)樵诿糠N情況下它都與氨基端序列一致，所以所述 編碼序列是所表達(dá)抗體的序列。如序列中標(biāo)注出的，從已知J區(qū)中鑒定 出J區(qū)。
#乂 C2)"7重遂和在鏈差厲付義鏖々#/^
構(gòu)建含有四個(gè)主要IgG亞類(lèi)的人恒定區(qū)序列的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體。 這些載體攜帶山羊p酪蛋白啟動(dòng)子以及確保乳腺特異性轉(zhuǎn)基因表達(dá)的 其它5，和3，調(diào)控序列。通過(guò)插入小鼠抗人CD137抗體的可變區(qū)序列來(lái) 構(gòu)建所述嵌合抗體變體。通過(guò)對(duì)相應(yīng)可變區(qū)測(cè)序來(lái)鑒定小鼠序列的抗 CD137 H和L鏈。組裝代表來(lái)自多個(gè)小鼠免疫球蛋白家族5，編碼區(qū)序 列的寡核苷酸集合。單個(gè)使用小鼠免疫球蛋白序列作為5，引物來(lái)擴(kuò)增從 雜交瘤RNA制得的cDNA，對(duì)所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測(cè)序。3，PCR 引物從恒定區(qū)的已知序列中制得。所述PCR引物包含限制性?xún)?nèi)切酶位 點(diǎn)，以使所擴(kuò)增的序列可插入表達(dá)載體中。將這些序列插入所述構(gòu)建體 中以產(chǎn)生編碼嵌合蛋白的基因.
用于克隆和測(cè)序抗CD137抗體基因可變區(qū)的方法包括下述步驟 (1) - (5)。 (1)從雜交瘤RNA得到cDNA。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法從雜交瘤 制備RNA，通過(guò)4吏用市售試劑盒(Reverse Transcription System, Promega, Madison, WI)的逆轉(zhuǎn)錄來(lái)制備cDNA。 (2)使用基于數(shù)個(gè)良 好表征的小鼠單克隆抗體VH和VL區(qū)氨基端已知序列的引物，通過(guò)PCR 擴(kuò)增cDNA。 (3)通過(guò)將PCR產(chǎn)生的序列插入帶有新霉素抗性(neoR) 選擇標(biāo)記的克隆載體來(lái)擴(kuò)增可變區(qū)序列，分離neoR菌落。U)對(duì)從約6 個(gè)菌落制得的H和L鏈cDNA進(jìn)行測(cè)序，以確定每個(gè)可變區(qū)的共有序列。確保沒(méi)有在PCR產(chǎn)物序列中引入突變是很重要的。DNA測(cè)序通過(guò) SequeGen，Co. (Worcester, MA)的付費(fèi)服務(wù)進(jìn)行。(5)對(duì)分離自雜 交瘤上清液的H和L蛋白進(jìn)行測(cè)序，將實(shí)際的蛋白質(zhì)序列與從基因序 列推導(dǎo)出的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較。此步驟確認(rèn)了所克隆的基因編碼功能 性抗體鏈。蛋白質(zhì)測(cè)序通過(guò)Cardinal Health (San Diego, CA)的付費(fèi) 服務(wù)進(jìn)行。
盧^^于嵌合犮舉邦^岸辨嵌合/gG ,遂及鞋遂游^^舉
使用根據(jù)上文所提供方法獲得的可變區(qū)序列來(lái)替換現(xiàn)有人IgGl 抗體中的人可變區(qū)序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，IgGl表達(dá)載體 中的人可變區(qū)序列與小鼠可變區(qū)序列 一起使用，以產(chǎn)生嵌合人源化抗 體。所述抗體表達(dá)載體含有天然糖基化模式的IgGl H基因。IgGl糖基 化位點(diǎn)是CH2結(jié)構(gòu)域中297位的Asn殘基。通過(guò)基因序列中的定點(diǎn)誘 變將Asn297改變成Gln297，產(chǎn)生IgGl H鏈的非糖基化形式。這提供了 3種構(gòu)建體L鏈、糖基化H鏈和非糖基化H鏈。使用每個(gè)構(gòu)建體的兩 種形式進(jìn)行測(cè)試。通過(guò)限制性作圖和Southern印跡分析來(lái)評(píng)價(jià)每個(gè)構(gòu) 建體，所述構(gòu)建體用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。另外，所述構(gòu)建體用于瞬時(shí)轉(zhuǎn) 染研究，以測(cè)試經(jīng)遺傳改造的嵌合蛋白的生物活性。
用于開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的構(gòu)建體含有山羊P酪蛋白啟動(dòng)子和用于確 保高水平乳腺特異性轉(zhuǎn)基因表達(dá)的其它5，和3，調(diào)控序列。因?yàn)閱?dòng)子和 其它調(diào)控元件的物種交叉識(shí)別，所以同一構(gòu)建體可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠 和山羊。 一旦育種后，針對(duì)糖基化水平和增強(qiáng)的ADCC特性來(lái)篩選山 羊和/或小鼠。通過(guò)限制性作圖來(lái)確認(rèn)所述構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)完整性，所述 構(gòu)建體用于產(chǎn)生瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
游建,鏈嵌合參#^^入《這裁伴*
為了構(gòu)建小鼠IgG2a恒定區(qū)被人IgGl恒定區(qū)替換的重鏈嵌合物， 使用含有帶小鼠前導(dǎo)序列的人抗體序列的BC2083表達(dá)載體(質(zhì)粒1)。 通過(guò)不改變C端附近甘氨酸編碼的G到A沉默突變來(lái)消除剪接供體位 點(diǎn)。將唯一的位點(diǎn)置于BC2083表達(dá)載體中可變區(qū)附近。將DraIII和 PmII置于N端，Apal存在于重鏈恒定區(qū)的氨基部分中。通過(guò)使用引物 從CMV-Zeo中進(jìn)行zeo基因的PCR，將這些位點(diǎn)克隆到BC2083的Xhol 位點(diǎn)中，得到p80 BC2083 zeo (質(zhì)粒2)。這種將限制性位點(diǎn)插入質(zhì)粒的快速方法4吏用了 zeo基因所賦予的zeocin抗性。通過(guò)4吏用NZYCM瓊 月旨中25 ng/ml的zeocin來(lái)選擇zeocin抗性。
通過(guò)將人IgGl恒定區(qū)部分從BC2083中切出并克隆進(jìn)p80來(lái)將其 放回到唯一的Apal和Xhol位點(diǎn)，得到p83 BC2083 DraIII IgGl (質(zhì)粒 3)。此質(zhì)粒具有重鏈可變區(qū)側(cè)翼的唯一的DralII/Pm11和Apal位點(diǎn)， 使得任何重鏈可變區(qū)附著到人IgGl恒定區(qū)編碼序列。
通過(guò)PCR將DraIII和Pmll位點(diǎn)置于氨基端并且將Apa位點(diǎn)置 于C端，制備用于插入的抗CD137抗體的重鏈可變區(qū)。所述ApaI位 點(diǎn)天然存在于人IgGl恒定區(qū)的氨基端附近。使用引物MHE和MHEC， 利用PfuTurbo ( Stratagene目錄號(hào)600153-81 )和cDNA實(shí)施PCR。將 PCR片段克隆進(jìn)pCR-BluntII-TOPO (Invitrogen目錄號(hào)K28602 )，使 用pcr2.1f和pcr2.1b進(jìn)行測(cè)序。這得到了 p96，其含有側(cè)翼是 DraIII-PmlI和Apal的重鏈可變區(qū)(質(zhì)粒4 ),
通過(guò)分離p96 pCR-BluntII-Mayo-重鏈DraIII-ApaI片段并連接到 DraIII-ApaI切割的p83 BC2083 DraIII IgGl (質(zhì)粒3 )中來(lái)構(gòu)建p酪蛋 白表達(dá)載體，p100 BC2083重鏈(BC2197 )(質(zhì)粒5 )。
為了通過(guò)將靶天冬酰胺改變?yōu)楣劝滨０穪?lái)阻斷糖基化，通過(guò)使用 PfuTurbo和引物的PCR從BC2083來(lái)制備重鏈編碼序列，將重鏈恒定 N和重鏈恒定C亞克隆到pCR-Zero-Blunt中。這得到了 p76和p77 pCR2.1-Blunt-IgGl-重鏈恒定。對(duì)這些質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序以確保在PCR過(guò) 程中沒(méi)有在恒定區(qū)中引入突變。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，使用QuickChange XL Mutagenesis (Stratagene)試劑盒和i秀變寡聚物對(duì)p77中亞克隆的 抗CD137抗體恒定區(qū)進(jìn)行誘變。此寡聚物將天冬酰胺297改變?yōu)楣劝?酰胺并去除鄰近的BsaAI位點(diǎn)，以便于通過(guò)蘇氨酸密碼子沉默突變的限 制性酶分析來(lái)進(jìn)行篩選。這得到了質(zhì)粒p88 、 p89和p卯 pCR2.1-Blunt-IgGl-重鏈-mut。使用引物對(duì)這些質(zhì)粒進(jìn)行PCR以制備 用于測(cè)序的片段。
種建牽遂嵌合浙并插入^/《迷我伴*
用于輕鏈的表達(dá)載體是BC1060 (質(zhì)粒6)。為了使得可變區(qū)能夠 與人k恒定區(qū)融合，將兩個(gè)限制性位點(diǎn)依次改造進(jìn)入小鼠j區(qū)。通過(guò)將 甘氨酸密碼子從GGG或GGC改變?yōu)镚GT來(lái)引入KpnI位點(diǎn)。將亮氨酸的編碼序列從CTG改變?yōu)镃TT以產(chǎn)生HindIII位點(diǎn)(質(zhì)粒8 )。
通過(guò)使用PfuTurbo ( Stratagene)的PCR，使用引物從BC1060 中分離出人k鏈恒定區(qū)編碼區(qū)，其帶有編碼區(qū)起始處的Kpnl和HindIII 位點(diǎn)以及編碼區(qū)末端天然存在的Sacl位點(diǎn)。將PCR產(chǎn)物克隆到ZERO Blunt TOPO PCR W EC中(Invitrogen目錄號(hào)K286020 )。對(duì)這些質(zhì) 粒進(jìn)行測(cè)序。這得到了 p85 pcr-blunt-1060K恒定rev (質(zhì)粒7 )和p86 pcr-blunt-1060K恒定(^粒8 )。
類(lèi)似地，使用引物通過(guò)PCR從cDNA中分離出可變區(qū)，并克隆 到pCR2.1-Blunt-TOPO中，得到p92 pCR2.1國(guó)Blunt-k可變(質(zhì)粒9 )， 其中所述可變區(qū)的側(cè)翼是340位核苷酸處的Xhol位點(diǎn)以及731位核苷 酸附近的Kpnl和HindIII位點(diǎn)。對(duì)這些質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。
首先使用3段DNA將輕鏈嵌合物構(gòu)建到pCR-Blunt中.p86 pcr-blunt-1060K恒定提供Xhol至Sacl的主鏈。k恒定區(qū)是來(lái)自p85 pcr-blunt畫(huà)1060K恒定rev的HindIII誦SacI片段。4吏用XhoI國(guó)HindIII片 段由p92 pCR2.1-Blunt-k可變r(jià)ev提供可變區(qū)。通過(guò)PCR使用引物 pcr2.1f和pcr2.1b通過(guò)查找863bp片段的產(chǎn)生來(lái)檢測(cè)菌落。這得到了 p94 pCR-Bluntll-Mayo-kap-chim (質(zhì)粒10 )。通過(guò)4吏用Xhol和Sacl 的切割得到684 bp片段來(lái)檢測(cè)所述質(zhì)粒。
將所述輕鏈嵌合物置于含有帶小鼠重鏈前導(dǎo)序列的免疫原人輕鏈 的P酪蛋白表達(dá)載體BC1060。用Xhol-Sacl切割p94，分離小片段。 用Kpnl-Sacl切割BC1060,分離5206 bp的片段。用Kpnl、 Xhol和 Pacl切割BC1060以分離大主鏈。連接這三個(gè)片段，使用所需引物篩選 菌落。用BglII檢測(cè)陽(yáng)性質(zhì)粒，對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序。此質(zhì)粒是p104 BC1060 LC chim ( BC2198 )(質(zhì)粒11 )。
游建勿應(yīng)培#4這裁體
為了構(gòu)建輕鏈的瞬時(shí)表達(dá)栽體，將來(lái)自p104 BC1060 LC chim(質(zhì) 粒11)的Xhol片段連接進(jìn)pCEP4的Xhol位點(diǎn)，得到p106和p107 pCEP4-Mayo-LC ( #2203 ) (^粒12 )。通過(guò)使用寡聚CEPF和KVC的 PCR來(lái)檢測(cè)陽(yáng)性克隆。
為了構(gòu)建重鏈的瞬時(shí)表達(dá)載體，將p100 BC2083重鏈的BamHI 片段克隆進(jìn)BamHI切割的pCEP4.通過(guò)使用HVC09和CEPF的PCR來(lái)篩選菌落。這得到了質(zhì)粒p110 pCEP4-BamHI-HC( #2202 )(質(zhì)粒13 )。
通過(guò)將含有可變區(qū)的#110 pCEP4-BamHI-HC (#2202 )的 Kpnl-Agel小片段連接進(jìn)KpnII-AgeI切割的#88 pCR2.1-Blunt-IgGl-重鏈-mut來(lái)制備帶有抗CD137抗體重鏈可變區(qū)的嵌合物。這得到了質(zhì) 粒pill pCR2.1-Mayo-IgGl-重鏈-mut (質(zhì)粒14 )。用BsaAI-PstI檢測(cè)此質(zhì)粒。
為了構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)載體，將來(lái)自含有嵌合抗體編碼區(qū)的plll的 Xhol小片段插入到pCEP4的Xhol位點(diǎn)。通過(guò)使用HVC C09和CEPF 的PCR來(lái)檢測(cè)菌落。這得了了 p112 pCEP4-Xho-Mayo-IgGl-aglycos (BC2206 )。使用EcoRV-HindIII消化(2479 bp )和BamHI消化(1454 bp)獲得預(yù)期片段。為了構(gòu)建P酪蛋白表達(dá)載體，將來(lái)自含有嵌合抗體 編碼區(qū)的plll的Xhol小片段插入到BC2083的Xhol位點(diǎn)。通過(guò)使用 寡聚HVC 09和CA5的PCR來(lái)檢測(cè)菌落。用MluI-Eco47III-Notl消化 得到預(yù)期的2479 bp片段，而使用BamHI消化得到預(yù)期的1454 bp片 段。
^發(fā)/gG7 ^^伴
在小鼠乳中表達(dá)所使用的抗CD137抗體。對(duì)于小鼠表達(dá)，使用 BC2197 ( p100 BC2083重鏈)和(BC2198 ) p104 BC1060輕鏈的構(gòu)建 技術(shù)。類(lèi)似地，親本質(zhì)粒是用于重鏈的BC2083或用于輕鏈的BC1060。 基本上，將親本質(zhì)粒中包含前導(dǎo)序列的可變區(qū)與來(lái)自抗CD137抗體 cDNA重鏈和輕鏈可變區(qū)的cDNA序列進(jìn)行交換。所述表達(dá)載體的恒定 區(qū)(重鏈的IgGl和輕鏈的k)被所克隆的序列取代。
從購(gòu)自Invitrogen的cDNA中克隆所使用的抗體重鏈。使用胎盤(pán) cDNA和下文所示引物實(shí)施利用PfuTurbo的PCR。 C端引物61960C11 相對(duì)于野生型序列改變了一個(gè)堿基以破壞剪接供體位點(diǎn).將993 bp片 段克隆進(jìn)ZeroBlunt。所述序列表明一個(gè)序列是Glm ( 3 )。存在與來(lái)自 人血清的y球蛋白相關(guān)的內(nèi)在差異(Grubb 1956; Grubb和Laurell 1956 )。具有Km類(lèi)似的系統(tǒng)(k標(biāo)記物，之前稱(chēng)為Inv,其代表glnhibitrice Virmi)。這是白人同種異型Glm(f)或Glm(3),其取代了起始質(zhì)粒上存 在的黑人同種異型Glm(z)或Glm(17)。
56為了克隆其它的同種異型，如上所述從腦cDNA進(jìn)行了 PCR，得 到質(zhì)粒pl16、 p117、 pll8和pl19。這些質(zhì)粒中無(wú)一具有正確的序列。 例如，大部分的所述質(zhì)粒丟失了序列末端應(yīng)該由PCR引物提供的Apal 和/或Xhol位點(diǎn)。使用p116或腦cDNA作為模板再次進(jìn)行PCR。
對(duì)p116的PCR得到了 121、 122和123。對(duì)腦cDNA的PCR得 到了 124。 4吏用來(lái)自質(zhì)粒121的插入片段產(chǎn)生p133、p134、 p135和p136, 它們是通過(guò)用Apal和Xhol切割100c BC2083重鏈并用Apal和Xhol 切割p121 ZeroBlunt-IgGl Glm(17)、連接并在卡那霉素上進(jìn)行選擇的 BC2083重鏈Glm(17)。使用了 p133。
對(duì)于小鼠表達(dá)，只有質(zhì)粒BC2083中的可變區(qū)發(fā)生了改變，所述 質(zhì)粒是含有帶小鼠前導(dǎo)序列的人抗體序列的表達(dá)載體。它在IgGl恒定 區(qū)末端具有剪接供體位點(diǎn)，所述位點(diǎn)被不改變甘氨酸編碼的G到A的 沉默突變所消除.為了增強(qiáng)山羊表達(dá)，將所述恒定區(qū)改變?yōu)殡S后克隆的 IgGl恒定區(qū)。將來(lái)自p114的克隆恒定區(qū)用于產(chǎn)生p137和138。用 Apal-Xhol切割p100 BC2083重鏈(BC2197 )，用Apal和Xhol切割 114 ZeroBlunt國(guó)IgGl Glm(3),然后連接得到p138 ( BC2228 )。從p121 (Glm(17))克隆的恒定區(qū)用于產(chǎn)生p133、 134、 135和136 BC2083重 鏈Glm(17)。 k恒定區(qū)也被GTC Biotherapeutics克隆的所替換。
犯Q.ID,NO. l:AGGGTACCAAGCTTGAAATCAAACGAAC- K恒定人H01 ; SEQ ID NO.2: 5,AAGGGTCCGGATCCTCGAGGATCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC-人 K
C#7734。
在體外將來(lái)自新鮮山羊皮膚活檢樣品的成纖維細(xì)胞在原代培養(yǎng)物 中維持。簡(jiǎn)言之，在無(wú)Ca"和1^++的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中切碎 皮膚樣品，用EDTA中稀釋的胰酶收獲以回收單細(xì)胞懸液并培養(yǎng)于37 匸下。用胰酶消化會(huì)合的細(xì)胞，傳代培養(yǎng)。將細(xì)胞的等分試樣冷凍于液 氮中待用。
絲脊染勿應(yīng)系
使用轉(zhuǎn)基因(例如P酪蛋白、嵌合抗CD137 H和L鏈cDNA )特 異性探針，通過(guò)Southern印跡分析來(lái)表征轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以確定轉(zhuǎn)基因的 拷貝數(shù)并鑒定可能的重排。還通過(guò)FISH分析每個(gè)細(xì)胞系，以證實(shí)單整合并確定染色體位置。進(jìn)行細(xì)胞遺傳分析以證實(shí)細(xì)胞系的核型。
對(duì)于分裂間期FISH，將來(lái)自每個(gè)擴(kuò)增集落的數(shù)百個(gè)細(xì)胞固定在濾 膜上，并與擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因特異性的地高辛標(biāo)記探針雜交。對(duì)于分裂中期 FISH，細(xì)胞培養(yǎng)于Lab Tek室玻片(Nunc, Rochester, NY)，用5-溴 -2，脫氧尿苷(BrdU)脈沖處理以得到復(fù)制帶。用FITC綴合的抗地高 辛檢測(cè)探針結(jié)合，用4，，6-二脒-2-苯基吲哚(DAPI)復(fù)染染色體。使用 Zeiss Axioskop顯微鏡(Zeiss Imaging, Thornwood, NY )、 Hamamatsu 數(shù)碼照相機(jī)(Hamamatsu, Bridgewater， NJ)和Image Pro-Plus軟件 (Media Cybernetics, Silver Springs, MD)來(lái)捕獲圖像。大部分探針 是相對(duì)大且易于檢測(cè)的。對(duì)于個(gè)體IgGH和L鏈(其由相對(duì)短的cDNA 序列編碼)的探針太小，以至于其自身不能得到好的分辨率。這些小探 針與來(lái)自山羊P酪蛋白乳特異性啟動(dòng)子的序列相混合。
勿應(yīng)遽傳》#
實(shí)施對(duì)供體轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞系的細(xì)胞遺傳分析。通過(guò)缺口翻譯用 地高辛-dUTP標(biāo)記轉(zhuǎn)基因探針。用FITC綴合的抗地高辛或者用辣根過(guò) 氧化物酶綴合的抗地高辛和之后FITC綴合的酪胺來(lái)檢測(cè)探針與變性染 色體的結(jié)合。用DAPI使染色體帶模式可見(jiàn)。山羊具有60個(gè)染色體， 均為近端著絲粒(在一端而不是在中部或中部附近具有著絲粒)。在分 裂中期伸展中檢查嚴(yán)重異常的跡象，例如染色體丟失、重復(fù)或明顯的重 排。用于產(chǎn)生第一代轉(zhuǎn)基因山羊的細(xì)胞系是核型一般正常的，并且攜帶 結(jié)構(gòu)完整的嵌合抗CD137 H和L鏈基因以及P酪蛋白啟動(dòng)子和其它必 要調(diào)控元件。
,蘭在乾—表這嵌合戎人CD"7的脊差廚動(dòng)浙
已產(chǎn)生了糖基化和非糖基化形式的嵌合抗人CD137抗體。在從乳 中純化足夠量的抗體以測(cè)試生物活性之后，發(fā)現(xiàn)盡管它們基本以相同的 水平產(chǎn)生，但是兩種形式的活性鐠有所不同。
嵌合抗體的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠和山羊。轉(zhuǎn)基因動(dòng) 物通過(guò)引入H鏈和L鏈構(gòu)建體的1:1混合物來(lái)產(chǎn)生成熟抗體。L鏈構(gòu)建 體糖基化或非糖基化H鏈構(gòu)建體相組合。具體地，在體外通過(guò)Western 印跡分析和抗體結(jié)合測(cè)量對(duì)乳中生物活性產(chǎn)物的相對(duì)及絕對(duì)水平進(jìn)行測(cè)量。
掙差厲'/、虞
用于測(cè)試轉(zhuǎn)基因小鼠中誘導(dǎo)型系統(tǒng)可行性的實(shí)用策略是評(píng)估第一
代(FJ小鼠乳中的轉(zhuǎn)基因蛋白表達(dá)。已經(jīng)確定，在一些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中， 原始轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體在顯微注射后在細(xì)胞分裂時(shí)整合進(jìn)染色體位點(diǎn)。因 此，初始動(dòng)物是可影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的嵌合體。這些染色體整合位點(diǎn) 將在后續(xù)世代中發(fā)生分離，以形成穩(wěn)定的同質(zhì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系，因此， R小鼠是用于確定轉(zhuǎn)基因表達(dá)穩(wěn)定性及其生物產(chǎn)物穩(wěn)定性的合理模型。 另外，為了讓小鼠泌乳，它們必須成熟(需約2個(gè)月的時(shí)間)、交配并 產(chǎn)生后代。在分析之后，確定分泌水平是穩(wěn)定的，所使用的構(gòu)建體是有 效的。
通過(guò)CsCl梯度和之后的電洗脫來(lái)純化來(lái)自每個(gè)所制備構(gòu)建體的 線(xiàn)性DNA，通過(guò)前核顯微注射產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠。通過(guò)尾組織DNA的 PCR分析來(lái)鑒定轉(zhuǎn)基因初始小鼠，使用Southern印跡分析測(cè)定相對(duì)拷 貝數(shù)。對(duì)每個(gè)構(gòu)建體(糖基化和非糖基化)產(chǎn)生許多轉(zhuǎn)基因笫一代的攜 帶轉(zhuǎn)基因的"初始"(FJ雌性。在成熟時(shí)這些F。小鼠交配開(kāi)始泌乳。 用山羊抗人Fc抗體進(jìn)行的Western印跡分析它們的乳，以鑒定分泌結(jié) 構(gòu)完整的帶有人CH區(qū)的嵌合抗體的小鼠.
然后繁殖最佳初始動(dòng)物(定義為具有在其乳中最大合理抗體表達(dá) 的健康動(dòng)物)以產(chǎn)生F1雌性，其用于提供足夠收集用于體外和體內(nèi)測(cè) 試的抗體的乳。
脊差西^半
使用本領(lǐng)域中常規(guī)的核轉(zhuǎn)移技術(shù)產(chǎn)生具有預(yù)先確定遺傳學(xué)情況的 轉(zhuǎn)基因山羊。核轉(zhuǎn)移消除了在前幾代中轉(zhuǎn)基因鑲嵌現(xiàn)象的問(wèn)題，因?yàn)樗?br> 有來(lái)自于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的動(dòng)物都應(yīng)完全是轉(zhuǎn)基因。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染方法 (脂轉(zhuǎn)染或電穿孔)將所述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體引入原代細(xì)胞系中。在重組原 代細(xì)胞系用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物之前，針對(duì)重要特征(例如轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)、 完整性和整合位點(diǎn))對(duì)它們進(jìn)行體外篩選.雌性山羊皮膚成纖維細(xì)胞用 于產(chǎn)生轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，作為核轉(zhuǎn)移的核供體，得到全部雌性后代。 因此，可直接從Fo山羊獲得含有重組蛋白的乳。通過(guò)Western印跡測(cè) 定乳中生物活性產(chǎn)物的相對(duì)和絕對(duì)水平.結(jié)果
祐沐的趟化; k^在
產(chǎn)生了四種不同的嵌合抗CD137抗體。 一種變體是通過(guò)將Asn297 突變?yōu)楣劝滨０范翘腔?。此抗體變體可在功能性研究中發(fā)揮陰性 對(duì)照的作用，因?yàn)橐阎翘腔疘gG不結(jié)合Fc受體，且在ADCC中無(wú) 活性(Nose等，1983)。從乳中制備了另外兩種抗體變體， 一種來(lái)自小 鼠乳， 一種來(lái)自山羊乳.在HEK 293細(xì)胞(人細(xì)胞系)表達(dá)第四種抗 體變體。
在人細(xì)胞中表達(dá)一種抗體變體。人胚腎293細(xì)胞系(293)適用于 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)，因?yàn)樗杀桓咝мD(zhuǎn)染。使用穩(wěn)定表達(dá)EBVEBNA1蛋白 (293E)的遺傳變體，其在EBV的oriP存在于載體骨架中時(shí)提供顯著 更高的蛋白表達(dá)。
當(dāng)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)，oriP/EBNAl系統(tǒng)中獲得的表達(dá)提高似乎與 附加體復(fù)制無(wú)關(guān)，因?yàn)槿コ齩riP中負(fù)責(zé)在EBNA1陽(yáng)性細(xì)胞中起始DNA 復(fù)制的DS結(jié)構(gòu)域不降低轉(zhuǎn)基因表達(dá)，而去除FR而不是DS則顯著降 低表達(dá)。因此，表達(dá)提高似乎是由于oriP的EBNAl依賴(lài)性增強(qiáng)子活性 與質(zhì)粒入核增多的聯(lián)合作用，入核增多是由于EBNA1中存在核定位信 號(hào)(Pham等，2003)。
4吏用i殳計(jì)用于從CMV啟動(dòng)子高水平組成型表達(dá)的載體pCEP4 (目錄號(hào)V04450; Invitrogen, Carlsbad, CA)來(lái)表達(dá)所述抗體。 293EBNA/ebv載體宿主系統(tǒng)表現(xiàn)出對(duì)基于COS7/SV40ori的系統(tǒng)的顯著 改善(Jalanko等，1988; Shen等，1995)。高水平重組蛋白表達(dá)的一 個(gè)重要問(wèn)題在于使用具有在宿主細(xì)胞系中高活性啟動(dòng)子的載體，所述啟 動(dòng)子例如CMV啟動(dòng)子，其在293細(xì)胞中特別有力，因?yàn)樗ㄟ^(guò)組成型 表達(dá)腺病毒Ela蛋白來(lái)反式活化(Durocher等，2002)。
通過(guò)用如前述的標(biāo)準(zhǔn)方法(Wilcox等，2002， J Clin Inv 109: 651-659)將BALB/c小鼠的脾B細(xì)胞與小鼠漿細(xì)胞瘤融合來(lái)產(chǎn)生生產(chǎn) 人CD137特異性單克隆抗體的雜交瘤(GW )，所述BALB/c小鼠已經(jīng) 用人CD137胞外部分和小鼠IgG2aFc區(qū)的融合蛋白進(jìn)行了免疫。所述 抗CD137抗體是小鼠單克隆抗體(mAb)與人CD137的嵌合形式，其 中重鏈和輕鏈的恒定區(qū)已分別被人IgGl恒定區(qū)和人K恒定區(qū)所替換。這種抗體使用p酪蛋白啟動(dòng)子在小鼠和山羊乳中表達(dá)(Pollock等，J Immunol Meth 231: 147-157)，或者使用巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子 通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染在HEK 293細(xì)胞中表達(dá)。山羊乳來(lái)自轉(zhuǎn)基因山羊的激素 誘導(dǎo)泌乳(Ebert等，1994, Biotech 12: 699-702)。通過(guò)A蛋白層析純 化所述抗體。在泌乳9天后純化山羊乳抗體，以避免污染早期擠奶所得初 乳的山羊抗體。通過(guò)尺寸排阻層析發(fā)現(xiàn)，山羊乳來(lái)源的嵌合抗CD137 抗體的類(lèi)似制劑是卯％的單體和10%的聚集體。通過(guò)280 nm處的吸光 度來(lái)測(cè)量抗體濃度，使用1.4 mg/ml為1 OD的值作為換算因子。
潛##
使用PNG酶F，在37n下在含l。/。巰基乙醇的50 mM褲酸鈉緩 沖液pH7.0中過(guò)夜釋放天冬酰胺連接的寡糖。使用Voyager-DE PRO Biospectrometry Workstation ( Applied Biosystems， Foster City, CA， USA),通過(guò)基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時(shí)間(matrix-assisted laser desorption-ionization time-of誦flight, MALDI- TOF ) 質(zhì)謙 (mass spectrometry, MS)分析來(lái)分析樣品。以陽(yáng)離子、反射模式使用2，5-二羥基苯甲酸/2-鞋基-5-甲氧基苯甲酸(9:1，體積/體積)基質(zhì)來(lái)實(shí)施 MALDI-TOF MS分析。小鼠乳來(lái)源抗體中的主要碳水化合物(63%) 是非巖藻糖基化的Man5。圖1顯示通過(guò)PNG酶F消化從所述抗體中 釋放的N-聚糖的MALDI-TOF MS分析。將來(lái)自小鼠乳來(lái)源抗體的結(jié)果 與來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)源抗體的結(jié)果進(jìn)行比較，顯然來(lái)自小鼠乳來(lái)源抗體 的主要寡糖是含有5個(gè)甘露糖殘基和2個(gè)GlcNAc殘基的Man5。
對(duì)PNG酶F在37t:過(guò)夜消化后所釋放的2-氨基苯甲酸標(biāo)記的寡 糖進(jìn)行高壓液相層析(high-pressure liquid chromatography, HPLC )分 析。用PNGF酶在37t:過(guò)夜處理80 jig抗體。用10 kDa濾器過(guò)濾樣品， 然后在生物透析器中用水透析過(guò)夜。干燥樣品，用2-氨基苯甲酸標(biāo)記， 回收以除去過(guò)量的標(biāo)記物。在蒸發(fā)干燥之后，用500 jil水重建樣品，根 據(jù)Anumula等所述的方法(Cammusco等，2000, Anim Biotech 11; 1-17)，使用裝備有熒光檢測(cè)器(230 nm激發(fā)，425 nm發(fā)射)的HP1100 系統(tǒng)將100 nl注入Asahipak NH2P-50 4D柱(4.6 x 250 mm, Phenomenex )。 Man5和Man6標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Prozyme。通過(guò)HPLC分析 進(jìn)行定量，示于圖2。確認(rèn)來(lái)自小鼠乳來(lái)源的抗體種類(lèi)(其與標(biāo)準(zhǔn)Man5 的實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)相同)是甘露糖寡糖的是其Endo H敏感性的證實(shí)(Maley等，1981和Tarentino等，1974)。用EndoH處理之后，Man5峰消失， 證實(shí)了在小鼠乳來(lái)源抗體樣品中36.5分鐘所見(jiàn)峰的身份(圖2和3)。 存在一些次要種類(lèi)，例如含有核心巖藻糖的G1F( 16% )和G2F( 21% )， 以及更少量的非巖藻糖基化的Gl和Man6。含有甘露寡糖結(jié)構(gòu)的雞IgG 含有2068和1906處的種類(lèi)，對(duì)應(yīng)于Man8和GlclMan8 ( Raju等)。 盡管在1420處可檢測(cè)到Man6，但是在1582、 1744和l卯6處的高聚甘 露寡糖明顯不存在。相反，存在于HEK293細(xì)胞來(lái)源的材料中的主要種 類(lèi)是巖藻糖基化的G0F( 55% )和G1F( 37% )， G2F為次要種類(lèi)(8% )。 HEK293細(xì)胞已知無(wú)法有效對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行高水平的唾液酸化(Chitlaru 等，2002; Chitlaru等，1998)。
圖l(MS數(shù)據(jù))和圖2均顯示，乳來(lái)源抗體與細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)源抗 體的碳水化合物組成顯著不同。圖2是使用熒光檢測(cè)的HPLC所獲得的 寡糖圖的比較，顯示小鼠乳來(lái)源抗體中主要的碳水化合物(63%)是非 巖藻糖基化Man5，而細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)源抗體中的主要碳水化合物則被巖 藻糖基化。非糖基化抗體不得到任何峰。HPLC數(shù)據(jù)顯示，乳來(lái)源抗體
伴刀豆球蛋白A (Con A)是一種結(jié)合末端甘露糖殘基的凝集素 (Goldstein等，1965a， Biochim Biophys Acta; Goldstein等，1965b Biochem)。與我們?nèi)閬?lái)源抗體中含有甘露寡糖的發(fā)現(xiàn)一致，其結(jié)合伴刀 豆球蛋白A，并被a-甲基甘露糖苷洗脫(圖4)。來(lái)源于細(xì)胞培養(yǎng)物的 材料中的主要種類(lèi)是具有末端GlcNAc殘基的G0F，預(yù)計(jì)它不結(jié)合伴刀 豆球蛋白A。圖4顯示轉(zhuǎn)基因乳來(lái)源抗體中含有甘露寡糖。相反，所使 用的非糖基化抗體在相同實(shí)驗(yàn)中不結(jié)合。
來(lái)源于HEK293細(xì)胞的材料中存在的主要種類(lèi)是巖藻糖基化的 G0F (55%)和GIF (37%)， G2F為次要種類(lèi)(8%)。這意味著來(lái)源 于細(xì)胞培養(yǎng)物的抗體是完全巖藻糖基化的。來(lái)源于細(xì)胞培養(yǎng)物的抗體中 缺乏唾液酸修飾，因?yàn)橐阎狧EK293無(wú)法有效對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行高水平的唾 液酸化(Chitlaru等，2002; Biochem J 363, 619-631 )。
與來(lái)源于細(xì)胞培養(yǎng)物的抗體中絕大多數(shù)糖基化是巖藻糖基化的情 況相反，小鼠乳來(lái)源抗體中的主要碳水化合物(63°/。)是非巖藻糖基化 Man5。小鼠乳來(lái)源抗體中的主要種類(lèi)與標(biāo)準(zhǔn)Man5的實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)一致。 在HPLC分析中GIF的實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)與Man5接近，但是確認(rèn)該峰是甘露
，而細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)源抗體中缺乏甘露寡糖。糖寡糖的是其Endo H敏感性的證實(shí)(Maley等，1981 ， J Biol Chem 256:1088-1090)。在用EndoH處理之后，小鼠乳來(lái)源抗體樣品中36.5分鐘處可見(jiàn)的峰消失(圖2D)。存在次要種類(lèi)例如含核心巖藻糖的GIF(16% )和G2F ( 21% )，以及更少量的非巖藻糖基化的Gl和Man6。對(duì)山羊乳來(lái)源物質(zhì)中糖的MALDI-TOF分析顯示了比小鼠乳來(lái)源的材料中所見(jiàn)更為廣泛的含甘露糖的糖分布，值得注意的是，Man7和Man8的存在表明甘露糖苷酶加工不足。這使得HPLC分析的定量更加困難，因?yàn)榉菐r藻糖基化糖分散在更寬的范圍內(nèi)。HPLC分析證明存在代表10-20%總糖的許多EndoH敏感峰(圖2 )。
通過(guò)FACS分析評(píng)價(jià)不同形式嵌合抗體的結(jié)合。將2><105個(gè)細(xì)胞與5% FBS的PBS中1 ng/ml濃度的抗體一起孵育。用1:100稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗人Fc ( Jackson Immuno Research Labs )檢測(cè)抗體，通過(guò)FACSCalibur ( Becton Dickinson )進(jìn)行分析。圖5所示數(shù)據(jù)證明，所研究的所有抗體均相似地結(jié)合抗原，無(wú)論其來(lái)源如何.與預(yù)計(jì)一致，抗DNP抗體對(duì)照不結(jié)合，
通過(guò)表面等離子共振在BIAcore2000 i殳備和CM5傳感芯片(BIACORE， Uppsala, Sweden )上測(cè)定IgGl與CD16a相互作用的動(dòng)力學(xué)情況。用NHS/EDC偶聯(lián)條件將抗HPC4抗體固定在所述芯片上。所述抗體濃度是20-50 ng/ml， pH為5.0,得到11000RU的芯片。CD16a-HPC4被捕獲到此抗體表面，其中使用3分鐘注射的30 jig/ml蛋白質(zhì)，流速為5嗎/分鐘，所述蛋白質(zhì)在含有0.15 MNaCl和0.005%(體積/體積)P20表面活性劑(HBS-P緩沖液，BIAcore AB )并加入1mM CaCl2的10 mM Hepes緩沖液(pH7.4 )中。然后將測(cè)試抗體在上述結(jié)合緩沖液中稀釋到50 jig/ml，并以20 jd/分鐘的流速注射到所捕獲的CD16a上一分鐘。監(jiān)測(cè)解離3分鐘。然后，在下一輪的捕獲-結(jié)合-再生之前，用HBS-P緩沖液中制得的5 mM EDTA的3分鐘注射來(lái)再生表面。圖13顯示與來(lái)源于細(xì)胞培養(yǎng)物的抗體相比，乳來(lái)源抗體具有更強(qiáng)的結(jié)合。接著確定這種增強(qiáng)的ADCC活性是否反映為對(duì)NK細(xì)胞受體CD16的親和力提高。使用表面等離子共振測(cè)定測(cè)量多種抗體與固定化CD16的結(jié)合。乳來(lái)源抗體比來(lái)源于細(xì)胞培養(yǎng)物的抗體結(jié)合得更好(圖13 )。勿應(yīng)縱
人腎癌細(xì)胞786-0和人胚腎(human embryonic kidney, HEK)293細(xì)胞購(gòu)自ATCC。 786-0是來(lái)自腎細(xì)胞腺癌的貼壁上皮細(xì)胞(Williams等，1978， /" v,Yra 14: 779-786 )。所述細(xì)胞在調(diào)整為含2 mML-谷氨酰胺、1.5 g/L碳酸氫鈉、4.5 g/L葡萄糖、10 mM HEPES和1.0 mM丙酮酸鈉、90%， 胎牛血清(FBS ) 10%的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
用表達(dá)CD137編碼序列的pCEP4載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。通過(guò)用潮霉素選擇來(lái)分離克隆，通過(guò)FACS對(duì)細(xì)胞表面表達(dá)進(jìn)行篩選，使用一個(gè)克隆。
浙定
為了測(cè)試乳來(lái)源和細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)源的抗體的相對(duì)ADCC活性，制備來(lái)自不同來(lái)源的相同抗體。制備了四種不同形式的嵌合抗CD137抗體。 一種形式是通過(guò)將Asn297突變?yōu)楣劝滨０范蔀榉翘腔?。這作為陰性對(duì)照，因?yàn)橐阎翘腔疘gG不結(jié)合Fc受體，且在ADCC中無(wú)活性(Nose等，1983， PNAS 80: 6632: 6636)。從乳中制備了兩種其它形式的抗體， 一種來(lái)自小鼠乳，另一種來(lái)自山羊乳。第四種形式來(lái)自瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK 293細(xì)胞( 一種人細(xì)胞系)。
使用1:50 Versene (Invitrogen )收集786-0細(xì)胞，重懸于培養(yǎng)基中，使用Na251Cr04 (1 fiC/jil)標(biāo)記1.5小時(shí)，之后用RPMI將細(xì)胞洗滌三遍《 效應(yīng)細(xì)胞是如前之前v犯 Epps等所述(Van Epps等，1999，J Virol 73: 5301-5308)制備的人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral bloodmononuclear cell, PBMC )。使用200:1的效應(yīng)細(xì)胞:耙細(xì)胞比，因?yàn)榻鈨龊驪BMC的成活力只有40-60%。細(xì)胞在37n下共孵育12小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移25 jil上清液用于計(jì)數(shù)。通過(guò)將靶細(xì)胞與等量含抗體培養(yǎng)基(無(wú)PBMC) —起孵育來(lái)測(cè)定自發(fā)釋放。通過(guò)將靶細(xì)胞與等體積含1%Triton-X100 (Sigma)的培養(yǎng)基一起孵育來(lái)測(cè)定總放射性。按照如下計(jì)算特異性裂解百分比([E-S/(T-S))xl00，其中T是總放射性，E是實(shí)驗(yàn)釋放，S是自發(fā)釋放，為19±3%。
為了測(cè)試這些制備物的ADCC活性，鑒定表達(dá)CD137的腫瘤細(xì)胞系。786-0是表達(dá)少量CD137并有時(shí)表達(dá)HER2的腎細(xì)胞癌細(xì)胞系。為了比較不同形式嵌合抗CD137抗體的結(jié)合，使用了 FACS。就這個(gè)此標(biāo)準(zhǔn)而言所有抗體的結(jié)合是相同的(圖5)。但是，當(dāng)在ADCC測(cè)定中測(cè)定活性時(shí)，抗體的效力差別很大。兩種乳來(lái)源蛋白都是有活性的，而來(lái)源于細(xì)胞培養(yǎng)物的材料盡管也結(jié)合，但不具有任何活性(圖6)。無(wú)細(xì)胞時(shí)的細(xì)胞毒性(即自發(fā)釋放)不存在，這證明該抗體自身不具有殺傷性。在圖6中，顯示在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳中所產(chǎn)生的分子具有增強(qiáng)的ADCC活性。此特征提高了轉(zhuǎn)基因乳來(lái)源的抗體殺傷靶細(xì)胞(例如肺瘤細(xì)胞)的能力.所使用的對(duì)照是不應(yīng)結(jié)合靶細(xì)胞的抗DNP抗體以及不應(yīng)結(jié)合Fc受體的非糖基化抗CD137。
還測(cè)試了這些多種制劑對(duì)用CD137表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的ADCC活性。同樣，所有抗體制備均相同地結(jié)合轉(zhuǎn)染細(xì)胞(圖11)。乳來(lái)源抗體的活性是細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)源抗體的兩倍(圖12)。
在一些實(shí)施方案中，增強(qiáng)的ADCC活性是因?yàn)橹劓満愣▍^(qū)的糖基化中缺乏巖藻糖。在小鼠乳中，糖基化主要是前體MansGlcNAc2，而不是巖藻糖。但是發(fā)生了一些加工，因?yàn)椴淮嬖诟呔鄹事短欠N類(lèi).乳來(lái)源抗體Man6可在1420 (圖1)處檢測(cè)到，而1582 ( Man7 )、 1744 ( Man8 )和1906 (Man9)處的高聚甘露寡糖明顯不存在，表明發(fā)生了一些甘露糖苷酶I介導(dǎo)的加工。
N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶I ( GnT-l)是引起生長(zhǎng)中碳水化合物鏈對(duì)高爾基體a-甘露糖苷酶II的敏感性的關(guān)鍵酶。在小鼠乳腺中此酶似乎具有功能性限制，因?yàn)樘腔钄鄬?dǎo)致Man5GlcNAc2的積累(Li等，1978， JBiolChem253: 6426-6431)。這種積累也可以是所述抗體未在此酶所定位的中間高爾基體區(qū)室中度過(guò)足夠時(shí)間的結(jié)果。不能將GlcNAc轉(zhuǎn)移到此鏈阻止了它被高爾基體a-甘露糖苦酶II切割，該酶將允許N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶II (GnT-II)和半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶的進(jìn)一步加工。1,6-巖藻糖在GnT-II修飾之后加入，這解釋了為何甘露寡糖結(jié)構(gòu)不被巖藻糖基化(Longmore等，1982， carbohy Res 100: 365-392)。IgG的這種甘露寡糖糖基化形式之前已在缺乏N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶I活性的Lecl細(xì)胞、CHO細(xì)胞中產(chǎn)生(Wright等，1994， J Exp Med 180:1087-1096)。發(fā)現(xiàn)它在補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血和FcRI結(jié)合中有缺陷。相比于其它抗體，它顯著更多地結(jié)合補(bǔ)體活性旁路途徑中的C3 (Wright等，J Immunol 160: 3393-3402 )。來(lái)源于山羊乳的抗體顯示出更異質(zhì)的糖基化.盡管大量材料進(jìn)行
了 GIF和G2F加工，但含有甘露糖的寡糖為Man5至Man8 (圖1 )。
低水平的巖藻糖消耗導(dǎo)致在ADCC增強(qiáng)中的良好效果.抗體的重鏈?zhǔn)嵌垠w。如果重鏈的糖基化是全或無(wú)的，那么抗體會(huì)在兩條重鏈上均具有甘露寡糖，或者在兩條重鏈上均具有經(jīng)加工的甘露糖Man3GlcNAc2;不會(huì)有混合的二聚體。高水平的ADCC表明，所述鏈?zhǔn)仟?dú)立糖基化的，就增強(qiáng)活性而言?xún)H需一條鏈中缺乏巖藻糖?？贵w鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中多聚化，而糖基化是在高爾基體中完成的。由于重鏈的獨(dú)立糖基化及20%的鏈為高甘露糖，因此僅有4%的抗體分子兩條鏈中均含甘露寡糖，64%的兩條鏈均含加工甘露糖，而其余的32%由一條含甘露寡糖的鏈和一條含加工甘露糖的鏈組成。這使得共有36%的抗體分子具有至少一條甘露寡糖鏈。因此，看來(lái)單個(gè)缺乏巖藻糖的重鏈足以增強(qiáng)ADCC?？紤]到Fc受體與免疫球蛋白分子的不對(duì)稱(chēng)結(jié)合，這是合理的，所述免疫球蛋白分子中大致是Dl區(qū)結(jié)合一條鏈，D2區(qū)結(jié)合另一條鏈(Radaev等，2002， Mol Immun 38: 1073-1083)。因此巖藻糖基化只影響與一個(gè)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，這足以增強(qiáng)親和力。在之前研究中，在巖藻糖基化抗體含有91%巖藻糖、缺乏巖藻糖的抗體含有72%巖藻糖的情況下觀察到了相似的ADCC提高(Shinkawa等，2003， J Biol Chem 278:3466-3473 )。
令人驚奇的是，該實(shí)驗(yàn)在這樣的低抗原密度下運(yùn)行得如此良好。已經(jīng)證明，從IgGl中除去巖藻糖可由于有效活化NK細(xì)胞而降低ADCC活性所需的抗原量。這種作用很可能解釋了用CD137表達(dá)很弱的細(xì)胞系所獲得的優(yōu)良結(jié)果。
小鼠乳中產(chǎn)生的抗體在較高濃度時(shí)具有比山羊乳來(lái)源抗體更高的活性。山羊乳來(lái)源的抗體制備物可含有10%聚集體，所示聚集體可在不結(jié)合靶細(xì)胞的情況下直接結(jié)合PBMC.此非生產(chǎn)性結(jié)合可阻斷PBMC的活性(Kipps等，1985， JExpMedl61: 1-17),
因此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因乳是增強(qiáng)了 ADCC活性的抗體的良好來(lái)源。有報(bào)道稱(chēng)，在昆蟲(chóng)細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體比在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生的相同抗體更加有效(Lang等，2004),嘗試了其它系統(tǒng)但是沒(méi)有成功。在黑曲霉(js/^w,7/ms w&w)產(chǎn)生的抗體不具有增強(qiáng)的ADCC活性，可能是因?yàn)樗欠翘腔贵w和糖基化抗體的混合物(Ward等，2004)。有報(bào)道稱(chēng)，在酵母中產(chǎn)生的嵌合抗體具有與來(lái)源于細(xì)胞培養(yǎng)物的抗體相
同的ADCC活性(Horwitz等，1988 )。 FcyIIIb的活化也導(dǎo)致細(xì)胞因子 的分泌。
在一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)使抗體混合物通過(guò)凝集素柱來(lái)將含 有巖藻糖的抗體與非糖基化抗體分離。
上文不旨在描述本發(fā)明的所有方面或所有實(shí)施方案，并且不以任 何方式限制本發(fā)明。加入并構(gòu)成說(shuō)明書(shū)一部分的附圖展示了本發(fā)明的實(shí) 施方案，并與說(shuō)明書(shū)一起用于解釋本發(fā)明的原理。
本說(shuō)明書(shū)中提及的所有公開(kāi)出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)均通過(guò)參考并入本 文，其程度等同于具體指明將每個(gè)獨(dú)立的公開(kāi)出版物或?qū)＠暾?qǐng)通過(guò)參 考并入本文。
盡管結(jié)合本發(fā)明的具體實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是應(yīng)該理解， 它能夠進(jìn)行其他改變，本申請(qǐng)旨在涵蓋本發(fā)明的任何變化、用途或適應(yīng) 性調(diào)整，這些變化、用途或適應(yīng)性調(diào)整總體上遵循本發(fā)明的原理，并包 括本發(fā)明所屬領(lǐng)域領(lǐng)域中已知或慣用實(shí)踐范圍內(nèi)可用于本文公開(kāi)必要 特征的改動(dòng)。
本文引用的參考文獻(xiàn)不意為承認(rèn)所述參考文*^現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)。參考文獻(xiàn)
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7權(quán)利要求
1. 一種包含乳來(lái)源抗體的組合物，其中所述乳來(lái)源抗體具有增強(qiáng)的抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)活性。
2. 權(quán)利要求l的組合物，其中所述乳來(lái)源抗體的ADCC活性是細(xì) 胞培養(yǎng)物來(lái)源抗體的ADCC活性的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、 7倍、8倍、9倍或10倍。
3. 權(quán)利要求l的組合物，其中所述乳來(lái)源抗體的至少一條鏈中不 含有巖藻糖。
4. 權(quán)利要求3的組合物，其中所述乳來(lái)源抗體中含有甘露寡糖。
5. 權(quán)利要求l的組合物，其中所述乳來(lái)源抗體中含有甘露寡糖。
6. 權(quán)利要求1的組合物，其中至少30%的所述乳來(lái)源抗體中含有 至少一個(gè)甘露寡糖。
7. 權(quán)利要求l的組合物，其中所述乳來(lái)源抗體中的碳水化合物顯 示高甘露糖的糖基化模式。
8. 權(quán)利要求7的組合物，其中所述乳來(lái)源抗體的至少一條鏈含有 甘露寡糖并且是非巖藻糖基化的。
9. 權(quán)利要求l的組合物，其中所述乳來(lái)源抗體中的主要碳水化合 物是非巖藻糖基化的。
10. 權(quán)利要求9的組合物，其中所述主要碳水化合物是非巖藻糖基 化的甘露寡糖。
11. 權(quán)利要求10的組合物，其中所述主要碳水化合物是非巖藻糖基 化的Man5。
12. 權(quán)利要求1的組合物，其中所述乳來(lái)源抗體中少于40%的碳水 化合物含有巖藻糖。
13. 權(quán)利要求l的組合物，其中所述乳來(lái)源抗體中不含有l(wèi),6-巖藻
14. 權(quán)利要求l的組合物，其中所述抗體中至少60"/。的碳7jC化合物 是非巖藻糖基化的甘露寡糖，并且所述抗體中少于40%的碳水化合物含 有巖藻糖。
15. 權(quán)利要求1的組合物，其中所述抗體中63%的碳水化合物是非 巖藻糖基化的甘露寡糖，所述抗體中16。/。的碳水化合物是含有核心巖藻 糖的GIF,并且所述抗體中21%的碳水化合物是含有核心巖藻糖的 G2F。
16. 權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的組合物，其中所述抗體是針對(duì)CD3、 CD4、 CD5、 CD8、 CD14、 CD15、 CD16、 CD19、 CD20、 CD21、 CD22、 CD23、 CD25、 CD32B、 CD30、 CD33、 CD37、 CD38、 CD40、 CD亂、 CD46、 CD52、 CD54、 CD59、 CD74、 CD80、 CD126、 CD138、 CD137或 GPIIbIIIa的單克隆抗體。
17. 權(quán)利要求16的組合物，其中所述單克隆抗體是針對(duì)CD137。
18. 權(quán)利要求1的組合物，其中所述抗體是針對(duì)HM1.24、 HLA-DR、 MUC1、生腱蛋白、PIGF、 VEGF、癌基因、癌基因產(chǎn)物、壞死抗原、17-A1 抗原、IL-2、 TlOl、 TAC、 IL-6、 TRAIL-R1、 GD3神經(jīng)節(jié)苷脂或TRAIL-R2 的單克隆抗體。
19. 權(quán)利要求l的組合物，其中所述乳來(lái)源抗體是嵌合抗體、人源 化抗體或全人抗體。
20. 權(quán)利要求l的組合物，其中所述乳來(lái)源抗體是全長(zhǎng)抗體。
21. 權(quán)利要求20的組合物，其中所述全長(zhǎng)抗體是全長(zhǎng)單鏈抗體。
22. 權(quán)利要求20的組合物，其中所述全長(zhǎng)抗體包含重鏈和輕鏈。
23. 權(quán)利要求l的組合物，其中所述乳來(lái)源抗體是抗體片段。
24. 權(quán)利要求1的組合物，其中所述乳來(lái)源抗體是IgG、 IgA或IgD 同種型。
25. 權(quán)利要求24的組合物，其中所述乳來(lái)源抗體是IgG同種型。
26. 權(quán)利要求25的組合物，其中所述乳來(lái)源抗體是IgGl或IgG2同種型。
27. 權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)的組合物，其還包含可藥用栽體。
28. 權(quán)利要求l-26中任一項(xiàng)的組合物，其還包含其他治療劑。
29. —種治療受試者的方法，其包括以有效增強(qiáng)該受試者中ADCC的量對(duì)有此需要的受試者施用權(quán) 利要求27或28的組合物。
30. —種治療受試者的方法，其包括以有效治療疾病的量對(duì)患該疾病的受試者施用權(quán)利要求27或 28的組合物。
31. 權(quán)利要求30的方法，其中所述疾病是癌癥、淋巴增生性疾病或 自身免疫病。
32. 權(quán)利要求29-31中任一項(xiàng)的方法，其中另外對(duì)所述受試者施用 其它治療劑。
33. 權(quán)利要求32的方法，其中所述其它治療劑是免疫調(diào)節(jié)劑。
34. 權(quán)利要求33的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑是IL-1、 IL-2、 IL-3、 IL-6、 IL-IO、 IL-12、 IL-18、 IL-21、干擾素、紫杉醇、TNF-a或者其組 合。
35. 權(quán)利要求29-31中任一項(xiàng)的方法，其中另外對(duì)所述受試者施用 免疫調(diào)節(jié)劑和曲妥珠單抗.
36. 權(quán)利要求29-31中任一項(xiàng)的方法，其中另外對(duì)所述受試者施用 IL-21。
37. 權(quán)利要求29-31中任一項(xiàng)的方法，其中另外對(duì)所述受試者施用 IL-12。
38. 權(quán)利要求29-31中任一項(xiàng)的方法，其中另外對(duì)所述受試者施用 IL-21和曲妥珠單抗，
39. 權(quán)利要求29-31中任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者是人。
40. —種增強(qiáng)抗體ADCC活性的方法，其包括修飾抗體的糖基化，其中通過(guò)在哺乳動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生 所述抗體來(lái)修飾所述糖基化。
41. 權(quán)利要求40的方法，所述哺乳動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞是經(jīng)改造以在 其乳中表達(dá)所述抗體的非人哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。
42. 權(quán)利要求40或41的方法，其中所述抗體經(jīng)修飾以使該抗體的 至少 一條鏈中不含有巖藻糖。
43. 權(quán)利要求42的方法，其中所述抗體經(jīng)修飾以使該抗體的一條鏈 中不含有巖藻糖。
44. 權(quán)利要求43的方法，其中所述抗體經(jīng)修飾以使其含有甘露寡糖 或額外的甘露寡糖，
45. 權(quán)利要求40或41的方法，其中所述抗體經(jīng)修飾以使其含有甘 露寡糖或額外的甘露寡糖。
46. 權(quán)利要求40或41的方法，其中所述抗體經(jīng)修飾以使該抗體中 的碳水化合物顯示高甘露糖的糖基化模式。
47. 權(quán)利要求46的方法，其中所述抗體經(jīng)修飾以使該抗體的至少一 條鏈含有甘露寡糖并且是非巖藻糖基化的。
48. 權(quán)利要求47的方法，其中所述抗體經(jīng)修飾以使該抗體的一條鏈 含有甘露寡糖并且是非巖藻糖基化的。
49. 權(quán)利要求40或41的方法，其中所述抗體經(jīng)1務(wù)飾以使該抗體中 的主要碳水化合物是非巖藻糖基化的。
50. 權(quán)利要求49的方法，其中所述主要碳水化合物是非巖藻糖基化 的甘露寡糖。
51. 權(quán)利要求50的方法，其中所述主要碳水化合物是非巖藻糖基化 的Man5。
52. 權(quán)利要求40或41的方法，其中所述抗體經(jīng)修飾以使該抗體中 少于40%的碳水化合物含有巖藻糖。
53. 權(quán)利要求40或41的方法，其中所述抗體經(jīng)修飾以使至少30% 的所述抗體含有至少一個(gè)甘露寡糖。
54. —種方法，其包括(a)從經(jīng)改造以在其乳中表達(dá)抗體的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物的乳 中收集抗體；和(b )測(cè)定所述抗體的ADCC活性。
55. 權(quán)利要求54的方法，其中所述方法還包括(c)將所收集抗體的ADCC活性與細(xì)胞培養(yǎng)物中所表達(dá)抗體的 ADCC活性進(jìn)行比較.
56. 權(quán)利要求54的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物是山羊、綿 羊、野牛、駱駝、牛、豬、兔、水牛、馬、大鼠、小鼠或美洲駝，
57. 用于產(chǎn)生抗體的方法，其包括(a)從經(jīng)改造以表達(dá)所述抗體的乳腺上皮細(xì)胞中收集抗體；和 (b )測(cè)定所述抗體的ADCC活性。
58. 權(quán)利要求57的方法，其中所述方法還包括(c)將所收集抗體的ADCC活性與非乳腺細(xì)胞中所表達(dá)抗體的 ADCC活性進(jìn)行比較。
59. 包含來(lái)源于乳腺上皮細(xì)胞的抗體的組合物，其中所述抗體具有 增強(qiáng)的抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)活性。
60. 權(quán)利要求59的組合物，其中所述抗體的ADCC活性是來(lái)源于 非乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)物之抗體的ADCC活性的至少2倍、3倍、4倍、 5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。
61. 權(quán)利要求59的組合物，其中所述抗體的至少一條鏈中不含有巖藻糖。
62. 權(quán)利要求61的組合物，其中所述抗體中含有甘露寡糖。
63. 權(quán)利要求59的組合物，其中所述抗體中含有甘露寡糖。
64. 權(quán)利要求59的組合物，其中至少30%的所述抗體中含有至少 一個(gè)甘露寡糖。
65. 權(quán)利要求59的組合物，其中所述抗體中的碳水化合物顯示高甘 露糖的糖基化模式。
66. 權(quán)利要求65的組合物，其中所述抗體的至少一條鏈含有甘露寡 糖并且是非巖藻糖基化的。
67. 權(quán)利要求59的組合物，其中所述抗體中的主要碳水化合物是非 巖藻糖基化的。
68. 權(quán)利要求67的組合物，其中所述主要碳水化合物是非巖藻糖基 化的甘露寡糖。
69. 權(quán)利要求68的組合物，其中所述主要碳水化合物是非巖藻糖基 化Man5'
70. 權(quán)利要求59的組合物，其中所述抗體中少于40%的碳水化合 物含有巖藻糖。
71. 權(quán)利要求59的組合物，其中所述抗體中不含有1，6-巖藻糖。
72. 權(quán)利要求59的組合物，其中所述抗體中至少60%的碳水化合 物是非巖藻糖基化的甘露寡糖，并且所述抗體中少于40%的碳水化合物 含有巖藻糖。
73. 權(quán)利要求59的組合物，其中所述抗體中63%的碳水化合物是 非巖藻糖基化的甘露寡糖，所述抗體中16%的碳水化合物是含有核心巖 藻糖的G1F，并且所述抗體中21%的碳水化合物是含有核心巖藻糖的 G2F。
74. 權(quán)利要求59-73任一項(xiàng)的組合物，其中所述抗體是針對(duì)CD3、CD4、 CD5、 CD8、 CD14、 CD15、 CD16、 CD19、 CD20、 CD21、 CD22、 CD23、 CD25、 CD32B、 CD30、 CD33、 CD37、 CD38、 CD40、 CD40L、 CD46、 CD52、 CD54、 CD59、 CD74、 CD80、 CD126、 CD138、 CD137或 GPIIbIIIa的單克隆抗體。
75. 權(quán)利要求74的組合物，其中所述單克隆抗體是針對(duì)CD137。
76. 權(quán)利要求59的組合物，其中所述抗體是針對(duì)HML24、HLA-DR、 MUC1、生腱蛋白、PIGF、 VEGF、癌基因、癌基因產(chǎn)物、壞死抗原、17-A1 抗原、IL-2、 TlOl、 TAC、 IL-6、 TRAIL-R1、 GD3神經(jīng)節(jié)苷脂或TRAIL-R2 的單克隆抗體。
77. 權(quán)利要求59的組合物，其中所述抗體是嵌合抗體、人源化抗體 或全人抗體。
78.權(quán)利要求59的組合物，其中所述抗體是全長(zhǎng)抗體。
79.權(quán)利要求78的組合物，其中所述全長(zhǎng)抗體是全長(zhǎng)單鏈抗體.
80.權(quán)利要求78的組合物，其中所述全長(zhǎng)抗體包含重鏈和輕鏈。
81.權(quán)利要求59的組合物，其中所述抗體是抗體片段。
82.權(quán)利要求59的組合物，其中所述抗體是IgG、 IgA或IgD同種
83.權(quán)利要求82的組合物，其中所述抗體是IgG同種型。
84.權(quán)利要求83的組合物，其中所述抗體是IgGl或IgG2同種型。
85.權(quán)利要求1-84中任一項(xiàng)的組合物，其還包含可藥用載體。
86. 權(quán)利要求1-84中任一項(xiàng)的組合物，其還包含其他治療劑。
87. —種治療受試者的方法，其包括以有效增強(qiáng)該受試者中ADCC的量對(duì)有此需要的受試者施用權(quán)利 要求85或86的組合物。
88. —種治療受試者的方法，其包括以有效治療疾病的量對(duì)患所述疾病的受試者施用權(quán)利要求85或86的組合物。
89.權(quán)利要求88的方法，其中所述疾病是癌癥、淋巴增生性疾病或自身免疫病。
90.權(quán)利要求87-89中任一項(xiàng)的方法，其中另外對(duì)所述受試者施用其它治療劑。
91. 權(quán)利要求90的方法，其中所述其它治療劑是免疫調(diào)節(jié)劑。
92. 權(quán)利要求91的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑是IL-1、 IL-2、 IL-3、IL-6、 IL-IO、 IL-12、 IL-18、 IL-21、干擾素、紫杉醇、TNF-a或者其組合。
93. 權(quán)利要求87-89中任一項(xiàng)的方法，其中另外對(duì)所述受試者施用免疫調(diào)節(jié)劑和曲妥珠單抗。
94. 權(quán)利要求87-89中任一項(xiàng)的方法，其中另外對(duì)所述受試者施用IL-21。
95. 權(quán)利要求87-89中任一項(xiàng)的方法，其中另外對(duì)所述受試者施用IL-12'
96. 權(quán)利要求87-89中任一項(xiàng)的方法，其中另外對(duì)所述受試者施用IL-21和曲妥珠單抗。
97. 權(quán)利要求87-89中任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者是人。
全文摘要
本發(fā)明的一部分涉及具有提高的ADCC活性的抗體。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)這些抗體的方法。本發(fā)明的抗體在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生，例如經(jīng)改造在其乳中表達(dá)和分泌所述抗體的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳腺上皮細(xì)胞。所述抗體或包含所述抗體的組合物可用于治療其中ADCC活性提供益處的疾病。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體或包含所述抗體的組合物可用于治療癌癥、淋巴增生性疾病或自身免疫病。
文檔編號(hào)C07K16/04GK101484470SQ200680048006
公開(kāi)日2009年7月15日 申請(qǐng)日期2006年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月21日
發(fā)明者丹尼爾·申德勒, 哈里·M·米德, 約翰·麥克弗森, 蒂莫西·埃德蒙茲 申請(qǐng)人:Gtc生物治療有限公司