專利名稱：：IL-15Rαsushi結(jié)構(gòu)域作為通過(guò)IL-15Rβ/γ的IL-15作用的選擇性和有效的增強(qiáng)劑以及超...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及細(xì)胞因子誘導(dǎo)的和/或細(xì)胞因子刺激的生物響應(yīng)領(lǐng)i或，更具體地涉及IL-15誘導(dǎo)和/或IL-15刺激的生物響應(yīng)領(lǐng)域，并尤其涉及那些包含IL15R/3/7信號(hào)通^各的生物響應(yīng)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：IL-15是一種細(xì)胞因子，其類似于IL-2,起初被描述為T(mén)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(l)。這兩種細(xì)胞因子屬于四個(gè)a-螺旋束家族，并且它們的膜受體共有兩個(gè)負(fù)責(zé)信號(hào)傳導(dǎo)的亞單位(IL-2R/IL-15Rp和y鏈)(2)。IL-2Rp/Y復(fù)合物是這兩種細(xì)胞因子的中等親合力受體。其主要被大多數(shù)NK細(xì)胞表達(dá)，并能夠在體外被納摩爾濃度的IL-2或IL-15活化。在例如活化T細(xì)胞上表達(dá)并能夠被皮摩爾濃度的任一細(xì)胞因子活化的高親合力IL-2和IL-15受體另外含有它們自身特有的a鏈(IL-2Ra和IL-15Ra)，其賦予細(xì)胞因子特異性并增強(qiáng)細(xì)胞因子結(jié)合的親合力(3)。兩種細(xì)胞因子均在先天的和適應(yīng)的免疫性中起關(guān)鍵作用。盡管最初的體外實(shí)驗(yàn)顯示4交大的功能重疊(活化、淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的誘導(dǎo)、B細(xì)胞增殖和免疫球蛋白合成的共刺激，T細(xì)胞的化學(xué)誘導(dǎo))(1,4-6)，但最近的實(shí)驗(yàn)表明這兩種細(xì)胞因子在體內(nèi)顯示互補(bǔ)的甚至相反的作用。小鼠中IL-2或IL-2Ra敲除與具有增加的活化T和B細(xì)胞總體自身免疫顯型相關(guān)，而IL-15和IL-15Ra敲除則導(dǎo)致NK、NK-T、上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和記憶CD8T細(xì)胞中的特異性缺陷(7，8)。此外，IL-2通過(guò)誘導(dǎo)激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(AICD)而促進(jìn)外周耐受，而IL-15抑制IL-2介導(dǎo)的AICD(9),并且不同于IL-2,IL-15是CD8記憶T細(xì)胞的存活因子(IO)。根據(jù)這些觀察結(jié)果，已提出IL-2的主要作用是限制活化T細(xì)胞的連續(xù)擴(kuò)張，而IL-15對(duì)于T細(xì)胞分裂的起始和記憶T細(xì)胞的存活是關(guān)鍵的(ll)。已描述了IL-15轉(zhuǎn)呈遞的新機(jī)理，其中通過(guò)抗原呈遞細(xì)胞(單核細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞)協(xié)同表達(dá)IL-15和IL-15Ra,并且與IL-15Ra結(jié)合的IL-15以轉(zhuǎn)呈遞到僅表達(dá)IL-15Rp/y受體的鄰近NK或CD8T細(xì)胞(12)。作為共刺激事件發(fā)生于免疫突觸的IL-15轉(zhuǎn)呈遞，現(xiàn)在似乎是IL-15體內(nèi)作用的主要機(jī)理(13，14)。這表明其在腫瘤免疫監(jiān)視中起主要作用(15)。IL-15Ra和IL-2Ra亞單位形成細(xì)胞因子受體的亞家族，因?yàn)樵谒鼈兊腘-末端胞外部分它們包括所謂的"sushi"結(jié)構(gòu)域(在IL-15Ra中一個(gè)，在IL-2Ra中兩個(gè))，所述sushi結(jié)構(gòu)域也發(fā)現(xiàn)于補(bǔ)體或粘著分子中(16)。在兩種情況下均顯示這些sushi結(jié)構(gòu)域帶有負(fù)責(zé)細(xì)胞因子結(jié)合的大部分結(jié)構(gòu)元件。單獨(dú)的IL-2Ra是IL-2的低親合力受體(Kd=10nM)，而IL-15Ra以高親合力與正-15結(jié)合(1:(1=100pM)。IL-2Ra通過(guò)蛋白水解的脫落是參與淋巴細(xì)胞活化的向下調(diào)節(jié)的自然機(jī)理。IL-2Ra被主要的螨過(guò)敏原Derpl裂解以抑制Thl細(xì)胞并偏愛(ài)過(guò)敏環(huán)境(17),并且被源自胂瘤的金屬蛋白酶裂解以抑制遭遇癌的T細(xì)胞的增殖(18)。由此產(chǎn)生的可溶性IL-2Ra在體外是IL-2作用的竟?fàn)幮砸种苿Ｈ欢?，它仍然是低親合力IL-2結(jié)合物，并且不太可能有效參與體內(nèi)IL-2活性的向下調(diào)節(jié)。最近顯示人IL-15Ra的可溶形式也能夠由IL-15Ra陽(yáng)性細(xì)月包通過(guò)涉及MMPs的脫落過(guò)程而自然釋放(19)。與可溶性IL-2Ra相反，該可溶性IL-15Ra受體能夠以高親合力與IL-15結(jié)合，并有效封閉通過(guò)高親合力IL-15Ra/p/y信號(hào)復(fù)合物驅(qū)動(dòng)的增殖。該結(jié)果與sIL-15Ra作為拮抗劑的行為(如同其同系物sIL-2Ra)的概念一致，并且與小鼠sIL-15Ra在體外和體內(nèi)的抑制作用一致(20,21)。在此，本發(fā)明人顯示基本由IL-15R阿爾法(^L-15Ra)的sushi結(jié)構(gòu)域組成的片段具有相反的作用。這樣的片段能夠通過(guò)IL-15R貝塔/伽瑪(=IL-15R(3/力中等親合力受體增強(qiáng)IL-15的結(jié)合以及生物活性，而不影響那些通過(guò)高親合力受體的IL-15的結(jié)合以及生物活性。此外，本發(fā)明人描述了作為IL-15Rp/y復(fù)合物的有效超激動(dòng)劑起作用的融會(huì)蛋白。這樣的融合蛋白包括IL-15R/3Ay結(jié)合體，例如IL-15(或其保守片段、激動(dòng)劑、模擬物)，所述IL-15R/5Ay結(jié)合體通過(guò)諸如柔性連接區(qū)的共價(jià)連接與保留IL-15Ra的sushi結(jié)構(gòu)域的IL-15Rot或IL-15Ra片,爻融合。據(jù)本發(fā)明人所知，僅有一篇現(xiàn)有4支術(shù)報(bào)道了包括IL-15Rce相關(guān)元件的化合物，即可商購(gòu)形式的可溶性IL-15Ra的刺激作用。該現(xiàn)有4支術(shù)為Giron-Michel等人發(fā)表的題為"Mem6rawe-Z)o回of朋j/mwc"ow51ow/mmawAae,鄉(xiāng)o/Wc/ragem7ora卩應(yīng)潛合的X溶'^的/l-"/^-"/^復(fù)合務(wù)對(duì)乂類造j&源^^為v么yr子和^雜/，的文章(Blood,1October2005,Vol.106，No.7，pp.2302-2310;2005年6月網(wǎng)絡(luò)預(yù)出版)。Giron-Michel等人的出版物公開(kāi)了(參見(jiàn)Giron-Micheletal.中圖7):-當(dāng)重組IL-15(rlL-15)以10ng/ml的劑量使用時(shí)誘導(dǎo)顯著的抗凋亡效應(yīng)，并且-在0.1ng/mL的劑量下rIL-15不i秀導(dǎo)任何顯著的抗凋亡效應(yīng)，但是-當(dāng)rIL-15與可溶性IL-15Ra的可商購(gòu)形式共同4吏用時(shí)在0.1ng/mL的劑量下誘導(dǎo)顯著的抗凋亡效應(yīng)。Giron-Michel等人所用的可溶性IL-15Ra是IL-15Ra的可商購(gòu)形式(購(gòu)自R&DSystems,參照符號(hào)147-IR)。該可溶性IL-15Ra是可溶性IL-15Ra的修飾形式，其缺少外顯子3。因此Giron-Michel等人所用的可溶性IL-15Ra的形式包括IL-15Ra的外顯子2編碼部分，直接連接于IL-15Ra的外顯子4編碼部分，不包含任何IL-15Ro;的外顯子3編碼部分。因此Giron-Michel等人所用的可溶性IL-15Ra的形式不對(duì)應(yīng)于IL-15R0!的片段，而對(duì)應(yīng)于其4務(wù)飾形式。Giron-Michel等人所用的可溶性IL-15Ra的形式還包括與其共《介連接的Fc片段(人IgG)。Fc片段不與IL-15R/8Ay結(jié)合。因此Giron-Michel等人的出版物沒(méi)有公開(kāi)其中可溶性IL-15Ra形式與IL-15R/5Ay結(jié)合體共價(jià)結(jié)合的任何化合物。Giron-Michel等人的出版物還公開(kāi)了抗凋亡效應(yīng)，但沒(méi)有公開(kāi)對(duì)IL-15R0Ay陽(yáng)性細(xì)胞的增殖和/或活化的任何效應(yīng)。能夠進(jìn)一步指出，所公開(kāi)的抗凋亡效應(yīng)測(cè)定不包括任何含有下列成分的對(duì)照樣品(i)沒(méi)有rIL-15存在下的可溶性IL-15Rce-Fc片段或(ii)不具有任何Fc片段的可溶性IL-15Rce。因此所公開(kāi)的抗凋亡效應(yīng)不能直接歸因于所用化合物的IL-15Ra部分。另外，Giron-Michel等人的出版物不包含IL-15Ra的sushi結(jié)構(gòu)域的任何線索(也不包含該現(xiàn)有技術(shù)中所用的可溶性IL-15Ra形式中不存在的鉸鏈區(qū)的線索)，也不包含IL-15jS/7信號(hào)通路的線索。本發(fā)明首次描述了對(duì)IL-15生物作用的誘導(dǎo)和/或刺激、IL-15|SAy信號(hào)通路的特異性觸發(fā)以及NK和/或T細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)和/或刺激的必要和尤其有利的結(jié)構(gòu)單元。因此本發(fā)明代表對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)貢獻(xiàn)，其能夠?qū)崿F(xiàn)先前未達(dá)到的生物和醫(yī)藥應(yīng)用。因此，本發(fā)明人相信，當(dāng)在先驗(yàn)的基礎(chǔ)上分析時(shí)，Giron-Michel等人的出版物沒(méi)有向本領(lǐng)域技術(shù)人員教導(dǎo)請(qǐng)求保護(hù)的本發(fā)明，也沒(méi)有引導(dǎo)技術(shù)人員至請(qǐng)求保護(hù)的本發(fā)明。發(fā)明概述本發(fā)明涉及IL-15R/3/7信號(hào)通路以及諸如NK和/或T細(xì)胞的IL-15R/3Ay陽(yáng)性細(xì)胞的活化和/或增殖的誘導(dǎo)和/或刺激和/或凋亡的防止。本發(fā)明證明IL-15Ra胞外區(qū)能夠通過(guò)IL-15Rj8Ay信號(hào)通路作為IL-15生物作用的激動(dòng)劑起作用。本發(fā)明特別證明IL-15Ro;胞外區(qū)能夠刺激和/或誘導(dǎo)諸如NK和/或T細(xì)胞的IL-15R/3/7陽(yáng)性細(xì)胞的增殖和/或活化，和/或防止凋亡。本發(fā)明證明包含在該IL-15Ra胞外區(qū)中賦予這樣的激動(dòng)劑作用所需的最小結(jié)構(gòu)單元是IL-15Ra胞外區(qū)的sushi結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還證明該IL-15Ra胞外區(qū)的鉸鏈區(qū)和尾區(qū)顯著增加該激動(dòng)劑作用的效率。本發(fā)明還提供這樣的化合物，其生物活性與野生型IL-15相比顯示30至150倍的增加，并且其甚至比IL-15與可溶性IL-15Rasushi結(jié)構(gòu)域的簡(jiǎn)單締合更有效。本發(fā)明涉及詳細(xì)描述部分所描述的目標(biāo)，并且更具體地涉及所附的權(quán)利要求中所定義的那些目標(biāo)。附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1.各種可溶性IL-15Ra蛋白對(duì)IL-15的結(jié)合親合力.與增加濃度的rIL-15(3.1nM、6.2nM、12.5nM、25nM、50nM和100nM)結(jié)合(締合和離解相)以固定(j)sIL-15Ra-IL曙2、(5)sIL國(guó)15Ra國(guó)sushi誦IL國(guó)2或(C)IL-15Ra-sushi的SPR傳感圖。(D):用與TF-1細(xì)胞結(jié)合的放射性石輿化的rIL-15(200pM)進(jìn)行的sIL-15Ra畫(huà)sushi()、sIL-15Ra-IL-2(令)或sIL-15Ra-sushi-IL-2(A)的竟?fàn)幯芯?。與增加濃度的rIL-15(1nM、2.5nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM)結(jié)合(締合和離解相)以固定(E)sIL-15Ra-Sushi+的SPR傳感圖圖2.通過(guò)IL-15RP對(duì)IL-15誘導(dǎo)的增殖的影響。通過(guò)并入[311]-胸苷評(píng)價(jià)Mo-7細(xì)胞的增殖。用增加濃度的人rIL-15(j)或人rlL-2(5)，不在(參)或在(O)固定濃度(IOnM)的sIL-15Ra-sushi存在下培養(yǎng)細(xì)胞。(C):不用(參)或用增加濃度的sIL-15Ra-sushi()，在1nMrIL-15存在下培養(yǎng)細(xì)胞。(￡>):用增加濃度的rIL-15(*)、IL-15和sIL-15Ra-sushi的等摩爾混合物(O)、RLI(A)或ILR融合蛋白(A)培養(yǎng)細(xì)胞。用于表達(dá)RLI和ILR融合蛋白的分子構(gòu)建體。IL-15Rasp:人IL-15Ra信號(hào)肽，pplsp:牛泌乳素前體信號(hào)肽。(F):融合蛋白的三維模型結(jié)構(gòu)。圖3.通過(guò)IL-15Rp/y對(duì)IL-15誘導(dǎo)的預(yù)防凋亡的影響。使用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法通過(guò)膜聯(lián)蛋白V細(xì)胞表面表達(dá)評(píng)價(jià)凋亡。實(shí)柱狀圖(Ja)表示實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)膜聯(lián)蛋白V在Mo-7上染色。不用046)或用固定濃度的人rlL-15(500pM)(Jc),不在(實(shí)柱狀圖)或在(實(shí)線)sIL-15Ra-sushi(10nM)的存在下將細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)。(5):不在外源細(xì)胞因子(參)的存在下或在rIL-15C500pM)C〇)、sIL-15Ra-sushi(10nM)(□)、sIL畫(huà)15Ra國(guó)sushi(10nM)力。rIL-15(500pM)(O)或RLI(500pM)(A)的存在下膜聯(lián)蛋白V在Mo-7細(xì)胞上表達(dá)的動(dòng)力學(xué)。(C):用增加濃度的rIL-15，不在(O)或在(O)固定濃度(IOnM)的sIL-15Ra-sushi存在下培養(yǎng)Mo-7細(xì)胞，或用增加濃度的RLI(A)培養(yǎng)Mo-7細(xì)胞。圖4.sIL-15Ra-sushi對(duì)結(jié)合到IL-15Rp/y上的IL-15的激動(dòng)劑作用。RLI的結(jié)合與內(nèi)在化，(A):不在(B)或在(口)10nMsIL-15Ra-sushi的存在下1251標(biāo)記的rIL-15與Mo7細(xì)胞的結(jié)合。(萬(wàn))1251標(biāo)記的RLI融合蛋白的結(jié)合。插入的圖中顯示Scatchard圖。(C):1251標(biāo)記的RLI融合蛋白的內(nèi)在化(500pM)。圖5.通過(guò)IL-15Ra/p/y受體對(duì)IL-15誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和凋亡的影響。用增加濃度的rIL-15(*)、rIL-15和sIL-15Ra-sushi的等摩爾混合物(O)、RLIO)或ILR融合蛋白(A)培養(yǎng)的Kit225(A)和TF-lp(B)細(xì)胞對(duì)pH]-胸苷的并入。(C):實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)(Oz)、不用(C6)或用固定濃度的人rIL-15(500pM)(C。，不在(實(shí)柱狀圖)或在(實(shí)線)sIL-15Ra-sushi蛋白(IOnM)的存在下、或在10pM的RLI(OZ)存在下培養(yǎng)48小時(shí)后膜聯(lián)蛋白V對(duì)TF-ip的染色。(Z)):不在外源細(xì)胞因子(O)或在rIL-15(10pM)(參)、sIL-15Ra-sushi(10nM)(□)、sIL曙15Ra儒hi(10nM)加rIL-15(10pM)(O)或RLI融合蛋白(10pM)(A)存在下的染色動(dòng)力學(xué)。用增加濃度的rIL-15，不在(參)或在(O)固定濃度(10nM)的sIL-15Ra-sushi存在下培養(yǎng)48小時(shí)后的染色，或用增加濃度的RLI融合蛋白(A)培養(yǎng)48小時(shí)后的染色。圖6.sIL-15Ra-sushi和RLI對(duì)TF-ip細(xì)胞的結(jié)合與內(nèi)在化.sIL-15Ra-sushi對(duì)IL-15結(jié)合的影響。(A):1251標(biāo)記的rIL-15不在(B)或在(口)10nMsIL-lSRa-sushi存在下的飽和結(jié)合曲線。(S):增加濃度的sIL-15Ra-sushi對(duì)固定濃度的放射性碘化的rIL-15(200pM)的結(jié)合的影響。(C):1251標(biāo)記的sIL-15Ra-sushi在lnMrlL-15存在下的飽和結(jié)合曲線以及(D)后續(xù)的內(nèi)在化。(五)1251標(biāo)記的RLI的飽和結(jié)合曲線以及("后續(xù)的內(nèi)在化。圖7:提出的sIL-15Ra與sIL-15Ra-sushi的差異影響的才莫型。(A)在IL-15Ra/p/Y受體的情況下，sIL-15Ra與膜IL-15Ra竟?fàn)幗Y(jié)合IL-15。(5)在IL-15RpA/受體的情況下，sIL-15Ra-sushi與IL-15形成復(fù)合物，其比單獨(dú)的IL-15更有效地活化IL-15Rp/y復(fù)合物。RLI或ILR融合蛋白放大該激動(dòng)劑作用。(C)在IL-15Ra/p/丫受體的情況下，sIL-15Ra-sushi與膜IL-15Ra的竟?fàn)幮瘦^低，或者其與膜IL-15Ra竟?fàn)帲⑶襰IL-15Ra-sushi與IL-15的復(fù)合物與在(5)中類似，活化過(guò)量的IL-15R(3/y復(fù)合物。圖8-42顯示氨基酸和核酸序列，其序列號(hào)列于表4(表4位于參考文獻(xiàn)之后，權(quán)利要求之前)。圖8:人野生型IL-15RacDNA(SEQIDN0:1)。圖9:人野生型IL-15Ra的CDS(SEQIDNO:2)，以及人野生型IL-15Ra蛋白(SEQIDNO:3)。圖10:人野生型IL-15Ra的信號(hào)肽的CDS和氨基酸序列(SEQIDNO:4和NO:5),以及成熟肽的CDS和氨基酸序列(SEQIDNO:6和NO:7)。圖ll:人野生型IL-15Ra的外顯子1至5的核酸序列(SEQIDNO:8-12)。圖12:人野生型IL-15Ra的sushi結(jié)構(gòu)域的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:13-14),以及包含sushi結(jié)構(gòu)域的人野生型IL-15Ra片段的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:15和NO:16)。圖13:包含sushi結(jié)構(gòu)域的人野生型IL-15Ra片段的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:17和NO:18)。圖14:人野生型IL-15Ra的鉸鏈區(qū)以及該鉸鏈區(qū)的片段的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:19和NO:20)。圖15:包含sushi結(jié)構(gòu)域的人野生型IL-15Ra片段和鉸鏈區(qū)的片段的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:21-24)。圖16:包含sushi結(jié)構(gòu)域的人野生型IL-15Ra片段和鉸鏈區(qū)的片段的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:25-28)。圖17:包含sushi結(jié)構(gòu)域的人野生型IL-15Ra片段和鉸鏈區(qū)的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:29-30)。圖18:人野生型IL-15Ra的富含糖基化位點(diǎn)的區(qū)域的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:31-32)。圖19:人野生型IL-15Ra富含糖基化位點(diǎn)的區(qū)域的外顯子3編碼的部分的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:33-34)，以及包含sushi結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)以及富含糖基化位點(diǎn)的區(qū)域的外顯子3編碼的部分的IL-15Ra片段的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:35-36)。圖20:人野生型IL-15Ra的可溶性胞外區(qū)片段的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:37-38)。圖21:人野生型IL-15Ra的可溶性胞外區(qū)的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:39-40)。圖22:人IL-15Ra可溶性的、刪除信號(hào)肽的胞外結(jié)構(gòu)域片段的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:41-42)。圖23:人IL-15Ra可溶性的、刪除信號(hào)肽的胞外結(jié)構(gòu)域的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:43-44)。圖24:人野生型IL-15的核酸序列(SEQIDNO:45)。圖25:人野生型IL-15前體蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:46),人野生型成熟IL-15的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:47-48)。圖26:兩種柔性連接區(qū)的核酸和氨基酸序列(連接區(qū)20SEQIDNO:49-50;連接區(qū)26SEQIDNO:51-52)。圖27:Flag標(biāo)簽和Xa結(jié)合位點(diǎn)的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:53-56),牛泌乳素前體信號(hào)肽的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:57-58),以及IL-15R的核酸序列和泌乳素前體Kozak序列。圖28:RLI的核酸和氨基酸序列(本發(fā)明的融合蛋白；SEQIDNO:59-60)。RLI融合蛋白=IL-15Ra的信號(hào)肽+Flag標(biāo)簽和Xa結(jié)合位點(diǎn)+it+sushi+i+rd+11個(gè)外顯子3編碼的aa+連接區(qū)26+人野生型成熟IL-15。圖29:ILR的核酸和氨基酸序列(本發(fā)明的融合蛋白；SEQIDNO:61-62)。ILR融合蛋白=牛泌乳素前體信號(hào)肽+Flag標(biāo)簽和Xa結(jié)合位點(diǎn)+人野生型成熟IL-15+連接區(qū)26+it+sushi+i+rd+11個(gè)外顯子3編碼的氨基酸。圖30:人野生型IL-2的核酸序列(SEQIDNO:63)。圖31:人野生型成熟IL-2的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:64-65),以及用于將IL-2連接于IL-15Ra的含sushi片段的連接區(qū)的才亥酸和氨基酸序列。圖32:連接有IL-2的IL-15Ra的含sushi片段的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:66-67)。圖33:連接有IL-2的IL-15Ra的含sushi片段(胞外IL-15Ra片段)的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:68-69)。圖34:小家鼠IL-15Ra的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:72-73)。圖35:小家鼠IL-15Ra胞外區(qū)的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:74)、sushi結(jié)構(gòu)域的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:75)、鉸鏈區(qū)的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:76)以及尾區(qū)的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:77).圖36:黑猩猩IL-15Ra的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:78-79)。圖37:黑猩猩IL-15Ra胞外區(qū)的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:80)、sushi結(jié)構(gòu)域的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:81)、鉸鏈區(qū)的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:82)以及尾區(qū)的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:83)。圖38:褐家鼠IL-15Ra的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:84-85)。圖39:褐家鼠IL-15Ra胞外區(qū)的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:86)、sushi結(jié)構(gòu)域的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:87)、鉸鏈區(qū)的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:88)以及尾區(qū)的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:89)。圖40:小家鼠IL-15Ra的外顯子3的核酸序列(SEQIDNO:90)、黑猩猩IL-15Ra的外顯子3的核酸序列(SEQIDNO:91)以及褐家鼠IL-15Ra的外顯子3的核酸序列(SEQIDNO:92)。圖41:人IL-15Ra的外顯子3編碼部分的氨基酸序列(SEQIDNO:93)、小家鼠IL-15Ra的外顯子3編碼部分的氨基酸序列(SEQIDNO:94)、黑猩猩IL-15Ro;的外顯子3編碼部分的氨基酸序列(SEQIDNO:95)以及褐家鼠IL-15Ra的外顯子3編碼部分的氨基酸序列(SEQIDNO:96)。圖42:人IL-15Ra的外顯子2編碼部分的氨基酸序列(SEQIDNO:24)、小家鼠IL-15Ra的外顯子2編碼部分的氨基酸序列(SEQIDNO:97)、黑猩猩IL-15Ra的外顯子2編碼部分的氨基酸序列(SEQIDNO:98)以及褐家鼠IL-15Ra的外顯子2編碼部分的氨基酸序列(SEQIDNO:99)。發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及IL-15Ra,并涉及包含至少一個(gè)IL-15Rasushi結(jié)構(gòu)i或的IL-15Rce片段。本發(fā)明涉及這樣的產(chǎn)物，其能夠用于刺激IL-15R/5Ay信號(hào)通路，/人而i秀導(dǎo)和/或刺激諸如NK和/或T細(xì)胞的IL-15Rj8/7陽(yáng)性細(xì)胞的活化^和/或增殖和/或預(yù)防所述細(xì)^>凋亡。本發(fā)明涉及分離的含sushi多肽，其含有包括在IL-15Ra的胞外區(qū)的sushi結(jié)構(gòu)域，即本發(fā)明涉及由IL-15Ra胞外區(qū)組成的分離的片段，并涉及保留了sushi結(jié)構(gòu)域的所述片段的亞片段。本發(fā)明的含sushi多肽能夠共價(jià)連接于或未共價(jià)連接于至少一個(gè)IL-15Ri8Ay結(jié)合體。本發(fā)明更具體地涉及包含至少這樣的與至少一個(gè)IL-15Ri3Ay結(jié)合體直接或間接共價(jià)連接的含sushi多肽的共價(jià)連接的化合物。這樣的化合物與野生型IL-15相比，其生物活性能夠增加30至150倍，并且比IL-15與可溶性IL-15Rasushi結(jié)構(gòu)域的自由締合更有凌文。IL-15Ri8/7結(jié)合體除了所述至少一個(gè)含sushi多肽，本發(fā)明的所述共價(jià)連接的化合物包含至少一個(gè)IL-15R]8Ay結(jié)合體。所述IL-15Rj3Ay結(jié)合體優(yōu)選為IL-15或IL-15片段、模擬物或;敫動(dòng)劑，其中所述IL-15片段、模擬物或激動(dòng)劑具有不顯著低于天然IL-15的與IL-15R)8Ay結(jié)合的親合力。所述IL-15能夠是任何IL-15,如人IL-15或非人哺乳動(dòng)物IL-15或非哺乳動(dòng)物IL-15。示例性的非人哺乳動(dòng)物IL-15為猴IL-15或鼠IL-15(如登錄號(hào)為NM—008357的小鼠IL隱15;登錄號(hào)為NM—013129的大鼠IL誦15)或兔IL-15(如登錄號(hào)DQ157152),綿羊IL-15(如登錄號(hào)NM—001009734)或豬IL-15(如登錄號(hào)N1VL211390)。示例性的非哺乳動(dòng)物IL-15為雞(如登錄號(hào)NM—204571)。更優(yōu)選地，所述IL-15是人IL-15。最優(yōu)選地，所述人IL-15的氨基酸序列是序列SEQIDNO:48。IL-15不與IL-2Ra結(jié)合?？紤]到本發(fā)明所預(yù)期的生物和醫(yī)藥用途，所述IL-15片段、模擬物或激動(dòng)劑優(yōu)選不與IL-2Ra結(jié)合。術(shù)語(yǔ)"激動(dòng)劑"和"模擬物"在此具有其在本領(lǐng)域的普通含義。當(dāng)化合物誘導(dǎo)的生物響應(yīng)的水平與天然IL-15誘導(dǎo)的水平類似或比天然IL-15誘導(dǎo)的水平高，則該化合物被稱為IL-15激動(dòng)劑。優(yōu)選的激動(dòng)劑是那些誘導(dǎo)甚至更高水平的生物響應(yīng)的激動(dòng)劑(超激動(dòng)劑)。IL-15激動(dòng)劑通常具有與IL-15Ra和/或IL-15R/3Ay結(jié)合的親合力，該親合力與天然IL-15的親合力至少?zèng)]有顯著不同，并且優(yōu)選顯著高于天然IL-15的親合力。IL-15的模擬物(或mimetope)是指能夠模擬IL-15的生物作用的任何化合物。在本發(fā)明中，優(yōu)選的IL-15模擬物或激動(dòng)劑是那些能夠通過(guò)IL-15R^Ay信號(hào)通路模擬IL-15的生物作用的模擬物或激動(dòng)劑。因此這樣的優(yōu)選IL-15模擬物具有與IL-15j3復(fù)合物結(jié)合、并從而通過(guò)所述IL-15R0Ay復(fù)合物誘導(dǎo)和/或刺激生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力。本發(fā)明優(yōu)選的IL-15模擬物或激動(dòng)劑具有與IL-15R/3Ay結(jié)合的親合力，該親合力與天然IL-15的親合力至少?zèng)]有顯著不同，并且優(yōu)選;也顯著高于天然IL-15的親合力。適當(dāng)?shù)募?dòng)劑或模擬物已被描述于例如INSERM于2005年2月10日提交的國(guó)際PCT申請(qǐng)PCT/EP2005/002367中。含sushi多肽所述至少一個(gè)含sushi多肽的氨基酸序列是IL-15Ra胞外區(qū)的氨基酸序列(所述IL-15Ra的胞外區(qū)包含IL-15Rasushi結(jié)構(gòu)i或)，或是IL-15Ra胞外區(qū)片段的氨基酸序列，其中所述片段保留了所述IL-15Ra胞外區(qū)的sushi結(jié)構(gòu)域，其中所述sushi結(jié)構(gòu)域定義為開(kāi)始于第一外顯子2編碼的半胱氨酸殘基(C1)，并終止于第四外顯子2編碼的半胱氨酸殘基(C4)，殘基Cl和C4均包括在sushi結(jié)構(gòu)域中，或是保留了所述sushi結(jié)構(gòu)域的全部四個(gè)半胱氨酸殘基(C1、C2、C3和C4)的變體氨基酸序列。所述定義的可選擇定義是，其開(kāi)始于所述信號(hào)肽之后的第一半胱氨酸殘基(C1),并且終止于所述信號(hào)肽之后的第四半胱氨酸殘基(C4)。所述變體氨基酸序列可包含IL-15Rasushi結(jié)構(gòu)域的保守變體序列。這樣的IL-15Rasushi結(jié)構(gòu)域的保守變體序列通過(guò)氨基酸的至少一次刪除和/或至少一次取代和/或至少一次添加書(shū)f生自母體sushi結(jié)構(gòu)i或的序列，但保留了下列特征中至少一個(gè)特征的能力i.增加IL-15對(duì)IL-15R/3的親合力，ii.誘導(dǎo)和/或刺激對(duì)/5/7陽(yáng)性細(xì)胞的抗凋亡作用，并且更具體地，對(duì)諸如天然NK和/或T細(xì)胞的/3Ay陽(yáng)性、a陰性細(xì)月包的抗凋亡作用，iii.通過(guò)IL-15R/3Ay信號(hào)通路增強(qiáng)IL-15生物作用的效率，即，誘導(dǎo)和/或刺激/3/y陽(yáng)性細(xì)胞的增殖和/或活化，并且更具體地，諸如天然或休眠NK和/或T細(xì)胞的/3Ay陽(yáng)性、a陰性細(xì)胞的增殖和/或活化。優(yōu)選地，所述保守變體保留了上述iii中所述的特征。測(cè)定上述特征的適當(dāng)?shù)募?xì)胞系為IL-15R/3Ay-陽(yáng)性IL-15Ra-陰性細(xì)胞。示例性的這種細(xì)胞系為細(xì)胞系32D，其能夠被/3和7鏈(如人/3和人7鏈)轉(zhuǎn)染?；蛘撸軌驈纳飿悠?，例如血液樣品中純化天然或休眠NK和/或T細(xì)胞。優(yōu)選地，在IL-15Ra胞外區(qū)或IL-15Ra胞外區(qū)片段的該序列的全長(zhǎng)上，所述變體氨基酸序列與這樣的IL-15Ra胞外區(qū)或這樣的IL-15Ra胞外區(qū)片段的氨基酸序列具有至少85%的同一性。更優(yōu)選地，該序列同一性百分?jǐn)?shù)為至少90%,更優(yōu)選為至少92%，最優(yōu)選為至少95%，如至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。這樣的變體氨基酸序列特別包含天然存在于動(dòng)物物種中的IL-15Ra多態(tài)性，以及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠產(chǎn)生的保守變體。IL-15Ra:IL-15Ra的外顯子1編碼IL-15Ra的信號(hào)肽。IL-15Ra的外顯子2編碼IL-15Ra的sushi結(jié)構(gòu)域。外顯子3的5，末端部分編碼IL-15Ra的被稱為鉸鏈區(qū)的區(qū)域。外顯子3以及其它胞外外顯子(即外顯子4、外顯子5和人IL-15ra以及大部分物種的外顯子6的5，部分)的其余部分編碼也稱為IL-15Ra尾區(qū)的富含糖基化位點(diǎn)的區(qū)域。其余IL-15Ra外顯子(即外顯子6的3'部分，以及人IL-15m以及大多數(shù)物種的外顯子7)編碼IL-15Ro;的跨膜和胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域?？紤]到本發(fā)明的醫(yī)藥應(yīng)用，所述IL-15Ra優(yōu)選為人IL-15Ra是有利的。所述人IL-15Ra的氨基酸序列最優(yōu)選為人IL-15Ra序列SEQIDNO:3(267個(gè)氨基酸)的序列。人IL-15RaSEQIDNO:3的胞外區(qū)具有氨基酸序列SEQIDNO:40(SEQIDNO:3的1..209)。SEQIDNO:40的刪除信號(hào)肽的形式凈皮列為SEQIDNO:44(SEQIDNO:3的31..209)。IL-15Ra的某些人等位基因可在SEQIDNO:3的位置182處具有Thr氨基酸(氨基酸t(yī),由act、acc、aca或acg編碼)，而不是Asn氨基酸(氨基酸n，由aat或aac編碼)。這樣的變體是天然存在的，并且是功能性的。在本申請(qǐng)中，人IL-15Ra的這種等位天然存在的變體意為等^f介于參考人IL-15Ra序列的SEQIDNO:3(氨基酸序列)和SEQIDNO:1或NO:2(cDNA和CDS序列)，并且等價(jià)于直接由其衍生的參考人IL-15Ra序列，即SEQIDNO:40或NO:44的胞外區(qū)序歹'J(氨基酸序列)以及SEQIDNO:39和NO:43的胞外區(qū)序列(CDS序列)。人IL-15Rce的SEQIDNO:3的7個(gè)外顯子的位置如下列表1所述。在這方面，請(qǐng)注意，如下列表l所述，外顯子1的位置是1..170，并且外顯子2的位置是171..365，而不是登錄號(hào)U31628的序列中所聲稱的分別為1..171和172..365。表1:<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>人IL-15Ra的SEQIDNO:3的不同區(qū)域和部分的位置如下列表2所示。表2:人IL-15RaSEQIDNO:1中的CDS位信號(hào)肽83..172IL-15Ra蛋白173..883信號(hào)肽83..172外顯子2編碼的部分，其含有sushi結(jié)構(gòu)域(it-sushi-i)173..364人IL-15Ra蛋白的部分Sushi結(jié)構(gòu)i或(Cl至C4)鉸鏈區(qū)(irdpalvhqrpapp)跨膜部分胞質(zhì)內(nèi)部分179..361362..403710..766767..883SEQIDNO:3中的氨基酸位置1..3031..2671..3031..9433..9394..107108..209210..228229..267富含糖基化位點(diǎn)的區(qū)域404..709在本申請(qǐng)中，置于第一個(gè)數(shù)字和第二個(gè)之間的雙點(diǎn)符號(hào)(《..)描述與從"第一個(gè)數(shù)字"的位置延伸至"第二個(gè)數(shù)字"的位置的序列相同的分離序列。在本申請(qǐng)中，當(dāng)序列由"開(kāi)始"位置和"終止"位置定義時(shí)，這些開(kāi)始和終止位置意為被包括在所述序列中。對(duì)于某些生物應(yīng)用，例如初步檢測(cè)、研究、開(kāi)發(fā)、化合物或細(xì)月包篩選、臨床前和臨床研究(包括與藥理學(xué)、毒理學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)或生物學(xué)性質(zhì)相關(guān)的測(cè)試以及"風(fēng)險(xiǎn)-效益評(píng)估"和安全相關(guān)測(cè)試)，也能夠使用非人哺乳動(dòng)物IL-15Ra。優(yōu)選的非人哺乳動(dòng)物IL-15Ra特別包括猴IL-15Ra(如黑猩猩IL-15Ra)或鼠IL-15Ra(如小鼠IL-15Ra、大鼠IL-15Ra)或兔IL-15Ra或豬IL-15Ra。這種非人哺乳動(dòng)物IL-15Ra的示例性IL-15Ra氨基酸序列是那些由下列來(lái)源的核酸序列編碼的氨基酸序列登錄號(hào)NM一008358(小家鼠IL-15Ra:核酸序列SEQIDNO:72,氨基酸序列SEQIDNO:73);登錄號(hào)XM—521684(黑猩猩IL-15Ra:核酸序列SEQIDNO:78,氨基酸序列SEQIDNO:79);或者登錄號(hào)XM—577598(褐家鼠IL-15Ra:核酸序列SEQIDNO:84，氨基酸序列SEQIDNO:85)。示例性的人IL-15Ra外顯子2和外顯子3的位置和序列請(qǐng)參見(jiàn)圖40、41、42。IL-15Ra的胞外區(qū)IL-15Ra的胞外區(qū)通常定義為IL-15Ra序列由其第一N-末端氨基酸延伸至尾區(qū)(或富含糖基化位點(diǎn)的區(qū)域)的最后氨基酸的區(qū)域。如下文的詳細(xì)描述，技術(shù)人員能夠通過(guò)例如軟件的幫助確定IL-15Ra序列的尾區(qū)。所述IL-15Ra的胞外區(qū)為人IL-15Ra胞外區(qū)或非人哺乳動(dòng)物IL-15Ra胞外區(qū)。在人胞外IL-15Ra區(qū)域的氨基酸序列中，優(yōu)選胞外IL-15Ra區(qū)域SEQIDNO:40的氨基酸序列。胞外IL-15Ra區(qū)域SEQIDNO:40的氨基酸序列是由外顯子1-5以及人IL-15Ra的外顯子6的小5，部分編碼的。人IL-15Ra的外顯子1(SEQIDNO:8)編碼IL-15Ra信號(hào)肽(核酸序列SEQIDNO:4;氨基酸序列SEQIDNO:5)。外顯子2(SEQIDNO:9)包含編碼人IL-15Rasushi結(jié)構(gòu)域的序列。外顯子2的最后的3，密碼子編碼鉸鏈區(qū)的第一氨基酸。外顯子3的5'部分(外顯子3的SEQIDNO:10)編碼人IL-15Ra的鉸鏈區(qū)。外顯子3的其余3，部分，加上外顯子4(SEQIDNO:11)、外顯子5(SEQIDNO:12)以及外顯子6的5，部分(SEQIDNO:l的699..709)編碼富含糖基化位點(diǎn)的區(qū)域(也稱為尾區(qū))。序列SEQIDNO:44是IL-15Ra胞外區(qū)SEQIDNO:40刪除信號(hào)肽的形式。在本發(fā)明中可使用信號(hào)肽，但這是任選的。這樣的信號(hào)肽能夠是IL-15Ra信號(hào)肽或者另一蛋白的信號(hào)肽。因此，IL-15Ra胞外區(qū)的刪除信號(hào)肽的形式(例如SEQIDNO:44)直接等同于全部IL15Ra胞外序歹'J(例如SEQIDNO:40)。示例性的非人哺乳動(dòng)物IL-15Rcd包外區(qū)具有下列序列SEQIDNO:74(小家鼠IL-15Ra的1..204)、SEQIDNO:80(黑猩猩IL-15Ra的1..286)、SEQIDNO:86(褐家鼠IL-15Rce的1..182)。Sushi結(jié)構(gòu)i或定義所述至少一個(gè)含sushi多肽的IL-15Ra或其片段的胞外區(qū)含有IL-15Rasushi結(jié)構(gòu)域。IL-15Ra的胞外區(qū)含有^皮稱為sushi結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域(Weietal.2001，J.Immunol.167:277-282)。IL-15Ra的sushi結(jié)構(gòu)域具有/5折疊構(gòu)象。其是由IL-15Ra的外顯子2編碼的。其開(kāi)始于第一外顯子2編碼的半胱氨酸殘基(C1),并終止于第四外顯子2編碼的半胱氨酸殘基(C4)。當(dāng)考慮標(biāo)準(zhǔn)N-末端至C-末端方向的IL-15Ra蛋白序列時(shí)，IL-15Ra的sushi結(jié)構(gòu)域能夠被定義為開(kāi)始于信號(hào)肽之后的第一半胱氨酸殘基(Cl)，并終止于信號(hào)肽之后的第四半胱氨酸殘基(C4)。殘基Cl和C4均包括在sushi序列中。因此，當(dāng)在由其信號(hào)肽序列刪除的IL-15Ra序列(例如序列SEQIDNO:44)上識(shí)別sushi結(jié)構(gòu)域時(shí)，然后將sushi結(jié)構(gòu)域定義為開(kāi)始于第一半胱氨酸殘基(開(kāi)始于蛋白的N-末端)，并終止于該IL-15Rce序列的第四半胱氨酸殘基。還能夠通過(guò)使用例如下列軟件的適當(dāng)軟件分析IL-15Ra的氨基酸序列而確定IL-15Rcesushi結(jié)構(gòu)域Prosite(http:〃us.expasy.org/prosite/),InterProScan(http:〃www.ebi.ac.uk/InterProScan/)，SMART(http:〃elm.eu,org/)。所述sushi結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列能夠是人IL-15Rasushi結(jié)構(gòu)域或非人哺乳動(dòng)物sushi結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。在人IL-15Rasushi結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中，優(yōu)選人IL-15Rasushi結(jié)構(gòu)域SEQIDNO:14的氨基酸序列。例如，人IL-15Ra胞外區(qū)的所述片段的氨基酸序列能夠是序列SEQIDNO:16(it+人IL-15Rasushi)或NO:18(t+人IL-15Rasushi)。示例性的非人哺乳動(dòng)物IL-15Rasushi結(jié)構(gòu)域?yàn)榘被嵝蛄蠸EQIDNO:75(小家鼠IL國(guó)15Ra的36..96)、SEQIDNO:81(黑猩猩IL-15Ra的13..73)或SEQIDNO:87(褐家鼠IL-15Ra的24..84)。信號(hào)肽信號(hào)肽是引導(dǎo)蛋白的轉(zhuǎn)譯后輸送的較短(15-60個(gè)氨基酸長(zhǎng)度)的肽鏈。某些信號(hào)肽是在輸送蛋白后通過(guò)信號(hào)肽酶從蛋白中分裂的。信號(hào)肽還可被稱為靶向信號(hào)或信號(hào)序列。信號(hào)肽的氨基酸序列將細(xì)胞溶質(zhì)中合成的蛋白引導(dǎo)至特定的細(xì)胞器，例如細(xì)胞核、線粒體基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、葉綠體以及過(guò)氧化物酶體。IL-15Ra的信號(hào)肽是約29-33個(gè)氨基酸，例如30-32個(gè)氨基酸的N-末端序列。其開(kāi)始于IL-15Ra的第一N-末端氨基酸殘基。其通過(guò)使用例如下列軟件的適當(dāng)軟件分析IL-15Ra的N-末端氨基酸序列而確定SIGCLEAVE(http:〃bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/sigcleave.html),InterProScan(http:〃www.ebi.ac.uk/InterProScan/)，SMART0ittp:〃elm.eu.org/)。小家鼠IL-15Ra的信號(hào)肽是32個(gè)氨基酸的N-末端氨基酸序列(參見(jiàn)登錄號(hào)NP—032384;sig—肽1..32)。人IL-15Ra的信號(hào)肽，如SEQIDNO:5所示，是含有1個(gè)半胱氨酸殘基的30個(gè)氨基酸的N-末端氨基酸序列。外顯子2編碼部分的片段IL-15Ra的外顯子2含有sushi結(jié)構(gòu)域，即本發(fā)明要求的最小結(jié)構(gòu)單元。所述IL-15Ra胞外區(qū)的片段能夠包含(或能夠基本由下列組成)-11^151^胞外區(qū)部分，其是由所述IL-15Ra的外顯子2編碼的，或者-這種外顯子2編碼部分的片段。根據(jù)本發(fā)明，所述IL-15Ra胞外區(qū)的片段必須包含至少一個(gè)IL-15Rce結(jié)構(gòu)域。因此，外顯子2編碼部分的片段能夠是其任何片段，前提是其仍然包含sushi結(jié)構(gòu)域(從殘基Cl至殘基C4)。例如，人胞外區(qū)SEQIDNO:40的外顯子2編碼部分是由位置31延伸至位置94的序列(即SEQIDNO:24)，即它是it+sushi+i。該外顯子2編碼部分的片段為t+sushi;it+sushi;t+sushi+i。例如，所述外顯子2編碼的序列能夠是-人胞外IL-15Ra的外顯子2編碼部分，其為序列SEQIDNO:24,-黑猩猩胞外IL-15Ra的外顯子2編碼部分，其為序列SEQIDNO:98，-小家鼠胞外IL-15Ra的外顯子2編碼部分，其為序列SEQIDNO:97,-褐家鼠胞外IL-15Ra的外顯子2編碼部分，其為序列SEQIDNO:99。這種IL-15Ra胞外區(qū)片段的變體包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這樣的變體特別包括那些在其序列中具有保守氨基刪除和/或取和/或力口成的變體。IL-15Ra胞外區(qū)片段的保守變體序列通過(guò)氨基酸的至少一次刪除和/或至少一次取代和/或至少一次加成而書(shū)f生自母體IL-15Ra胞外區(qū)片段的序列，并且保留了至少一種下列特征的能力iv.增加IL-15對(duì)IL-15R/3Ay的親合力，v.誘導(dǎo)和/或刺激對(duì)/3Ay-陽(yáng)性細(xì)胞的抗凋亡作用，以及更具體地，對(duì)諸如天然NK和/或T細(xì)胞的/3Ay-陽(yáng)性、o;-陰性細(xì)胞^的抗凋亡作用，vi.通過(guò)IL-15R/3/7信號(hào)通路增強(qiáng)IL-15生物作用的效率，即，誘導(dǎo)和/或刺激/3Ay-陽(yáng)性細(xì)胞的增殖和/或活化，以及更具體地，諸如天然或休眠NK和/或T細(xì)胞的j8/，陽(yáng)性、a-陰性細(xì)胞的增殖和/或活化。優(yōu)選地，所述保守變體保留了上文iii.中所述的特征。至少85%同一性的氨基酸序列的變體。優(yōu)選地，所述同一性百分?jǐn)?shù)為至少90%，更優(yōu)選為至少92%，最優(yōu)選為至少95%,如至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。例如，開(kāi)始于SEQIDNO:40的上述外顯子2編碼部分，對(duì)本領(lǐng);或才支術(shù)人員來(lái)i兌4艮明顯，i+sushi、i+sushi+t、i+sushi+i、it+sushi十t為保守變體，其在技術(shù)上等同于母體片段。外顯子2-3編碼部分的片段根據(jù)本發(fā)明的非常有利的實(shí)施方案，所述IL-15Ra胞外區(qū)片段還可包含至少一個(gè)來(lái)自由所述IL-15Ra的外顯子3編碼的序列的氨基酸。因此所述IL-15Rce胞外區(qū)片段可包含如下、或由下列部分組成-IL-15Ra胞外區(qū)部分，其是由所述IL-15Ra的外顯子2和3編碼的，或者-這種外顯子2-3編碼部分的片段，其保留了所述sushi結(jié)構(gòu)域。人IL-15Ra的SEQIDNO:3(即人胞外區(qū)SEQIDNO:40)的外顯子3是核酸序列SEQIDNO:10。SEQIDNO:3的外顯子3編碼部分是序列SEQIDNO:93,即SEQIDNO:3或SEQIDNO:40的95..127序列部分(即人IL-15Ra序列SEQIDNO:3或NO:40中由位置95延伸至位置127的氨基酸序列，包括位置95和127)。例如，所述外顯子3編碼的序列能夠是-人胞外IL-15Ra的外顯子3編碼部分，其為序列SEQIDNO:93，畫(huà)黑猩猩胞外IL國(guó)15Rce的外顯子3編碼部分，其為序列SEQIDNO:95，國(guó)小家鼠胞外IL畫(huà)15Ra的外顯子3編碼部分，其為序列SEQIDNO:94，-褐家鼠胞外IL-15Ra的外顯子3編碼部分，其為序列SEQIDNO:96。外顯子3編碼部分的片段能夠是僅有一個(gè)氨基酸的片段，優(yōu)選為至少2個(gè)氨基酸的片段，更優(yōu)選為至少3個(gè)氨基酸的片段，還更優(yōu)選為至少4個(gè)氨基酸的片段，最優(yōu)選為至少5個(gè)氨基酸的片段。本發(fā)明人證明，IL-15Ra或其片段的外顯子3編碼部分有利地增加所得化合物在IL-15R/3Ay信號(hào)傳導(dǎo)以及IL-15RjSAy陽(yáng)性細(xì)胞的增殖和活化方面的親合力和效率。當(dāng)含sushi多肽用于產(chǎn)生融合蛋白時(shí)，技術(shù)人員可能寧愿將外顯子3氨基酸的數(shù)目限定為最佳的數(shù)目，即限定為在一方面增加親合力和效率與另一方面增加分子大小和構(gòu)象困難這兩方面之間達(dá)到較好平衡的氨基酸數(shù)目。因此，技術(shù)人員可能發(fā)現(xiàn)將向所述IL-15Rasushi結(jié)構(gòu)域中加入的外顯子3編碼氨基酸的數(shù)目限定為下列數(shù)目是有利的30，優(yōu)選為25,更優(yōu)選為20，還更優(yōu)選為18,最優(yōu)選為17，如17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6。因此，外顯子3編碼的氨基酸的最優(yōu)選數(shù)目是那些由每一上述較低限與每一上述較高限的組合產(chǎn)生的間隔。示例性的外顯子3編碼部分的優(yōu)選片段是源自人IL-15Ra的SEQIDNO:3(或SEQIDNO:40)的外顯子3編碼部分的所有片l殳，即由位置95延伸至位置127的部分，包括位置95和127(即SEQIDNO:3或NO:40的序列95..127)。因此本發(fā)明的優(yōu)選化合物包含至少一個(gè)含sushi多肽，其除了所述sushi結(jié)構(gòu)域之外還包含至少一個(gè)來(lái)自SEQIDNO:3的由位置95延伸至位置127(包括位置95和127)的序列的氨基酸。其最優(yōu)選地包含-優(yōu)選數(shù)目的這種氨基酸(即"至少2個(gè)氨基酸，更優(yōu)選為至少3個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選為至少4個(gè)氨基酸，最優(yōu)選為至少5個(gè)氨基酸")，或者-最優(yōu)選數(shù)目的這種氨基酸(即由"至少2個(gè)氨基酸，更優(yōu)選為至少3個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選為至少4個(gè)氨基酸，最優(yōu)選為至少5個(gè)氨基酸"與"至多30,優(yōu)選至多25,更優(yōu)選至多20,還更優(yōu)選至多18，最優(yōu)選至多17，如17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6"產(chǎn)生的任意組合)。因此，所述IL-15Ra胞外區(qū)片段有利地包含IL-15Ra胞外區(qū)部分，它是由所述IL-15Rce的外顯子2或其如上文所定義的保守變體編碼的，并且還包含至少一個(gè)來(lái)自所述IL-15Ra的外顯子3編碼的序列的氨基酸更具體地，所述IL-15Ra胞外區(qū)片段能夠包含(能夠基本由下列部分組成)國(guó)由所述IL誦15Ra的外顯子2和3編碼的IL-15Ra胞外區(qū)部分，或其保守變體，或者-由所述IL-15Ra的外顯子2編碼的IL-15Ra胞外區(qū)部分，以及由所述IL-15Ra的外顯子3編碼的IL-15Rce胞外區(qū)部分的片段。還更具體地，所述IL-15Rce胞外區(qū)片段能夠包含(能夠基本由下列部分組成)-由所述IL-15Ra的外顯子2和3編碼的IL-15Ra胞外區(qū)部分，或其保守變體，或者-這樣的外顯子2-3編碼部分的片段或這樣的外顯子2-3編碼的變體的片段，隱含的條件是這樣的片段保留了sushi結(jié)構(gòu)域。上文給出的保守變體的定義為對(duì)外顯子2-3編碼部分的保守變體提供細(xì)節(jié)上必要的改動(dòng)，即，它是衍生自母體外顯子2-3編碼的序列的序列，所述衍生是通過(guò)氨基酸的至少一次刪除和/或至少一次取代和/或至少一次添加，并保留了至少一種下列特征的能力vii.增加IL-15對(duì)IL-15R/3Ay的親合力，viii.誘導(dǎo)和/或刺激對(duì)|3/7-陽(yáng)性細(xì)胞的抗凋亡作用，以及更具體地，對(duì)諸如天然NK和/或T細(xì)胞的j8Ay-陽(yáng)性、a-陰性細(xì)胞的抗凋亡作用，ix.通過(guò)IL-15R/3Ay信號(hào)通^各增強(qiáng)IL-15生物作用的效率，即，誘導(dǎo)和/或刺激/3Ay-陽(yáng)性細(xì)胞的增殖和/或活化，以及更具體地，諸如天然或休眠NK和/或T細(xì)胞的j3Ay-陽(yáng)性、a-陰'l"生細(xì)胞的增殖和/或活化。優(yōu)選地，所述保守變體保留了上文iii.中所述的特征。至少85%同一性的氨基酸序列的變體。優(yōu)選地，所述同一性百分?jǐn)?shù)為至少90%，更優(yōu)選為至少92%,最優(yōu)選為至少95%，如至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。鉸鏈區(qū)(位于sushi結(jié)構(gòu)域之后，由外顯子2的3，部分和外顯子3的5，部分編碼，或由外顯子3的5'部分編碼)本發(fā)明人證明，IL-15Ra的鉸鏈區(qū)更特別地與該信號(hào)傳導(dǎo)效率的增加、以及該IL-15Ri8Ay-陽(yáng)性細(xì)胞的增殖和活化的增加有關(guān)。因此，根據(jù)本發(fā)明的非常有利的實(shí)施方案，所述IL-15Ra胞外區(qū)片段除了所述IL-15Rasushi結(jié)構(gòu)域之外，還能夠包含IL-15Ra鉸鏈區(qū)或IL-15Ra鉸鏈區(qū)的片段。IL-15Ra鉸鏈區(qū)被定義為開(kāi)始于sushi結(jié)構(gòu)域之后的第一氨基酸殘基(當(dāng)考慮標(biāo)準(zhǔn)N-末端至C-末端方向的IL-15Ra序列時(shí))，并且終止于第一潛在糖基化位點(diǎn)之前的最后氨基酸殘基的氨基酸序列。使用用于識(shí)別潛在0-糖基化位點(diǎn)的軟件NetOGlyc(http:〃www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc-3.1/)以及用于識(shí)別潛在N-糖基化位點(diǎn)的軟件NetNGlyc(http:〃www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)確定潛在糖基化位點(diǎn)的位置。在人IL-15Ra中，鉸鏈區(qū)的氨基酸序列由14個(gè)氨基酸組成，其位于該IL-15Ra的sushi結(jié)構(gòu)域之后相對(duì)于所述sushi結(jié)構(gòu)域的C-末端位置，即所述IL-15Ra鉸鏈區(qū)開(kāi)始于所述(C4)半胱氨酸殘基之后的第一氨基酸，并終止于第14氨基酸(以標(biāo)準(zhǔn)的"從N-末端至C-末端"方向計(jì)數(shù))。在人IL-15Ra的SEQIDNO:3(其胞外區(qū)為序列SEQIDNO:40)中，所述人IL-15Ra鉸鏈區(qū)的氨基酸序列是序列SEQIDNO:20。其含有一個(gè)由外顯子2(氨基酸i)編碼的氨基酸，以及由外顯子3編碼的13個(gè)氨基酸。在小家鼠IL-15Ra的SEQIDNO:73中，4交鏈區(qū)具有序列SEQIDNO:76。在黑猩猩IL-15Ra的SEQIDNO:79中，鉸鏈區(qū)具有序列SEQIDNO:82。在褐家鼠IL-15Ra的SEQIDNO:85中，鉸鏈區(qū)具有序列SEQIDNO:88。因此所述至少一個(gè)含sushi多肽可包含sushi結(jié)構(gòu)域SEQIDNO:75和鉸鏈區(qū)SEQIDNO:76(小家鼠)、sushi結(jié)構(gòu)域SEQIDNO:81和鉸鏈區(qū)SEQIDNO:82(黑猩猩)或者sushi結(jié)構(gòu)域SEQIDNO:87和鉸鏈區(qū)SEQIDNO:88(褐家鼠)。有利地，所述至少一個(gè)含sushi多肽優(yōu)選包含人sushi結(jié)構(gòu)域SEQIDNO:14,以及人鉸鏈區(qū)SEQIDNO:20(例如鉸鏈區(qū)SEQIDNO:20之前的SEQIDNO:16或NO:18)。優(yōu)選地，所述至少一個(gè)含sushi多肽包含，或者是，任選由其N-末端i和/或t刪除的多肽SEQIDNO:30(it+sushi+hinge)?；蛘咚鯥L-15Ra胞外區(qū)片段除了sushi結(jié)構(gòu)域之外能夠包含鉸鏈區(qū)片段。本文的鉸鏈區(qū)片段意為所述鉸鏈區(qū)的少至僅一個(gè)氨基酸的任何片段。優(yōu)選地，鉸鏈區(qū)片段包含至少2個(gè)氨基酸，更優(yōu)選包含至少3個(gè)氨基酸。因此IL-15Ra鉸鏈區(qū)片段能夠是1個(gè)(如氨基酸i)、2個(gè)(如氨基酸ir)、3個(gè)(如氨基酸ird)、4個(gè)(如氨基酸irdp)、5個(gè)(如氨基酸irdpa)、6個(gè)(如氨基酸irdpa)、7個(gè)(如氨基酸irdpal)、8個(gè)(如氨基酸irdpalv)、9個(gè)(如氨基酸irdpalvh)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)或14個(gè)氨基酸的片段。有利地，所述至少一個(gè)含sushi多肽優(yōu)選地包含人sushi結(jié)構(gòu)域SEQIDNO:14，以及鉸鏈區(qū)片段SEQIDNO:20。所述IL-15Ra鉸鏈區(qū)片段的氨基酸序列包含、或者是i或ir或ird。含sushi多肽SEQIDNO:22、24和26包含sushi結(jié)構(gòu)域SEQIDNO:14以及鉸鏈區(qū)SEQIDNO:20的"i"片段。含sushi多肽SEQIDNO:28包含結(jié)構(gòu)域SEQIDNO:14以及鉸鏈區(qū)SEQIDNO:20的"ird"片段。所述人IL-15Rcd包外區(qū)片段基酸序列除了所述sushi結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)之外，可更具體地包含下列氨基酸序列-已知為富含糖基化位點(diǎn)的區(qū)域、或者尾區(qū)的胞外IL-15Ra區(qū)域的氨基酸序列，或者-其片段。富含糖基化位點(diǎn)的區(qū)域，也稱為尾區(qū)(由外顯子3的3，部分編碼，由其它胞外外顯子編碼)IL-15Ra的富含糖基化位點(diǎn)的區(qū)域是含有數(shù)個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)的區(qū)域。有時(shí)它是指IL-15Ra的"尾部"區(qū)域。其開(kāi)始于鉸鏈區(qū)之后的第一氨基酸殘基(當(dāng)以標(biāo)準(zhǔn)的"N-末端至C-末端"方向考慮序列時(shí))，并終止于IL-15Ra的跨膜區(qū)域之前的最后氨基酸殘基。其包含數(shù)個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)。通過(guò)用諸i口TopPred(http://biowed.pasteur.fr/seqanal/interfaces/topred.html)、TMpred(http:〃www.ch.embnet.org/software/TMPRED—form.html)的適當(dāng)軟件分析IL-15Ra的氨基酸序列而確定跨膜結(jié)構(gòu)域。人IL-15Ra尾區(qū)包含數(shù)個(gè)O-糖基化位點(diǎn)和一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。人IL-15Ra尾區(qū)SEQIDNO:32由所述人IL-15Ra的外顯子3的3'部分、外顯子4、外顯子5以及外顯子6的5，部分編碼。示例性的非人哺乳動(dòng)物IL-15Ra胞外區(qū)尾區(qū)為氨基酸序列SEQIDNO:77(小家鼠)、SEQIDNO:83(黑猩猩)或SEQIDNO:89(褐家鼠)。36本文富含糖基化位點(diǎn)的區(qū)域的片段或亞片段(或尾區(qū)的片段或亞片段)意為所述區(qū)域的少至僅一個(gè)氨基酸的任何片段或亞片段。優(yōu)選地，所述片段或亞片段包含至少2個(gè)氨基酸，更優(yōu)選地包含至少3個(gè)氨基酸。因此所述IL-15Ra胞外區(qū)片段的氨基酸序列可包含-IL-15Ra的富含糖基化位點(diǎn)的區(qū)域的外顯子3編碼部分，或者-這樣的外顯子3編碼部分的片段。人IL-15Ra的富含糖基化位點(diǎn)的區(qū)域的外顯子3編碼部分的優(yōu)選氨基酸序列是SEQIDNO:34的氨基酸序列。本發(fā)明的含sushi多肽有利地為多肽SEQIDNO:36(任選的由第一C-末端i和/或t氨基酸刪除的)。如前所述，能夠使用技術(shù)人員認(rèn)為適當(dāng)?shù)耐怙@子3編碼部分的任何片段，如至少一個(gè)氨基酸、優(yōu)選至少2個(gè)氨基酸、更優(yōu)選至少3個(gè)氨基酸的任何片段。不同于外顯子l、2、3的胞外外顯子不同于外顯子l、2、3的胞外IL-15Rce外顯子編碼尾區(qū)的C-末端片段。這樣的部分或其片段可進(jìn)一步增強(qiáng)本發(fā)明化合物的效率。因此所述IL-15Ra胞外區(qū)片段的氨基酸序列還可包含由外顯子4和/或外顯子5和/或外顯子6編碼的胞外IL-15Ra部分或這樣的部分的任何片段。人IL-15Ra的SEQIDNO:3的外顯子位置在此示于上文表1中。這樣的含sushi多肽的示例性氨基酸序列為序列SEQIDNO:38,或者刪除信號(hào)肽的SEQNO:42，或者刪除信號(hào)肽的SEQNO:44。示例性的含sushi多肽是那些含有sushi結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)和IL-15Ra的全尾部(如人IL-15Ra尾部SEQIDNO:32;黑猩猩IL-15Ra尾部SEQIDNO:83;小家鼠IL-15Ra尾部SEQIDNO:77;褐家鼠IL-15Ra尾部SEQIDNO:89)、以及任選的信號(hào)肽的多肽，。IL-15生物作用在生物體或細(xì)胞水平，本發(fā)明產(chǎn)物的特征在于其誘導(dǎo)和/或刺激IL-15的生物作用。其刺激那些由IL-15、IL-15模擬物和/或IL-15激動(dòng)劑賦予的、誘導(dǎo)的或刺激的生物作用。本發(fā)明產(chǎn)物(即本文所述的分離形式的含sushi多肽，并且更具體地為本發(fā)明的化合物)可因此被認(rèn)為是IL-15生物作用的激動(dòng)劑。本發(fā)明產(chǎn)物的一個(gè)特別的和有利的顯著特征是其能夠誘導(dǎo)和/或刺激IL-15R/3Ay信號(hào)通路，并且更具體地通過(guò)IL-15R/3Ay信號(hào)通路刺激IL-15生物作用。因此在分子水平，本發(fā)明的產(chǎn)物的更具體的特征在于，其增加IL誦15R)8Ay信號(hào)通路的效率。其使得那些表達(dá)IL-15R/3Ay復(fù)合物的細(xì)胞對(duì)IL-15的作用敏感。更具體地，其使得那些表達(dá)IL-15R/3復(fù)合物^f旦不表達(dá)IL-15Ra的細(xì)胞(IL-15Rp/y+IL-15RoT細(xì)胞)對(duì)IL-15的作用敏感。本發(fā)明的某些產(chǎn)物不增強(qiáng)IL-15Rc^5Ay信號(hào)通路的效率，因此是IL-15R/3Ay特異性的。尤其是本發(fā)明的ILR融合蛋白(氨基酸序列SEQIDNO:62;以及核酸序列SEQIDNO:61)。本發(fā)明的某些其它產(chǎn)物能夠增強(qiáng)IL-15Ri8/7和IL-15Ro^3信號(hào)通路的效率。尤其是本發(fā)明的RLI融合蛋白(氨基酸序列SEQIDNO:60;以及核酸序列SEQIDNO:59)。本發(fā)明還顯示IL-15Ra的sushi結(jié)構(gòu)域?qū)τ谵D(zhuǎn)呈遞是關(guān)4建的。其從而具有在癌癥治療和/或減輕和/或預(yù)防領(lǐng)域中尤其有用的和尤其需要的醫(yī)藥用途，這是通過(guò)疫苗給藥，例如給予包含含有至少一個(gè)IL-15Rasushi結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)化合物的組合物。IL-15是刺激淋巴細(xì)胞(例如T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞)增殖和/或存活、和/或其對(duì)抗腫瘤細(xì)胞的活性的細(xì)胞因子。IL-15與佐細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞之間的交叉感知有關(guān)。它在用于發(fā)展NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞和CD8+記憶T細(xì)胞的周圍組織中是必不可少的。它是能夠誘導(dǎo)CD34+造血細(xì)胞分化的最強(qiáng)大的生理學(xué)因子。所述IL-15生物作用是由IL-15和/或IL-15才莫擬物和/或IL-15;敫動(dòng)劑賦予的、誘導(dǎo)的或刺激的生物作用。技術(shù)人員能夠選擇他/她認(rèn)為適當(dāng)?shù)幕蚍奖阍u(píng)價(jià)或監(jiān)控的任何IL-15生物響應(yīng)。優(yōu)選地，所述IL-15生物作用是由IL-15和/或IL-15才莫擬物和/或IL-15激動(dòng)劑對(duì)IL-15Rj3Ay+IL-15Ra'細(xì)胞賦予的、誘導(dǎo)的或刺激的生物作用。通常的IL-15生物響應(yīng)是IL-15每文感性細(xì)胞的增殖和/或活化。IL-15每文感性細(xì)胞的實(shí)例為T(mén)細(xì)胞、CD8+T細(xì)月包、NK細(xì)J包、樹(shù)突細(xì)胞，加入IL-15和/或IL-15才莫擬物和/或IL-15激動(dòng)劑會(huì)i秀導(dǎo)和/或刺激其增殖，和/或加入IL-15和/或IL-15模擬物和/或IL-15激動(dòng)劑會(huì)誘導(dǎo)和/或刺激其活化(如誘導(dǎo)抗腫瘤活性)。這樣的細(xì)胞能夠例如采集自哺乳動(dòng)物有機(jī)體。IL-15敏感性細(xì)胞的其它實(shí)例包括已知的細(xì)胞系，例如CTL-L2小鼠細(xì)胞毒性T淋巴瘤細(xì)胞系(ATCC登錄號(hào)TIB-214)或TFl-(3細(xì)胞。TF1-Z細(xì)胞可通過(guò)用/3鏈轉(zhuǎn)染TF-1細(xì)胞而得到。TF-1細(xì)胞得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC;P.O.Box1549;Manassas,VA20108;U.S.A.;c/http:〃www.lgcpromochem.com/atcc/，ATCC登錄號(hào)CRL-2003。然后能夠使用IL-2R/3重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染TF-1細(xì)胞以便在含有G418的培養(yǎng)基中選擇后產(chǎn)生TF-1卩。優(yōu)選地，所述IL-15敏感性細(xì)胞為IL-15Rj3+IL-15R"-細(xì)胞。IL-15R/5/7+IL-15R&細(xì)胞的實(shí)例包括人Mo-7細(xì)胞系或休眠NK和/或T細(xì)月包。休眠NK和/或T細(xì)胞對(duì)技術(shù)人員是可得的。它們能夠例如通過(guò)純化諸如血液樣品的細(xì)胞樣品而得到。休眠NK和T細(xì)胞能夠從健康成年供者的血液中分離，如下將全血進(jìn)行高速離心以得到白細(xì)胞層。將該白細(xì)胞層在密度梯度(Histopaque,Sigma)上離心以得到外周血淋巴細(xì)胞。然后使用NK細(xì)胞陰性分離試劑盒(Dynal,BiotechASA,Oslo,Norway)將休眠NK細(xì)胞從外周血淋巴細(xì)胞中分離?；蛘?，使用T細(xì)胞陰性分離試劑盒(Dynal,BiotechASA,Oslo,Norway)將休眠T細(xì)胞從外周血淋巴細(xì)胞中分離。IL-15R/3/7+IL-15R(/細(xì)胞的其它實(shí)例包括IL-15Ra-細(xì)胞，其是由IL-15R/3Ay轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的，優(yōu)選是由人IL-15R/3Ay轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的。例如，鼠32D細(xì)胞系(ATCCCRL-11346)能夠被j3和7鏈轉(zhuǎn)染，優(yōu)選被人/3和7鏈轉(zhuǎn)染。j8鏈(即IL-15R/3鏈，也指IL-2R/3鏈)是技術(shù)人員已知的和可得到的。在/3鏈中，優(yōu)選人]3鏈。使用才交正讀碼聚合酶Pfu(Stratag^ien。600390)和作為同義引物的5，GAGAGACTGGATGGACCC3，(SEQIDNO:70)、以及作為反義引物的5，AAGAAACTAACTCTTAAAGAGGC3，(SEQIDNO:71)，按照人IL-2R/3序列(NCBI登錄號(hào)K03122),通過(guò)RT-PCR可由HuT102(ATCCTIB-162)的RNA得到/3鏈模板。使用ZeroBluntPCR克隆試劑盒(InVitrogen,目錄號(hào)K2700-20)或TOPOXLPCR克隆試劑盒(InVitrogen，目錄號(hào)K4750-10)將PCR產(chǎn)物有效地克隆。然后將用于IL-2R/3基因的cDNA亞克隆至泛向逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)(BDBiosciencesClontechn。631512)的pLXRN逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，并如試劑盒中所述轉(zhuǎn)染至GP2-293細(xì)胞以產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。7鏈(即IL-15R7鏈，也指IL-2R/y鏈)是技術(shù)人員已知的并可得的。在7鏈中，優(yōu)選人7鏈。寸吏用才交正讀碼聚合酶Pfu和作為同義引物的5，GAAGAGCAAGCGCCATGTTG3，(SEQIDNO:100)和作為反義引物的5，TCAGGTTTCAGGCTTTAGGG3，(SEQIDNO:101)，按照人白細(xì)胞介素-2受體7序列(NCBI登錄號(hào)D11086),通過(guò)RT-PCR可由TF1(ATCCCRL2003)或HuT102(ATCCTIB162)的RNA得到下鏈模板。使用ZeroBluntPCR克隆試劑盒或TOPOXLPCR克隆試劑盒將PCR產(chǎn)物有效地克隆。然后將用于IL-2R7基因的cDNA亞克隆至pcDNA3.1/HYGRO(InVitrogen)以產(chǎn)生pcDNAIL-2R7/HYGRO質(zhì)粒。IL-2R/3重組逆轉(zhuǎn)錄病毒能夠用于感染32D細(xì)胞以便在含有G418的培養(yǎng)基中選擇后產(chǎn)生32DP。然后能夠通過(guò)電穿孔技術(shù)將pcDNAIL-2R7/HYGRO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至32Dp細(xì)胞，以便在含有潮霉素的培養(yǎng)基中選擇后產(chǎn)生32DPy。作為選擇，技術(shù)人員可選擇評(píng)價(jià)或監(jiān)控信號(hào)通路中更下游的IL-15生物響應(yīng)，例如酪氨酸激酶(如Jak-1/Jak-3;Lck;Syk)的活化、MAP激酶的活化或核轉(zhuǎn)運(yùn)事件(如磷酸化Stat-3和/或Stat-5的轉(zhuǎn)運(yùn))。然后所述IL15生物響應(yīng)可以是非細(xì)胞響應(yīng)。另外的元件(信號(hào)肽、分子標(biāo)簽、蛋白水解位點(diǎn)等等)本發(fā)明化合物可包含信號(hào)肽。該信號(hào)肽能夠直接或間接與所述至少一個(gè)含sushi多肽連接或與所述至少一個(gè)IL-15Rj3Ay結(jié)合體連接。所述信號(hào)肽能夠與所述化合物共價(jià)連接。信號(hào)肽有助于從細(xì)胞分泌蛋白。該信號(hào)肽可以例如是直接或間接與所述片段連接的IL-15Ra的信號(hào)肽，例如人IL-15Ra的信號(hào)肽(如人IL-15Ra的信號(hào)肽，即序列SEQIDNO:5)，或者是直接或間接與所述片段連接的另一蛋白的信號(hào)肽(例如牛泌乳素前體的信號(hào)肽SEQIDNO:58)。示例性的信號(hào)肽為國(guó)人野生型IL-15Ra的前導(dǎo)序列(SEQIDNO:4)編碼的肽，即人野生型IL-15Ro;的最初30個(gè)N-末端氨基酸(SEQIDNO:5)，或者-牛泌乳素前體的前導(dǎo)序列(SEQIDNO:57)編碼的肽，即牛泌乳素前體的最初31個(gè)N-末端氨基酸(SEQIDNO:58)。也可使用技術(shù)人員認(rèn)為合適的其它信號(hào)肽。此外，能夠改變IL-15前導(dǎo)序列中的某些核苷酸而不改變氨基酸序列。此外，可進(jìn)行不影響序列作為信號(hào)肽的能力的氨基酸變化。本發(fā)明的含sushi多肽可與衍生該含sushi多肽的IL-15Ra的信號(hào)肽直接連接。然而這種含sushi多肽可以-與這樣的"天然"信號(hào)肽間接連接，或畫(huà)與不來(lái)自衍生所述含sushi多肽的IL-15Ra的信號(hào)肽直接或間接連接。本發(fā)明化合物還可包含至少一個(gè)分子標(biāo)簽和/或至少一個(gè)蛋白水解位點(diǎn)。例如，分子標(biāo)簽和/或蛋白水解位點(diǎn)能夠位于信號(hào)肽和sushi結(jié)構(gòu)域之間，或者信號(hào)肽和IL-15R/5Ay結(jié)合體之間。所述分子標(biāo)簽和/或蛋白水解位點(diǎn)可與所述至少一個(gè)含sushi多肽或與所述IL-15R/3Ay結(jié)合體直接或間接連接。分子標(biāo)簽的實(shí)例特別包括FLAG⑧標(biāo)簽。蛋白水解位點(diǎn)的實(shí)例特別包括Xa結(jié)合位點(diǎn)。FLAG⑧(注冊(cè)商標(biāo))八肽(Hoppetal"Bio/Technology6:1204，1988)不改變?nèi)诤系鞍椎纳锘钚?，是高度抗原的，并提供通過(guò)特異性單克隆抗體而可逆結(jié)合的表位，這能夠?qū)崿F(xiàn)被表達(dá)融合蛋白的快速檢測(cè)和輕易的純化。FLAG⑧序列還可被牛粘膜腸激酶在緊隨AspLys對(duì)之后的殘基處特異性裂解。覆有該肽的融合蛋白還可抵抗大腸桿菌中的細(xì)胞內(nèi)降解。已沉淀了與FLAG⑧序列結(jié)合的鼠單克隆抗體，其ATCC登錄號(hào)為HB9259。使用該抗體純化包含F(xiàn)LAG⑧序列的融合蛋白的方法如第5，011，912號(hào)美國(guó)專利所述。編碼Flag表位和因子X(jué)a結(jié)合位點(diǎn)的序列的實(shí)例包括SEQIDNO:53和NO:55(分別為氨基酸序列SEQIDNO:54和NO:56)。氨基酸在本發(fā)明的上下文中，"氨基酸殘基"意為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何氨基酸殘基(參見(jiàn)如Sewald"a/.,2002(42);IUPAC命名法，http:〃www.chem.qmul.ac.uk/iupac/AminoAcid/)。其包括天然存在的氨基酸(包括例如，使用三字母編碼，Ala、bAla、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val)、以及罕見(jiàn)的和/或合成的氨基酸及其書(shū)亍生物(包括例如Aad、Abu、Acp、Ahe、Aib、Apm、Dbu、Des、Dpm、Hyl、MeLys、MeVal、Nva、HAO、NCap、Abu、Aib、MeXaa等等(參見(jiàn)如(Mtiller"a/"1993;Aurora"a/"1998;Obrecht"a/.,1999;MaisonWa/.,2001;FormaggioWa/.,2003;Nowick"a/.，2003;.(43-竭。所述氨基酸殘基或其衍生物能夠是其任何異構(gòu)體，尤其是任<可手性異構(gòu)體，如L-或D-亞型。這里的氨基酸衍生物意為本領(lǐng)域已知的任何氨基酸衍生物(參見(jiàn)^口Sewald"a/.,2002(42);IUPAC命名法，http:〃www.chem.qmul.ac.uk/iupac/AminoAcid/)。例如，氨基酸衍生物包括可由具有諸如烷基側(cè)鏈的另外側(cè)鏈和/或雜原子取代的天然氨基酸衍生的殘基。氨基酸衍生物的其它實(shí)例包括帶有化學(xué)修飾的氨基酸，如發(fā)現(xiàn)于模擬肽或肽模擬物中的氨基酸，所述模擬肽或肽模擬物是含有非肽結(jié)構(gòu)要素、能夠模擬或?qū)固烊荒阁w肽的生物作用的化合物。肽模擬物通常不再具有典型的肽特征，如可被酶裂解的肽4走。優(yōu)選地，所述氨基酸屬于非必需氨基酸類。優(yōu)選的非必需氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、組氨酸。通過(guò)選擇那些以較低量存在于待給藥的患者中的氨基酸可精確選擇適當(dāng)?shù)陌被?。能夠以患者中所述氨基酸水平的函?shù)確定劑量和給藥方案。優(yōu)選的劑量和給藥方案是那些旨在將患者的氨基酸水平增加至正常標(biāo)準(zhǔn)水平的劑量和給藥方案。將所述至少一個(gè)含sushi多肽與所述至少一個(gè)IL-15RjgAy結(jié)合體連接本發(fā)明所述至少一個(gè)含sushi多肽可直接連接于所述至少一個(gè)IL-15R/3Ay結(jié)合體?；蛘撸景l(fā)明所述至少一個(gè)含sushi多肽以及所述至少一個(gè)IL-15R/3Ay結(jié)合體蛋白可由"連接區(qū)"氨基酸序列分隔，所述"連接區(qū)"氨基酸序列的長(zhǎng)度足以確保所述蛋白形成適當(dāng)?shù)亩?jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，所述連接區(qū)是肽連接區(qū)，其包括至少一個(gè)、但少于30個(gè)氨基酸，如2至30個(gè)氨基酸的肽連接區(qū)、優(yōu)選10至30個(gè)氨基酸的肽連接區(qū)、更優(yōu)選15至30個(gè)氨基酸的肽連接區(qū)、還更優(yōu)選19至27個(gè)氨基酸的肽連接區(qū)、最優(yōu)選20至26個(gè)氨基酸的肽連接區(qū)。優(yōu)選的連接區(qū)是那些允許化合物采取適當(dāng)構(gòu)象(即通過(guò)IL-15RjSA/信號(hào)通路而允許適當(dāng)信號(hào)傳導(dǎo)活性的構(gòu)象)的連接區(qū)。適當(dāng)連接區(qū)的實(shí)例包括柔性連接區(qū)。最合適的連接區(qū)序列(1)會(huì)采取柔性延伸的構(gòu)象，(2)不會(huì)顯示與融合蛋白的功能性結(jié)構(gòu)域相互作用形成有序二級(jí)結(jié)構(gòu)的傾向，并且(3)會(huì)具有最小的疏水性或帶電特性，所述疏水性或帶電特性會(huì)促進(jìn)與功能性蛋白結(jié)構(gòu)域相互作用。柔性蛋白區(qū)域中通常的表面氨基酸包括Gly、Asn和Ser(即G、N或S)。事實(shí)上，可預(yù)期含有Gly、Asn和Ser的氨基酸序列的任何變換均滿足上述連接區(qū)序列的標(biāo)準(zhǔn)。其它近中性氨基酸，例如Thr、Ala、Leu、Gln(即T、A、L、Q)也可用于連接區(qū)序列?？筛淖冞B接區(qū)序列的長(zhǎng)度而不顯著影響融合蛋白的生物活性。示例性的連接區(qū)序列描述于第5,073,627號(hào)和第5,108,910號(hào)美國(guó)專利。更具體地適用于本發(fā)明的示例性柔性連接區(qū)包括那些由序列SEQIDNO:49或NO:51編碼的柔性連接區(qū)(分別為氨基酸序列SEQIDNO:50-也稱為連接區(qū)20,以及NO:52-也稱為連接區(qū)26)。在本發(fā)明化合物中，所述至少一個(gè)含sushi多肽的序列能夠位于相對(duì)于所述至少一個(gè)IL-15R/5/7結(jié)合體的序列的N-末端位置中。或者，所述至少一個(gè)含sushi多肽的序列能夠位于相對(duì)于所述至少一個(gè)IL-15R/3Ay結(jié)合體的序列的C-末端位置中。本發(fā)明化合物能夠是融合蛋白。融合蛋白是包含兩個(gè)或多個(gè)源自不同或異種蛋白或肽的區(qū)域的多肽。使用常規(guī)的片段酶切和連接技術(shù)從期望的序列制備融合蛋白?？墒褂脩?yīng)用合成寡核苷酸的PCR技術(shù)來(lái)制備和/或擴(kuò)增期望的片段。重疊合成代表期望序列的寡核苷酸也能夠用于制備編碼融合蛋白的DNA構(gòu)建體。融合蛋白能夠包含數(shù)個(gè)序列，包括前導(dǎo)(或信號(hào)肽)序列、連接區(qū)序列、亮氨酸拉鏈序列或其它形成低聚物的序列、以及編碼高度抗原部分的序列，所述編碼高度抗原部分的序列提供用于融合蛋白的輕易純化或快速檢測(cè)的方法。示例性的本發(fā)明化合物是這樣的融合蛋白，其包含含sushi多肽SEQIDNO:30(it+sushi+鉸鏈)和人野生型IL-15SEQIDNO:48,任44選地通過(guò)連接區(qū)連接在一起。其它示例性的本發(fā)明化合物是融合蛋白，其包含-信號(hào)肽SEQIDNO:5，-Flag標(biāo)簽和Xa結(jié)合位點(diǎn)序列SEQIDNO:54，-含sushi多肽SEQIDNO:30(it+sushi+鉸鏈)，-連接區(qū)SEQIDNO:50，以及-人野生型IL-15的SEQIDNO:48，即由SEQIDNO:60編碼的RLI融合蛋白。其它示例性的本發(fā)明化合物是融合蛋白，其包含-信號(hào)肽SEQIDNO:58，-Flag標(biāo)簽和Xa結(jié)合位點(diǎn)序列SEQIDNO:56，-人野生型IL-15的SEQIDNO:48，-連接區(qū)SEQIDNO:52，-含sushi多肽SEQIDNO:30(it+sushi+鉸鏈)，即ILR融合蛋白SEQIDNO:62。能夠通過(guò)技術(shù)人員認(rèn)為合適的任何方式產(chǎn)生本發(fā)明化合物，所述方式例如，化學(xué)多肽合成或多肽生物合成?，F(xiàn)在化學(xué)多肽合成是4艮常規(guī)的(參見(jiàn)例如Andersson"a/.，2000，Biopolymers(PeptideScience)55:227-250)，并JU艮多公司專門(mén)進(jìn)4亍這種合成。優(yōu)選地，通過(guò)固相肽合成(SPPS)技術(shù)，使用標(biāo)準(zhǔn)FMOC方案(參見(jiàn)例如Carpino"a/.,1970,J.Am.Chem.Soc.92(19):5748-5749;Carpinoetal.，1972，J.Org.Chem.37(22):3404-3409)合成本發(fā)明^i合物?；蛘?，技術(shù)人員可選擇用生物方法通過(guò)體外或體內(nèi)翻譯編碼這種化合物的核酸而產(chǎn)生所述化合物。核酸、載體、宿主細(xì)胞本發(fā)明因此還涉及編碼產(chǎn)物的核酸(DNA或RNA)，所述產(chǎn)物旨在刺激IL-15R/3Ay信號(hào)通路、從而誘導(dǎo)和/或刺激諸如NK和/或T細(xì)胞的IL-15R/3/7-陽(yáng)性細(xì)胞的活化和/或增殖。更具體地，本發(fā)明的核酸編碼本文所定義的本發(fā)明的分離的含sushi多肽，或編碼本文所定義的共價(jià)連接的本發(fā)明化合物(即，含有至少一個(gè)直接或間接與至少一個(gè)IL-15Ri8A/結(jié)合體共價(jià)連接的含sushi多肽)。所述編碼與通用遺傳密碼一致，適當(dāng)考慮其簡(jiǎn)并性。本發(fā)明的核酸能夠任選地包含在載體內(nèi)，如轉(zhuǎn)染型載體或表達(dá)型載體內(nèi)。本發(fā)明的核酸可操作地連接于諸如轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)序列、任選的控制轉(zhuǎn)錄的操縱基因序列、編碼適當(dāng)?shù)膍RNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯起始與終止的適當(dāng)序列。這種載體的實(shí)例包才舌pEFl/myc-His(InVitrogen，V921-20)、pcDNA3.1(InVitrogen，V800畫(huà)20)。本發(fā)明的核酸還可與能夠促進(jìn)被翻譯的多肽胞外分泌的前導(dǎo)序列連接。這種前導(dǎo)序列的實(shí)例包括來(lái)自大鼠泌乳素前體的前導(dǎo)序列(SEQIDNO:57)或來(lái)自IL-15Ra的前導(dǎo)序列，例如人IL-15Rcd言號(hào)肽CDS的SEQIDNO:4。這些核酸的序列還可在其3'末端包含終止密碼子(TAG、TGA、TAA)。本發(fā)明涉及編碼所述本發(fā)明化合物之一的每一核酸。位于權(quán)利要求部分之前的表4表明這些核酸的相應(yīng)SEQIDNO:。例如-編碼所述人IL-15Ra的核酸能夠包含序列SEQIDN0:2;-編碼所述人胞外IL-15Ra的核酸能夠包含序列SEQIDNO:39;-編碼所述人sushi結(jié)構(gòu)域的核酸能夠包含序列SEQIDNO:13;-編碼所述人尾區(qū)的核酸能夠包含序列SEQIDNO:31;-編碼所述人尾區(qū)的所述外顯子3編碼部分的核酸能夠包含序列SEQIDNO:33;-編碼所述人IL-15的核酸能夠包含序列SEQIDNO:47;-編碼共價(jià)連接的本發(fā)明化合物的核酸能夠包含序列SEQIDNO:59(RLI融合蛋白)或SEQIDNO:61(ILR融合蛋白)。本發(fā)明的核酸能夠在其5，端包含Kozak序列，例如來(lái)自人野生型IL-15R的Kozak序列，如gccgcc;或來(lái)自牛泌乳素前體的Kozak序歹寸，如gccacc。本發(fā)明的核酸能夠在其3，端包含終止密碼子(如tag、tga或taa)。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的核酸的任何載體。優(yōu)選地，這樣的載體是桿狀病毒載體所述載體能夠例如是轉(zhuǎn)染型載體或表達(dá)型載體。細(xì)胞。本文所用的"轉(zhuǎn)染的"或"轉(zhuǎn)染"意為向真核細(xì)胞中引入一個(gè)或多個(gè)外源核酸。轉(zhuǎn)染包括通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)物理和化學(xué)轉(zhuǎn)染技術(shù)引入諸如質(zhì)粒的棵核酸，所述物理和化學(xué)轉(zhuǎn)染技術(shù)包括磷酸鈣沉淀、葡聚糖硫酸酯沉淀、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的核酸轉(zhuǎn)移、諸如微粒轟擊的基因槍方法等等。轉(zhuǎn)染還包括通過(guò)生物學(xué)方法向細(xì)胞中引入核酸，所述生物學(xué)方法包括病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染(受體介導(dǎo)的和非受體介導(dǎo)的)。本文所用的"轉(zhuǎn)化的"或"轉(zhuǎn)化"意為向原核細(xì)胞中引入一個(gè)或多個(gè)外源核酸。轉(zhuǎn)化包括引入棵核酸以及諸如噬菌體的核酸載體。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞包括在適當(dāng)?shù)膯?dòng)子控制下的原核生物、酵母或高級(jí)真核細(xì)胞。原核生物包括革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性有機(jī)體，例如大腸桿菌(^scAen'cA/aco〃)、牙古草4干菌(5ac/〃wsi/6"'"51)、鼠傷寒沙門(mén)菌(Sa/附o"e〃a(y/^/附wn'M附)，以及4干菌屬(5fl"'〃/ws)、，1單月包菌屬(尸化wc/omowa力、鏈霉菌屬(5Y^p,omyc&s)和葡萄球菌屬(5"/apA少/ococci/51)中的各種其它物種。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞的實(shí)例還包括諸如釀酒酵母(SaccAflramyces""v^ae)的酵母，以及諸如哺乳動(dòng)物或昆蟲(chóng)來(lái)源的確立細(xì)胞抹的高級(jí)真核細(xì)胞。適當(dāng)?shù)母呒?jí)真核細(xì)胞的實(shí)例包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，如中國(guó)卵巢倉(cāng)鼠細(xì)胞系CHO/dhfr-(CHOduk-)(ATCCn。CRL-9096);或者例如上皮細(xì)胞系，如猿上皮細(xì)胞系COS-7(ATCCn。CRL1651),或人細(xì)胞系，如293c18人腎細(xì)胞系(ATCCn。CRL-10852)或FreeStyle293-F人腎細(xì)胞系(InVitrogenn°R790-07)。所述宿主細(xì)胞可以是真核細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞(人細(xì)胞或諸如CHO細(xì)胞的非人細(xì)胞)、酵母細(xì)胞或原核細(xì)胞(例如大腸桿菌)。最優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，這是由于在本發(fā)明中這種細(xì)胞更有效(與任何糖基化問(wèn)題無(wú)關(guān))。生物和醫(yī)藥應(yīng)用本發(fā)明的產(chǎn)物特別包含本文所定義的分離形式的所述含sushi多肽，以及其共價(jià)連接形式，所述共價(jià)連接形式在此稱為共價(jià)連接的本發(fā)明化合物(即包含與至少一個(gè)IL-15R/5Ay結(jié)合體直接或間接共價(jià)連接的至少一個(gè)含sushi多肽的化合物)。本發(fā)明的產(chǎn)物還包括編碼這種多肽和化合物的核酸、包含這種核酸的載體、以及被這種核酸和這種載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的產(chǎn)物可用于擴(kuò)大淋巴細(xì)胞子集，例如特定的T/NK子集。本發(fā)明因此涉及本發(fā)明的產(chǎn)物作為擴(kuò)大諸如NK細(xì)胞、NK-T細(xì)胞、CD8+記憶細(xì)胞的一個(gè)或數(shù)個(gè)淋巴細(xì)胞群的試劑的用途，以及涉及用于這種用途的佐劑、組合物和試劑盒，其包括含有至少一種本發(fā)明產(chǎn)物的藥物組合物和藥物。所述至少一個(gè)含sushi多肽和所述至少一個(gè)IL-15Rj8Ay結(jié)合體能夠以組合形式使用，例如以共價(jià)結(jié)合的本發(fā)明化合物的形式使用，或者以單獨(dú)的形式使用。本發(fā)明因此涉及作為用于同時(shí)、單獨(dú)或順序使用的組合制劑，即以一整套組件(kit-of-parts)形式的-所述至少一個(gè)如本文所定義的IL-15Rj8Ay結(jié)合體，以及-所述至少一個(gè)如本文所定義的含sushi多肽，或其相應(yīng)的核酸、載體、宿主細(xì)月包。本發(fā)明因此涉及這樣的制劑，其為包括藥物組合物和藥物的佐劑、組合物或試劑盒。本申請(qǐng)因此涉及其中期望IL-15活性增加的疾病狀態(tài)或疾病的預(yù)防和/或緩解和/或治療，所述疾病狀態(tài)或疾病例如特別是癌或免疫缺陷。這樣的預(yù)防和/或緩解和/或治療可以通過(guò)刺激淋巴細(xì)胞(例如T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞)的增殖和/或存活和/或其對(duì)抗腫瘤細(xì)胞的活性起作用。本發(fā)明的預(yù)防和/或緩解和/或治療方法包括將本發(fā)明的產(chǎn)物給予有需要的患者。本發(fā)明還涉及用于這樣的預(yù)防和/或緩解和/或治療的佐劑、組合物、藥物組合物、藥物以及疫苗。本發(fā)明的藥物組合物、藥物以及疫苗包括至少一種本發(fā)明的產(chǎn)物，以及任選的藥物可接受賦形劑和/或載體和/或稀釋劑和/或佐劑。本發(fā)明更具體地涉及佐劑。這樣的佐劑特別適用于誘導(dǎo)和/或刺激免疫反應(yīng)，其包括分離的IL-15Rasushi結(jié)構(gòu)域或其保守變體。這樣的佐劑可以是用于抗孩t生物(抗病毒、抗菌、抗真菌)疫苗或抗腫瘤疫苗的佐劑。本發(fā)明還涉及-能夠特別用于誘導(dǎo)和/或刺激IL-15生物作用的組合物，其包括分離的IL-15Rasushi結(jié)構(gòu)域或其保守變體，-分離的IL-15Rasushi結(jié)構(gòu)域或其保守變體在制備用于免疫治療組合物的佐劑中的用途，-分離的IL-15Rasushi結(jié)構(gòu)域或其保守變體在制備用于誘導(dǎo)和/或刺激IL-15生物作用的組合物中的用途。本申請(qǐng)因此涉及包含至少一個(gè)如本文所定義的含sushi多肽以及任選的藥物可接受賦形劑和/或載體和/或稀釋劑和/或佐劑的藥物或疫苗。這樣的藥物或疫苗用于其中期望IL-15活性增加的疾病狀態(tài)或疾病的預(yù)防和/或治療和/或緩解，所述疾病狀態(tài)或疾病例如特別是癌或免疫缺陷。這樣的藥物或疫苗可以通過(guò)刺激淋巴細(xì)胞(例如T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞)的增殖和/或存活和/或其對(duì)抗腫瘤細(xì)l包的活性起作用。本發(fā)明更具體地涉及抗腫瘤藥物或疫苗，所述藥物和疫苗通過(guò)刺激表達(dá)IL-15R/3Ay但不表達(dá)IL-15Ra的NK和CD8+T細(xì)胞的增殖而賦予其預(yù)防和/或緩解和/或治療作用。這樣的抗肺瘤藥物或疫苗因此用于這樣的患者其NK和/或CD8+T細(xì)胞群沒(méi)有足夠的活性賦予有效的抗腫瘤監(jiān)視和清除。這樣的抗腫瘤藥物或疫苗更具體地用于這樣的患者其沒(méi)有足夠的或沒(méi)有足夠活性的表達(dá)IL-15R/3Ay但不表達(dá)IL-15Ra的NK和/或CD8+T細(xì)胞群。本發(fā)明的抗腫瘤藥物或疫苗可包含分離的IL-15Rasushi結(jié)構(gòu)域或其保守變體。本發(fā)明優(yōu)選的抗腫瘤藥物或疫苗包含國(guó)至少一個(gè)如本文所定義的IL-15Rj3Ay結(jié)合體，如IL-15，以及-至少一個(gè)如本文所定義的含sushi多肽，例如分離的IL-15Rasushi結(jié)構(gòu)域或其保守變體。優(yōu)選地，諸如IL-15的至少一個(gè)IL-15R/3Ay結(jié)合體和諸如分離的IL-15Rasushi結(jié)構(gòu)域的所述至少一個(gè)含sushi多肽或其保守變體在融合蛋白中是連接的，從而形成本發(fā)明的共價(jià)連接的化合物。本發(fā)明還涉及預(yù)防和/或緩解和/或治療涉及免疫缺陷的疾病或疾病狀態(tài)。本發(fā)明更具體地涉及預(yù)防和/或緩解和/或治療涉及HIV相關(guān)的免疫缺陷的疾病或疾病狀態(tài)。該預(yù)防和/或緩解和/或治療包括將本發(fā)明的產(chǎn)物給予有需要的患者。本發(fā)明涉及用于這樣的預(yù)防和/或緩解和/或治療的藥物和/或組合物。本發(fā)明因此涉及用于免疫治療組合物的佐劑，其特征在于其包含下列要素中至少一個(gè)要素-本發(fā)明的化合物，-本發(fā)明的核酸，-本發(fā)明的載體，-本發(fā)明的宿主細(xì)胞。有利地，所述佐劑改善CD8記憶響應(yīng)。在本申請(qǐng)中，《免疫治療》包涵通過(guò)誘導(dǎo)和/或刺激免疫反應(yīng)而進(jìn)行治療、緩解和/或預(yù)防。術(shù)語(yǔ)《免疫治療組合物》因此包涵預(yù)防疫苗以及緩解和/或治療"疫苗"。術(shù)語(yǔ)《佐劑》用于定義能夠被加入至組合物以改善免疫反應(yīng)(先天免疫反應(yīng)和/或適應(yīng)免疫反應(yīng))的物質(zhì)。在本發(fā)明中，其還包涵能夠?qū)てぜ尤胫两M合物以改善該組合物隨時(shí)間，即免疫反應(yīng)(記憶CD8+T細(xì)胞)持續(xù)時(shí)間期間，進(jìn)行的效率的物質(zhì)。本發(fā)明化合物可作為佐劑化合物而用于組合物，但也能夠本身作為活性物質(zhì)起作用。其確實(shí)能夠獨(dú)立地并且自發(fā)地誘導(dǎo)和/或刺激IL-15R/3/7-陽(yáng)性細(xì)胞的增殖和活化，以及更具體的NK和/或T細(xì)胞/人天然NK和/或T細(xì)胞的分化。術(shù)語(yǔ)《活性物質(zhì)》旨在定義能夠引起免疫反應(yīng)的物質(zhì)。作為用于免疫治療組合物的佐劑，本發(fā)明化合物改善免疫反應(yīng)(先天免疫反應(yīng)；適應(yīng)免疫反應(yīng))的強(qiáng)度和/或改善免疫反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間(其改善TCD8記憶響應(yīng))。作為用于免疫治療組合物的活性試劑，本發(fā)明化合物誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)比其它NK/T細(xì)胞刺激劑誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)具有更高的強(qiáng)度和/或更長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間。因此，無(wú)論是用作與所誘導(dǎo)的另一免疫反應(yīng)關(guān)聯(lián)的佐劑誘導(dǎo)，或是用作獨(dú)立地并且自發(fā)地誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的活性物質(zhì)，本發(fā)明化合物改善免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和/或持續(xù)時(shí)間。其有利地-誘導(dǎo)改善的先天免疫反應(yīng)，-誘導(dǎo)改善的適應(yīng)免疫反應(yīng)以及更具體的改善的CD8記憶響應(yīng)。本申請(qǐng)還涉及佐劑組合物，其包含下列要素中至少一個(gè)要素-本文所定義的本發(fā)明化合物，-本發(fā)明的核酸，-本發(fā)明的載體，51-本發(fā)明的宿主細(xì)胞。本申請(qǐng)還涉及產(chǎn)生用于免疫治療組合物的佐劑的方法，其特征在于其包含提供可溶性IL-15Ra分子或保留了其sushi結(jié)構(gòu)域的片段，將其共價(jià)連接于選自IL-15、IL-15片段、激動(dòng)劑或模擬物的IL-15R/3/7結(jié)合單元，所述IL-15Rj8結(jié)合單元與IL-15R|8/7結(jié)合的親合力不顯著低于天然IL-15與IL-15R/3Ay結(jié)合的親合力(能夠與天然IL-15和/或IL-2竟?fàn)幗Y(jié)合IL-15R/3/7),并且所述IL-15R/3Ay結(jié)合單元優(yōu)選地不與IL-2Rce結(jié)合，從而由此得到化合物是用于免疫治療組合物的佐劑。本發(fā)明還涉及包含至少一個(gè)含有如本文所定義的IL-15Rasushi結(jié)構(gòu)域的多肽的組合物、藥物組合物或藥物，即其中所述至少一個(gè)含sushi多肽的氨基酸序列是人IL-15Ra胞外區(qū)、或保留了所述IL-15Ra的sushi結(jié)構(gòu)域的片段的氨基酸序列，其中所述IL-15Rasushi結(jié)構(gòu)域被定義為開(kāi)始于第一外顯子2編碼的半胱氨酸殘基(C1)并且終止于第四外顯子2編碼的半胱氨酸殘基(C4),sushi序列中包括殘基Cl和C4，與這樣的IL-15Ra或IL-15Ra片段序列具有至少85%的同一性，前提是保留所述sushi結(jié)構(gòu)域中所有四個(gè)半胱氨酸殘基(C1、C2、C3和C4)。所述同一性百分?jǐn)?shù)優(yōu)選為至少90%,還更優(yōu)選為至少92%,最優(yōu)選為95%，如至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。本發(fā)明更具體地涉及組合物、藥物組合物或藥物，其包含至少一個(gè)含有如本文所定義的IL-15Rasushi結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述至少一個(gè)含sushi多肽包含、或由下列部分組成由外顯子2和3編碼的胞外IL-15Ro;部分，或保留sushi結(jié)構(gòu)域的所述部分的片段。本發(fā)明優(yōu)選地涉及組合物、藥物組合物或藥物，其包含-人IL-15Ra片段，其氨基酸序列是SEQIDNO:3的從位置l延伸至位置127的氨基酸，或者-保留了所述片段的sushi結(jié)構(gòu)域的亞片段，其中國(guó)所述sushi結(jié)構(gòu)域被定義為開(kāi)始于第一外顯子2編碼的半胱氨酸殘基(C1)并終止于第四外顯子2編碼的半胱氨酸殘基(C4)，該sushi結(jié)構(gòu)域中包括殘基CI和C4，并且-所述信號(hào)肽的氨基酸序列為所述SEQIDN0:3的從位置l延伸至位置30的序列，或者-所述片段或亞片段的變體，其在所述片段或亞片段全長(zhǎng)上的氨基酸序列同一性為至少85%。所述同一性百分?jǐn)?shù)優(yōu)選為至少90%，還更優(yōu)選為至少92%，最優(yōu)選為至少95%,如至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。這樣的組合物、藥物組合物或藥物還可包含至少一個(gè)IL-15Rj8Ay結(jié)合體，例如本文所定義的IL-15或IL-15片,殳或變體。所述至少一個(gè)IL-15R/3/7結(jié)合體能夠不與所述至少一個(gè)含sushi多肽共價(jià)連接，即能夠以游離形式置于所述組合物中，和/或能夠與所述至少一個(gè)含sushi多肽共價(jià)連接。在后一情況下，本發(fā)明的組合物、藥物組合物或藥物實(shí)際上包含如本文所定義的本發(fā)明化合物。這樣的藥物組合物或藥物能夠用于引起IL-15生物作用，并且更具體地用于誘導(dǎo)和/或刺激IL-15Rj3Ay-陽(yáng)性細(xì)胞的增殖和/或活化。這樣的藥物組合物或藥物能夠用于誘導(dǎo)和/或刺激NK和/或T免疫反應(yīng)的增殖和/或活化。這樣的藥物組合物或藥物能夠用于預(yù)防性和/或緩解性和/或治療性疫苗組合物。這樣的藥物組合物或藥物能夠用于預(yù)防和/或緩解和/或治療傳染性疾病，和/或用于預(yù)防和/或緩解和/或治療免疫缺陷(例如HIV誘導(dǎo)的免疫缺陷)，和/或用于預(yù)防和/或緩解和/或治療腫瘤發(fā)展或存在(并且然后可以進(jìn)一步含有至少一種腫瘤抗原)，和/或用于預(yù)防和/或緩解和/或治療X-SCID。根據(jù)本發(fā)明的有利實(shí)施方案，所述至少一個(gè)含sushi多肽與IL-15R/3Ay結(jié)合體共價(jià)連接。最優(yōu)選地，該IL-i5Rj8/7結(jié)合體不結(jié)合IL-2Ra。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述至少一個(gè)含sushi多肽與IL-15R/3Ay結(jié)合體共價(jià)連接，所述IL-15R|8Ay結(jié)合體是IL-15或IL-15片段、模擬物或激動(dòng)劑，其與IL-15R/Ay結(jié)合的親合力不顯著低于天然IL-15與IL-15R/3Ay結(jié)合的親合力(即能夠與天然IL-15和/或IL-2竟?fàn)幗Y(jié)合IL-15R/5Ay的片段、模擬物或激動(dòng)劑)。本發(fā)明因此更具體地涉及用于刺激IL-15R/3Ay信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)和/或刺激諸如NK和/或T細(xì)胞的IL-15R/3Ay-陽(yáng)性細(xì)胞的活化和/或增殖的藥物組合物，其特征在于其包含下列要素中至少一個(gè)要素-本發(fā)明的化合物，-本發(fā)明的核酸，-本發(fā)明的載體，-本發(fā)明的宿主細(xì)胞。這樣的藥物組合物還可包含藥物上適當(dāng)?shù)馁x形劑(載體、稀釋劑、賦形劑、添加劑、pH調(diào)節(jié)劑、乳化劑或分散劑、防腐劑、表面活性劑、膠凝劑以及緩沖劑和其它穩(wěn)定劑和增溶劑等等)。本發(fā)明還涉及用于刺激IL-15Rj3/7信號(hào)通路、從而誘導(dǎo)和/或刺激諸如NK和/或T細(xì)胞的IL-15R|3Ay-陽(yáng)性細(xì)胞的活化和/或增殖的藥物，其特征在于其包含下列要素中至少一個(gè)要素-本發(fā)明的化合物，-本發(fā)明的核酸，-本發(fā)明的載體，-本發(fā)明的宿主細(xì)胞。所述藥物優(yōu)選為免疫治療組合物。這樣的藥物最優(yōu)選為預(yù)防性和/或緩解性和/或治療性疫苗組合物。所述藥物還可包含生理上適當(dāng)?shù)馁x形劑(載體、稀釋劑、賦形劑、添加劑、pH調(diào)節(jié)劑、乳化劑或分散劑、防腐劑、表面活性劑、膠凝劑以及緩沖劑和其它穩(wěn)定劑和增溶劑等等)。適當(dāng)?shù)牡乃幬锟山邮艿馁x形劑和制劑包括所有已知的藥物可接受的賦開(kāi)j劑和制劑，例3o在"Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(雷明頓藥物科學(xué)與實(shí)踐)，，，20thedition,MackPublishingCo.;以及"PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems(藥物劑型和藥物遞送系統(tǒng))"，Ansel,PopovichandAllenJr.，LippincottWilliamsandWilkins中4笛述的那些。通常，載體的性質(zhì)取決于所用的具體給藥方式。例如，腸胃外制劑除了一種或多種造影劑之外通常包含可注射用液體作為賦形劑，所述可注射用液體包括藥物上和生理上可接受的液體，包括水、生理鹽水、平衡鹽溶液、緩沖液、含水葡萄糖、甘油、乙醇、芝麻油、其組合等等。介質(zhì)還可含有常規(guī)的藥物附屬材料，例如調(diào)節(jié)滲透壓的藥物可接受鹽、緩沖劑、防腐劑等等。載體和組合物能夠是無(wú)菌的，并且制劑適合于給藥方式。對(duì)于固體組合物(如粉劑、丸劑、片劑或膠嚢劑形式)，常規(guī)的無(wú)毒栽體能夠包括例如藥物級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂、或硬脂酸鎂。除了生物中性載體外，待給藥的藥物組合物能夠含有少量的輔助物質(zhì)，如潤(rùn)濕劑或乳化劑、防腐劑和pH緩沖劑等等，例如乙酸鈉或脫水山梨糖醇單月桂酸酯。組合物能夠是液體溶液、混懸液、乳液、片劑、丸劑、膠嚢劑、持續(xù)釋放制劑或粉劑。能夠用傳統(tǒng)的粘合劑和栽體，例如甘油三酸酯，配制纟且合物。本發(fā)明的組合物或藥物可用于通過(guò)IL-15R/3/7信號(hào)通i各誘導(dǎo)和/或刺激IL-15生物作用。其尤其可用于誘導(dǎo)和/或刺激先天免疫反應(yīng)(NK細(xì)胞)，和/或適應(yīng)性免疫(T細(xì)胞，以及更具體的TCD8+記憶細(xì)胞)。根據(jù)本發(fā)明的非常有利的實(shí)施方案，所述藥物能夠用于預(yù)防和/或緩解和/或治療腫瘤發(fā)展或存在。所述腫瘤能夠例如是黑素瘤、淋巴瘤、癌(如子宮頸癌)、乳癌、卵巢癌、胰腺瘤。有利地，所述抗腫瘤藥物是通過(guò)轉(zhuǎn)呈遞起作用的抗腫瘤疫苗。本發(fā)明的抗腫瘤藥物還能夠包含至少一種腫瘤抗原。所述至少一種腫瘤抗原能夠是可溶性形式，或與本發(fā)明化合物連接(通過(guò)共價(jià)連接或通過(guò)另外形式的連接)。有利地，以載有這種抗原的樹(shù)突細(xì)胞的形式，如以表達(dá)所述至少一種腫瘤抗原的遺傳學(xué)構(gòu)建的樹(shù)突細(xì)胞的形式提供所述至少一種腫瘤抗原。腫瘤抗原是由MHCI分子在腫瘤細(xì)胞表面呈遞的抗原。腫瘤抗原還能夠以例如突變的受體的形式存在于腫瘤表面，在這種情況下它們會(huì)被B細(xì)胞識(shí)別。腫瘤抗原有時(shí)能夠僅由腫瘤細(xì)胞而不被正常細(xì)胞呈遞。在這種情況下，它們被稱為腫瘤特異性抗原(TSA)或腫瘤特異性移植抗原(TSTA)或腫瘤排異抗原(TRA),并通常源自腫瘤特異性突變。通常當(dāng)感染性病毒使得細(xì)胞成為永生并表達(dá)病毒抗原時(shí)出現(xiàn)TSA。非被病毒誘導(dǎo)的TSA是B細(xì)胞淋巴瘤上的BCR或T細(xì)胞淋巴瘤上的TCR的獨(dú)特型。更常見(jiàn)的是由腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞呈遞的抗原，并且它們被稱為腫瘤相關(guān)抗原(TAA)。TAA發(fā)現(xiàn)于腫瘤細(xì)胞和胎兒期的正常細(xì)胞上(癌胚抗原)、出生后選擇的器官中、或在TAA濃度大大小于在腫瘤細(xì)胞中的濃度的許多細(xì)胞中。癌基因可在致癌病毒中表達(dá)。大多數(shù)癌基因?qū)嶋H上存在于宿主細(xì)胞中，其中它們表現(xiàn)為調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)。當(dāng)被病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)并在病毒啟動(dòng)子的控制下表達(dá)時(shí)，宿主細(xì)胞基因的產(chǎn)物，即原癌基因的產(chǎn)物，有助于腫瘤細(xì)胞的未調(diào)節(jié)生長(zhǎng)。由于原癌基因所編碼的蛋白通常由正常細(xì)胞表達(dá)，其在腫瘤細(xì)胞上的過(guò)表達(dá)會(huì)使其能夠作為腫瘤相關(guān)抗原。識(shí)別這些抗原的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞可能能夠在腫瘤細(xì)胞增殖或轉(zhuǎn)移之前^5皮壞腫瘤細(xì)胞。然而，腫瘤細(xì)胞可向下調(diào)節(jié)I類MHC表達(dá)。的粘著分子。某些腫瘤細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生諸如TGF/3的抑制細(xì)胞免疫性的抑制性細(xì)^^因子而活3夭地抑制免疫反應(yīng)。腫瘤抗原的實(shí)例特別包括-細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑，例如依賴細(xì)胞周期蛋白的激酶4(黑素瘤)，-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，例如/3-連環(huán)蛋白(黑素瘤)，國(guó)凋亡調(diào)節(jié)劑，例如caspase畫(huà)8(鱗狀細(xì)胞癌)，-睪丸蛋白，例如MAGE抗原(黑素瘤、乳腺腫瘤、膠質(zhì)瘤)，如MAGE國(guó)1(登錄號(hào)P43355)、MAGE-2(登錄號(hào)P43356)、MAGE-3(登錄號(hào)P43357)、MAGE-4(登錄號(hào)P43358)、MAGE-6(登錄號(hào)P43360)、MAGE-8(登錄號(hào)P43361)、MAGE-9(登錄號(hào)P43362)、MAGE-10(登錄號(hào)P43363)、MAGE-11(登錄號(hào)P43364)、MAGE-12(登錄號(hào)P43365),-黑色素合成中涉及的化合物(黑素瘤)，例如酪氨酸酶(登錄號(hào)P14679),-BCR獨(dú)特型，例如表面Ig獨(dú)特型(淋巴瘤)，-酪氨酸激酶受體，例如Her-2/neu、MUC-1(乳癌和卵巢癌)，-低糖基化粘蛋白類，例如MUC-1(乳腺腫瘤和胰腺腫瘤)，畫(huà)病毒基因產(chǎn)物，例如HPVE6和E7(宮頸癌)。本發(fā)明的組合物或藥物能夠用于預(yù)防和/或緩解和/或治療感染性疾病(被諸如病毒、細(xì)菌、酵母、真菌等等的微生物感染)。本發(fā)明的組合物或藥物能夠用于預(yù)防和/或緩解和/或治療免疫缺陷(如由諸如抗肺瘤治療或移植前治療的具體治療的副作用誘導(dǎo)的免疫缺陷；或由諸如HIV的病毒誘導(dǎo)的免疫缺陷)。本發(fā)明的組合物或藥物能夠用于預(yù)防和/或緩解和/或治療SCID-X(X染色體連鎖性嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷，其與IL-15R機(jī)能障礙相關(guān))。包括至少一種本發(fā)明產(chǎn)物的藥物組合物制劑是本領(lǐng)域技術(shù)中公知的。所述組合物給藥的細(xì)節(jié)也是本領(lǐng)域技術(shù)中公知的。治療患者的醫(yī)師在其它參數(shù)中必須考慮年齡、一般狀況和病狀?？赏ㄟ^(guò)對(duì)具體化合物適當(dāng)?shù)娜魏畏椒?如口服、靜脈內(nèi)、腸胃外、經(jīng)皮、經(jīng)粘膜)、或通過(guò)手術(shù)或移植(如采用固體的或半固體的生物相容性和可再吸收基質(zhì)形式的化合物)在期望所述化合物起作用的位點(diǎn)或在該位點(diǎn)附近給予患者根據(jù)本發(fā)明的方法識(shí)別的對(duì)治療有用的化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定適當(dāng)?shù)闹委焺┝浚⑶抑委焺┝渴求w重的函數(shù)。本發(fā)明還涉及用化合物通過(guò)治療和/或緩解和/或預(yù)防對(duì)需要該化合物的患者或非人動(dòng)物進(jìn)行治療的方法。本發(fā)明還涉及對(duì)需要該化合物的患者進(jìn)行治療的方法(通過(guò)治療57和/或緩解和/或預(yù)防進(jìn)行治療)，該方法是通過(guò)給以本發(fā)明的產(chǎn)物、組合物或藥物。本發(fā)明還涉及誘導(dǎo)和/或刺激IL-15R/3Ay-陽(yáng)性細(xì)胞的增殖和/或活化的方法，其特征在于其包括-使IL-15Rj8Ay-陽(yáng)性細(xì)胞與至少一個(gè)下列要素接觸，從而誘導(dǎo)和/或刺激所述IL-15R/3/，陽(yáng)性細(xì)胞的增殖和/或活化-本發(fā)明的化合物，-本發(fā)明的核酸，-本發(fā)明的載體，-本發(fā)明的宿主細(xì)胞。在能夠?qū)崿F(xiàn)所述IL-15Ri8Ay-陽(yáng)性細(xì)胞的增殖和/或活化的條件下進(jìn)行所述接觸。這樣的條件特別包括持續(xù)時(shí)間以及環(huán)境條件(溫度、空氣、培養(yǎng)基)。這些條件的調(diào)節(jié)在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。本發(fā)明還涉及誘導(dǎo)和/或刺激IL-15R/3Ay-陽(yáng)性細(xì)胞的增殖和/或活化的體外方法，其特征在于其包括-提供包含IL-15Rj8Ay-陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞樣品，-使所述樣品與至少一個(gè)下列要素在能夠?qū)崿F(xiàn)所述接觸的環(huán)境條件下接觸一段時(shí)間，以誘導(dǎo)和/或刺激所述IL-15R/3Ay-陽(yáng)性細(xì)胞的增殖和/或活化-本發(fā)明的化合物，-本發(fā)明的核酸，-本發(fā)明的載體，-本發(fā)明的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生活化NK和/或T細(xì)胞的方法，其特征在于其包括-使休眠NK和/或T細(xì)胞與至少一個(gè)下列要素在能夠?qū)崿F(xiàn)所述接觸的環(huán)境條件下接觸一段時(shí)間，以誘導(dǎo)包含在所述樣品中的所述休眠NK和/或T細(xì)胞的活化-本發(fā)明的化合物，-本發(fā)明的核酸，-本發(fā)明的載體，-本發(fā)明的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生活化NK和/或T細(xì)胞的體外方法，其特征在于其包括-提供包含休眠NK和/或T細(xì)胞的細(xì)胞樣品，-使所述樣品與至少一個(gè)下列要素在能夠?qū)崿F(xiàn)所述接觸的環(huán)境條件下接觸一段時(shí)間，以誘導(dǎo)包含在所述樣品中的所述休眠NK和/或T細(xì)胞的活化-本發(fā)明的化合物，-本發(fā)明的核酸，-本發(fā)明的載體，-本發(fā)明的宿主細(xì)胞。誘導(dǎo)和/或刺激IL-15R(8Ay-陽(yáng)性細(xì)胞的增殖和/或活化的方法中，以及在產(chǎn)生活化的NK和/或T細(xì)胞的方法中，被接觸的細(xì)胞可以是細(xì)胞系?；蛘咚鼈兡軌蚴怯缮矬w(如人患者)采集的離體細(xì)胞，并旨在經(jīng)體外處理后送回該生物體或另外的生物體(如同一患者)。因此，本發(fā)明包涵所述方法的離體實(shí)施方案，以及其在通過(guò)治療和/或緩解和/或預(yù)防而進(jìn)行的治療過(guò)程中的實(shí)施。在本申請(qǐng)中，通常不宣稱"終止，，密碼子(TAG、TGA或TAA)被包含在CDS內(nèi)。術(shù)語(yǔ)"包含(comprising)"是"包括(including)"或"含有(containing)"的同義詞，其是開(kāi)放的，并且不排除另外的、未述及的要素、成分或方法步驟，而術(shù)語(yǔ)"由……組成(consistingof)"是封閉術(shù)語(yǔ)，其排除任何未明確述及的另外的要素、步驟或成分。術(shù)語(yǔ)"基本上由……組成(essentiallyconsistingof)"是部分開(kāi)》文術(shù)語(yǔ)，其不排除另外的、未述及的要素、步驟或成分，前提是這些另外的要素、部分或成分不從本質(zhì)上影響本發(fā)明的基本的和新穎的性質(zhì)。因此術(shù)語(yǔ)"包含(comprising)"(或"comprise(s)")包括術(shù)^吾"由......組成(consistingof)"("consist(s)of，)以及術(shù)語(yǔ)"基本上由……組成(essentiallyconsistingof)"("essentiallyconsist(s)of，)。因此，本申請(qǐng)中的術(shù)語(yǔ)"包含(comprising)"(或"comprise(s)")意為更具體地包涵術(shù)語(yǔ)"由……組成(consistingof)"("consist(s)of，)以及術(shù)i吾"基本上由......組成(essentiallyconsistingof)"("essentiallyconsist(s)of，)。本文所用的術(shù)語(yǔ)"顯著地"具有統(tǒng)計(jì)學(xué)領(lǐng)域(如t檢驗(yàn)、z檢驗(yàn)、卡方值或F比值等等)的通常含義，即為了比較一個(gè)值與另一個(gè)值，并確定這些值是否彼此不同。因此術(shù)語(yǔ)"顯著地，，包涵下面的事實(shí)技術(shù)人員會(huì)考慮標(biāo)準(zhǔn)偏差(若有)，其以頻率分布測(cè)量數(shù)據(jù)分布的量。期望的p值通常設(shè)置為5%的a水平，或者更嚴(yán)格的1%的a水平。本文引用的所有參考文獻(xiàn)的相關(guān)公開(kāi)中每一種均以參考的方式明確并入。以舉例說(shuō)明的方式，而不是以限制的方式提供下列實(shí)施例。實(shí)施例實(shí)驗(yàn)步驟細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞因子-重組人IL-15(rlL-15)來(lái)自PeprotechInc(RockyHill，NJ)。在含有10。/o熱滅活的胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺以及1ng/mlGM-CSF(R&DSystems;Abington,UK)的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)Mo-7髓樣白血病細(xì)胞系(表達(dá)IL-l5R/3Ay、但不表達(dá)IL-l5Ra的人細(xì)胞系)以及TF-l紅白血病人細(xì)胞系(表達(dá)IL-15Ra和IL-15R>但不表達(dá)IL-15R/3的細(xì)胞系；ATCCCRL-2003)。在添加有250|ug/ml遺傳霉素的相同培養(yǎng)基中培養(yǎng)TFl-卩細(xì)胞(22)。在含有6%FCS、2mM谷氨酰胺、10ng/mlrIL-2(Chiron;Emeryville,CA)的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)Kit225人T淋巴瘤細(xì)胞系(IL-2依賴細(xì)胞系)。在含有10%FCS、0.4ng/mlm-IL-3、10pg/mlb-巰基乙醇、250pg/ml遺傳霉素的RPMI中培養(yǎng)小鼠32DiS細(xì)胞系，其表達(dá)內(nèi)源性小鼠IL-15Ry鏈和轉(zhuǎn)染的人IL-15Ri3鏈(可得自ATCCCRL-11346的32D細(xì)胞系)。'sIL誦15Ra國(guó)IL2、sIL-15Ra畫(huà)sushi畫(huà)IL醒2和sIL-15Ra-sushi—在CHO細(xì)胞中表達(dá)并如(23)所述制備sIL-15Ra-IL-2。制備類似的構(gòu)建體，其中所述IL-15Ra的sushi結(jié)構(gòu)域(成熟編碼序列的氨基酸l-66)與人IL-2分子連接(sIL-15Ra-sushi-IL-2)。通過(guò)PCR擴(kuò)增IL-15Ra的sushi結(jié)構(gòu)域。將PCR產(chǎn)物純化，用BamHI和HindIII(Fermentas、Vilnius、Lithuania)酶切，并連4妄到pQE30表達(dá)載體。在IPTG誘導(dǎo)下在大腸桿菌SG"0W細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。在細(xì)胞裂解后，將包涵體洗滌，溶于6mM鹽酸胍、pH7.4的20mM磷酸鈉、20mM咪唑、150mM氯化鈉和1mMDTT。將IL-15Ra-sushi捕獲在用增溶緩沖液加1mM還原谷胱甘肽和0.2mM氧化谷胱甘肽平衡的Ni-NTA瓊脂糖柱(Qiagen)上。將其在柱緩沖液中通過(guò)從6M至0M鹽酸胍梯度再折疊(24)并用250mM咪唑洗脫。RLI和ILR融合蛋白-融合蛋白的構(gòu)建體如圖2E所示。對(duì)于RLI,人IL-15Rocsushi結(jié)構(gòu)域(aal-77)和人IL-15通過(guò)連接區(qū)20(SGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ;SEQIDNO:50)分隔，或者對(duì)于ILR則通過(guò)連接區(qū)26(SGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ;SEQIDNO:52)分隔。在信號(hào)肽(sp)和編碼序列之間加入編碼Flag表位和因子X(jué)a結(jié)合位點(diǎn)的序列(對(duì)于RLI，DYKDDDDKIEGR，SEQIDNO:54;對(duì)于ILR,TTRDYKDDDDKIEGR，SEQIDNO:56)。對(duì)于RLI,使用人IL-15Ra的內(nèi)源性sp(SEQIDNO:5),以及對(duì)于ILR,使用牛泌乳素前體的sp(SEQIDNO:58)。將這些構(gòu)建體插入至pFastBac1(InVitrogen)表達(dá)載體的BamHI和HindIII位點(diǎn)之間以產(chǎn)生兩個(gè)表達(dá)載體，使用Bac至Bac表達(dá)系統(tǒng)(InVitrogen)將其重組在桿狀病毒DNA中。使用重組桿狀病毒感染SF9細(xì)胞(ATCCCRL-1711),融合蛋白表達(dá)在SF900II培養(yǎng)基(GibcoTMInvitrogenCorp.)中并在感染4天后收集。通過(guò)ELISA,使用抗IL-15mAb247(R&DSystems)作為捕獲抗體、以及抗FlagM2過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物(Sigma;StLouis,MO)作為顯色抗體測(cè)量融合蛋白的濃度。表面等離子共振(SPR)研究-使用BIACore2000生物傳感器(BIACore，Uppsala,Sweden)進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)。將rIL-15共價(jià)連接于CM5傳感器芯片，并監(jiān)控增加濃度的sIL-15Rot-IL-2、sIL隱15Rot畫(huà)sushi-IL-2或sIL誦15Ra-sushi的結(jié)合。使用BIAlogue動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)軟件進(jìn)行傳感圖的分析。增殖測(cè)定-如(19)所述，通過(guò)卩H]-胸香并入，在脫除細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中4小時(shí)、培養(yǎng)48小時(shí)并與[311]-胸苷培養(yǎng)16小時(shí)后，測(cè)量Mo-7、TF-1(3和Kit225細(xì)胞對(duì)rIL-15、rlL-2、RLI或ILR的增殖響應(yīng)。凋亡-使用FACScan流式細(xì)胞儀和膜聯(lián)蛋白V-FITC凋亡4企測(cè)試劑盒(BDBiosciencesPharmingen,France)進(jìn)4亍膜聯(lián)蛋白V測(cè)定。細(xì)月包因子饑餓后，將細(xì)胞以1ml中5x105細(xì)胞/孔種在多孔板中，并在添加有各種反應(yīng)物(rIL-15、sIL-15Rot-sushi和RLI融合蛋白)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。使用CellQuest軟件獲得并分析數(shù)據(jù)。結(jié)合測(cè)定和內(nèi)在化-用[1251]-碘標(biāo)記人rIL-15、sIL-15Ra-sushi和RLI融合蛋白，隨后如前所述(19)進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)。對(duì)于內(nèi)在化，在4°C下將細(xì)胞用標(biāo)記的sIL-15Ra國(guó)sushi或RLI平衡，并將溫度轉(zhuǎn)到37。C。在不同的時(shí)間間隔，將兩種樣品洗滌并離心。將細(xì)胞沉淀的一種用pH2.5的0.2M甘氨酸-HCl緩沖液處理，而另一種在4。C下用pH7.4的PBS處理5分鐘。離心后，由用PBS處理的細(xì)胞沉淀測(cè)定總配體結(jié)合，而由用酸性pH處理的細(xì)胞的上清液和沉淀中分別測(cè)定膜結(jié)合分?jǐn)?shù)和內(nèi)在化分?jǐn)?shù)。sIL-15Ra-Sushi+:如對(duì)融合蛋白R(shí)LI和ILR所述，將Flag-因子X(jué)a標(biāo)900II(InVitrogen,Cergy-Pontoise,France)中。通過(guò)用碌u酸銨沉淀將上清液濃縮至90%飽和度并上樣到抗Flag瓊脂糖免疫親合柱上(Sigma-Aldrich,Saint-QuentinFallavier，F(xiàn)rance)。如前所述(Lehoursetal.Eur.CytokineNetw.11(2000)，207-5)，在用氯胺-T方法進(jìn)行碘化之后，通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定sIL-15Ra-Sushi+的純度為100%,表觀分子量為12kDa。通過(guò)基于雙會(huì)啉-4-羧酸(BCA)的蛋白測(cè)定(Pierce,PerbioScience,Brebi6res，F(xiàn)rance)而測(cè)定其濃度。結(jié)果IL-15Ra與IL-15的結(jié)合主要是由于sushi結(jié)構(gòu)域一先前的研究(25)顯示除去由IL-15R的外顯子2編碼的"sushi"結(jié)構(gòu)域?qū)е翴L-15與膜錨定的IL-15Ra的結(jié)合的完全消除，這表明sushi結(jié)構(gòu)域?qū)τ诮Y(jié)合是必需的。為了直接測(cè)量sushi結(jié)構(gòu)域在IL-15結(jié)合中的貢獻(xiàn)，制備了含有全部胞外結(jié)構(gòu)域或僅含有N-末端sushi結(jié)構(gòu)域的可溶形式的IL-15Ra，并在竟?fàn)帨y(cè)定中通過(guò)使用表面等離子共振(SPR)技術(shù)測(cè)定了其IL-15結(jié)合。如圖1A所示，CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的并包含與人IL-2分子(用作純化的標(biāo)簽)結(jié)合的全部IL-15Rce胞外結(jié)構(gòu)域的sIL-15Ra-IL-2融合蛋白以高親合力與il-15結(jié)合(kon-3.7xio5M"s";koff=1.4xi(r5s-1;Kd=38pM)。連接IL-15Ra的sushi結(jié)構(gòu)域到人IL-2上的類似構(gòu)建體也結(jié)合IL-15(圖1B)，但親合力低10倍，這主要是由于更快的離開(kāi)速率(kon=3.1x1()5m"s";koff=1.3x10—4s";Kd=420pM)?？扇苄詓ushi結(jié)構(gòu)域也產(chǎn)生于大腸桿菌中。該sIL-15Ra-sushi也以較低的親合力與IL-15結(jié)合(kon-2.5xK^M-V1;koff=3.8xl(T4s";Kd=1.5nM)(圖IC)。這些結(jié)果表明sushi結(jié)構(gòu)域是IL-15的結(jié)合親合力的主要原因，但其不完全重新構(gòu)成全長(zhǎng)胞外結(jié)構(gòu)域所顯示的高親合力結(jié)合。如圖1E所示，延伸至稱為鉸鏈區(qū)的由外顯子3編碼的最初13個(gè)氨基酸的可溶性sushi結(jié)構(gòu)域與含有未延伸的sushi結(jié)構(gòu)域的sIL-15Ra-Sushi-IL-2相比，顯示結(jié)合親合力增加4倍，并且比全長(zhǎng)可溶性IL-15Ra的親合力僅^氐3倍，所有3個(gè)構(gòu)建體均產(chǎn)生于具有類似折63疊能力的真核體系中。這些結(jié)果表明，延伸至鉸鏈區(qū)的sushi結(jié)構(gòu)域幾乎完全重新構(gòu)成全長(zhǎng)胞外結(jié)構(gòu)域所顯示的高親合力結(jié)合。傳感圖的分析結(jié)果給出對(duì)于各種可溶性IL-15Ra蛋白所計(jì)算的對(duì)IL-15的親合力常數(shù)(Ko),以及統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)常數(shù)(x2),如下表3所示表3:<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>可溶性IL-15Ra蛋白抑制IL-15與膜錨定的IL-15Ra的結(jié)合-檢測(cè)了IL-15Ra的三種可溶形式勝過(guò)放射性碘標(biāo)記的IL-15與人細(xì)胞系TF-1表達(dá)的IL-15Ra的結(jié)合的能力，所述人細(xì)胞系TF-1還表達(dá)IL-15R/y鏈，但不表達(dá)IL-15R/3鏈(圖1D)。所述三種蛋白完全抑制IL-15與TF-1細(xì)胞的結(jié)合，其各自的IC50類似于通過(guò)SPR技術(shù)測(cè)量的Kd:100pM(sIL-15R(畫(huà)IL國(guó)2)、270pM(sIL-15Ra-sushi誦IL-2)以及1.3nM(sIL國(guó)15RO"Sushi)。sIL-15Ra-sushi通過(guò)IL-15R^y復(fù)合物增加IL-15驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞增殖—由于在大腸桿菌中很容易以高收率得到可溶性sushi結(jié)構(gòu)域，其謬皮選擇用于所有的進(jìn)一步研究。在第一實(shí)例中，在僅表達(dá)IL-15R0/7復(fù)合物的細(xì)胞系上(人Mo-7細(xì)胞系以及表達(dá)內(nèi)源小鼠IL-15R鏈和轉(zhuǎn)染的人IL-15R/3鏈的小鼠32D/細(xì)胞系)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。如所期待的，Mo-7細(xì)胞系響應(yīng)于納摩爾濃度的rIL-15或rlL-2而增殖(圖2A和2B)。出乎意料地，在測(cè)定中加入固定濃度的sIL-15Ra-sushi(10nM)增加了增殖響應(yīng)，對(duì)較低濃度的rIL-15其變化為約4倍。單獨(dú)的sIL-15Ra-sushi不誘導(dǎo)任何增殖響應(yīng)。在32D/3上得到類似的結(jié)果，變化為約10倍。通過(guò)sIL-15Ra-sushi不影響rlL-2驅(qū)動(dòng)的Mo-7細(xì)胞增殖的事實(shí)評(píng)Y介特異性(圖2B)。圖2C顯示sIL-15Ra-sushi劑量依賴地增強(qiáng)固定濃度的rIL-15(1nM)的作用，其IC50(3.5nM)類似于其對(duì)IL-15的Kd，而固定濃度的rIL-15(1nM)單獨(dú)僅誘導(dǎo)較小的增殖作用。RLI和ILR融合蛋白通過(guò)IL-15R3"復(fù)合物是有效的細(xì)胞增殖誘導(dǎo)劑為了評(píng)價(jià)sushi對(duì)IL-15生物活性的協(xié)同效應(yīng)是否在單獨(dú)分子上轉(zhuǎn)移，精心制作了編碼連接IL-15和sushi結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的分子構(gòu)建體。對(duì)于兩種構(gòu)建體，在IL-15的C末端和sushi結(jié)構(gòu)域的N末端之間(ILR)或相反(RLI)引入柔性連接區(qū)(圖2E)。圖2F中顯示了示例說(shuō)明這些蛋白的結(jié)構(gòu)的分子模型。在Mo-7細(xì)胞增殖方面檢測(cè)了這兩種融合蛋白。如圖2D所示，兩種蛋白均誘導(dǎo)Mo-7細(xì)胞增殖的劑量依賴誘導(dǎo)，其EC50類似(約25pM)并遠(yuǎn)低于單獨(dú)rIL-15的EC50(3nM)，或rIL-15與sIL-15Ra-sushi的等摩爾混合物的EC50(0.9nM)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了sIL-15Ra-sushi對(duì)IL-15作用的協(xié)同效應(yīng)，并表明用共價(jià)連接區(qū)穩(wěn)定IL-15:sIL-15Ra-sushi復(fù)合物顯著增強(qiáng)該協(xié)同效應(yīng)。sIL-15Ra-sushi增加IL-15誘導(dǎo)的凋亡預(yù)防，并且RLI有效地預(yù)防細(xì)胞凋亡-細(xì)胞因子去除后，凋亡Mo-7細(xì)胞的分?jǐn)?shù)在48小時(shí)內(nèi)由10%升至80%(圖3A，曲線a和b)。當(dāng)在時(shí)間O加入時(shí)，rIL-15(5nM)將該凋亡降至70%(圖3A，曲線c)。單獨(dú)的sIL-15Ra-sushi(10nM)不起作用(圖3Ab)。然而，其顯著增強(qiáng)rIL-15的抗凋亡作用(48小時(shí)，35%凋亡)(圖3A,曲線c)。動(dòng)力學(xué)分析(圖3B)和劑量響應(yīng)曲線(圖3C)證實(shí)了sIL-15Ra-sushi對(duì)IL-15預(yù)防凋亡的協(xié)同效應(yīng)。rIL-15起作用的IC50為約1.5nM，與IL-15p/y受體的飽和一致。該IC50比在10nMsIL-15Ra-sushi存在下低約10倍(170pM)。RLI融合蛋白顯著預(yù)防凋亡(圖3B)。在摩爾濃度基礎(chǔ)上，其甚至比IL-15:sIL-15Ra-sushi締合物更活潑，IC50為約40pM(圖3C)。sIL-15Ra-sushi增加IL-15與Mo-7細(xì)胞的結(jié)合，并且RLI融合蛋白與Mo-7細(xì)胞結(jié)合并被Mo-7細(xì)胞內(nèi)在化-如所期待的，Mo-7細(xì)胞以中等親合力與IL-15結(jié)合(Kd-13.5nM)，最大結(jié)合能力為800位點(diǎn)/細(xì)胞(圖4A)。加入sIL-15Ra-sushi(10nM)增加IL-15結(jié)合的親合力(Kd-7nM)而不顯著影響最大結(jié)合能力(1180位點(diǎn)/細(xì)胞)。當(dāng)使用放射性碘化的RLI融合蛋白時(shí)(圖4B)，發(fā)現(xiàn)其與類似數(shù)目的受體位點(diǎn)結(jié)合(730位點(diǎn)/細(xì)胞)，并且結(jié)合親合力(Kd-780pM)顯著高于IL-15。圖4C顯示RLI能夠被有效地和快速地內(nèi)在化<sIL-15Ra-sushi不影響IL-15驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞增殖，也不通過(guò)高親合力IL-15Ra/(3/Y復(fù)合物抑制凋亡-人淋巴瘤細(xì)胞系Kit225表達(dá)內(nèi)源性IL-15Ra、j3和y鏈，并且人TF-1卩細(xì)胞系表達(dá)內(nèi)源性IL-15Ra和y鏈加轉(zhuǎn)染的人IL-15R(3鏈。因此，如圖5A和5B所示，這些細(xì)胞系響應(yīng)于低的皮摩爾濃度的IL-15而增殖(EC50分別為19pM和21pM)。與對(duì)于Mo-7或32D卩細(xì)胞所發(fā)現(xiàn)的相反，向IL-15中加入等摩爾濃度的sIL-15Ra-sushi不顯著影響IL-15對(duì)任一細(xì)胞類型的劑量響應(yīng)曲線。ILR融合蛋白對(duì)所述兩種細(xì)胞系的活性與rIL-15類似。RLI對(duì)Kit225細(xì)胞的活性也與rIL-15類似，但L對(duì)TF-ip細(xì)胞的效率比rIL-15高16倍(EC5(^1.2pM)。進(jìn)一步分析了sIL-15Ra-sushi和RLI對(duì)細(xì)月包因子剝奪所誘導(dǎo)的TF-lp細(xì)胞凋亡的影響。柱狀圖示于圖5C(曲線a、b、c和d)，而動(dòng)力學(xué)和劑量響應(yīng)曲線分別示于圖5D和5E。rIL-15劑量和時(shí)間相互依賴地抑制TF-ip凋亡。單獨(dú)的sIL-15Ra-sushi沒(méi)有影響并且不改變IL-15的影響。ILR融合蛋白的活性與rIL-15類似，而RLI具有比rIL-15高約3倍的保護(hù)效果(對(duì)于RLI，IC50=2.5pM,而對(duì)于rIL-15或sIL-15Ra-sushi加rIL-15,IC50=6.5pM)。IL-15、sIL-15Ra-sushi和RLI與TFlp細(xì)胞結(jié)合—在IL-15Ra彌hi不影響TF-1(3的IL-15增殖的范圍內(nèi)，我們研究了很寬濃度范圍內(nèi)其對(duì)于IL-15結(jié)合的影響(圖6A)。飽和結(jié)合曲線的Scatchard分析表明兩類IL-15結(jié)合位點(diǎn)的存在，與少數(shù)高親合力結(jié)合位點(diǎn)(IL-15Rot/p/"y復(fù)合物，Kd=22pM,Bmax=100位點(diǎn)/細(xì)胞)加更大量的中等親合力結(jié)合位點(diǎn)(IL-15R(3/y復(fù)合物，Kd=30nM，2800位點(diǎn)/細(xì)胞)的存在一致。sIL-15Ra-sushi誘導(dǎo)IL-15結(jié)合的增加，這在Scatchard分析下主要是由于IL-15與中等親合力成分結(jié)合的親合力增加(Kd:3.5nM)。為了更具體地檢驗(yàn)sIL-15Ra對(duì)高親合力成分的影響，在低濃度的放射性標(biāo)記的IL-15下分析了其影響。如圖6B所示，在高至25nM的濃度下，sIL-15Ra-sushi不影響低濃度(200pM)的主要靶向高親合力受體的IL-15的結(jié)合C圖6B)。;故射性標(biāo)記的sIL-15Rot-sushi與TF-ip細(xì)胞的結(jié)合(圖6C)揭示了特異性結(jié)合成分，其嚴(yán)格依賴于rlL-15的存在。在lnMrlL-15的存在下，反映sIL-15Ra-sushi結(jié)合的Kd為3.5nM，該值與其對(duì)IL-15的親合力一致，最大結(jié)合能力(3300位點(diǎn)/細(xì)胞)與IL-15中等結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目一致。如圖6D進(jìn)一步顯示，放射性標(biāo)記的sIL-15Ra-sushi祐L有效地內(nèi)在化。；改射性標(biāo)記的RLI融合蛋白還與TFlp細(xì)胞結(jié)合(圖6E)。觀察到單獨(dú)的特異性結(jié)合成分，Kd為250pM,并且最大能力(4000位點(diǎn)/細(xì)胞)再次與IL-15中等親合力結(jié)合位點(diǎn)相當(dāng)。一旦結(jié)合，RLI也i皮有效地內(nèi)在化(圖6F)。討論以前顯示刪除人IL-15Ra的外顯子2會(huì)完全消除IL-15結(jié)合，這表明sushi結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞因子識(shí)別中的關(guān)鍵作用(25)。本發(fā)明顯示，除去IL-15Ra胞外部分的C-末端尾部(外顯子3至5)(在sIL-15Ra-IL-2融合蛋白的環(huán)境中)導(dǎo)致其與IL-15結(jié)合的親合力下降10倍，如通過(guò)SPR所示；以及其親合力下降3.5倍，如在竟?fàn)帨y(cè)定中所示。才艮據(jù)熱力學(xué)，親合力下降10倍^皮計(jì)算為對(duì)應(yīng)于IL-15與IL-15Ra相互作用的自由能的10%損失。因此由外顯子2編碼的N-末端結(jié)構(gòu)域(sushi結(jié)構(gòu)域)帶有大部分(90%)、但不是全部的IL-15結(jié)合能力。來(lái)自我們實(shí)驗(yàn)室的最近數(shù)據(jù)表明外顯子3編碼的結(jié)構(gòu)域也有助于IL-15結(jié)合。大腸桿菌中產(chǎn)生的sIL-15Ra-sushi具有的親合力比CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的sIL-15Ra-sushi-IL-2的親合力j氐3至4倍。由于sushi結(jié)構(gòu)i或不含有任何N-或0-連接的糖基化的潛在位點(diǎn)(2)，因此該差異不能通過(guò)兩種蛋白的糖基化狀態(tài)的差異來(lái)解釋。因此，這有可能是由于這兩種蛋白的結(jié)構(gòu)折疊的差異。當(dāng)與IL-15竟?fàn)幗Y(jié)合膜IL-15Ra時(shí)，發(fā)現(xiàn)sIL-15Ra-sushi通過(guò)增強(qiáng)IL-15作用而賦予激動(dòng)劑效應(yīng)，所述IL-15作用是經(jīng)過(guò)IL-15(3/y復(fù)合物。對(duì)僅表達(dá)中等親合力IL-15受體(Mo-7，32DP)或表達(dá)高親合力和中等親合力IL-15受體(TF-1(3，Kit225)的細(xì)胞的研究顯示sIL-15Ra-sushi的激動(dòng)劑作用特別指向IL-15RP"復(fù)合物(i)當(dāng)不存在IL-15時(shí)其不具有影響，(ii)當(dāng)存在IL-15時(shí)其與TF-lp細(xì)胞的單一親合力類型的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，所述結(jié)合位點(diǎn)的密度與中等IL-15結(jié)合位點(diǎn)的密度相當(dāng)，(iii)在Mo-7細(xì)胞和TF-1(3細(xì)胞上，其增加IL-15對(duì)于IL-15R(3/y復(fù)合物的親合力，但不影響TF-ip細(xì)胞上IL-15與高親合力復(fù)合物的結(jié)合，(iv)其通過(guò)IL-15R卩/y增強(qiáng)Mo-7細(xì)胞上IL-15生物作用(增殖、預(yù)防凋亡)的效率，但不影響TF-lp細(xì)胞上通過(guò)高親合力受體介導(dǎo)的相同生物作用。sIL-15Ra-sushi—旦與IL-15偶聯(lián)結(jié)合于Mo-7細(xì)胞上的IL-15R(3/y，就;故有效地細(xì)胞內(nèi)在化，該事實(shí)進(jìn)一步支持了該激動(dòng)劑作用的功能性。在ILR和RLI融合蛋白的環(huán)境中增強(qiáng)了其潛能(i)RLI與IL-15Rp/y結(jié)合的親合力比IL-15本身好幾乎20倍，(ii)RLI的結(jié)合之后跟隨融合蛋白的快速內(nèi)在化，(iii)在功能測(cè)定中，RLI或ILR融合蛋白比IL-15有效得多。這兩種融合蛋白在Mo-7細(xì)胞上的劑量響應(yīng)曲線與Kit225或TF-1(3細(xì)胞上IL-15通過(guò)高親合力受體的劑量響應(yīng)曲線相當(dāng)，這表明這些融合蛋白在僅表達(dá)中等親合力受體的細(xì)胞上幾乎完全重新構(gòu)成高親合力響應(yīng)。68因此所述結(jié)果表明sIL-15Ra-sushi和IL-15形成復(fù)合物，協(xié)同增加其對(duì)IL-15Rp/y受體的結(jié)合親合力。相反，一旦IL-15已經(jīng)與膜高親合力受體復(fù)合物締合，則sIL-15Ra-sushi不能影響IL-15結(jié)合與生物活性。然而，不能排除，并且應(yīng)該檢驗(yàn)sIL-15Ra-sushi是否仍然能夠與已經(jīng)與該高親合力復(fù)合物結(jié)合的IL-15結(jié)合，所述檢驗(yàn)是使用主要表達(dá)高親合力受體的細(xì)胞、即表達(dá)類似水平的這三種受體亞單位的細(xì)胞的可用度。我們的實(shí)-瞼室以前顯示了COS細(xì)胞中表達(dá)的sIL-15Ra或由IL-15Ra陽(yáng)性細(xì)胞天然產(chǎn)生的sIL-15Ra表現(xiàn)為有效的拮抗劑，其以高親合力與IL-15結(jié)合(Kd:166pM)并在低濃度(IC50為3pM至10pM)抑制IL-15誘導(dǎo)的Kit225細(xì)胞增殖(19)。這些結(jié)果與本發(fā)明相反，本發(fā)明顯示sIL-15Ra-sushi不影響Kit225細(xì)胞或TF-lp細(xì)胞的增殖，并且是Mo-7細(xì)力包上的激動(dòng)劑。另一相反的結(jié)果是最近的報(bào)道，顯示rIL-15與重組人sIL-15Ra(缺乏外顯子3)-Fc同型二聚體嵌合體的混合物會(huì)誘導(dǎo)Mo-7細(xì)胞上的抗凋亡效應(yīng)，而單獨(dú)的rIL-15在相同的劑量下沒(méi)有影響(26)。為了解釋這些作用的差異，在本申請(qǐng)的圖7中提出了模型。在高親合力IL-15響應(yīng)的環(huán)境中，sIL-15Ra作為膜IL-15Ra的竟?fàn)幬镉糜谀技疘L-15(圖7A)。相反，sIL-15Ra-sushi與IL-15的復(fù)合物能夠與膜IL-15R卩々締合并增強(qiáng)IL-15的生物效應(yīng)(圖7B)。為了解釋sIL-15Ra-sushi在高親合力受體的環(huán)境中不存在抑制效應(yīng)，有兩種選擇(圖7C)。根據(jù)第一選擇，sIL-15Ra-sushi對(duì)IL-15具有比sIL-15Ra(Kd=160pM)低的親合力(Kd-1.5nM,本文)(19),因此不能有效;也在Kit225或TF-lp細(xì)胞上與膜IL-15Ra竟?fàn)帯２鹏迵?jù)第二選4奪，sIL-15Ra-sushi能夠與膜IL-15Ra竟?fàn)幣cIL-15結(jié)合并與IL-15Rp/y形成類似于在Mo-7細(xì)胞上形成的復(fù)合物。這種復(fù)合物效率較低，這是由于它們需要較高濃度的IL-15才能活化(IC50-750pM，而對(duì)于高親合力受體，IC50=20pM,圖2和5)。然而，由于在Kit225或TF-lp細(xì)胞中IL-15Rp/y過(guò)量于IL-15Ra,這種復(fù)合物的較低效率可被其較高密度(TF-ip細(xì)胞上約3，000中等親合力受體代替100高親合力受體，參見(jiàn)圖6)所補(bǔ)償。這不會(huì)導(dǎo)致生物效應(yīng)的可觀測(cè)的變化。我們觀測(cè)到sIL-15Ra-sushi不影響IL-15在TF-1(3細(xì)胞上的高親合力結(jié)合(圖6B),這在某種程度上傾向于第一選擇。sIL-15Rot和sIL-15Ra-sushi之間的功能差異表明sIL-15Ra的C末端尾部在與膜IL-15Ra的竟?fàn)幹小⒉⒁虼嗽趕IL-15Ra的拮抗劑作用中起關(guān)#:作用。該尾部或者阻止可溶性IL-15Ra與IL-15R(3/y締合，或者允許這種締合，但導(dǎo)致IL-15R(3/Y對(duì)于其機(jī)能不適當(dāng)?shù)臉?gòu)象。在可溶性普通Y鏈的情況下已提出了類似的機(jī)理(27)。通過(guò)除去該可溶性Y鏈(對(duì)應(yīng)于Y鏈的全部胞外部分)的C-末端部分或通過(guò)WSXWS基序的突變而消除該可溶性Y鏈的抑制活性，所述C-末端部分和WSXWS基序是不涉及細(xì)胞因子結(jié)合的兩個(gè)區(qū)域。Sushi的激動(dòng)劑效應(yīng)暗示對(duì)于細(xì)胞因子的廣大IL-6家族中的可溶性受體(即sIL-6R、sIL-llR、sCNTFR和IL-12p40亞單位)所述的、激動(dòng)劑效應(yīng)(28)。然而，對(duì)于IL-15R，不能期待這樣的激動(dòng)劑作用，這是由于yc家族中目前所述的所有可溶性受體(sIL-2Ra、sIL-2Rp、sIL-4R)以及sIL-15Ra本身作為細(xì)胞因子拮抗劑起作用(19,29)。本結(jié)果因此將IL-15Ra的可溶性sushi結(jié)構(gòu)域識(shí)別為該家族中意外的和有效的5敫動(dòng)劑。細(xì)胞因子跨信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(tmnssignaling)的概念首先被用在IL-6的情況中，其中顯示可溶性IL-6R可增強(qiáng)IL-6響應(yīng)細(xì)月包對(duì)IL-6作用的敏感性并可使表達(dá)gpl30但不表達(dá)膜IL-6R的細(xì)胞對(duì)IL-6響應(yīng)(30)。該概念已被擴(kuò)展至gpl30細(xì)胞因子家族的其它成員(IL-11R、CNTFR、CLC)(31-34)。在IL-15的情況下，已顯示了細(xì)胞因子轉(zhuǎn)呈遞的機(jī)理(12),其中由單核細(xì)胞/樹(shù)突細(xì)胞產(chǎn)生的IL-15與由相同細(xì)胞表達(dá)的膜IL-15Ra締合并能夠刺激IL-15Rp/Y+IL-15RoT旁觀者細(xì)胞的增殖。最近的才艮道提出轉(zhuǎn)呈遞是體內(nèi)的支配性機(jī)理，這使得由相同細(xì)胞表達(dá)IL-15和IL-15Ra成為必要(13、14、35、36)。其與跨信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)概念有某些相似性，其中轉(zhuǎn)呈遞的IL-15/IL-15Ra復(fù)合物能夠使IL-15R卩//IL-15Ra-細(xì)胞對(duì)IL-15的生理濃度敏感。在這方面，膜IL-15Ra通過(guò)增加IL-15對(duì)IL-15Rp/y復(fù)合物的親合力和發(fā)信號(hào)的效率而作為IL-15作用的;敫動(dòng)劑(12)。我們的數(shù)據(jù)顯示，sIL-15Ra-sushi的行為是類似的并4吏IL-15Rp//IL-15Ra—細(xì)胞對(duì)IL-15的作用敏感。這暗示膜IL-15Ra的sushi結(jié)構(gòu)域?qū)D(zhuǎn)呈遞是關(guān)鍵的。我們已顯示由IL-15Ra表達(dá)細(xì)胞產(chǎn)生的并包涵IL-15Ra全部胞外部分的sIL-15Ra可抑制IL-15作用(19)。它很可能建立負(fù)反饋機(jī)理，限制IL-15的生物效應(yīng)。相反，本研究中描述的sIL-15Ra-sushi顯示激動(dòng)劑效應(yīng)。若這種可溶性sushi是由IL-15Ra表達(dá)細(xì)胞產(chǎn)生的，則其能夠參與IL-15轉(zhuǎn)呈遞機(jī)理。這種天然產(chǎn)生的可溶性sushi結(jié)構(gòu)域的存在還未被描述過(guò)，但被下列事實(shí)支持(i)已描述了膜IL-15Ra的不同亞型，包括某些連接sushi結(jié)構(gòu)域于S爭(zhēng)膜結(jié)構(gòu)域的缺乏尾部(由外顯子3至5編碼)的亞型(3、25、37),以及(ii)已證明了它們中某些的可溶性對(duì)應(yīng)物通過(guò)脫落的產(chǎn)生(19)。因it匕，sIL-15Ra和sIL-15Ra-sushi可能具有相反的調(diào)節(jié)效應(yīng)，并且因此二者均參與調(diào)整比-15生物作用的大小和持續(xù)時(shí)間。本發(fā)明還顯示，在IL-15的情況下使用柔性連接區(qū)以產(chǎn)生諸如ILR或RLI的融合蛋白是有效的方法。產(chǎn)生了帶有sushi結(jié)構(gòu)域的IL-15的分子模型(圖2)，其幫助設(shè)計(jì)能夠連接IL-15的C-末端與sushi的N-末端(ILR融合蛋白)或相反(RLI融合蛋白)的柔性連接區(qū)。該模型還預(yù)測(cè)所述連接區(qū)不遮蓋IL-15中涉及與IL-15Rp和y鏈連接的區(qū)域。如上文所討論的，這兩種融合蛋白證明比IL-15以及IL-15加sIL-15Ra-sushi的組合在活化Mo-7細(xì)胞上的IL-15Rp/y復(fù)合物方面活潑得多。在TF-113細(xì)胞上，以及在高親合力受體活化的環(huán)境中，ILR融合蛋白與IL-15同樣活潑，并且RLI融合蛋白甚至更活潑IO倍，其EC50在誘導(dǎo)細(xì)月包增殖中低至1.2pM。由于其高活性，這些超-IL-15融合蛋白看來(lái)構(gòu)成用于擴(kuò)充淋巴細(xì)胞子集的有用工具，尤其是那些細(xì)胞(NK、CD8記憶T細(xì)胞)，其中IL-15的轉(zhuǎn)呈遞^皮暗示為生理學(xué)活化過(guò)程(13)。它們因此是針對(duì)患有癌、免疫缺陷或感染性疾病的患者的治療的治療策略中非常有效的佐劑分子。1.Grabstein,K.H.，Eisenman,J,，Shanebeck,K.，Rauch，C.,Srinivasan,S.,Fung,V.，Beers,C.,Richardson,J.,Schoenbom,M.A.，Ahdieh,M.，andetal.(1994)264，965-9682.Giri，J.G,，Ahdieh,M.，Eisenman，J.，Shanebeck,K,，Grabstein,K.，Kumaki，S.,Namen,A.，Park,L.S.，Cosman，D.，andAnderson,D.(1994)五m6oJ13,2822-28303.Anderson,D.M.，Kumaki，S.,Ahdieh,M.,Bertles，J.，Tometsko,M.,Loomis,A.,Giri,J.,Copeland,N.G.，Gilbert,D.J.,Jenkins,N.A.，andetal,(1995)J歷o/CAem270，29862-298694.Burton,J,D.,Bamford,R.N.，Peters,C.,Grant,A.J.，Kurys,G.，Goldman,C.K.,Breiman,J.,Roessler,E.,andWaldmann,T.A.(1994)iVoc胸"ca"".t/"91,4935-49395.Carson，W.E.，Giri,J.G.,Lindemann,M.J.，Linett,M.L.,Ahdieh,M.,Paxton，R.,Anderson,D,，Eisenmann,J.，Grabstein,K,，andCaligiuri,M.A.(1994)J五jc;180,1395-14036.Wilkinson,P.C.，andLiew，F(xiàn).Y.(1995)/~181，1255-12597.Kennedy，M.K.，Glaccum,M.,Brown,S.N.，Butz,E.A.，Viney，J.L.，Embers,M.，Matsuki，N.,Charrier,K.,Sedger，L.,Willis,C.R.,Brasel，K.，Morrissey，P.J.，Stocking,K.,Schuh，J.C.，Joyce,S.，andPeschon，J.J.(2000)191,771-7808.Lodolce，丄P.，Burkett，P.R.，Boone，D.L，Chien，M.,andMa，A.(2001)/￡jc/7M^/194，1187-11949.Marks-Konczalik，J.，Dubois,S.,Losi,J.M.，Sabzevari,H.,Yamada，N.，F(xiàn)eigenbaum，L,Waldmann,T.A.,andTagaya,Y.(2000)尸麼扁細(xì)d》"J97，11445-1145010.Ku,C.C.,Murakami,M.，Sakamoto,A.，Kappler，J.，andMarmck，P.(2000)288,675-67811.Li,X.C.，Demirci,G.，F(xiàn)errari-Lacraz，S.，Groves,C.,Coyle,A.,Malek，T.R.,andStrom,T.B.(2001)M/MW7，114-11812.Dubois,S.，Mariner,J.，Waldmann，T.A.，andTagaya,Y。C200"/mmwmXy17,537-54713.Burkett,P.R.，Koka,R.，Chien,M.，Chai，S.，Chan,F.,Ma，A。，andBoone，D.L.(2003)Pracf/S^100，4724-472914.Schluns,K.S.，Nowak，E.C.，Cabrera-Hernandez,A,，Puddington,L,,Lefrancois,L.，andAguila,H.L.(2004)M^/Jcad<Scz.t/"101，5616-562115.Kobayashi,H.，Dubois,S.，Sato,N.，Sabzevari,H.，Sakai，Y。,Waldmann,T.A.,andTagaya,Y.(2005)5/oo</105,721-72716.Norman,D.G.，Barlow,P.N.，Baron,M.，Day,A.J,，Sim，R,B.,andCampbell,I.D.(1991)J編編219，717-72517.Schulz,O,，Sewell,H.F.,andShakib，F(xiàn).(1998)JE"jc;187，271-27518.Sheu,B.C.，Hsu，S.M.，Ho,H.N.,Lien,H.C,，Huang,S。C。，andLin，R.H.(2001)C匿w61,237-24219.Mortier，E.，Bernard,J.，Plet,A.，andJacques,Y.(2004)//mm畫(huà)/173，1681-168820.Ruchatz，H.,Leung,B.P.，Wei,X.Q.,Mclnnes，I.B.，andLiew，F(xiàn).Y.(1998)//www"o/160，5654-566021.Smith,X.G.，Bolton,E.M.,Ruchatz，H.，Wei，X.,Liew,F.Y.，andBradley,J.A.(2000)J/mm畫(huà)/165，3444-345022.Farner，N.L，Gan，J.,deJong,J.L.,Leary，T.P.,Fenske,T.S.，Buckley,P.，Dunlap，S.，andSondel，P.M.(1997)C,to9，316-32723.Bernard,J.,Harb，C.，Mortier,E.,Quemener，A.,Meloen，R,H.,Vermot-Desroches,C.，Wijdeness，J.,vanDijken,P.,Grotzinger,J.,Slootstra,J.W.，Plet，A.，andJacques,Y.(2004)/5zo/CAe附279,24313-2432224.Matsumoto，M.,Misawa,S.,Tsumoto,K.,Kumagai，I.,Hayashi,H.，andKobayashi,Y.(2003)iVoto'w_Pwn/31,64-717325.Dubois,S.，Magrangeas,F.,Lehours,P.，Raher，S.，Bernard,J.,Boisteau,O.，Leroy,S.,Minvielle,S.,Godard,A.,andJacques,Y.(1999)/^o/C&m274，26978-2698426.Giron-Michel,J.,Giuliani,M.,Fogli，M,，Brouty-Boye,D.，F(xiàn)errini,S,，Baychelier，F(xiàn).，Ei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]3Ay結(jié)合體不與IL-2Rce結(jié)合。22.如權(quán)利要求1至21中任一權(quán)利要求所述的化合物，其特征在于所述至少一個(gè)含sushi多肽直接連接于所述至少一個(gè)IL-15R]8Ay結(jié)合體。23.如權(quán)利要求1至21中任一權(quán)利要求所述的化合物，其特征在于所述至少一個(gè)含sushi多肽間接連接于所述至少一個(gè)IL-15R/3Ay結(jié)合體。24.如權(quán)利要求23所述的化合物，其特征在于所述至少一個(gè)含sushi多肽通過(guò)含有至少一個(gè)氨基酸、但少于30個(gè)氨基酸的肽連接區(qū)與所述至少一個(gè)IL-15Rj3Ay結(jié)合體連接。25.如權(quán)利要求24所述的化合物，其特征在于所述肽連接區(qū)的氨基酸序列是序列SEQIDNO:50或NO:52。26.如權(quán)利要求1至25中任一權(quán)利要求所述的化合物，其特征在于，所述至少一個(gè)含sushi多肽位于相對(duì)于所述至少一個(gè)IL-15Ri8Ay結(jié)合體的N-末端位置。27.如權(quán)利要求1至25中任一權(quán)利要求所述的化合物，其特征在于所述至少一個(gè)含sushi多肽位于相對(duì)于所述至少一個(gè)IL-15R//7結(jié)合體的C-末端位置。28.如權(quán)利要求1至7、9至12、18至21、23至25、26中任一權(quán)利要求所述的化合物，其特征在于其氨基酸序列是序列SEQIDNO:60。29.如權(quán)利要求1至7、9至12、18至21、23至25、27中任一^L利要求所述的化合物，其特征在于其氨基酸序列是序列SEQIDNO:62。30.編碼用于刺激IL-15R]8Ay信號(hào)通路、從而誘導(dǎo)和/或刺激_渚如NK和/或T細(xì)胞的IL-15RjSAy-陽(yáng)性細(xì)胞的活化和/或增殖的化合物的核酸，其特征在于其依照通用遺傳密碼、適當(dāng)考慮其簡(jiǎn)并性而編碼;〖又利要求1至29中任一權(quán)利要求所述的化合物。31.載體，其特征在于其包含至少一個(gè)如權(quán)利要求30所述的核酸。32.宿主細(xì)胞，其由權(quán)利要求30的核酸和/或權(quán)利要求31的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。33.如權(quán)利要求32所述的宿主細(xì)胞，其特征在于其為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。34.用于免疫治療組合物的佐劑，其特征在于其包含下列要素中至少一個(gè)要素-權(quán)利要求1至29中任一權(quán)利要求所述的化合物，-權(quán)利要求30所述的核酸，-權(quán)利要求31所述的載體，-權(quán)利要求32或33所述的宿主細(xì)胞。35.如權(quán)利要求34所述的佐劑，其特征在于其改善CD8記憶響應(yīng)。36.藥物組合物，其特征在于其包含下列要素中至少一個(gè)要素-權(quán)利要求1至29中任一權(quán)利要求所述的化合物，-權(quán)利要求30所述的核酸，-權(quán)利要求31所述的載體，-權(quán)利要求32或33所述的宿主細(xì)胞。37.藥物，其特征在于其包含下列要素中至少一個(gè)要素-權(quán)利要求1至29中任一權(quán)利要求所述的化合物，-權(quán)利要求30所述的核酸，-權(quán)利要求31所述的載體，-權(quán)利要求32或33所述的宿主細(xì)胞。38.如權(quán)利要求37所述的藥物，其特征在于其為預(yù)防性和/或緩解性和/或治療性疫苗組合物。39.如權(quán)利要求37或38所述的藥物，其特征在于其用于預(yù)防和/或緩解和/或治療腫瘤發(fā)展或存在。40.如權(quán)利要求39所述的藥物，其特征在于其還包含至少一個(gè)腫瘤抗原。41.如權(quán)利要求37或38所述的藥物，其特征在于其用于預(yù)防和/或緩解和/或治療感染性疾病。42.如權(quán)利要求37或38所述的藥物，其特征在于其用于預(yù)防和/或緩解和/或治療免疫缺陷。43.如權(quán)利要求37或38所述的藥物，其特征在于其用于預(yù)防和/或緩解和/或治療SCID-X。44.用于誘導(dǎo)和/或刺激IL-15R/5/7-陽(yáng)性細(xì)胞的增殖和/或活化的體外方法，其特征在于其包含-提供包含IL-15R/3Ay-陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞樣品，-使所述樣品與至少一個(gè)下列要素在能夠?qū)崿F(xiàn)所述接觸的環(huán)境條件下接觸一段時(shí)間，以誘導(dǎo)和/或刺激所述IL-15Ri3-陽(yáng)性細(xì)胞的增殖和/或活化-權(quán)利要求1至29中任一權(quán)利要求所述的化合物，-權(quán)利要求30所述的核酸，-權(quán)利要求31所述的載體，-權(quán)利要求32或33所述的宿主細(xì)胞。45.產(chǎn)生活化NK細(xì)胞和/或T細(xì)胞的體外方法，其特征在于其包含'.-提供包含休眠NK細(xì)胞和/或T細(xì)胞的細(xì)胞樣品，-使所述樣品與至少一個(gè)下列要素在能夠?qū)崿F(xiàn)所述接觸的環(huán)境條件下接觸一段時(shí)間，以誘導(dǎo)包含在所述樣品中的所述休眠NK和/或T細(xì)胞的活化-權(quán)利要求1至29中任一權(quán)利要求所述的化合物，-權(quán)利要求30所述的核酸，-權(quán)利要求31所述的載體，-權(quán)利要求32或33所述的宿主細(xì)胞。46.組合物，其特征在于其包含隱至少一個(gè)IL-15R/5/7結(jié)合體，以及-至少一個(gè)包含IL-15Ra胞外區(qū)sushi結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述至少一個(gè)IL-15R|3Ay結(jié)合體不與所述至少一個(gè)包含IL-15Ra胞外區(qū)sushi結(jié)構(gòu)域的多肽共價(jià)連接，其中-.國(guó)所述至少一個(gè)IL-15R/3Ay結(jié)合體是IL-15,或者是IL-15片段、模擬物或激動(dòng)劑，其中所述IL-15片段、模擬物或激動(dòng)劑結(jié)合IL-15R/3/7的親合力不顯著低于天然IL-15結(jié)合IL-15R]3Ay的親合力，以及-所述至少一個(gè)含sushi多肽的氨基酸序列是IL-15Ra胞外區(qū)的氨基酸序列，或是IL-15Ra胞外區(qū)片段的氨基酸序列，其中所述片段保留了所述IL-15Ra胞外區(qū)的sushi結(jié)構(gòu)域，其中所述sushi結(jié)構(gòu)域定義為開(kāi)始于第一外顯子2編碼的半胱氨酸殘基(C1),并終止于第四外顯子2編碼的半胱氨酸殘基(C4),殘基Cl和C4均包括在所述sushi結(jié)構(gòu)域中，或是變體氨基酸序列，其在所述胞外區(qū)或胞外區(qū)片段的氨基酸序列的全長(zhǎng)上與這樣的IL-15Ra胞外區(qū)或這樣的IL-15Ra胞外區(qū)片段的氨基酸序列具有至少85%的同一性，前提是所述sushi結(jié)構(gòu)域的所述4個(gè)半胱氨酸殘基(C1、C2、C3和C4)的每一個(gè)均保留在所述變體序列中。47.至少一個(gè)含有IL-15Ro;胞外區(qū)的sushi結(jié)構(gòu)域的多肽在制備用于誘導(dǎo)和/或刺激NK和/或T免疫反應(yīng)的增殖和/或活化的藥物中的用途，其中所述至少一個(gè)含sushi多肽的氨基酸序列是IL-15Rce胞外區(qū)的氨基酸序列，或是IL-15Ra胞外區(qū)片段的氨基酸序列，其中所述片段保留了所述IL-15Ra胞外區(qū)的sushi結(jié)構(gòu)域，其中所述sushi結(jié)構(gòu)域定義為開(kāi)始于第一外顯子2編碼的半胱氨酸殘基(C1),并終止于第四外顯子2編碼的半胱氨酸殘基(C4),殘基Cl和C4均包括在所述sushi結(jié)構(gòu)域中，或是變體氨基酸序列，其在所述胞外區(qū)或胞外區(qū)片段的氨基酸序列的全長(zhǎng)上與這樣的IL-15Ra胞外區(qū)或這樣的IL-15Ra胞外區(qū)片段的氨基酸序列具有至少85%的同一性，前提是所述sushi結(jié)構(gòu)域的所述4個(gè)半胱氨酸殘基(C1、C2、C3和C4)的每一個(gè)均保留在所述變體序列中。全文摘要本發(fā)明涉及刺激IL-15Rβ/γ信號(hào)通路、從而誘導(dǎo)和/或刺激諸如NK細(xì)胞和/或T細(xì)胞的IL-15Rβ/γ陽(yáng)性細(xì)胞的活化和/或增殖。適當(dāng)?shù)幕衔锇ò辽僖粋€(gè)IL-15Rβ/γ結(jié)合體的化合物，所述結(jié)合體與至少一個(gè)含有IL-15Rα胞外區(qū)的sushi結(jié)構(gòu)域的多肽直接或間接共價(jià)連接。文檔編號(hào)C07K14/715GK101360827SQ200680048358公開(kāi)日2009年2月4日申請(qǐng)日期2006年10月6日優(yōu)先權(quán)日2005年10月20日發(fā)明者帕特里夏·武塞歐,揚(yáng)尼克·雅克,愛(ài)爾文·莫提爾,艾瑞恩·盧萊特,阿涅絲·凱梅內(nèi)申請(qǐng)人:國(guó)立醫(yī)學(xué)與健康研究所