專利名稱：鵝去氧膽酸的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種純化鶴去氧膽酸(3a，7a-二羥基-5p-膽酸)的方法。 尤其，本發(fā)明涉及一種以高產(chǎn)率和高純度、由豬膽汁固體中含有的低 等級鵝去氧膽酸混合物純化鵝去氧膽酸的方法。
背景技術(shù)：
鵝去氧膽酸通常含在牛、豬、熊或家禽，例如雞或鵝的膽汁中， 也含在人的膽汁中。鵝去氧膽酸是制備熊去氧膽酸的原料，熊去氧膽 酸能夠有效援解膽汁系統(tǒng)的疾病、高脂血癥、膽石病和慢性肝病，本 領(lǐng)域已知的制備熊去氧膽酸的常用方法如下所示。
制備鵝去氧膽酸的常用方法包括步驟用甲基酯化膽酸 (3a，7a，12a-三羥基膽酸)；用無水乙酸對3a和7a位上的羥基進行乙酰 化作用以對其進行保護；使用鉻酸將12a位上的羥基氧化為羰基，然 后通過Wolff-kichner還原反應(yīng)除去羰基；水解所得產(chǎn)物并脫保護以得 到鵝去氧膽酸。上述方法需要將反應(yīng)維持在高于200。C的溫度下，而 且原料的供應(yīng)可能由于牛海綿狀腦病等而被中斷。
家禽的膽汁中含有鵝去氧膽酸、石膽酸和少量的膽酸。因此，從 家禽制備鵝去氧膽酸的方法是本領(lǐng)域公知的，但是由于原料供應(yīng)減少 和產(chǎn)率低的原因這種方法在經(jīng)濟上并不可行[參見，Windhaus等人，I Physiol. Chem.， 140， 177 ~ 185(1924)。
美國專利No. 4，186，143公開了 一種從來自天然豬膽汁的鵝去氧膽 酸混合物完全分離和純化鵝去氧膽酸的方法。該方法包括以下主要步 驟通過膽汁的皂化作用而預(yù)處理除去3a-羥基-6-氧代-5p-膽酸；膽汁 酸的酯化；膽汁酸酯的乙?；皇褂梅菢O性有機溶劑除去中間產(chǎn)物； 對式I的乙?；孽ミM行結(jié)晶；脫保護；和利用在有機溶劑中的結(jié)晶 來制備式I化合物。但是，該專利沒有描述用于式I的乙?；サ腍PLC內(nèi)容物，而且由于特有的旋光性為aD25 +13.8°(c=l， CHC13), 熔點為U9 121。C [STD: [aD25 +15.2°(c=l， CHC13)，熔點127 ~ 129°C，因此終產(chǎn)物的純度非常低。而且，經(jīng)結(jié)晶純化終產(chǎn)物需要非 常長的時間(即，16-48小時)，并且整個過程有八個(8)步驟之復(fù)雜。因 此，當使用上述方法純化式I化合物時，終產(chǎn)物的產(chǎn)物變低，反應(yīng)時 間長達12天。因此，該方法經(jīng)濟上不可行。
尤其，當采用上述方法，由本發(fā)明中所用的含有5 35wt。/o鵝去 氧膽酸的豬膽汁固體純化式I的乙?；r，盡管在乙醇溶劑中進行 兩次結(jié)晶，但是終產(chǎn)物的含量仍低達80%。
為了克服上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種以高純度和高產(chǎn)率 純化式I化合物的方法，同時還縮短整個方法所需的時間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種純化式I化合物的方法，
式I
該方法包括下述步驟預(yù)處理豬膽汁；膽汁酸的酯化；膽汁酸酯 的乙?；?；使用非極性有機溶劑除去中間產(chǎn)物；乙?；懼狨サ慕Y(jié) 晶；和脫保護；其中該方法的特征在于
1) 作為預(yù)處理步驟，將含有5-35wt。/。鵝去氧膽酸的豬膽汁固體 溶解在含有鹽的有機溶劑中；
2) 作為結(jié)晶步驟，在0 15。C的溫度范圍內(nèi)，使從預(yù)處理步驟獲 得的產(chǎn)物在曱醇或異丙醇中結(jié)晶；和
3) 作為脫保護步驟，通過加入堿使從結(jié)晶步驟獲得的產(chǎn)物脫保 護，并通過加入酸使脫保護的產(chǎn)物在水存在下結(jié)晶。
發(fā)明詳述
在本說明書中，措詞"豬膽汁固體"代表來自豬膽汁的固體，其含
有式1~ IV的鵝去氧膽酸的混合物。
<formula>formula see original document page 6</formula>[式II
<formula>formula see original document page 6</formula>[式II
<formula>formula see original document page 6</formula>[式III
<formula>formula see original document page 6</formula>[式iv
其中，式I化合物代表鵝去氧膽酸(3a，7a-二羥基-5p-膽酸， CDCA);式II化合物代表豬去氧膽酸(3a，6a-二羥基-5卩-膽酸，HDCA); 式I化合物代表豬膽酸(3a，6a，7a-三羥基-5卩-膽酸，HCA);和式IV化 合物代表3a-羥基-6-氧代-5p-膽酸(keto)。
下文中將舉例詳細說明根據(jù)本發(fā)明的純化鵝去氧膽酸的每個步驟。
步驟l:豬膽汁固體的預(yù)處理
為了在純化步驟中使用含有5 ~ 35wt。/。鵝去氧膽酸的豬膽汁固 體，攪拌所有的豬膽汁固體并在回流下將其溶解在有機溶劑中。然后， 將混合物冷卻至室溫，再攪拌1~2小時。之后使用濾紙，優(yōu)選濾紙和 硅藻土從混合物中除去不溶的物質(zhì)。減壓除去有機溶劑得到剩余物 (CDCA、 HDCA、 HCA和keto)，將其用在下一步驟中。可以一f壬意選 擇該步驟中使用的鹽，只要其不影響反應(yīng)物中的化合物。優(yōu)選，該鹽 為選自氯化鈉、無水硫酸鎂(MgS04)和無水硫酸鈉中的至少一種，更 優(yōu)選氯化鈉?；谟袡C溶劑的量，該步驟中所用的鹽的量優(yōu)選為5~ 10wt%。如果鹽的量小于5wt%，則不能充分除去豬膽汁固體中的水 和不溶性物質(zhì)(例如脂肪酸等)，其使過濾發(fā)生困難并且降低產(chǎn)率和酯 化反應(yīng)的速度。如果鹽的量大于10wt%，則過量的鹽殘留成為雜質(zhì)， 使純化發(fā)生困難。優(yōu)選可以從能溶解豬膽汁固體中的鵝去氧膽酸并且 沒有不利影響的溶劑中任意選擇有機溶劑。更優(yōu)選，溶劑為乙酸乙酯 或丙酮。
步驟2:鵝去氧膽酸的酯化
向前面步驟所獲得的剩余物鵝去氧膽酸混合物中加入醇，之后回 流攪拌溶液直至剩余物完全溶解。然后將溶液冷卻至0~5°C。將酸催 化劑加入到溶液中，在室溫下攪拌溶液直至鵝去氧膽酸混合物的酯化 反應(yīng)進行完全。當反應(yīng)完全時，加入堿中和溶液，隨后進行過濾。用 醇洗滌濾出的物質(zhì)并減壓濃縮，得到剩余物鵝去氧膽酸酯混合物 (CDCA-Me、 HDCA-Me、 HCA-Me和keto-Me)。對于用在該步驟中 的醇沒有特別限制，但是為了容易進行酯化反應(yīng)優(yōu)選具有1 ~ 4個碳原
子的低級醇，更優(yōu)選曱醇。該步驟中使用的酸催化劑優(yōu)選為硫酸或者
對曱苯磺酸(PTSA),堿為碳酸氫鈉、碳酸鈉或碳酸鉀。 步驟3:鵝去氧膽酸酯的乙?；?br> 在回流下向前面步驟中獲得的剩余物中加入無水乙酸和弱堿，使 鵝去氧膽酸酯混合物中的所有羥基發(fā)生乙酰化作用。當反應(yīng)完全時， 在回流攪拌下向反應(yīng)溶液中加入甲苯。然后減壓濃縮反應(yīng)溶液以除去 無水乙酸、乙酸和反應(yīng)后剩余的堿，從而獲得剩余物乙?；Z去氧膽 酸酯混合物(CDCA-diAc-Me、 HDCA-diAc-Me 、 HCA-triAc-Me和 keto-Ac-Me)。該步驟中使用的弱堿優(yōu)選為無水乙酸鈉或吡咬，更優(yōu)選 無水乙酸鈉。
步驟4:式III和IV中間產(chǎn)物的除去
將非極性溶劑加入到剩余物中?；亓鲾嚢杌旌衔镏敝潦Ｓ辔锶芙?并冷卻至室溫。將溶劑的溫度保持在20~25°C,使式III和IV的中間 產(chǎn)物和一部分式II的中間產(chǎn)物(HCA-triAc-Me、 keto-Ac-Me和部分 HDCA-diAc-Me)結(jié)晶并將其過濾除去。用非極性溶劑額外洗滌濾過的 物質(zhì)，之后減壓濃縮過濾和洗滌的溶液并真空干燥。該步驟中^f吏用的 非極性溶劑優(yōu)選為己烷、庚烷、辛烷、異辛烷等，更優(yōu)選己烷或庚烷。
步驟5:鵝去氧膽酸-二乙酸酯-甲酯的制備
為了制備式V的鵝去氧膽酸-二乙酸酯-曱酯(CDCA-diAc-Me)，其 為制備式I化合物的中間產(chǎn)物，將醇溶劑加入到從前面步驟獲得的產(chǎn) 物中，之后將混合物在0°C ~ 15°C，優(yōu)選0。C 5。C下放置2~3小時以 使式V化合物結(jié)晶。
[式v<formula>formula see original document page 8</formula>
如果溫度低于o。c，則式v化合物的含量降低，而如果溫度高于
15°C，則結(jié)晶作用不充分。當式V化合物發(fā)生結(jié)晶時，使用過濾從溶 劑中除去式II的中間產(chǎn)物。用醇溶劑洗滌如此過濾的物質(zhì)，并真空干 燥以獲得粗產(chǎn)物式V的鵝去氧膽酸-二乙酸酯-甲酯。為了以高純度純 化式V化合物，在相同條件下進行重結(jié)晶直至式V化合物的含量達到 98.5%或更高，優(yōu)選99%或更高。為了獲得99%或更高的含量，優(yōu)選 進行三(3)次或更多次重結(jié)晶?？紤]到式V化合物的含量，結(jié)晶所用的 醇優(yōu)選為低級醇，更優(yōu)選甲醇或異丙醇，最優(yōu)選甲醇。結(jié)晶所用的醇 的量為剩余物量的0.5~3倍，優(yōu)選1.5~3倍。如果該量^f氐于0.5倍， 則由于晶體彼此凝結(jié)而難以過濾。如果該量高于3倍，則式V化合物 的含量不受該量的影響。
步驟6:鵝去氧膽酸的脫保護和結(jié)晶
在堿存在下對在前面步驟中獲得的式V化合物進行脫保護，并在 酸性條件下將反應(yīng)的pH調(diào)節(jié)至4或更低，優(yōu)選2~3，以形成式I的 鵝去氧膽酸。同時，在水存在下使反應(yīng)溶液保持在35 ~ 45°C,優(yōu)選35 ~ 40°C,以使式I化合物結(jié)晶。過濾反應(yīng)溶液、用水洗滌并真空干燥以 完全精制鵝去氧膽酸。對用于脫保護的堿沒有特別地限制，但是為了 后處理步驟而優(yōu)選氬氧化鈉或氫氧化鉀。如果pH大于4，則不形成 晶體，如果pH小于2，則由于過量的酸而使終產(chǎn)物的純度降低。如 果在水中的結(jié)晶溫度低于35°C，則式I化合物的純度降低，而如果溫 度高于45'C，則由于來自式I化合物的晶體彼此凝結(jié)而難以過濾。對 用于中和反應(yīng)溶液的酸沒有特別限制，但是為了后處理步驟而優(yōu)選鹽 酸或硫酸。由于來自前面步驟的剩余物含有98.5%或更多的式V化合 物，優(yōu)選99%或更多，由于雜質(zhì)含量低，因而無需使用有機溶劑進行 附加的結(jié)晶作用就可以完全精制式I化合物。含有根據(jù)本發(fā)明的、從 水中結(jié)晶的式I化合物的產(chǎn)物適合于工業(yè)制備方法，因為與在有機溶 劑中結(jié)晶的式I化合物相比，其熔點高出約2(TC,并且具有更小的體 積。
下列實施例將更詳細地闡釋本發(fā)明。但是，應(yīng)該理解下列實施例 的意圖是說明本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
分析方法
使用HPLC來確定每個步驟分離出來的中間產(chǎn)物，試驗條件如下
柱Capcell pak UG120 C18(4.6 X 250mm, Shiseido)
流動相乙腈/水(85:15)
檢測器紫外分光計(21011111)
流速l.Oml/min
注入20fil
實施例
步驟l:豬膽汁固體的預(yù)處理
將150g含有30 35wt。/o鵝去氧膽酸的豬膽汁固體和60g氯化鈉 在600ml乙酸乙酯中攪拌回流l小時，以溶解所有的豬膽汁固體。然 后，將混合物冷卻至20~25。C,攪拌l小時并用娃藻土過濾，用60 ml 乙酸乙酯洗滌如此過濾的物質(zhì)。減壓濃縮過濾出的物質(zhì)以除去有^L溶 劑，從而獲得剩余物鵝去氧膽酸混合物(CDCA、HDCA、HCA和keto)。
步驟2:鵠去氧膽酸的酯化
向得自前面步驟的剩余物中加入375ml曱醇，回流攪拌混合溶液 30分鐘直至剩余物完全溶解。將溶液冷卻至0~10°C,在攪拌下將 4.88ml硫酸加入到溶液中，之后通過在20 ~ 25°C下攪拌2小時而使鵝 去氧膽酸混合物的酯化反應(yīng)進行完全。當酯化反應(yīng)完成后，用53.9g 碳酸氫鈉中和溶液，之后過濾。用150ml曱醇洗滌如此過濾的物質(zhì)， 并減壓濃縮而獲得I34g剩余物鵝去氧膽酸酯混合物(CDCA-Me、 HDCA畫Me、 HCA-Me和keto-Me)。
步驟3:鵝去氧膽酸酯的乙酰化
向134g得自前面步驟的鵝去氧膽酸酯混合物中加入20g無水乙酸 鈉和200ml無水乙酸。在120-140""C下回流混合溶液5小時，之后立 即減壓濃縮。向反應(yīng)溶液中加入25ml曱苯，回流攪拌15分4中并減壓 濃縮以徹底除去無水乙酸和乙酸，從而獲得剩余物乙?；Z去氧膽酸 酯混合物(CDCA-diAc-Me 、 HDCA-diAc-Me 、 HCA-triAc-Me和 keto畫Ac畫Me)。剩余物的HPLC結(jié)果(RT): HCA-triAc-Me(8.76min)、 keto-Ac隱Me(9.05min)、 CDCA-diAc-Me(12.21min)和HDCA國diAc-Me (12.81min)。
步驟4:式III和IV中間產(chǎn)物的除去
向得自前面步驟的剩余物中加入非極性溶劑(400ml己烷)，之后將 混合溶液攪拌回流30分鐘。然后，將己烷溶劑冷卻至25~35°C，攪 拌3小時，隨后過濾。用65ml己烷額外洗滌如此過濾的物質(zhì) (HCA-triAc-Me、 keto畫Ac-Me和部分HDCA陽diAc-Me)，并減壓濃縮 經(jīng)過濾和洗滌的溶液，從而獲得剩余物式I和II的中間產(chǎn)物 (CDCA陽diAc-Me、 HDCA畫diAc-Me)。剩余物的HPLC結(jié)果(RT): CDCA-diAc-Me(12.21min)和HDCA-diAc-Me(12.81min)。
步驟5:鵝去氧膽酸-二乙酸酯-甲酯的制備
向得自前面步驟的剩余物中加入270ml甲醇，并將混合溶液攪拌 回流30分鐘，冷卻至0 10。C，再攪拌2小時，之后過濾。用70ml 甲醇洗滌過濾出的物質(zhì)(CDCA-diAc-Me)，在6(TC下真空干燥獲得 85%含量的粗產(chǎn)物。然后，向粗產(chǎn)物中加入72ml甲醇，并在0-5。C 下重結(jié)晶2小時。對混合物再進行一次重結(jié)晶以獲得99%含量的鵝去 氧膽酸-二乙酸酯-曱酯。產(chǎn)率為24.5g(19.5g+母液5g)。 m.p.: 128 ~ 129°C。剩余物的HPLC結(jié)果(RT): CDCA-diAc-Me(12.21 min)。
步驟6:鵝去氧膽酸的脫保護和結(jié)晶
向220ml水中加入24.5g鵝去氧膽酸-二乙酸酯-酯和29.5g氬氧化 鈉，之后將溶液攪拌回流4小時。向溶液中加入370ml水。4吏用59ml 鹽酸將溶液的pH調(diào)節(jié)至2.0 ~ 3.0。之后在35 45。C下攪拌溶液1小 時，然后過濾。用24.5ml水洗滌過濾出的物質(zhì)并在70'C下真空干燥 得到19.5g純鵝去氧膽酸。m.p.: 160 ~ 161。C， [aD25 +13.0°(c=l， CHC13)。
對比例
步驟l:膽汁的預(yù)處理
將150g濃縮的豬膽汁溶解在1000ml熱水中。然后加入100g氬 氧化鈉，攪拌回流溶液20小時。將該溶液冷卻至25。C。向溶液中加
入1500ml水，使溶液保持冷卻1天。將10g珪藻土加入到反應(yīng)溶液 中，然后攪拌并過濾以除去沉淀的、式IV的3a-羥基-6-氧代膽酸鈉。 使用濃硫酸將濾出液的pH調(diào)節(jié)至8,之后加入5g連二亞硫酸鈉，然 后攪拌15分鐘。隨后將400ml乙酸乙酯加入到溶液中，再使用稀釋 的硫酸將pH調(diào)節(jié)至5。將溶液攪拌30分鐘，通過層分離而從中除去 水層。向有機層中加入7g硅藻土和7g活性炭，然后攪拌30分4中并過 濾。用50ml乙酸乙酯洗滌如此過濾出的物質(zhì)，并減壓濃縮。 步驟2:膽汁酸的酯化
將得自前面步驟的剩余物溶解在300ml甲醇中。之后用碳酸氫鈉 (pH7)中和溶液、過濾，然后減壓濃縮。 步驟3:式II的甲酯的除去
將得自前面步驟的剩余物溶解在320ml熱苯中，將混合溶液濃縮 至225ml并保持低溫1天。然后過濾溶液；用苯洗滌如此過濾出的物 質(zhì)(式II的甲酯苯加合物)，減壓濃縮苯-過濾和洗滌的溶液。
步驟4:膽汁酸酯的乙酰化
向得自前面步驟的剩余物中加入75ml無水乙酸和7，5g無水乙酸 鈉，之后將混合溶液攪拌回流5小時。通過蒸餾無水乙酸、加入35ml 曱醇，之后攪拌回流15分鐘，隨后減壓蒸餾而除去剩余的無水乙酸。
步驟5:式III的乙?；サ某?br> 在200ml己烷溶劑中回流得自前面步驟的剩余物，在20。C下將溶 液貯存1天；并過濾。用己烷洗滌如此過濾出的物質(zhì)(HDCA-triAc-Me 的粗晶體)，并減壓蒸餾過濾并洗滌的溶液。
步驟6:式V化合物的分離
將得自前面步驟的剩余物溶解在46ml熱乙醇中，之后保持冷卻1 天。過濾該'溶液，用27ml冷乙醇洗滌如此過濾出的物質(zhì)，并在60°C 下真空干燥。使用乙醇對21.5g式V的化合物進行3次重結(jié)晶，以獲 得18.5g產(chǎn)物。m.p. 119~121°C;aD25 +10.4°(c=l， 二氧雜環(huán)己垸)； [alD2S+13.80(c=l，CHCl3)。
步驟7:皂化和中和
向185ml水中加入18.5g鵝去氧膽酸-二乙酸酯-曱酯和18.5g氫氧 化鈉，之后將混合溶液攪拌回流14小時，然后使用濃硫酸將溶液的 pH調(diào)節(jié)至4.5。
步驟8:式I化合物的制備
使用乙酸乙酯萃取反應(yīng)溶液，從中棄去水層。用6%的鹽水洗滌 溶液中的乙酸乙酯層，并將溶液蒸餾至約90ml。冷卻該溶液，加入 90ml己烷，之后保持冷卻1天并過濾。用20ml己烷洗滌如此過濾出 的物質(zhì)，并在60。C下真空干燥以制備12.7g鵝去氧膽酸。m.p. 142 ~ 145°C; [aD25 +13.0°(c=l， CHC13)。
工業(yè)實用性
本發(fā)明可以從豬膽汁固體中高產(chǎn)率和高純度地純化式I的鵝去氧 膽酸。而且，本發(fā)明由于縮短純化時間而適合用于工業(yè)純化。
權(quán)利要求
1.一種純化式I化合物的方法， id="icf0001" file="A2006800501550002C1.tif" wi="73" he="40" top= "46" left = "67" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>[式I]該方法包括以下步驟豬膽汁的預(yù)處理；膽汁酸的酯化；膽汁酸酯的乙?；皇褂梅菢O性有機溶劑除去中間產(chǎn)物；乙酰化膽汁酸酯的結(jié)晶；和脫保護；其中該方法的特征在于1)作為預(yù)處理步驟，將含有5～35wt％鵝去氧膽酸的豬膽汁固體溶解在含有鹽的有機溶劑中；2)作為結(jié)晶步驟，在0～15℃的溫度范圍內(nèi)，使從預(yù)處理步驟獲得的產(chǎn)物在甲醇或異丙醇中結(jié)晶；和3)作為脫保護步驟，通過加入堿使從結(jié)晶步驟獲得的產(chǎn)物脫保護，并通過加入酸使脫保護的產(chǎn)物在水存在下結(jié)晶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中用在預(yù)處理步驟中的鹽為選自下 列的至少一種鹽氯化鈉、無水硫酸鎂和無水疏酸鈉。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中基于有機溶劑的總重量計，鹽的 量為5~ 10wt%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中得自結(jié)晶步驟的產(chǎn)物含有98.5%或 更多的式V化合物1. 一種純化式I化合物的方法，<formula>formula see original document page 2</formula>
5. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中結(jié)晶步驟在0 5。C的溫度范圍內(nèi)進行。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中結(jié)晶步驟中所用的曱醇或異丙醇 的量為從中間產(chǎn)物除去步驟獲得的剩余物的量的0.5~3倍。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中脫保護步驟的pH為4或更小。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在水存在下的結(jié)晶于35 45'C的 溫度范圍內(nèi)進行。<formula>formula see original document page 3</formula>[式VI 。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種純化鵝去氧膽酸(3α，7α-二羥基-5β-膽酸)的方法。尤其，本發(fā)明涉及一種以高產(chǎn)率和高純度、由低等級的鵝去氧膽酸混合物純化鵝去氧膽酸的方法。
文檔編號C07J9/00GK101351470SQ200680050155
公開日2009年1月21日 申請日期2006年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月12日
發(fā)明者尹然貞, 崔秀珍, 李圣宰, 李炳具, 林永默, 秦庸碩, 金月永, 金泰利, 金英洙 申請人:株式會社大熊制藥;大熊化學株式會社