專利名稱：Activin-ActRIIa拮抗劑及其促進骨骼生長的應用的制作方法
Activin-ActRIIa拮抗劑及其促進骨骼生長的應用
相關(guān)申請
本申請要求2005年11月23號提交的臨時申請?zhí)枮?0/739,462、 2006年3月17日提交的臨時申請?zhí)枮?0/783,322、 2006年9月15號 提交的臨時申請?zhí)枮?0/844,855的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，上述申請通過參考整 體并入本申請。
背景技術(shù)：
骨骼疾病，包括從骨質(zhì)疏松到骨折，代表了一組病理狀態(tài)，極少 有可以有效針對這些病理狀態(tài)的藥物制劑。取而代之的是，治療的焦 點集中在包括固化、運動和飲食改變物理和行為干涉上。對于治療各 種骨骼疾病，有促進骨骼生長以及增加骨骼密度的治療藥劑將是有益 的。
骨骼生長和礦化依賴于成骨細胞和破骨細胞這兩種類型細胞的活 性，盡管軟骨細胞和血管細胞也參與了這些過程的關(guān)鍵方面。發(fā)展地， 骨骼形成通過兩種機制發(fā)生，軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨，前者負責縱行 骨形成，后者負責拓樸扁平骨如頭骨骨骼的形成。軟骨內(nèi)成骨要求順 序形成以及生長板內(nèi)的軟骨結(jié)構(gòu)的降解，所述的生長板作為成骨細胞、 破骨細胞、血管細胞的形成以及隨后的礦化的^t板。在膜內(nèi)成骨過程 中，骨骼在結(jié)締組織中直接形成。這兩種進程要求成骨細胞的浸潤和
后續(xù)的基質(zhì)沉積。
骨折以及其它的骨骼結(jié)構(gòu)性破裂通過一種至少表面上類似骨生成
的發(fā)育順序的過程來愈合，所述的骨生成的發(fā)育包括軟骨組織形成以 及隨后的礦化。骨折愈合的過程可以以兩種方式發(fā)生。直接或初始的 骨骼愈合的發(fā)生沒有骨痂形成。間接或二級的骨骼愈合的發(fā)生具有骨 痂前體階段。骨折的初期愈合涉及橫跨緊密排布破裂的機械連接的改 造。在合適的條件下，圍繞破裂的骨骼吸收細胞顯示了隧道吸收應答， 并構(gòu)建穿刺血管以及隨后的愈合的通路。骨骼的二級愈合以炎癥反應、 軟骨痂形成、骨痂礦化和骨痂重構(gòu)的順序進4于。在炎癥反應階l炎，血 胂和出血形成源于損傷位置的骨膜以及骨內(nèi)膜血管的破裂。炎性細胞
侵入該區(qū)域。在軟骨痂形成階段，細胞生成新的血管、成纖維母細胞、 胞內(nèi)物質(zhì)和支持細胞，在骨折破片間的間隙形成肉芽組織。橫跨破裂 的臨床愈合通過纖維狀的或軟骨組織(軟骨痂)建立。成骨細胞形成 并調(diào)節(jié)軟骨痂的礦化，然后所述的軟骨痂被板層骨所代替且受限于正 常的重構(gòu)過程。
除了骨折以及骨骼結(jié)構(gòu)的其他物理破裂外，骨骼礦物質(zhì)含量以及 骨密度的丟失可由多種不同的條件引起并且可能導致重要的醫(yī)學問 題。骨密度的改變以相對可預期的方式發(fā)生于個體整個壽命期間。大 約到30歲的時候，男性和女性的骨骼通過軟骨內(nèi)成骨生長盤的線性生
長和徑向生長生長至最大質(zhì)量。在大約30歲(對于松質(zhì)骨，例如，扁 平骨諸如推骨和骨盆)以及40歲(對于皮質(zhì)骨，例如，在肢體中的長 骨)，男性和女性均發(fā)生緩慢的骨丟失。在女性中，還存在最后階段的 實質(zhì)骨骼丟失，也許是由于絕經(jīng)后缺乏雌激素。在此期間，女性可能 在皮質(zhì)骨上額外丟失10 %的質(zhì)量，以及在松質(zhì)間隔上額外丟失失2 5 % 的質(zhì)量。進行性的骨骼質(zhì)量丟失是否導致病理狀況諸如骨質(zhì)疏松嚴重 依賴于個體的初始骨骼質(zhì)量以及是否存在加重的狀況。
骨丟失有時以正常骨骼重構(gòu)過程的不平衡為特征。健康的骨骼經(jīng) 常受限于重構(gòu)。重構(gòu)以骨骼被破骨細胞吸收開始。然后被吸收的骨骼 被新的骨骼組織所代替，其特征在于成骨細胞形成膠原并且隨后鈣化。 在健康的個體中，吸收和形成的速率是平衡的。骨質(zhì)疏松癥是一種慢 性的、進行性的狀況，以朝向吸收的轉(zhuǎn)移為標記，導致骨骼質(zhì)量的全 面減少以及骨骼礦化。人體的骨質(zhì)疏松癥先于臨床的骨質(zhì)減少(骨礦 物質(zhì)密度在年輕成年人的均值以下大于一個標準差但小于兩個標準 差)。世界范圍內(nèi)，大致7億5千萬人具有骨質(zhì)疏松的風險。
因此，控制破骨細胞和成骨細胞活性的方法對促進骨折和骨骼其 它損傷的愈合以及疾病(如骨質(zhì)疏松，與骨骼質(zhì)量的損失以及骨骼礦 化相關(guān))的治療是有效的。
關(guān)于骨質(zhì)疏松癥，雌激素、降鈣素、骨鈣素和維生素K，或大劑 量的膳食4丐均用作干預治療。其它的骨質(zhì)疏松的治療途徑包括雙磷酸 酯、甲狀旁腺激素、擬鈣劑(calcimimetic )、他汀類、鑭和鍶的鹽以及 氟化鈉。然而，這些治療方法通常與不良副作用相關(guān)聯(lián)。
因此，本發(fā)明的目的是提供促進骨骼生長和礦化的組合物及方法。
發(fā)明概述
部分地，本發(fā)明證明了具有激活素(activin)或激活素IIA型受體 (ActRIIa)拮抗劑活性("activin拮抗劑"和"ActRIIa拮抗劑")的分 子能夠用于增加骨骼密度，促進骨骼生長，并且/或增加骨骼強度。特 別地，本發(fā)明證明了 ActRIIa的可溶形式作為activin-ActRIIa信號的抑 制劑，并且在體內(nèi)促進增加的骨骼密度、骨骼生長和骨骼強度。然而， 絕大多數(shù)的促進骨骼生長或抑制骨骼損失的藥物制劑或者作為抗-分解 代謝制劑(通常也涉及如"分解代謝制劑")(如，雙磷酸酯)或者作 為合成代謝制劑(如，曱狀旁腺激素，PTH,當劑量適宜時)，可溶性 的ActRIIa蛋白顯示雙重活性，具有分解代謝和合成代謝的效果。因此， 本發(fā)明確立，activin-ActRIIa信號通路的拮抗劑可以用于增加骨骼密度 以及促進骨骼生長。然而可溶性的ActRIIa可能通過除了 activin拮抗 以外的機制影響骨骼，盡管如此，本發(fā)明證明了合意的治療劑可以根 據(jù)activin-ActRIIa拮抗劑活性來選擇。因此，在某些實施方式中，本發(fā) 明了提供了使用activin-ActRIIa拮抗劑的方法來治療與低骨骼密度或 低骨骼強度相關(guān)聯(lián)的疾病(如骨質(zhì)疏松癥)或促進有此需要的患者(如 在骨折的患者中)的骨骼生長，所述的activin-ActRIIa拮抗劑包括例如 激活素結(jié)合IIA型受體(activin-binding ActRIIa)多肽、抗activin抗體、 抗ActRIIa抗體、activin輩巴向或ActRIIa耙向的小分子和核酸適體，以 及降低activin和ActRIIa表達的核酸。此外，可溶性的ActRIIa多肽促 進骨骼生長而不造成肌肉質(zhì)量的持續(xù)可測量的增加。
在某些方面，本發(fā)明提供了包括可溶的、結(jié)合至activm的 activin-binding ActRIIa多肽的多肽。ActRIIa多肽可以被制成包含 activin-binding ActRIIa和藥學上可接受的載體的藥物制劑。優(yōu)選的， activin-binding ActRIIa多肽以小于1個微摩爾或小于100、 10或1個納 摩爾的Kd結(jié)合至激活素。牙見情況，相對于GDF11和/或GDF8, activin-binding ActRIIa選擇'l"生:l也結(jié)合activin, ^f尤選:l也，activin的Kd至 少比GDF11和/或GDF8的Kd要低IO倍、20倍或50倍。然而不希望 束縛于特定的作用機制，預期的是，activin抑制高于GDF11/GDF8的 選擇度說明了在骨骼上的選擇效果不會在肌肉上造成持續(xù)可測量的效 果。在一些實施方式中，選擇引起低于15%、低于10%或低于5%的
肌肉增長的ActRIIa在骨骼上獲得合意的效果的劑量。優(yōu)選地，組合物 的純度至少是95%,有關(guān)其它的多肽成分，通過尺排阻色譜確定，更 優(yōu)選地，組合物的純度至少是98 % 。這樣的制劑中使用的 activin-binding ActRIIa多肽可以是本發(fā)明所7>開的任意多肽，如具有選 自SEQIDNos: 2、 3、 7、 12或13的氨基酸序列的多肽，或與選自SEQ IDNos: 2、 3、 7或12的氨基酸序列具有至少80 % 、 85%、 90%、 95 %、 97%或99%同一性的多肽。Activin-binding ActRIIa多肽可以包括 天然的ActRIIa的功能性片段，如包含選自SEQIDNOs: 1-3的序列或 SEQ ID Nos: 2 (缺少C末端的10到15個氨基酸)的序列的至少10 個、20個或30個氨基酸("尾")。
相對于天然存在的ActRIIa多肽，可溶性的、activin-binding ActRIIa 多肽可以包括一個或多個氨基酸序列的改變(例如'在配體結(jié)合結(jié)構(gòu) 域)。改變了的ActRIIa多肽的例子提供在WO 2006/012627的第59-60 頁，在此以引用的方式并入本文。氨基酸序列的改變可以是，例如， 當在哺乳動物、昆蟲或其它真核細胞生產(chǎn)時改變多肽的糖基化，或者 相對于天然存在的ActRIIa多肽改變多肽的蛋白酶切。
Activin-binding ActRIIa多肽可以是融合蛋白，其具有ActRIIa多肽 的一個結(jié)構(gòu)域(例如ActRIIa多肽的配體結(jié)合部分)和一個或多個另外 的提供合意的特性(如改進的藥代動力學、更容易純化、靶向特定的 組織等)的結(jié)構(gòu)域。例如，融合蛋白的結(jié)構(gòu)域可以增強體內(nèi)穩(wěn)定性、 體內(nèi)半衰期、吸收/施用、組織定位或分配、蛋白質(zhì)復合物的形成、融 合蛋白的多聚化和/或純化中的 一種或多種。Activin-binding ActRIIa融 合蛋白可以包括免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域(野生型或突變體)或血清白蛋 白或其它提供合意特性(諸如改進的藥代動力學、改進的可溶性或改 進的穩(wěn)定性)的多肽部分。在一個優(yōu)選的實施方式中，ActRIIa-Fc融合 包括相對非結(jié)構(gòu)化連接子，其位于Fc結(jié)構(gòu)域和ActRIIa胞外結(jié)構(gòu)域之 間。這種非結(jié)構(gòu)化的列鍵字可以對應于ActRIIa胞外結(jié)構(gòu)域的C末端端 點("尾")的大致15個氨基酸非結(jié)構(gòu)化區(qū)域，或者其可以是l、 2、 3、 4或5個氨基酸的人工序列，或5個與15、 20、 30、 50個或更多個二 級結(jié)構(gòu)相對自由的氨基酸間的長度，或兩者的混合物。連接子可以是 富含甘氨酸和脯氨酸殘基的，并且可以，例如，含有蘇氨酸/絲氨酸和 甘氨酸的筒單序列或蘇氨酸/絲氨酸和甘氨酸的重復序列(例如，TG4
或SG4單態(tài)或重復序列)。融合蛋白可以包括純化的子序列，如表位標
簽、FLAG標簽、多聚組氨酸序列以及GST融合。視情況，可溶性的 激活素結(jié)合IIA型受體多肽包括一個或多個選自下組的修飾的氨基酸 殘基糖基化的氨基酸、聚乙二醇修飾的(PEGylated)氨基酸、法尼 基化(farnesylated)的氨基酸、乙酰化的氨基酸、生物素化的氨基酸、 耦聯(lián)脂質(zhì)體部分的氨基酸、耦聯(lián)有機衍生物制劑的氨基酸。藥物制劑 也可以包括一個或多個附加化合物諸如用于治療骨骼疾病的化合物。 優(yōu)選地，藥物制劑大體上是無致熱源的。 一般地，優(yōu)選的是ActRIIa蛋 白在哺乳動物細胞系中表達，所述的細胞系調(diào)節(jié)ActRIIa蛋白合適地天 然糖基化以消除患者的不良免疫反應的可能性。人細胞系以及CHO細 胞系已4皮成功地應用，并且預期其它普通的哺乳動物表達系統(tǒng)也是有 用的。
如本發(fā)明所描述的，ActRIIa蛋白指定的ActRIIa-Fc具有合意的特 性，包括相對于GDF8和/或GDF11選擇性地結(jié)合激活素，配體結(jié)合的 高親和性以及動物模型中大于兩周的血清半衰期。在某些實施方案中， 本發(fā)明提供了 ActRIIa-Fc多肽以及包含這樣的多肽和藥學上可接受的 賦形劑的藥物制劑。
在某些方面，本發(fā)明提供了編碼可溶性activin-binding ActRIIa多 肽的核酸。分離的多核苷酸可以包含諸如上面所描述的可溶性 activin-binding ActRIIa多肽的編碼序列。例如，分離的核酸可以包括 ActRIIa的胞外結(jié)構(gòu)域(例如，配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域)的編碼序列，以及編 碼部分或全部的跨膜結(jié)構(gòu)域和/或ActRIIa的胞漿結(jié)構(gòu)域的序列，但不 編碼位于跨膜結(jié)構(gòu)域中或胞漿結(jié)構(gòu)域中的或位于胞外結(jié)構(gòu)域與跨膜結(jié) 構(gòu)域或胞漿結(jié)構(gòu)域之間的終止密碼子。例如，分離的多核苷酸可以包 含全長ActRIIa多核苷酸序列諸如SEQ ID NO: 4或5,或部分截除的 序列，所述的多核苷酸進一步包含在3'末端之前至少600個核苷酸或 其它的使得多核苷酸的翻譯導致胞外結(jié)構(gòu)域隨機地融合到部分截短的 全長ActRIIa的位置的轉(zhuǎn)錄終止密碼子。優(yōu)選的核酸序列是SEQ ID NO: 14。本發(fā)明所公開的核酸可操作地連接到用于表達的啟動子，并 且本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)化了這樣的重組多核苷酸的細胞。優(yōu)選地，所述的 細胞是哺乳動物細胞，諸如CHO細胞。
在某些方面，本發(fā)明提供了制備可溶性activin-binding ActRIIa多
肽的方法。這樣的方法可包括在適宜的細胞(諸如中國倉鼠卵巢(CHO ) 細胞)中表達本發(fā)明所公開的任何核酸(例如，SEQ ID NO: 4、 5或 14)。這樣的方法可包括a)在適宜的條件下培養(yǎng)細胞以表達可溶性 的ActRIIa多肽，其中所述的細胞轉(zhuǎn)化有可溶性ActRIIa的表達構(gòu)建物； 以及b)復性所表達的可溶性ActRIIa多肽?？扇苄訟ctRIIa多肽可以 作為天然的、部分純化的或高度純化的片段復性。純化可以通過一系 列的純化步驟完成，包括例如，下面所述中的一個、兩個或三個或多 個，以任意的順序蛋白親和層4斤(protein A chromatography )、陰離 子交換層析(例如，Q瓊脂糖)、疏水層析(例如，苯基瓊脂糖)，尺 寸排阻層析和陽離子交換層析。
在某些方面，本發(fā)明所公開的activm-ActRIIa拮抗劑，諸如可溶性 的activin-binding ActRIIa多肽，可以用于一種以促進骨骼生長或增加 骨骼密度為目的的方法。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了治療低骨 骼密度相關(guān)疾病或在有此需求的患者中促進骨骼生長的方法。該方法 可以包含對有此需求的對象施用有效劑量的activin-ActRIIa拮抗劑。在 某些方面，本發(fā)明提供了使用activin-ActRIIa拮抗劑制備治療上面所述 的疾病或狀況的藥物。
在某些方面，本發(fā)明提供了鑒別刺激骨骼生長或增加骨骼礦化的 藥物的方法。所述的方法包括a)鑒別結(jié)合至activin或ActRIIa多肽 的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的待測藥物1; b)評估藥物在骨骼生長或礦化上的 效果。


圖1顯示了 CHO細胞中所表達的ActRIIa-hFc的純化。純化的蛋 白為 一個良好峰形的單峰。
圖2顯示了 ActRIIa-hFc結(jié)合至activin和GDF11,通過BiaCore
分析檢測。
圖3顯示了 A-204報告基因分析的示意圖。該圖顯示了報告載體 pGL3(CAGA)12(在EMBO 17:3091-3100中有描述，Dennler等，1998)。 CAGA12基序出現(xiàn)在TGF-Beta反應性基因(PAI-1基因)中，因此該 載體通常用于通過Smad2和3信號通路的因子。
圖4顯示了 A-204報告基因分析中ActRIIa-hFc (菱形)和
ActRIIa-mFc (方塊)在GDF-8信號上的效果。兩種蛋白都展示了其在 皮摩爾濃度幾乎完全抑制GDF-8調(diào)節(jié)的信號。
圖5顯示了 A-204報告基因分析中三種不同的ActRIIa-hFc制劑在 GDF-ll信號上的效果。
圖6顯示了對照組和ActRIIa-mFc處理的BALB/c小鼠在12周的 治療期前(上面)和后(下面)的DEXA (雙能X線吸收測定)圖像 的示例。淺色部分顯示了增加了的骨骼密度。
圖7顯示了 ActRIIa-mFc在BALB/c小鼠12周治療期間對骨礦密 度的效果的定量。治療分為對照(菱形)、2mg/kg劑量的ActRIIa-mFc (方塊)、6mg/kg劑量的ActRIIa-mFc (三角形)以及10mg/kg劑量的 ActRIIa-mFc (圓圈)。
圖8顯示了 ActRIIa-mFc在BALB/c小鼠12周治療期間對骨礦含 量的效果的定量。治療分為對照(菱形)、2mg/kg劑量的ActRIIa-mFc (方塊)、6mg/kg劑量的ActRIIa-mFc (三角形)以及10mg/kg劑量的 ActRIIa-mFc (圓圈)。
圖9顯示了 ActRIIa-mFc對摘除卵巢(OVX )或々殳手術(shù)6周以上 的C57BL6小鼠松質(zhì)骨骨礦密度的效果的定量。治療分為對照(PBS) 或10mg/kg劑量的ActRIIa-mFc ( ActRIIa )。
圖IO顯示了 ActRIIa-mFc在摘除卵巢的(OVX) C57BL6小鼠的 12周治療期間對松質(zhì)骨的效果的定量。治療分為對照(PBS,淺色條) 或10mg/kg劑量的ActRIIa-mFc (ActRIIa,深色條)。
圖11顯示了 ActRIIa-mFc在假手術(shù)的C57BL6小鼠6周或12周治 療期后對松質(zhì)骨的效果的定量。治療分為對照(PBS,淺色條)或 10mg/kg劑量的ActRIIa-mFc ( ActRIIa,深色條)。
圖12顯示了摘除卵巢的(OVX)小鼠的12周治療期間的骨骼密 度pQCT分析結(jié)果。治療分為對照(PBS,淺色條)或10mg/kg劑量的 ActRIIa-mFc (ActRIIa,深色條)。Y軸mg/ccm
圖13描述了假手術(shù)的小鼠12周治療期間的骨骼密度pQCT分析 結(jié)果。治療分為對照(PBS,淺色條)或10mg/kg劑量的ActRIIa-mFc (ActRIIa，；果色條)。Y軸mg/ccm
圖14A和圖14B顯示了 12周治療期后(A)的全身DEXA分析和 股骨間接體內(nèi)分析(B)。亮區(qū)描述了高骨骼密度的區(qū)域。
圖15顯示了 12周治療期后的股骨中段的間接體內(nèi)pQCT分析。 治療分為對照(PBS,深色條)和ActRIIa-mFc (淺色條)。左側(cè)的四個 條顯示總骨骼密度而右側(cè)的四個條顯示皮質(zhì)骨密度。每四個條的第一 對代表了源于摘除卵巢的小鼠的數(shù)據(jù)而第二對代表了源于假手術(shù)小鼠 的數(shù)據(jù)。
圖16顯示了 12周治療期后的股骨中段的間接體內(nèi)pQCT分析和 骨干含量。治療分為載體對照(PBS,深色條)或ActRIIa-mFc (淺色 條)。左側(cè)的四個條顯示總骨骼含量而右側(cè)四個條顯示皮質(zhì)骨含量。每 四個條的第 一對代表了源于摘除卵巢的小鼠的數(shù)據(jù)而第二對代表了源 于假手術(shù)小鼠的數(shù)據(jù)。
圖17顯示了股骨中段的間接體內(nèi)pQCT分析和股骨皮層厚度。治 療分為對照(PBS,深色條)或ActRIIa-mFc (淺色條)。左側(cè)的四個條 顯示骨內(nèi)膜周長而右側(cè)的四個條小時骨膜周長。每四個條的第一對代 表了源于摘除卵巢的小鼠的數(shù)據(jù)而第二對代表了源于假手術(shù)小鼠的數(shù) 據(jù)。
圖18描述了 12周治療期后的股骨力學檢測結(jié)果。治療分為對照 (PBS,深色條)或ActRIIa-mFc (淺色條)。左側(cè)的兩個條代表了源于 摘除卵巢的小鼠的數(shù)據(jù)而后面的兩個條代表了源于假手術(shù)小鼠的數(shù)據(jù)。
圖19顯示了 ActRIIa-mFc對松質(zhì)骨容積的影響。 圖20顯示了 ActRIIa-mFc對股骨遠端的松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)的影響。 圖21顯示了 ActRIIa-mFc對皮質(zhì)骨的影響。 圖22顯示了 ActRIIa-mFc對骨骼力學強度的影響。 圖23顯示了在三個不同劑量下，不同劑量的ActRIIa-mFc對骨骼 特性的影響。
圖24顯示了組織形態(tài)學測量(histomorphometry )表明ActRIIa-mFc
具有雙重的合成代謝和抗吸收活性。
發(fā)明詳述 1.綜述
轉(zhuǎn)化生長因子beta ( TGF-beta )超家族包含多種具有相同的共有序 列單元以及結(jié)構(gòu)基序的生長因子。已知這些蛋白對脊推動物和無脊推 動物的許多類型的細胞發(fā)揮生物學功能。超家族的成員在胚胎發(fā)育期 的模式形成以及組織分化中執(zhí)行重要功能，并且能影響多種分化進程， 包括脂肪生成、肌肉發(fā)生、軟骨形成、心臟發(fā)生、造血作用、神經(jīng)生
成以及上皮細胞分化。這個家族^皮分為兩個通用分支BMP/GDF和 TGF-beta/Activin/BMP10分支，其成員具有不同的、通常是互補的效果。 通過操縱TGF-beta家族成員的活性，通?？梢詫е律矬w內(nèi)重要的生 理學變化。例如，皮德蒙特(Piedmontese)和比利時藍(Belgian Blue) 牛品種帶有GDF8 (也叫做肌抑素(myostatin))基因內(nèi)的缺失功能的 突變，其導致月幾肉質(zhì)量的顯著增長。Grobet等，Nat Genet. 1997, 17(1): 71-4。此外，在人體，GDF8等位基因的失活與肌肉質(zhì)量的增加以及(據(jù) 稱)異常強度相關(guān)。Schuelke等，N Engl J Med 2004， 350: 2682-8.
激活素(activin)是屬于TGF-beta超家族的二聚體多肽生長因子。 有三種基本形式(A、 B和AB)的activin,其為兩個密切相關(guān)的P亞
單位(PaPa、 PB^B和PAeB)的同源/異源二聚體。人類基因組也 編碼activin C和activin E,其最初在肝臟中表達。在TGF-beta超家族 中，activms是可以刺激卵巢內(nèi)以及胎盤細胞中激素產(chǎn)生、支持神經(jīng)細 胞存活、依賴細胞類型正性或負性地影響細胞周期進程、以及至少在 兩棲動物胚胎中誘導中胚層分化的惟一的以及多功能的因子(DePaolo 等，1991, Proc Soc Ep Biol Med. 198: 500-512; Dyson等，1997, Curr Biol. 7: 81-84; Woodruff, 1998, Biochem Pharmacol. 55: 953-963 )。
被發(fā)現(xiàn)與activinA相同(Murata等，1988, PNAS, 85: 2434 )。已經(jīng) 表明activm A在骨髓腔中作為紅細胞生成的天然的正調(diào)節(jié)因子。在一 些組織中，activin信號被其相關(guān)的異二聚體、抑制素所拮抗。例如， 在垂體釋放卯泡刺激素(FSH)時，activin促進FSH分泌與合成，而 抑制素阻止FSH分泌與合成。其它的可調(diào)節(jié)activin生物活性和/或結(jié)合 至activin的蛋白包括卵泡抑制素(FS )、卵泡抑制素相關(guān)蛋白(FSRP )、 ot 2-巨J求蛋白、Cerberus和內(nèi)皮灃唐蛋白(endoglin )。
TGF- P信號通過I型和II型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體的異聚復合體 調(diào)節(jié)，其通過配體激活而磷酸化以及激活下游的Smad蛋白(Massague, 2000， Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1: 169-178)。這些I型和II型受體是跨膜 蛋白，由帶有富含半胱氨酸區(qū)域的配體結(jié)合胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域
和帶有預知的絲氨酸/蘇氨酸特異性的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成。I型是信號通
路所必須的；II型是結(jié)合配體以及表達I型受體所需的。I型和II型activin 受體在配體結(jié)合后形成穩(wěn)定的復合物，導致I型受體纟皮II型受體磷酸化。
兩種相關(guān)的II型受體，ActRIIa和ActRIIb,已被鑒定為activin的II 型受體(Mathews and Vale, 1991, Cell 65: 973 -982; Attisano等,1992, Cell 68: 97-108 )。除activin夕卜，ActRIIa和ActRIIb可以生化地與其它 幾種TGF- P家族蛋白相互作用，包括BMP7、 Nodal、 GDF8和GDFll (Yamashita等，1995， J. Cell Biol. 130: 217-226; Lee和McPherron, 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 98: 9306-9311; Yeo和Whitman, 2001, Mol. Cell 7: 949-957; Oh等，2002, Genes Dev. 16: 2749-54)。 ALK4 是主要的activin I型受體，特別是對activin A而言，并且ALK-7也可 以作為activins的受體，特別是對activin B 。
如本發(fā)明所證明的，可溶性的ActRIIa多肽(sActRIIa),其顯示了 相對于其它的TGF-beta家族成員諸如GDF8或GDFll基本上優(yōu)先選擇 結(jié)合至activin A，可在體內(nèi)有效地促進骨駱生長以及增加骨骼密度。 然而不希望受限于任何特定的機制，考慮到通過這些研究中所采用的 特定sActRIIa構(gòu)建物所展現(xiàn)的activin非常強的結(jié)合(皮摩爾解離常數(shù))， 期望sActRIIa的效果主要是由activin拮抗劑效果所引起的。不考慮機 制，這里的數(shù)據(jù)很明顯地表明，ActRIIa-activin拮抗劑確實在正常小鼠 以及骨質(zhì)疏松的小鼠模型中增加了骨骼密度。請注意骨骼是動態(tài)組織， 其生長或萎縮以及密度的增加或減少依賴于生產(chǎn)骨骼以及刺激礦化 (主要是成骨細胞)的因素與破壞以及去除骨骼礦物質(zhì)(主要是破骨 細胞)的因素之間的平衡。骨骼的生長和礦化可以通過增加生產(chǎn)性因 素或減少破壞性因素或兩者同時進行而增加。術(shù)語"促進骨骼生長" 和"增加骨骼礦化，，指的是骨骼的物理學可見的變化并且用來中性地 描述骨骼中變化發(fā)生的機制。
本發(fā)明所描述的研究中采用的骨質(zhì)疏松的小鼠模型以及骨骼生長/ 密度被認為在人體中是高度預測具有效果的，因而，本發(fā)明提供了采 用ActRIIa多肽以及其它的activin- ActRIIa拮抗劑來在人體中促進骨骼 生長和提高骨骼密度。Activin- ActRIIa拮抗劑包括，例如，activin結(jié) 合可溶性ActRIIa多肽、結(jié)合至activin (特別是activinA或B亞單位， 也指代P A或P B )并且中斷ActRIIa結(jié)合的抗體、結(jié)合至ActRIIa并
且中斷activin結(jié)合的抗體、選自activin或ActRIIa結(jié)合的非抗體蛋白 (參見例如，WO/2002/088171, WO/2006/055689, WO/2002/032925, WO/2005/037989, US 2003/0133939,以及US 2005/0238646中的這類 蛋白的例子以及設計和選擇相同蛋白的方法)、選自activin或ActRIIa 結(jié)合的通常綴合到Fc結(jié)構(gòu)域的隨機肽。兩種具有activin或ActRIIa結(jié) 合活性的不同的蛋白(或其它部分)，特別是分別地阻斷I型(例如，可 溶性I型activin受體)或II型(例如可溶性II型activin受體)結(jié)合位點 的activin結(jié)合子，可以連接起來以產(chǎn)生雙功能性結(jié)合的分子。核酸適 體、小分子和其它的抑制activin-ActRIIa信號軸的制劑。各種各樣的蛋 白具有activin-ActRIIa拮抗劑活性，包括抑制素(即抑制素a亞單元) (盡管抑制素并不在所有組織中均拮抗activin )、卵泡抑制素(如卵泡 抑制素288和卵泡抑制素315 )、Cerberus、卵泡抑制素相關(guān)蛋白(FSRP )、 內(nèi)皮糖蛋白(endoglin)、 activin C、 cx 2-巨球蛋白和M108A (在108位 由甲硫氨酸變?yōu)楸彼?突變activin A。通常地，activin的替代形式， 特別是那些在I型受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域有變化的，可以結(jié)合至n型受體并且 不能形成活性的三重復合物，因而作為拮抗劑作用。另外，核酸，諸 如反義分子，抑制activinA、 B、 C或E或(特別地)ActRIIa表達的 siRNA或核酶，可以用作activin-ActRIIa拮抗劑。優(yōu)選地，所采用的 activin-ActRIIa拮抗劑將顯示相對于TGF-beta家族的其它成員(相對 于GDF8和GDF11)的抑制activin所調(diào)節(jié)信號的選擇性?？扇苄缘?ActRIIb結(jié)合至activin,然而，野生型的蛋白并不顯示相對于GDF8/11 的結(jié)合至activin的顯著的選擇性，并且初步實驗顯示，這種不能提供 合意的對骨骼的效果，但仍能引起肌肉的顯著生長。然而，具有不同 的結(jié)合特性的ActRIIb的改變形式已被鑒定(參見例如，WO 2006/012627，第55-59頁，通過引用的方式并入本發(fā)明)，并且這些蛋 白可以骨骼上的合意的效果。天然的或改變的ActRIIb可以通過耦聯(lián)第 二 activin選擇性結(jié)合成分而提供對activin的附加的特異性。
語境中通常具有其在本領(lǐng)域的普通含義。某些術(shù)語在下文中或在說明 書的其它部分一皮討論，用以在描述本發(fā)明的組合物和方法以及怎樣應 用上提供給實踐者附加的指導。術(shù)語的任何應用的范圍或含義在其所 應用的特定語境中是清楚的。
"大約"和"接近"通常意味著考慮測量法的本性和精度時實物 量度的可接受的錯誤程度。典型地，示范性的錯誤程度在給定數(shù)值或
數(shù)值范圍的20 %以內(nèi)，優(yōu)選在10 %以內(nèi)，更優(yōu)選地在5 %以內(nèi)。
或者，特定地在生物學系統(tǒng)中，術(shù)語"大約，，以及"接近"可能
意味著一定數(shù)量級內(nèi)的值，優(yōu)選的是給定數(shù)值5倍以內(nèi)的，更優(yōu)選的 是2倍以內(nèi)的。除非另有說明，本發(fā)明給定的數(shù)值是接近的，意味著 當沒有明文規(guī)定時，術(shù)語"大約"或"接近，，可以推斷。
本發(fā)明的方法可以包括互相對比序列的步驟，包括野生型的序列 與一個或多個突變體(序列變體)比較。這樣的比較通常包括多聚物 序列的比對，例如，采用本領(lǐng)域公知的序列比對程序何/或運算法則(例 如，BLAST、 FASTA和MEGALIGN,可i兌出一些)。本領(lǐng)域才支術(shù)人員 容易意識到，在這樣的比對中，在一個包含插入或刪除殘基的突變中， 比對序列將在不包含插入的或刪除的殘基的多聚物序列中產(chǎn)生"間隙" (gap)(通常以破折號或"A"表示)。
"同源的"，其所有的語法形式和拼寫變體，指的是具有"共同進 化起源"的兩種蛋白之間的關(guān)系，包括來自同種生物體的超家族的蛋 白，以及來自不同種的生物體的同源蛋白。這樣的蛋白(及其編碼核 酸)具有同源的序列，如由它們的序列相似性反映的，無論從一致性 百分比方面或通過特定殘基或基序以及保守位點的存在。
術(shù)語"序列相似性"，其所有的語法形式，指的是一致性的程度或 可能或不可能具有共同進化起源的核酸或氨基酸序列間的對應。
然而，在常見用法和即時申請中，術(shù)語"同源"，當被諸如"高度" 這樣的副詞修飾時，可指代序列相似性，并且可能或不可能指代涉及 共同進化起源。
2. ActRIIa多肽
在某些方面，本發(fā)明涉及ActRIIa多肽。如本發(fā)明所應用的，術(shù)語 "ActRIIa"指的是來自任何種屬以及源于通過突變或其它修飾的 ActRIIa蛋白變體的激活素IIa型受體家族。本發(fā)明的ActRIIa可以理解 為任何現(xiàn)有的鑒別了的形式。ActRIIa家族的成員通常時跨膜蛋白，其 由具有富含半胱氨酸區(qū)域的配體結(jié)合胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和具有 預測的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
術(shù)語"ActRIIa多肽"包括包含有任何天然存在的ActRIIa家族成 員及其保留有有用活性的任何變體(包括突變體、片段、融合子和擬 肽形式)。例如，ActRIIa多肽包括來源于任何至少與ActRIIa多肽具有 大約80%—致性的已知ActRIIa的序列的多肽，優(yōu)選地至少85%、 90 %、 95%、 97%、 99%或更高一致性。例如，本發(fā)明的ActRIIa多肽可 以結(jié)合至ActRIIa蛋白和/或activin并抑制其功能。優(yōu)選地，ActRIIa多 肽促進骨骼生長和骨礦化。ActRIIa多肽的例子包括人ActRIIa前體多 肽(SEQ ID NO: 1 )以及可溶性的人ActRIIa多肽(例如，SEQ ID NOs: 2、 3、 7和12)。
人ActRIIa前體多肽序列如下
VTPKPPYYNILLYSLVPLMLIAGIVICAFWVYRHHKMAYPPVL
VDVDLWLITAFHEKGSLSDFLKANVVSWNELCHIAETMARGL A YLHEDIPGLKDGHKPAISHRDIKSKNVLLK麗LTACIADFGLA
(SEQ ID NO: 1) 信號肽是以單下劃線標示的；胞外結(jié)構(gòu)域以粗體標示，并且潛在 的N-連"t妾糖基化位點以雙下劃線標示。
人ActRIIa可溶性的(月包外)、加工的多肽序列如下
GNMCNEKFSYFPEMEVTOPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 2)
胞外結(jié)構(gòu)域的C-末端"尾"以下劃線標示。刪除了 "尾，，(A15 序列)的序列如下
GNMCNEKFSYFPEM (SEQ ID NO: 3)
編碼人ActRIIa前體多肽蛋白的核酸序列如下(Genebank登入號 001616的164-1705位核苷酸):
CCTGTTCTT
CTTTAATGC
CGTGTTATGGT
ATTTCTGGTT ACTGCTATGA TTTTTGTTGC AGATGGAAG ATTACAACAT TCATTTGT TACTTGTTC GGTTGAAACC TGTCTGGAAA TACAGGACA
GAATGAAGCA CAGTGTTGAT CTATCAGACT TGCAGAAAC CTAAAAGAT AATGTGCTGT CCTTAAAATT TACCCGGAGG GGGATGCAT ACTGGCTTC CCATTTGAG GTTGTTGTGC ATGCTGGAAT CGCAGAAGCC CAGAGACTAA GGTGACAAA
TGTTGACTTTCCTCCCAAAGAATCTAGTCTATGA (SEQ ID NO: 4)
編碼人ActRIIa可溶性(胞外)多肽的核酸序列如下:
GTCACACAG CCCACTTCAAATCCAGTTACACcTAAGCCACCC (SEQIDNO: 5)
在特定的實施方式中，本發(fā)明涉及可溶性的ActRIIa多肽。如本發(fā) 明所描述的，術(shù)語"可溶性ActRIIa多肽"通常指代包含ActRIIa蛋白 的胞外結(jié)構(gòu)域的多肽。這里所用的術(shù)語"可溶性ActRIIa多肽"包括任 何ActRIIa蛋白的天然存在的胞外結(jié)構(gòu)域及其任意變體(包括突變體、 片段和擬肽形式)。Activin-結(jié)合ActRIIa多肽是保留結(jié)合至activin、特 別是activinAA、 AB或BB的能力的多肽。優(yōu)選地，activin-結(jié)合ActRIIa 多肽以InM或更低的解離常數(shù)結(jié)合至activinAA。人ActRIIa前體蛋白 的氨基酸序列提供在下面。ActRIIa蛋白的結(jié)合至activm并且通常是可 溶的，并因而稱為可溶性的activin-結(jié)合ActRIIa多肽。可溶性的activin-結(jié)合ActRIIa多肽的例子包括如SEQ ID NOs: 2、 3、 7、 12和13所說 明的可溶性多肽。SEQ ID NO: 7指代ActRIIa-hFc,并在實施例中進 一步描述。其它的可溶性的activin-結(jié)合ActRIIa多肽包括除ActRIIa 蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域外加上一個信號序列，例如，蜜蜂蜂毒肽前導序列 (SEQ ID NO: 8),組織纖溶酶原激活劑(TPA )前導(SEQ ID NO:
9)或者天然的ActRIIa前導(SEQ ID NO: 10)。在SEQ ID NO: 13 中說明的ActRIIa-hFc多肽作為TPA前導應用。
ActRIIa多肽的功能活性片l殳可以通過篩選由編碼ActRIIa多肽的 相應核酸片段所產(chǎn)生的多肽而獲得。另外，片段可以通過使用公知的 在技術(shù)諸如傳統(tǒng)的Merrifield固相f-Moc或t-Boc化學來化學合成。片 段可以一皮生產(chǎn)(重組地或化學合成)并用于測試鑒別那些能朽"使ActRIIa 蛋白拮抗劑(抑制劑)功能的或被activin調(diào)節(jié)信號的肽酰片段。
ActRIIa多肽的功能活性的變體可以通過篩選編碼ActRIIa多肽的 相應的誘變處理核酸所產(chǎn)生的修飾的重組多肽的文庫而獲得。變體可 以被生產(chǎn)并用于測試筌別那些能行使ActRIIa蛋白拮抗劑功能的或被 activin調(diào)節(jié)信號的。在某些實施方式中，ActRIIa多肽的功能性變體包 括與選自SEQIDNOs: 2或3的氨基酸序列具有至少75 %同 一性的氨 基酸序列。在某些例子中，功能性變體具有與選自SEQIDNOs: 2或 3的氨基酸序列具有至少80%、 85%、 90%、 95%、 97%、 98%、 99 %或100 %同 一性的氨基酸序列。
功能性的變體可以通過為了諸如增強治療功效或穩(wěn)定性(例如， 間接體內(nèi)保質(zhì)期以及體內(nèi)的抗蛋白降解的能力)的目的修飾ActRIIa多 肽的結(jié)構(gòu)而生成，這樣的4務飾過的ActRIIa多肽當^皮選擇^f呆留activin 結(jié)合時，；波認為是天然存在的ActRIIa多肽的功能性等同物。修飾的 ActRIIa多肽也可以生產(chǎn)，例如，通過氨基酸替代、刪除或添加。例如， 可以合理地預期以異亮氨酸或纈氨酸單獨替代亮氨酸、以谷氨酸單獨 替代天冬氨酸、以絲氨酸單獨替代蘇氨酸、或者以結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸 替代另一個氨基酸(例如，保守突變)不會對所產(chǎn)生的分子的生物學 活性帶來大的影響。保守替換是那些在家族內(nèi)的側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸之 間發(fā)生的替換。ActRIIa多肽氨基酸序列的改變的結(jié)果是否為功能同源 容易通過評估ActRIIa多肽變體以類似于野生型的ActRIIa多肽的方式 在細胞內(nèi)產(chǎn)生應答的能力來確定。
在某些實施方式中，本發(fā)明涵蓋了 ActRIIa多肽的特定突變以便改 變多肽的糖基化。這樣的突變可以選擇以便引入或消除 一 個或多個糖 基化位點，O-連接或N-連接糖基化位點。天冬酰胺-連接的糖基化識別 位點通常包括三肽序列，天冬酰胺-X-蘇氨酸(或天冬酰胺-X-絲氨酸) (這里的X可以是任何氨基酸)，其被適當?shù)募毎腔柑禺惖刈R
別。改造也可以通過一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基添加或替代至野
生型的ActRIIa多肽(對于O-連接的糖基化位點)而進行。在糖基化 識別位點的第 一個或第三個氨基酸位點的之一或兩者同時的各種氨基 酸替換或刪除(和/或在第二個位點氨基酸刪除)導致在修飾的三肽序 列的非糖基化。另一在ActRIIa多肽上增加碳水化合物數(shù)目的方法可以 通過化學耦合或酶耦合糖苦至ActRIIa多肽。依賴于所采用的耦合才莫 式，糖可以;故附加至(a)精氨酸和組氨酸；(b)自由羧基；(c)自由 巰基諸如半胱氨酸的自由巰基；(d)自由羥基諸如絲氨酸、蘇氨酸或 羥脯氨酸的自由羥基；(e)芳香殘基諸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸 的芳香殘基；或(f)谷胺酰胺的酰胺基團。這些方法在WO 87/05330 (1987年9月11日公開)以及Aplin和Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., 259-306頁中有描述，并以引用的方式并入本發(fā)明。可以通 過化學和/或酶學的方法完成移除ActRIIa多肽上的一個或多個碳水化 合物?；瘜W去糖基化可涉及，例如，ActRIIa多肽暴露于化合物三氟曱 磺酸或等效化合物。這種處理導致除連接的糖(N-乙?；咸烟腔騈-乙?；肴樘前?之外的大部分或所有的糖的切除，而同時保持氨基 酸序列的完整?；瘜W去糖基化在Hakimuddin等.(1987) Arch. Biochem. Biophys. 259: 52以及Edge等.(1981) Anal. Biochem. 118: 131中有 進一步的描述。ActRIIa多肽上的碳水化合物的酶學切除可以通過l吏用 由Thotakura等.(1987) Meth. Enzymol. 138: 350所描述的各種內(nèi)糖苦 酶或外糖苷酶來實現(xiàn)。ActRIIa多肽的序列可以適當?shù)卣{(diào)節(jié)，其依賴于 所采用的表達體系的類型，如哺乳動物、酵母、昆蟲以及植物細胞均 可以引入不同的糖基化模式，其可以被肽的氨基酸序列所影響。通常 情況下，用于人類的ActRIIa多肽可以在能提供正確的糖基化的哺乳動 物細胞系中表達，如HEK293細胞或CHO細胞系，盡管可以預期其它 的哺乳動物表達細胞系、具有工程的糖基化酶的酵母細胞系以及昆蟲 細胞系也可以用于表達。
本發(fā)明進一步地涵蓋了生成突變子的方法，特別是ActRIIa多肽的 成套組合突變體以及截斷突變體的方法；組合突變體的庫對于鑒別功 能性的變體序列特別有用。篩選這樣的組合文庫的目的在于產(chǎn)生，例 如，或作為激動劑或作為拮抗劑作用的ActRIIa多肽的變體，或替代地， 具有所有新活性的突變體。各種篩選方法在下面提供，并且這樣的方
法可用于評估變體。例如，ActRIIa多肽的變體可以通過結(jié)合至ActRIIa 配體而防止ActRIIa配體結(jié)合至ActRIIa多肽或干擾通過ActRIIa配體 引起的信號的能力來篩選。
ActRIIa多肽或其變體的活性也可以在細胞基礎(chǔ)上或在體內(nèi)測試。 例如，可以評估ActRIIa多肽變體在表達涉及骨骼生產(chǎn)或骨骼破壞的基 因的效果。如果需要，這可以在一個或多個重組的ActRIIa配體蛋白(例 如，activin )的存在時完成，并且細刃包可以-陂轉(zhuǎn)染以生產(chǎn)ActRIIa多肽 和/或其變體以及(視情況)ActRIIa配體。同樣地，ActRIIa多肽可以 施用給小鼠或其它動物，并且評估一種或多種骨骼特性諸如密度或容 積。骨折的治愈率也可以被評估。雙能X射線吸收測定(DEXA)是 一種成熟的、非侵入的評估動物中的骨密度的定量技術(shù)。人的中樞 DEXA系統(tǒng)可以用于評估脊推和骨盆的骨密度。這些是總骨骼密度最 好的預測體。外周DEXA系統(tǒng)可以用于評估外周骨骼的密度，包括例 如，手、腕、腳踝以及足的骨骼。傳統(tǒng)的x射線圖象系統(tǒng)，包括CAT 掃描，可以用于評估骨骼生長以及骨折愈合。骨骼的機械強度也可以 被評估。
組合來源的變體可以生成，其相對于天然存在的ActRIIa多肽具有 選擇性的或通常的增長的潛能。同樣地，突變可以導致變體具有戲劇 性地不同于相應的野生型ActRIIa多肽的胞內(nèi)半衰期。例如，改變的蛋 白對于蛋白水解或其它的導致其^L破壞的細胞進程或相反地天然 ActRIIa多肽的失活或者更穩(wěn)定或者更不穩(wěn)定。這樣的變體以及編碼它 們的基因，可以利用來通過調(diào)節(jié)ActRIIa多肽的半衰期來改變ActRIIa 多肽的水平。例如，短半衰期可以導致更多的瞬時生物學效應以及可 允許更緊密地控制患者體內(nèi)的重組ActRIIa多肽的水平。在Fc融合蛋 白中，突變可以是在連接子中(如果有)和/或Fc部分以改變蛋白的半 衰期。
重組文庫可以通過編碼多肽文庫的筒并基因文庫的方式產(chǎn)生，所 述的每個多肽均包括至少一部分潛在的ActRIIa多肽序列。例如，合成 的寡核苷酸混合物可以酶學地連接入基因序列使得潛在的ActRIIa多 肽核普酸序列的筒并形式可作為單獨的多肽表達，或替代地，作為更 大的融合蛋白的形式(例如，噬菌體展示)表達。
有很多中潛在同源物的文庫從簡并寡核苷酸序列中產(chǎn)生的方法。
筒并基因序列的化學合成可以在DNA自動合成儀中進行，并且合成的 基因隨后被連接入合適的表達用的載體。筒并寡核苷酸的合成在本領(lǐng) 域是公知的(參見例如，Narang, SA (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura 等，(1981)重組DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, 編輯.AG Walton, Amsterdam: Elsevier 273-289頁;Itakura等，(1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura等，(1984) Science 198: 1056; Ike等，(1983)Nucleic AcidRes. 11: 477)。這些技術(shù)已被應用于其它 蛋白的定向進化(參見例如，Scott等，(1990) Science 249: 386-390; Roberts等，(1992) PNAS USA 89: 2429-2433; Devlin等，(1990) Science 249: 404-406; Cwirla等，(1990) PNAS USA 87: 6378-6382;以及美 國專利5,223,409、 5,198,346禾口 5,096,815 )
或者，其它形式的突變可用于產(chǎn)生組合文庫。例如，ActRIIa多肽 的變體可以產(chǎn)生并通過采用例如丙氨酸篩選突變以及類似的(Ruf等， (1994) Biochemistry 33: 1565-1572; Wang等，(1994) J. Biol. Chem. 269: 3095-3099; Balint等，(1993) Gene 137: 109-118; Grodberg等，(1993) Eur. J. Biochem. 218: 597-601; Nagashima等，(1993) J. Biol. Chem. 268: 2888-2892; Lowman等，(1991) Biochemistry 30: 10832-10838;和 Cunningham等，(1989) Science 244: 1081-1085 )、通過接頭分區(qū)突變 (Gustin等，(1993) Virology 193: 653-660; Brown等，(1992) Mol. Cell Biol. 12: 2644-2652; McKnight等，(1982) Science 232: 316)、通過飽 和突變(Meyers等，(1986) Science 232: 613)、通過PCR突變(Leung 等，(1989) Method Cell Mol Biol 1: 1 l-19)或通過隨機突變，包括化學 突變等(Miller et al., (1992) A Short Course m Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; and Greener等，(1994) Strategies in Mol Biol 7: 32-34)從文庫中篩選分離出來。接頭分區(qū)突變，特別地是在組 合設定中，是一種有吸引力的鑒別截短(生物活性)形式的ActRIIa多 月大的方法。
用于篩選通過點突變和截短得到的組合文庫中的基因產(chǎn)品的范圍 廣泛的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，并且，就此而言，對篩選具有某種特性 的基因產(chǎn)品的cDNA文庫。這樣的技術(shù)通常適應于快速篩選通過 ActRIIa多肽的組合突變生成的基因文庫。最廣泛地用于篩選大的基因 文庫的技術(shù)通常包括克隆基因文庫入可復制的表達載體、以獲得的載
體文庫轉(zhuǎn)化合適的細胞、并且在檢測合意的活性使得分離編碼所檢測 的產(chǎn)物的基因的載體相對容易的條件下表達組合基因。優(yōu)選的方法包
括activin結(jié)合分析以及activin調(diào)節(jié)的細胞信號分析。
在某些實施方式中，本發(fā)明的ActRIIa多肽可以進一步包括翻譯后 的修飾任何天然存在于ActRIIa多肽的。這樣的修飾包括但不限于，乙 ?；?、羧基化、糖基化、磷酸化、脂質(zhì)化以及酰基化。結(jié)果是，修飾 后的ActRIIa多肽可包含非氨基酸元件，諸如聚乙二醇、脂質(zhì)、多糖或 單糖以及磷酸鹽。這樣的非氨基酸元件在ActRIIa多肽的功能上的效果 可以如本發(fā)明所述的對于其它的ActRIIa多肽變體那樣測試。當ActRIIa 多肽通過剪切ActRIIa多肽的初生形式而在細胞內(nèi)生成時，翻譯后進程 對蛋白質(zhì)的正確折疊和/或功能也是重要的。不同的細胞系(諸如CHO、 Hela、 MDCK、 293、 WI38、 NIH-3T3或HEK293 )對于這樣的翻譯后 行為具有特異的細胞機器以及特有的機制，并且可4皮選用來確保正確 修飾和ActRIIa多肽的進程。
在某些方面，A ctRI I a多肽的功能性變體或修飾形式包括具有至少 一部分ActRIIa多肽和一個或多個融合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。公知的這樣 的融合結(jié)構(gòu)域的例子包括但不限于多聚組氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽轉(zhuǎn) 移酶(GST)、硫氧還蛋白、A蛋白、G蛋白、免疫球蛋白重鏈恒定區(qū) (Fc)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)或人血清白蛋白。可以選擇融合結(jié)構(gòu) 域以賦予合意的特性。例如， 一些融合結(jié)構(gòu)域特定地用于通過親和層 析分離融合蛋白。為達到親和純化的目的，采用親和層析相關(guān)的基質(zhì) 諸如谷胱甘肽、淀粉酶以及鎳綴合或鈷綴合的樹脂。許多這樣的基質(zhì) 可以以"試劑盒"的形式獲得，諸如Pharmacia GST純化體系以及 QIAexpress 體系(Qiagen)與有用的(HISg)融合伴侶。作為另外的例 子，可以選擇融合結(jié)構(gòu)域以有助于檢測ActRIIa多肽。這樣的檢測結(jié)構(gòu) 域的例子包括各種熒光蛋白(例如GFP)以及"表位標記"，其通常是 可獲得的特異抗體的短肽序列。公知的對于特異單克隆抗體的表位標 記容易獲得，包括FLAG、流感病毒血凝素(HA)以及c-myc標記。 在一些例子中，融合結(jié)構(gòu)域具有諸如對于Xa因子或凝血酶的蛋白酶切 位點，其允許相關(guān)的蛋白酶部分地消化融合蛋白并因而從中釋放重組 蛋白。釋放的蛋白然后通過隨后的層析分離而從融合結(jié)構(gòu)域中分離。 在某些優(yōu)選的實施方式中，ActRIIa多肽融合有在體內(nèi)穩(wěn)定ActRIIa多
肽的結(jié)構(gòu)域("穩(wěn)定器，，結(jié)構(gòu)域)。通過"穩(wěn)定，，意味著可以增加血清 半衰期的任何物質(zhì)，不考慮其是否是因為降低了破壞、腎臟清除的降 低或其它藥物動力學效應。已知與免疫球蛋白的Fc部分的融合可賦予 范圍廣泛的蛋白以合意的藥物動力學特性。此外，融合人血清白蛋白 可賦予合意的特性。可選擇的其它類型的融合結(jié)構(gòu)域包括多聚結(jié)構(gòu)域
(例如二聚、四聚)以及功能性結(jié)構(gòu)域(其賦予另外的生物學功能， 諸如進一步刺激骨骼生長或肌肉生長，如所希望的那樣)。
作為特定的例子，本發(fā)明提供了包括融合至Fc結(jié)構(gòu)域(例如SEQ ID NO: 6 )的ActRIIa的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。
ALHM(A)HYT QKSLSLSPGK*
可選擇地，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域在殘基(諸如天冬氨酸265、賴氨酸322以 及天冬酰胺434)中具有一個或多個突變。在某些例子中，具有一個或 多個這樣的突變(例如天冬氨酸265突變)的突變體Fc結(jié)構(gòu)域相對于 野生型的Fc結(jié)構(gòu)域具有削減的結(jié)合至Fc Y受體的能力。在其它的例子 中，具有一個或多個這樣的突變(例如冬酰胺434突變)的突變體Fc 結(jié)構(gòu)域相對于野生型的Fc結(jié)構(gòu)域具有增加的結(jié)合至MHC I類相關(guān)Fc 受體(FcRN)的能力。
當然，融合蛋白的不同元件可以以任何與想得到的功能相 一致的 方式安排。例如，ActRIIa多肽可以置于異源結(jié)構(gòu)域的C末端，或替代 地，異源結(jié)構(gòu)域可置于ActRIIa多肽的C末端。ActRIIa多肽結(jié)構(gòu)域和 異源結(jié)構(gòu)域不需要在融合蛋白中緊鄰，并且附加的結(jié)構(gòu)域或氨基酸序 列可以包括C末端或N末端至兩個結(jié)構(gòu)域之一或處于兩個結(jié)構(gòu)域之間。
在某些實施方式中，本發(fā)明的ActRIIa多肽含有一個或多個可以穩(wěn) 定ActRIIa多肽的修飾。例如，這樣的修飾增強ActRIIa多肽在體內(nèi)的
半衰期，增強ActRIIa多肽的循環(huán)半衰期或減少ActRIIa多肽的蛋白降 解。這樣的穩(wěn)定修飾包括但不限于融合蛋白(包括，例如，包含ActRIIa 多肽和穩(wěn)定器結(jié)構(gòu)域的融合蛋白)、糖基化位點的修飾(包括，例如， 附加糖基化位點至ActRIIa多肽)以及碳水化合物的修飾(包括，例如， 從ActRIIa多肽中移除碳水化合物)。就融合蛋白而言，ActRIIa多肽融 合至諸如IgG分子的穩(wěn)定器結(jié)構(gòu)域(例如Fc結(jié)構(gòu)域)。如同本發(fā)明所 應用的，術(shù)語"穩(wěn)定器結(jié)構(gòu)域"不僅指代融合蛋白中的融合結(jié)構(gòu)域(例 如Fc ),而且包括諸如碳水化合物的非蛋白質(zhì)修飾或諸如聚乙二醇的非 蛋白質(zhì)聚合體。
在某些實施方式中，本發(fā)明使得可獲得分離形式和/或純化形式的 ActRIIa多肽，其分離自或相反地基本上從其它蛋白游離。ActRIIa多 肽通常通過從重組核酸表達而產(chǎn)生。
3. 編碼ActRIIa多肽的核酸
在某些方面，本發(fā)明提供了分離的和/或重組的編碼任何ActRIIa 多肽(例如可溶性ActRIIa多肽)包括片段、功能性變體和本發(fā)明所公 開的融合蛋白的核酸。例如，SEQ ID NO: 4編碼天然存在的人ActRIIa 前體多肽，而SEQ ID NO: 5編碼ActRIIa的加工的胞外結(jié)構(gòu)域。目標 核酸可以是單鏈的或雙鏈的。這樣的核酸可以是DNA分子或RNA分 子。這些核酸可以用于，例如，制造ActRIIa多肽的方法或直接的治療 劑(例如，在基因治療方法中)。
在某些方面，應進一步了解編碼ActRIIa多肽的目標核酸包括SEQ ID NO: 4或5的變體的核酸。變體核苷酸序列包括一個或多個核苷酸 取代、添加或刪除的不同的序列，諸如等位基因變體。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供了與SEQ ID NO: 4或5具有至少 80%、 85%、 90%、 95%、 97%、 98%、 99 %或100 %同 一性的分離的 或重組的核酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應當了解與SEQ ID NO: 4 或5互補以及與SEQ ID NO: 4或5的變體互補的核酸序列都可以包括 在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在進一步的實施方式中，本發(fā)明的核酸序列可以 是分離的、重組的和/或與異源核苷酸序列融合的或在DNA文庫中。
在其它的實施方式中，本發(fā)明的核酸還可以包括在嚴謹條件下雜 交至SEQ ID NO: 4或5中指定核苦酸序列、SEQ ID NO: 4或5的互
補序列或其片段的核苷酸序列。如上面所討論的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人
員應當容易了解，促進DNA雜交的適宜的嚴謹條件可以變動。例如， 可以在6.0 x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)在約45。C進行雜交，隨后在50 。C以2.0xSSC洗滌。例如，洗滌步驟的鹽濃度可以選擇從2.0xSSC、 50。C的低嚴謹條件至0.2 x SSC、 50。C的高嚴謹條件。另外，洗滌步驟 的溫度可以從約22。C的室溫的低嚴謹條件至約65。C的高嚴謹條件。溫 度和鹽都可以變動，或者溫度或者鹽濃度可在另一個可變條件改變是 保持恒定。在某些實施方式匯總，本發(fā)明提供了在6xSSC、室溫的低 嚴謹條件下雜交、隨后在室溫下以2xSSC洗滌的核酸。
由于遺傳密碼子的簡并而與SEQ IDNO:4或5中的核酸不同的分 離的核酸分子也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，大量的氨基酸通過不 止一個的三聯(lián)密碼子指定。指向相同的氨基酸的密碼子或同義密碼子
(例如，CAU和CAC是組氨酸的同義密碼子)可以導致"沉默"突變， 其不會影響蛋白質(zhì)的氨基酸序列。然而，我們預期確實導致目標蛋白 的氨基酸序列的變化的DNA序列的多態(tài)性存在于哺乳動物細胞中。本 領(lǐng)域技術(shù)人員應當了解編碼特定蛋白的核酸的在一個或多個核苷酸
(至多3-5%的核苷酸)上的變異由于天然的等位變異可以存在于給定 種屬的個體黨中。任意或全部的這樣的核苷酸的變異以及導致的氨基
酸多態(tài)性都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在某些實施方式中，本發(fā)明的重組核酸可操作的連接到表達構(gòu)建 物的一個或多個調(diào)節(jié)核苷酸序列。調(diào)節(jié)何干算序列通常適宜于表達所 應用的訴諸細胞。本領(lǐng)域公知用于各種宿主細胞的^f艮多類型的適宜的 表達載體以及合適的調(diào)節(jié)序列。通常地，所述的一個或多個調(diào)節(jié)核苷 酸序列可以包括但不限于啟動子序列、前導或信號序列、核糖體結(jié)合 位點、轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列以及增強子或激活 子序列。本領(lǐng)域公知的構(gòu)建的或誘導的啟動子被本發(fā)明所涵蓋。啟動 子或者是天然存在的啟動子，或者是一個以上的啟動子組合元件的雜 合啟動子。表達構(gòu)建物可存在于細胞內(nèi)的游離體上，諸如質(zhì)粒，或表 達構(gòu)建物插入染色體內(nèi)。在一個優(yōu)選的實施方式中，表達載體包含可 選擇的標記基因以允許選擇轉(zhuǎn)化宿主。可選擇的標記基因是本領(lǐng)域公 知的并且隨采用的宿主細胞而變化。
在本發(fā)明的某些方面，目標核酸提供在一個包含編碼ActRIIa多肽 的核苷酸序列的表達載體內(nèi)，并可操作地連接至至少一個調(diào)節(jié)序列。
調(diào)節(jié)序列是本領(lǐng)域/>認的以及#皮選擇來引導ActRIIa多肽的表達。相應 地，術(shù)語調(diào)節(jié)序列包括啟動子、增強子和其它表達控制元件。示范性 的調(diào)節(jié)序列描述于Goeddel;基因表達技術(shù)酶學方法，Academic Press, San Diego, CA (1990)。例如，任意大范圍的控制DNA序列表達的表 達控制序列，當被可操作地連接時，可用于表達編碼ActRIIa多肽的 DNA序列的表達。這樣的有用的表達控制序列包括，例如，SV40的早 期或晚期啟動子、tet啟動子、腺病毒或巨細胞病毒立即早期啟動子、 RSV啟動子、乳糖操縱子系統(tǒng)、色氨酸系統(tǒng)、TAC或TRC系統(tǒng)、由 T7 RNA聚合酶引導表達的T7啟動子、入噬菌體的主要操作和啟動區(qū) 域、fd山羊蛋白的控制區(qū)域、3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟 動子、酸性磷酸酶的啟動子例如Pho5、酵母oc-雜交因子的啟動子、桿 狀病毒系統(tǒng)的多面體啟動子以及其它已知的控制原核細月包或真核細月包 或它們的病毒基因及其各種重組體表達的序列。應當了解，表達載體 的設計依賴于諸如待轉(zhuǎn)化的宿主細胞和/或想表達的蛋白類型的選擇的 因子。此外，還應當考慮載體拷貝的數(shù)量、控制拷貝數(shù)量以及載體所 編碼的任何其它蛋白諸如抗生素標記的表達的能力。
本發(fā)明的重組核酸可以通過連接克隆的基因或其片段入適合或在 原核細胞中或在真核細胞(酵母、鳥類、昆蟲或哺乳動物)中或在兩 者中表達的載體而生產(chǎn)。重組ActRIIa多肽的生產(chǎn)用表達載體包括質(zhì)粒 和其它載體。例如，合適的載體包括下列類型的質(zhì)粒用于諸如大腸
桿菌的原核細胞中表達的pBR322-來源的質(zhì)粒、pEMBL-來源的質(zhì)粒、 pEX-來源的質(zhì)粒、pBTac-來源的質(zhì)粒以及pUC-來源的質(zhì)粒。
一些哺乳動物表達載體同時包含有助于載體在細菌中繁殖的原核 序列以及一個或多個表達于真核細胞的真核轉(zhuǎn)錄單元。PcDNAI/amp、 pcDNAI/neo、 pRC/CMV、 pSV2gpt、 pSV2腳、pSV2-dhfr、 pTk2 、 pRSVneo、 pMSG、 pSVT7、 pko-neo以及pHyg來源的載體是適合真核 細胞轉(zhuǎn)染的哺乳動物表達載體的例子。這些載體中的一部分被細菌質(zhì) 粒來源的序列所修飾，諸如pBR322,以有助于在原核細胞和真核細胞 中的復制以及藥物抗性選擇。另一選擇為，病毒的衍生物諸如牛乳頭 瘤病毒(BPV-1 )或eb病毒(pHEBo、 pREP來源的以及p205 )可用 于在真核細胞中蛋白的瞬時表達。其它的病毒(包括逆轉(zhuǎn)錄病毒)表
達體系的例子可以在下面基因治療導入系統(tǒng)的描述中找到。制備質(zhì)粒 以及轉(zhuǎn)化宿主生物體的過程中所采用的各種方法是本領(lǐng)域公知的。其 它的同時適合原核以及真核細胞的表達系統(tǒng)以及通常的重組過程，參
見Molecular Cloning A Laboratory Manual,第三片反,由Sambrook, Fritsch 和Maniatis編輯(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)。在某些 例子中，采用牛乳頭瘤病毒表達系統(tǒng)來表達重組多肽是合適的。這樣 的牛乳頭瘤病毒表達系統(tǒng)的例子包括pVL-來源的載體(諸如pVL1392、 pVL1393和pVL941 )、 pAcUW-漣源的載體(諸如pAcUWl )以及 pBlueBac-來源的載體(諸如包含pBlueBacIII的P半乳糖苷酶)。
在優(yōu)選的實施方式中，載體被設計為在CHO細胞中生產(chǎn)目標 ActRIIa多肽,諸如Pcmv-Script載體(Stratagene, La Jolla, Calif )、 pcDNA4載體(Invitrogen, Carlsbad, Calif )禾口 pCI國neo載體(Promega, Madison, Wisc)。顯然地，目標基因構(gòu)建物可用于引起目標ActRIIa多 肽在培養(yǎng)基中繁殖的細胞中的表達，例如，以產(chǎn)生蛋白，包括融合蛋 白或突變體蛋白，用于純化。
本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)染了重組基因的宿主細胞，所述的宿主基因包括 編碼一個或多個目標ActRIIa多肽的編碼序列(例如，SEQ ID NO: 4 或5)。宿主細胞可以是任何的原核或真核細胞。例如，本發(fā)明的ActRIIa 多肽克表達在細菌中，諸如大腸桿菌、昆蟲細胞(例如采用牛乳頭瘤 病毒表達系統(tǒng))、酵母或哺乳動物細胞。其它合適的宿主細胞是本領(lǐng)域 技術(shù)人員所公知的。
相應地，本發(fā)明進一步地涉及生產(chǎn)目標ActRIIa多肽的方法。例如， 轉(zhuǎn)化了編碼ActRIIa多肽的表達載體可在適宜的條件下培養(yǎng)以允許 ActRIIa多肽表達。ActRIIa多肽可從細胞以及包含ActRIIa多肽的基質(zhì) 的混合物中分泌并分離出來。另外的選擇是，ActRIIa多肽可留在細胞 質(zhì)中或作為膜組分并收獲細胞、溶解并分離蛋白。細胞培養(yǎng)物包括宿 主細胞、基質(zhì)和其它副產(chǎn)品。合適的細胞培養(yǎng)基質(zhì)是本領(lǐng)域公知的。 目標ActRIIa多肽可從細胞培養(yǎng)基質(zhì)、宿主細胞或同時從兩者中分離， 采用本領(lǐng)域公知的技術(shù)純化蛋白，包括離子交換層析、凝膠過濾層析、 超濾、電泳、采用特異于ActRIIa多肽的特定表位的抗體的免疫親和純 化以及采用結(jié)合至融合到ActRIIa多肽的結(jié)構(gòu)域的制劑的親和純化(例 如，A蛋白柱可用于純化ActRIIa-Fc融合蛋白)。在一個優(yōu)選的實施方 式中，ActRIIa多肽是包含有助于純化的結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。在一個優(yōu)
選的實施方式中，純化通過一系列的柱層析步驟而達到，包括，例如，
以任何順序的三個或多個的以下步驟A蛋白層析、Q瓊脂糖層析、
苯基瓊脂糖層析、尺寸排阻層析以及陽離子交換層析。純化可以通過
病毒過濾和緩沖交換而完成。如本發(fā)明所證明的，ActRIIa-hFc蛋白純
化至以尺寸阻排層析確定大于98 %而以SDS PAGE確定大于95 %的純
度。這樣的純度對于在小鼠的骨骼上獲得想要的效果以及在小鼠、大 鼠和非人靈長類中的可接受的藥物安全性來說是足夠的。
在另一實施方式中，編碼純化前導序列的融合基因，諸如重組 ActRIIa多肽合意部分N末端位置的多聚-(組氨酸)/腸激酶切割位點 序列，可允許采用N產(chǎn)金屬樹脂通過親和層析純化所表達的融和蛋白。 純化前導序列隨后通過腸激酶處理而移除以提供純化的ActRIIa多肽 (例如,參見Hochuli等，(1987) J Chromatography 411: 177;以及 Janknecht等，PNASUSA88: 8972)。
制備融合蛋白的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。本質(zhì)上，編碼不同的多肽 序列的各種DNA片段的連接是通過相應的傳統(tǒng)技術(shù)完成的，采用 blunt-ended或stagger-ended末端來連接、限制性酶消化以提供合適的 末端、適當?shù)那闆r下填補粘性末端、堿性磷酸酶處理以避免不想要的 連接，以及酶連接。在另一實施方式中，融合基因可以通過傳統(tǒng)技術(shù) 包括自動DNA合成儀來合成。或者，基因片段的PCR擴增可采用接 頭引物來執(zhí)行，所述的接頭引物使兩個連續(xù)的可隨后退火以產(chǎn)生嵌合 基因序列的基因片段之間互補懸垂(參見例如，Current Protocols m Molecular Biology, Ausubel等編輯，John Wiley & Sons: 1992)。
4. 選4奪性的Activm和ActRIIa 4吉才元劑
本發(fā)明所提供的數(shù)據(jù)證明了 activin-ActRIIa信號的拮抗劑可用于 促進骨骼生長以及骨礦化。盡管可溶性的ActRIIa多肽，特別是 ActRIIa-Fc,是優(yōu)選的拮抗劑，并且盡管這樣的拮抗劑可通過不止 activin拮抗的機制來影響骨骼(例如，activin抑制可以具有抑制光譜 分子活性趨向的指示劑，包括，可能的，TGF-beta超家族的其它成員， 并且這樣的群體抑制可能導致所希望的骨骼上的效果)，可以預期其它 類型的activin-ActRIIa拮抗劑是有效的，包括抗-activin (例如A、 B、
C或E)抗體、抗ActRIIa抗體、反義物、抑制ActRIIa生產(chǎn)的RNAi 或核酶核酸以及其它的activin或ActRIIa的抑制劑，特別是那些破壞 activin-ActRIIa結(jié)合的抑制劑。
特異地與ActRIIa多肽(例如，可溶性的ActRIIa多肽)反應的抗 體、以及或者竟爭性結(jié)合而與ActRIIa多肽配合的或者相反地抑制 ActRIIa調(diào)節(jié)的信號的物質(zhì)可用作ActRIIa多肽活性的拮抗劑。此外，
作拮抗劑。
采用來自ActRIIa多肽或activin多肽的免疫原，可通過標準方法 (參見,例如，A Laboratory Manual由Harlow和Lane編輯(Cold Spring HarborPress: 1988))制備抗-蛋白/抗-多肽抗血清或單克隆抗體。哺乳 動物，諸如小鼠、倉鼠或家兔可用ActRIIa多肽的免疫原形式、能夠引 發(fā)抗體反應的抗原性片段或融合蛋白免疫。賦予蛋白或多肽免疫原性 的技術(shù)包括綴合載體或其它本領(lǐng)域公知的技術(shù)。ActRIIa或activin多肽 的免疫原性部分可在佐劑存在的情況下施用。免疫過程可通過檢測抗 體在血漿或血清中的滴度來纟企測。標準ELISA或其它的免疫方法可與 作為抗原的免疫原 一起使用以評估抗體水平。
在以ActRIIa多肽的抗原性制劑免疫動物之后，得到抗血清，如果 需要，可以從血清中分離多克隆抗體。為產(chǎn)生單克隆抗體，可從免疫 的動物收集抗體產(chǎn)生細胞(淋巴細胞)并通過標準的體細胞融合步驟 與諸如骨髓瘤細胞的永生化細胞融合以生產(chǎn)雜交瘤細胞。這樣的技術(shù) 是本領(lǐng)域公知的，包括，例如，雜交瘤技術(shù)(最開始由Kohler和Milstein 開發(fā)，(1975) Nature, 256: 495-497)、人類B細胞雜交瘤技術(shù)(Kozbar 等，(1983) Immunology Today, 4: 72)以及EBV-雜交瘤技術(shù)來生產(chǎn)人 單克隆抗體(Cole等，(1985)單克隆抗體和癌癥治療，AlanR. Liss， Inc. 77-96頁)。雜交瘤細i包可以通過免疫化學篩選以生產(chǎn)與ActRIIa多 肽特異性反應的抗體，并且單克隆抗體從包含這樣的雜交瘤細胞的培 養(yǎng)基中分離。
本發(fā)明所用的術(shù)語"抗體"旨在包括那些也能與目標多肽特異性 反應的片段?？贵w可采用傳統(tǒng)的技術(shù)片段化，并且用上面所描述的用 于全抗體的同樣的方法篩選片段。例如，F(xiàn)(ab)2片段可以通過以胃蛋白 酶處理生成。產(chǎn)生的F(ab)2片段可以處理以較少二硫橋鍵來生產(chǎn)Fab
片段。本發(fā)明的抗體進一步旨在包括雙特異的、單鏈的、嵌合的、人
源化以及由至少一個抗體CDR區(qū)域賦予的ActRIIa或activin多肽親和 性的全長人類分子。抗體可進一步包括另外附加并能夠被檢測的標簽 (例如，標簽可以是放射性同位素、熒光化合物、酶或輔酶因子)。 在某些實施方式中，抗體是重組抗體，其術(shù)語包括了任意的部分 地以分子生物學技術(shù)產(chǎn)生的抗體，包括CDR移植的抗體或嵌合抗體、 人的或組裝自文庫選擇的抗體結(jié)構(gòu)域的抗體、單鏈抗體以及單結(jié)構(gòu)域
抗體(例如，人Vh蛋白或camelidVHH蛋白)。在某些實施方式中，本 發(fā)明的抗體是單克隆抗體，并且在某些實施方式中，本發(fā)明使得生產(chǎn) 新抗體的方法成為可能。例如， 一種生產(chǎn)特異地結(jié)合至ActRIIa多肽或 activin多肽的單克隆抗體的方法，包括給小鼠施用一定劑量的包含有 效量的刺激可檢測的免疫反應的抗原多肽的免疫原組合物，從小鼠中 獲得抗體生產(chǎn)細胞(例如，脾臟中的細胞)并將抗體生產(chǎn)細胞與骨髓 瘤細胞融合以獲得抗體生產(chǎn)雜交瘤，檢測抗體生產(chǎn)雜交瘤以鑒別可以 生產(chǎn)特異性結(jié)合抗原的單克隆的雜交瘤。 一旦獲得，從細胞培養(yǎng)基中 繁殖雜交瘤，視情況在雜交瘤來源的生產(chǎn)特異性結(jié)合抗原的細胞的培 養(yǎng)條件下。單克隆抗體可從細胞培養(yǎng)基中純化。
形容詞"特異地與之反應"在此指代抗體，意思是，如本領(lǐng)域通 常理解的那樣，抗體在特定生物樣品中的感興趣的抗原(例如，ActRIIa 多肽)和其它的非感興趣的抗原之間具有充分的選擇性的。在某些采 用抗體的方法中，諸如治療應用中，結(jié)合的高度特異性是必要的。單 克隆抗體通常具有更大的趨向(與多克隆抗體相比)有效地在合意的 抗原以及交叉反應的多肽間區(qū)別。影響抗體抗體相互作用特異性的 特征是抗體對抗原的親和力。盡管所希望的特異性可達到不同親和力 的范圍，通常優(yōu)選的抗體具有約l(T6、 1CT7、 10-8、 10力或更少的親和力 (解離常數(shù))。給定activin和ActRIIa之間的格外緊密的結(jié)合，我們預 期中和性的抗activin抗體或抗ActRIIa抗體通常具有1(T"或更少的解 離常數(shù)。
另外，用于篩選抗體以鑒定合意的抗體的技術(shù)可影響獲得的抗體 的特性。例如，如果抗體用于在溶液中結(jié)合抗原，測試溶液結(jié)合可能 是合適的。各種不同的技術(shù)可用于測試抗體與抗原之間的相互作用以 鑒別特定期望的抗體。這樣的技術(shù)包括ELISAs、表面等離子體共振結(jié)
合分析(例如,the Biacore binding assay, Biacore AB, Uppsala， Sweden )、 夾心法(例如，the paramagnetic bead system of IGEN International, Inc., Gaithersburg, Maryland )、 western免疫印跡、免疫 沉淀反應以及免疫組4匕。
Activin或ActRIIa拮抗劑的核酸化合物種類的例子包括反義核酸、 RNAi構(gòu)建物以及催化核酸構(gòu)建物。核酸化合物可以是單鏈的或雙鏈 的。雙鏈核酸化合物還可以包括懸臂或非互補的區(qū)域，其中一個或另 外一個片段是單鏈。單鏈化合物可包括自身互補的區(qū)域，意味著化合 物形成稱為"發(fā)夾"或"莖環(huán)"結(jié)構(gòu)，具有一個雙鏈螺旋結(jié)構(gòu)的區(qū)域。 核酸化合物可包括互補于包含全長ActRIIa核酸序列或activin PA或 activin PB核酸序列的不超過1000、不超過500、不超過250、不超過 100或不超過50、 35、 30、 25、 22、 20或18個核苷酸的區(qū)域的核苷酸 序列。優(yōu)選的互補區(qū)域至少是8個核苷酸， 一見情況地至少10個或至少 15個核普酸，并且視情況地在15到25個核苷酸之間?；パa區(qū)域可屬 于內(nèi)含子、耙轉(zhuǎn)錄子的編碼序列或非編碼序列諸如編碼序列部分。通 常地，核酸化合物具有8到約500個核苷酸或堿基對的長度，視情況 長度可以是約14到約50個核苷酸。核酸可以是DNA (特定地作為反 義核酸使用)、RNA或RNA: DNA雜合物。任何一條鏈可包括DNA 和RNA的混合物，以及不容易一皮區(qū)分為DNA或RNA的^f奮飾的形式。 此外，雙鏈化合物可以是DNA: DNA、 DNA: RNA或RNA: RNA， 并且任何一條鏈可以包括DNA和RNA的混合物，以及不容易^皮區(qū)分 為DNA或RNA的修飾的形式。核酸化合物可以包括任意的各種修飾， 包括骨架(天然核酸的糖-磷酸部分，包括核苷間鍵合)或堿基部分(天 然核酸的噪呤或嘧啶部分)的一個或多個〗奮飾。反義核酸化合物優(yōu)選 具有約15到約30核苷酸長，并通常包含一個或多個修飾以改善諸如 血清中的穩(wěn)定性、在細胞中或在化合物可能的給藥位置的特性，所述 的給藥位置為諸如胃部(在口服給藥的情況下)以及肺臟(對于吸入 化合物)。在RNAi構(gòu)建物的情況下，互補至靶轉(zhuǎn)錄子的鏈通常是RNA 或其修飾。其它鏈可以是RNA、 DNA或任何其它的變體。雙鏈或單鏈 "發(fā)夾"RNAi構(gòu)建物的雙相部分優(yōu)選地為18到40個核苷酸長度，牙見 情況為約21到23個核苷酸長度，只要其可作為Dicer底物起作用。催 化的或酶促核酸可以是核酶或DNA酶，并還可包含〗奮飾的形式。核酸
化合物在生理條件下，以無義或有義控制基本不產(chǎn)生或不產(chǎn)生效果的
濃度，與細胞相接觸，可抑制約50%、 75%、卯％或更多的靶的表達。 優(yōu)選的檢測核酸化合物的效果的濃度是1、 5以及10個微摩爾。核酸 化合物可用于測試例如在骨骼生長以及骨礦化上的效果。
5. 篩選方法
在某些方面，本發(fā)明涉及采用ActRIIa多肽(例如，可溶性ActRIIa 多肽)以及activin多肽來鑒定能夠激動或拮抗activin-ActRIIa信號通 路的化合物(藥物)。通過這種篩選鑒定藥劑可測試以評估它們在體內(nèi) 調(diào)節(jié)骨骼生長和骨礦化的能力，視情況，這些化合物可以進一步地在 動物中測試以評估它們在體內(nèi)調(diào)節(jié)組織生長的能力。
有非常多的用于篩選通過靶定activin和ActRIIa多肽以調(diào)節(jié)組織 生長的治療劑的途徑。在某些實施方式中，化合物的高通量篩選可用 于鑒別干擾activin或ActRIIa在骨骼上的調(diào)節(jié)效果的藥劑。在某些實 施方式中，該方法用于篩選和鑒定特異性抑制或減少ActRIIa多肽結(jié)合 至activin的化合物?；蛘?，該方法用于鑒定增強ActRIIa多肽結(jié)合至 activin的化合物。在另一個實施方式中，4匕合物可通過其與activin或 ActRIIa多肽相互作用的能力來鑒定。
各種方法的版本是足夠的并在本發(fā)明公開的范圍內(nèi)，然而那些本 發(fā)明沒有清楚地描述的可被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員領(lǐng)會。如同本發(fā)明所 描述的，本發(fā)明的檢測化合物(藥劑)可通過任何的組合化學方法制 造?；蛘撸繕嘶衔锟梢允翘烊淮嬖诘脑隗w內(nèi)或體外合成的生物分 子。待測其作為組織生長調(diào)節(jié)劑能力的化合物(藥劑)可通過例如細 菌、酵母、植物或其它生物體(例如，天然產(chǎn)品)生產(chǎn)，或化學生產(chǎn) (例如，小分子，包括擬肽)，或重組地生產(chǎn)。本發(fā)明所涵蓋的檢測化 合物包括非肽有機分子、肽、多肽、擬肽、糖、激素和核酸分子。在 特定的實施方式中，檢測藥劑是分子量小于約2000道爾頓的小有機分 子。
本發(fā)明的檢測化合物可以是單個的、離散的實體，或是具有更大 復雜度的文庫，諸如以組合化學制備的庫。這些庫可包括，例如，乙 醇、烷基面化物、胺、酰胺、酯、醛、醚以及其它類別的有機化合物。 檢測化合物在檢測系統(tǒng)中的存在可以是單獨形式的或以化合物的混合
物的形式，特別是在起始篩選步驟中。視情況，化合物可視情況與其 它化合物衍生以及衍生群體有助于化合物分離。非限制性的衍生物群 體的例子包括生物素、焚光素、地高辛、綠色熒光蛋白、同位素、多 聚組氨酸、磁珠、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)、光學激活交聯(lián)劑
(photoactivatible crosslinkers )或其任意的組合。
在許多檢測化合物庫以及天然提取物的藥物篩選程序中，高通量 的方法是為了在給定時間內(nèi)最大化檢測化合物數(shù)量所需要的。這種在 無細胞環(huán)境下的方法，諸如可到處純化或半純化蛋白的，通常優(yōu)選作 為"主要的，，篩選方法，其允許快速發(fā)展以及相對容易地檢測,皮檢測 化合物調(diào)節(jié)的粑分子的改變。此外，檢測化合物的細胞毒性或生物利 用度在體外系統(tǒng)中可以忽視，該方法轉(zhuǎn)而主要集中在藥物在靶分子上 的效果，其可表現(xiàn)在ActRIIa多肽和activin的結(jié)合親和力的改變上。
僅僅是舉例說明，在本發(fā)明的示例性篩選方法中，感興趣的化合 物與分離并純化的通?？山Y(jié)合至activin的ActRIIa多肽相接觸?；?物與ActRIIa多肽的混合物中隨后加入包含ActRIIa配體的組合物。 ActRIIa/activin復合物的檢測和定量提供了 一種確定化合物抑制(或加 強)ActRIIa多肽與activin之間的復合物形成效力的方法?；衔锏男?力可通過采用測試化合物的各種濃度獲得的數(shù)據(jù)而生成的劑量反應曲 線而評估。此外，對照分析可用于提供比較的基準。例如，在對照分 析中，分離并純化的activin加入至包含ActRIIa多肽的組合物中，在 沒有測試化合物的情況下定量ActRIIa/activin復合物。應當了解，通常 的，反應物混合的順序可以變化，并且可以同時混合。此外，代替純 化蛋白的細胞提取物和溶解物可用于提供合適的無細胞分析系統(tǒng)。
ActRIIa多肽與activin的復合物的形成可以由各種技術(shù)檢測。例如， 復合物形成的調(diào)節(jié)可采用例如可檢測標記的蛋白諸如放射性標記的
(例如，32P、 35S、 "C或3H)、焚光素標記(例如FITC)的或酶標記 的ActRIIa多肽或activin,通過免疫測定或?qū)游鰴z測來定量。
在某些實施方式中，本發(fā)明涵蓋了熒光偏振法以及熒光共振能量 轉(zhuǎn)移(FRET)在直接或間接測量ActRIIa多肽與其結(jié)合蛋白的相互作 用上的應用。進一步的，其它的檢測模式，諸如基于光波導的(PCT Publication WO 96/26432以及美國專利5,677,196 )、表面等離子體共振
(SPR)、表面電荷傳感以及表面受力傳感，都與本發(fā)明的許多實施方
式相一致。
此外，本發(fā)明涵蓋了相互作用陷阱方法(也被叫做"雙雜交方法")
的應用，以鑒定破壞或加強ActRIIa多肽與其結(jié)合蛋白的相互作用的藥 劑。參見例如，美國專利5,283，317; Zervos等(1993) Cell 72: 223-232; Madura等(1993) J Biol Chem 268: 12046-12054; Bartel等(1993) Biotechniques 14: 920-924;以及Iwabuchi等(1993) Oncogene 8: 1693-1696。在特定的實施方式中，本發(fā)明涵蓋了應用反向雙雜交系統(tǒng) 以鑒定分離ActRIIa多肽與其結(jié)合蛋白的相互作用的化合物(例如，小 分子或肽)。參見例如，Vidal and Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27: 919-29; Vidal和Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17: 374-81;以及 美國專利5,525,490; 5,955,280;和5,965,368。
在某些實施方式中，目標化合物通過其與本發(fā)明的ActRIIa或 activin多肽相互作用的能力來鑒定?；衔锱cActRIIa或activin多肽 之間的相互作用是共價的或非共價的。例如，這種相互作用可以采用 體內(nèi)生物化學方法在蛋白水平上鑒定，
所述的生物化學方法包括光交聯(lián)、同位素標記的配體結(jié)合以及親 和層析(Jakoby WB et al., 1974, Methods in Enzymology 46: 1 )。在 某些例子中，化合物可通過某些機制為基礎(chǔ)的諸如檢測結(jié)合到activin 或ActRIIa多肽的化合物的方法來篩選。這可包括固相或液相結(jié)合?；?者，編碼activin或ActRIIa多肽的基因可與報告系統(tǒng)(例如，P半乳 糖苷酶、熒光素酶或綠色熒光蛋白)一同轉(zhuǎn)染入細胞中并優(yōu)選地以高 通量篩選來篩選文庫，或與文庫中的個體一同轉(zhuǎn)染。其它基于結(jié)合方 法的機制可用于，例如，檢測自由能變化的結(jié)合分析。結(jié)合分析可與 固定至孔、珠子或芯片或被固定化的抗體俘獲或被毛細管電泳所分解 的耙一同進行。被限制住的化合物通常可采用比色法或熒光或表面等 離子體共振來測量。
在某些方面，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)(刺激或抑制)骨骼形成以及增 加骨骼質(zhì)量的方法和藥劑。因此，任何鑒定的化合物可在全細胞或組 織中、在體外或體內(nèi)測試，以確定其調(diào)節(jié)骨骼生長或骨礦化的能力。 各種本領(lǐng)域公知的方法可用于這個目的。
例如，ActRIIa或activin多肽或;f企測化合物在骨骼或軟骨生長上的 效果可通過在細胞基礎(chǔ)上測量Msx2的誘導或骨母細胞分化為成骨細
胞來確定(參見例如，(Daluiski等，Nat Genet. 2001， 27(1): 84-8; Hino等，F(xiàn)ront Biosci. 2004, 9: 1520-9)。其它細胞基礎(chǔ)上分析的例子 包括分析目標ActRIIa或activin多肽的成骨活性以及在間質(zhì)祖細胞以 及成骨細胞中測試化合物。舉例說明，表達activin或ActRIIa多肽的 重組腺病毒可構(gòu)建用于感染多能間質(zhì)^L細胞C3H10T1/2、成骨細l包前 體C2C12以及成骨細胞TE-85。成骨活性隨后通過測量4^性^疇酸酶、 骨鈣素以及基質(zhì)礦化的誘導來確定(參見，例如，Cheng等，Jbone Joint SurgAm.2003, 85-A(8): 1544-52)。
本發(fā)明還涵蓋了體內(nèi)檢測骨骼或軟骨生長的方法。例如， Namkung-Matthai等，Bone, 28: 80-86 (2001)公開了 一種大鼠骨質(zhì)疏 松模型，其研究了骨折后早期的骨骼修復。Kubo等，Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 68: 197- 202 (1999)也公開了 一種大 鼠骨質(zhì)疏松才莫型，其研究了骨折后晚期的骨骼修復。Andersson等，J. Endocrinol. 170: 529-537公開了小鼠的骨質(zhì)疏松模型，小鼠是去除卵 巢的，其導致小鼠丟失實質(zhì)骨礦含量和骨礦密度，其中松質(zhì)骨丟失了 大概50%的骨礦密度。去除卵巢的小鼠的骨骼密度可以通過施用一些 諸如甲狀旁腺激素的因子來提高。在某些方面，本發(fā)明施用了本領(lǐng)域 公知的骨折治愈方法。這些方法包括骨折技術(shù)、組織學分析和生物力 學分析，其在例如美國專利6,521,750中有描述，以引用的形式整體地 將其所公開的建立以及測量骨折的程度和修復進程的實^r方法并入本 發(fā)明。
6. 示范性治療應用
在某些實施方式中，本發(fā)明的activin-ActRIIa拮抗劑(例如，ActRIIa
傷無論是例如，通過斷裂、損失或脫礦物質(zhì)。在某些實施方式中，本 發(fā)明提供了通過給個體施用治療有效劑量的activin-ActRIIa拮抗劑(特 別是ActRIIa多肽)來治療或預防有此需要的個體的骨骼損傷的方法。 在某些實施方式中，本發(fā)明提供了通過給個體施用治療有效劑量的 activin-ActRIIa拮抗劑(特別是ActRIIa多肽)來促進有此需要的個體 的骨骼生長或礦化的方法。這些方法優(yōu)選地著眼于動物的治療以及預 防性治療，更優(yōu)選地，著眼于人。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了
activin-ActRIIa拮抗劑(特別是可溶性的ActRIIa多肽以及草巴向activin 或ActRIIa的中和性抗體)在治療與低骨骼密度或降低的骨骼強度相關(guān) 的疾病中的應用。
如本發(fā)明所應用的，"預防"疾病或狀況的治療劑指的是在一個統(tǒng) 計學樣本中，相對于未治療樣本，可減少治療樣本的疾病或狀況發(fā)生 的化合物，或者相對于未治療樣本，延遲發(fā)作或減輕疾病或狀況的一 個或多個癥狀的嚴重程度的化合物。本發(fā)明所用的術(shù)語"治療"包括 預防指定的狀況或一旦這種狀況確定時改善或消除這種狀況。在兩者 之中任何 一 種情況下，預防或治療以及預期的治療劑施用結(jié)果由作診 斷的醫(yī)師來考慮。
本發(fā)明提供了包括骨骼和/或軟骨形成、預防骨骼丟失、增加骨礦 化或預防骨骼脫礦的方法。例如，目標activin-ActRIIa拮抗劑已應用于 治療骨質(zhì)疏杠、以及骨折的治愈和人或動物中的軟骨缺損。ActRIIa或 activin多肽對診斷為亞臨床低骨骼密度的患者是有效的，其作為對抗 骨質(zhì)疏松發(fā)展的保護性措施。
在一個特異的實施方式中，本發(fā)明的方法和組合物具有在人和其 它動物的骨折愈合以及軟骨缺損中的醫(yī)療效用。目標方法和組合物在 閉合的以及開放的骨折復位以及人工關(guān)節(jié)的改良固定中還具有預防性 的應用。成骨藥劑誘導的De novo骨骼形成有助于先天性的、外傷引 起的或腫瘤切除引起的顱面畸形的修復，在醫(yī)療美容中也是有效的。 在某些例子中，目標activin-ActRIIa拮抗劑可提供一種吸引骨骼形成細 胞的環(huán)境，刺激骨骼形成細胞的生長或誘導骨骼形成前體細胞的分化。 本發(fā)明的activin-ActRIIa拮抗劑在骨質(zhì)疏水>的治療中也是有效的。
本發(fā)明的方法和組合物可被應用于以骨骼損失為或?qū)е鹿趋罁p失 為特征的狀況，諸如骨質(zhì)疏松(包括繼發(fā)性骨質(zhì)疏松)、曱狀旁腺功能 亢進、庫欣病(Cushing's disease )、柏哲氏病(Paget，s disease )、甲狀 腺功能亢進、慢性痢疾或吸收不良、腎小管性酸中毒或神經(jīng)性厭食。
骨質(zhì)疏松可由各種因素引起或與之相關(guān)。對女性來說，特別是絕 經(jīng)后的女性，體重低，以及致使的久坐行為都是骨質(zhì)疏松(丟失骨礦 密度，致使骨折風險)的風險因素。具有任一下列特征的人可作為以 ActRIIa拮抗治療的候選人絕經(jīng)后的并且沒有攝食雌激素或其它的激 素替代療法的女性；高(超過5英尺7英寸)或瘦(少于125磅)的
絕經(jīng)后的女性；具有骨骼損失相關(guān)的臨床狀況的男性；應用已知可導 致骨骼損失的藥物的人，包括諸如強的松(Prednisone )的糖皮質(zhì)激 素、各種抗抽搐藥物諸如苯妥英鈉(Dilantin )以及某些巴比妥鹽， 或高劑量的甲狀腺替代藥物；具有I型糖尿病、肝臟疾病、腎臟疾病或 具有骨質(zhì)疏松家族史的人；具有高骨轉(zhuǎn)換(例如，尿樣中膠原過多) 的人；具有甲狀腺狀況諸如甲狀腺功能亢進的人；輕度外傷后骨折的 人；具有脊推骨折或骨質(zhì)疏松的其它現(xiàn)象的x射線證據(jù)的人。
如同上面所提到的，骨質(zhì)疏松也可以是與另 一種疾病相關(guān)或與某 種藥物的使用相關(guān)的狀況。藥物導致的或其它醫(yī)療狀況導致的骨質(zhì)疏 爭>-故稱為繼發(fā)性骨質(zhì)疏卡>。在一種叫庫欣病(Cushing's disease)的狀 況中，身體所產(chǎn)生的過多的皮質(zhì)醇導致骨質(zhì)疏松和骨折。最通常的與 繼發(fā)性骨質(zhì)疏松相關(guān)的藥物是糖皮質(zhì)激素， 一類像皮質(zhì)醇一樣作用的 藥物， 一種天然的由腎上腺產(chǎn)生的激素。盡管曱狀腺激素(其由曱狀 腺產(chǎn)生)的適當水平是骨骼發(fā)育所必須的，過量的甲狀腺激素可持續(xù) 地降低骨量。當腎臟有問題的特別是透析的人攝入高劑量的包含鋁的 抗酸劑時可導致骨丟失。其它的可導致繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的藥劑包括用 于預防癲癇的苯妥英(苯妥英鈉(Dilantin))和巴比妥鹽；甲氨喋呤 (Rheumatrex, Immunex, Folex PFS )， 一種用于一些類型的關(guān)節(jié)炎、 癌癥或免疫疾病的藥物；環(huán)孢毒素(Sandimmune, Neoral )， 一種用于 治療 一 些自身免疫性疾病以及在器官移植的患者體內(nèi)抑制免疫系統(tǒng)的 藥物；促黃體激素釋方文激素激動劑(Lupron, Zoladex),用于治療前列 腺癌和子宮內(nèi)膜異位癥；肝磷脂(Calciparine, Liquaemin),抗凝血藥 物；以及消膽胺(Questran )和colestipol ( Colestid ),用于治療高膽固 醇。癌癥治療導致的骨丟失^t廣泛地認識并被成為癌癥治療誘導的骨 丟失(CTIBL)。骨轉(zhuǎn)移可在骨骼上造成空穴，其可通過以activin-ActRIIa 拮抗劑治療和^資正。
在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明所^^開的activin-ActRIIa拮抗 劑，特別是可溶性的ActRIIa,可應用與癌癥患者。具有某種腫瘤的患 者(例如，前列腺的、乳腺的、多發(fā)性骨髓瘤或任何引起甲狀腺功能 亢進的腫瘤)，由于腫瘤誘導的骨丟失以及骨轉(zhuǎn)移和治療劑的原因而具 有骨丟失的高風險。甚至是在缺乏骨丟失或骨轉(zhuǎn)移的證據(jù)的情況下， 這樣的患者可以以activin-ActRIIa拮抗劑治療。還可以監(jiān)測患者的骨丟
失或骨轉(zhuǎn)移的證據(jù)，當指示器顯示風險上升時以activin-ActRIIa拮抗劑 治療。通常地，采用DEXA (雙能X射線骨密度測量研究)掃描評估 骨密度的改變，而骨骼重構(gòu)的指示器可用于評估骨轉(zhuǎn)移的可能性?？?監(jiān)測血清標記。骨骼特異的堿性磷酸酶(BSAP)是一種在成骨細胞中 存在的酶。骨轉(zhuǎn)移以及其它導致骨骼重構(gòu)增加的狀況的患者的BSAP 血液水平是上升的。骨鈣素以及原骨膠原肽同樣與骨骼形成和骨轉(zhuǎn)移 相關(guān)。在具有前列腺癌導致的骨轉(zhuǎn)移的患者中，檢測到BSAP的上升， 并且不同程度的存在與乳腺癌導致的骨轉(zhuǎn)移中。高水平的骨骼形態(tài)發(fā) 生蛋白7(BMP-7)存在于已骨轉(zhuǎn)移至骨骼的前列腺癌中，但是不存在于 膀胱、皮膚、肝臟或肺臟癌癥引起的骨轉(zhuǎn)移中。I型羧基末端肽(ICTP) 是一種在骨骼吸收期間形成的膠原中發(fā)現(xiàn)的交聯(lián)劑。由于骨骼持續(xù)地 被破壞以及改造，ICTP在全身都能找到。然而，在骨轉(zhuǎn)移發(fā)生的位置， 其水平將顯著的高于在正常骨骼的區(qū)域。ICTP的高水平發(fā)現(xiàn)于前列腺、 肺臟以及乳腺癌引起的骨轉(zhuǎn)移中。另一種膠原交聯(lián)劑，I型氨基末端肽 (NTx),在骨轉(zhuǎn)換時與ICTP—同產(chǎn)生。在很多種不同癌癥包括肺臟、 前列腺以及乳腺癌引起的骨轉(zhuǎn)移中，NTx的量是上升的。并且，NTx 水平的上升伴隨著骨轉(zhuǎn)移的發(fā)展進程。因此，這個標記可用于檢測骨 轉(zhuǎn)移以及tf量疾病的程度。其它的吸收標記包括吡啶醚和脫氧吡啶醚。 吸收標記以及骨轉(zhuǎn)移標記的任何增長表明了患者需要activin-ActRIIa 拮抗劑的治療。
Activin-ActRIIa拮抗劑可與其它藥物制劑聯(lián)合施用。聯(lián)合施用可通 過單 一 的復合配方、通過同時施用或間隔時間施用來完成。 Activin-ActRIIa拮抗劑如果與其它的骨骼激活劑 一同施用，會有特別的 優(yōu)點?；颊呖蓮腶ctivin-ActRIIa拮抗劑與攝取補釣劑、維生素D、適宜 的鍛煉和/或(某些情況下)其它的藥物聯(lián)合施用中受益。其它的藥物 的例子包括，雙膦酸鹽(阿侖膦酸鈉、伊班膦酸鈉和利塞膦酸鈉)、降 鈣素、雌激素、甲狀旁腺素以及雷洛昔芬。雙膦酸鹽(阿侖膦酸鈉、 伊班膦酸鈉和利塞膦酸鈉)、降釣素、雌激素、曱狀旁腺素以及雷洛昔 芬影響骨骼重構(gòu)周期并被歸類為抗吸收藥物。骨骼重構(gòu)由兩個不同的 階段骨骼吸收和骨骼形成?？刮账幬餃p緩或停滯骨骼重構(gòu)周期的 骨骼吸收部分但不減緩周期的骨骼形成部分。結(jié)果是，新的形成速率 持續(xù)大于吸收速率，骨骼密度一直增加。甲狀旁腺素片段，曱狀旁腺
激素的一種形式，其增加骨骼重構(gòu)循環(huán)中的骨骼形成速率。阿侖膦酸
鈉已被認可用于絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松的預防(5毫克每天或每周一次35 毫克)和治療(10毫克每天或每周一次70毫克)。阿侖膦酸鈉減少骨 丟失，增加骨密度以及降低脊柱、腕和髖的骨折風險。阿侖膦酸鈉還 ^f皮認可用于治療男性和女性中的作為長期應用這些藥物(即強的松和 可的松)所導致的糖皮質(zhì)激素誘導的骨質(zhì)疏松以及用于男性中的骨質(zhì) 疏^^的治療。阿侖膦酸鈉加上維生素D ^^認可用于治療女性的絕經(jīng)后 的骨質(zhì)疏松(每周一次70毫克，加上維生素D),并用于治療以改善 患有骨質(zhì)疏松的男性的骨量。伊班膦酸鈉被認可用于預防和治療絕經(jīng) 后的骨質(zhì)疏松。每月服用一次(150毫克)，伊班膦酸鈉必須在每月的 同一天服用。伊班膦酸鈉減少骨丟失，增加骨密度以及減少脊柱骨折 的風險。利塞膦酸鈉;故認可用于預防和治療絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏;^。每天 服用(5毫克的劑量)或每周服用(35毫克劑量或35毫克劑量加上鈣)， 利塞膦酸鈉減緩骨丟失，增加骨骼密度以及減少脊柱骨折和非脊柱骨 折的風險。利塞膦酸鈉還^^皮認可用于男性和女性以預防和/或治療長期 施用這些藥物(即強的松和可的松)所導致的糖皮質(zhì)激素誘導的骨質(zhì) 疏松。降釣素是一種天然存在涉及釣調(diào)節(jié)和骨骼新陳代謝的激素。在 絕經(jīng)期5年以后的女性，降釣素減緩骨丟失，增加脊柱骨密度并可能 減輕骨折相關(guān)的疼痛。降鈣素減少脊柱骨折的風險。降鈣素可作為注 射劑(50-100IU每天)或鼻噴入(200IU每天)使用。雌激素治療(ET) /荷爾蒙治療(HT)被認可用于預防骨質(zhì)疏松。ET如所顯示的那樣減 少骨丟失，增加脊柱和髖的骨骼密度，并減少絕經(jīng)后的女性的髖和脊 柱骨折的風險。ET施用最常見是以藥丸或皮膚貼劑的形式，其釋放約 0.3毫克每天的低劑量或約0.625毫克每天的標準劑量，并且即使70歲 之后才開始也仍然有效。當單獨攝入雌激素時，其可增加女性發(fā)展宮 頸壁癌癥(子宮內(nèi)膜癌)的風險。為消除這種風險，醫(yī)療服務提供者 開出的處方是孕酮荷爾蒙與雌激素組合用于那些具有完整子宮的女 性。ET/HT減輕絕經(jīng)期癥狀并顯示對骨骼健康具有有益效果。副作用 包括陰道流血、乳房觸痛、情緒護G動以及膽嚢疾病。雷洛昔芬，60毫 克每天，被認可用于預防和治療絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松。它來源于一系列 的叫做選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERMs)的藥物，其被發(fā)展成為提 供雌激素的有益效果而沒有潛在的缺陷。雷洛昔芬增加估量并且減少
脊柱骨折的風險。仍未獲得數(shù)據(jù)以證明雷洛昔芬可以減少髖和非其它 非脊柱骨折的風險。這種藥物刺激新骨骼的形成并且顯著地增加骨礦 密度。在絕經(jīng)后的女性中，脊柱、髖、足、肋骨以及腕的骨折復位是 顯著的。男性中，脊柱中的骨折復位是顯著的，但沒有足夠的數(shù)據(jù)來 評估其它位置的骨折復位。曱狀旁腺素片段是自施用的，如同一天24 小時注射一樣。
7. 藥物組合物
在某些實施方式中，本發(fā)明的activin-ActRIIa拮抗劑(例如，ActRIIa 多肽)與藥學上可接受的載體配方。例如，ActRIIa多肽可單獨施用或 作為制劑配方(治療組合物)的成分。目標化合物可以任何適于應用 于人類或獸醫(yī)的途徑配方施用。
在某些實施方式中，本發(fā)明的治療方法包括全身性地施用組合物 或作為種植體或設備局部施用。施用時，用于本發(fā)明的治療組合物理 所當然是無熱原的、生理學上可接受的形式。除ActRIIa拮抗劑之外的 治療有效藥劑可視情況地包括入上面所描述的組合物，在本發(fā)明的方 法中其可與目標化合物(例如，ActRIIa多肽)同時或相繼地施用。
通常地，ActRIIa拮抗劑在腸胃外施用。適合胃腸外給藥的藥物組 合物包括一個或多個ActRIIa多肽與一種或多種藥學上可接受的無菌 等滲水溶液或非水溶劑、分散劑、懸液或乳劑、或可重組到前面所用 的無菌可注射溶液或分散體的無菌粉末相組合，其可包含抗氧化劑、 緩沖劑、抗菌劑、賦予配方與將來的受者的血液等張的溶質(zhì)或懸浮或 增稠的藥物。合適的應用于本發(fā)明的藥物組合物的水載體或非水載體 的例子包括水、乙醇、多羥基化合物(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇， 等等)及其合適的混合物，植物油(諸如橄攬油)，以及可注射的有機 酯(諸如油酸乙酯)。可保持適當?shù)牧鲃有?，例如，通過應用包^:物質(zhì) (諸如卯磷脂)，在分散體的情況下通過保持所要求的顆粒大小，以及 通過應用表面活性劑。
此外，組合物可被裝入膠嚢或注射為釋放至靶組織位置(例如， 骨骼)的形式。在某些實施方式中，本發(fā)明的組合物包括可以釋放一 種或多種治療化合物(例如ActRIIa多肽)至靶組織位置(例如，骨骼) 的基質(zhì)，為發(fā)育中的組織提供一種結(jié)構(gòu)并且，最理想地，能被吸收入
體內(nèi)。例如，基質(zhì)可提供ActRIIa多肽的緩慢釋放。這樣的基質(zhì)可由現(xiàn) 有的用于其它植入醫(yī)藥應用的物質(zhì)形成。
基質(zhì)物質(zhì)的選擇基于生物適應度、生物降解能力、機械特性、外 觀以及界面特性。目標組合物的特定應用將確定適宜的配方。潛在的 用于組合物的基質(zhì)是生物可降解的以及化學上清楚的石克酸鈣、磷酸三 4丐、羥基磷灰石、聚乳酸以及聚酸酐。其它潛在的物質(zhì)是生物可降解 的并且生物學上非常清楚的，諸如骨骼或真皮膠原。其它的基質(zhì)包括 純蛋白或細胞外基質(zhì)成分。其它潛在的基質(zhì)是非生物可降解的以及化 學上清楚的，諸如燒結(jié)的羥基磷灰石、生物玻璃、鋁酸鹽或其它陶瓷。 基質(zhì)可由上面所提到的任何類型的物質(zhì)的組合(諸如聚乳酸和羥基磷 灰石或膠原和-疇酸三鈣)組成。生物陶瓷可在組合物中改變，諸如在 鈣_鋁_磷酸中以及在改變孔徑、顆粒大小、顆粒形狀以及生物降解能力
的處理中。
在某些實施方式中，本發(fā)明的方法可以是口服給藥，例如，以膠 嚢、cathets、藥丸、藥片、含片(采用調(diào)味基質(zhì)，通常是蔗糖和阿拉伯 樹膠或黃芘膠)、粉末、顆粒或作為水或非水溶劑中的溶液或懸濁液、 或作為油包水或作為水包油的液體乳劑、或作為酏劑或糖漿劑、或作 為錠劑(采用惰性基質(zhì)，諸如凝膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯樹膠)和/ 或漱口劑等等的形式，每種都包含預先確定量的作為活性成分的藥劑。
藥劑也可作為丸劑、沖劑或糊劑的形式施用。
在口服給藥的固態(tài)劑量形式(膠嚢、藥片、藥丸、糖衣丸、粉末、 顆粒等等)中，本發(fā)明的一種或多種治療化合物可與一種或多種藥學 上可接受的載體(諸如擰檬酸鈉或磷酸二鈣)混合，和/或任何的下面 的物質(zhì)(l)填料或稀釋劑，諸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露 醇和/或硅酸；(2)粘合劑，諸如，例如，曱基纖維素、藻酸鹽、凝膠、 聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯樹膠；(3)保濕劑，諸如甘油；(4) 崩解劑，諸如瓊脂-瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯淀粉或木薯淀粉、褐藻酸、 某些硅酸鹽、以及碳酸鈉；(5)溶液緩釋劑，諸如石蠟；(6)吸收促 進劑，諸如季胺化合物；(7)潤濕劑，諸如，例如，十六醇以及甘油 單硬脂酸酯；(8)吸收劑，諸如高嶺土和膨潤土； (9)滑潤劑，諸如 滑石、硬脂酸鈣、應制酸鎂和固體聚乙二醇、硫酸十二烷基鈉及其混 合物；(IO)著色劑。在膠嚢劑、藥片以及藥丸的情況下，藥物組合物
可包含緩沖藥劑。相似類型的固態(tài)組合物也可用于^f吏用諸如乳糖或奶 糖以及高分子量聚乙二醇等等作為輔料的軟填充以及硬填充明膠膠嚢 的填料。
用于口服給藥的液態(tài)劑型包括藥學上可接受的乳液、微乳液、溶 液、糖漿和酏劑。除活性成分外，液態(tài)劑型包含本領(lǐng)域常用的惰性稀 釋劑(諸如水或其它溶劑)、助溶劑和乳化劑(諸如酒精、異丙醇、碳
酸乙酯、乙酸乙酯、苯丙醇、苯甲酸千酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特 別地，棉籽、落花生、玉米、胚芽、橄欖、蓖麻以及芝麻油)、甘油、 四氫呋喃曱醇、聚乙二醇以及山梨聚糖的脂肪酸酯及其混合物。除惰 性稀釋劑外，口服組合物還包括諸如潤濕劑、乳化和懸浮劑、甜味劑、
香料、著色劑、加香以及防腐劑的助劑。
懸浮劑，除了活性化合物外，包含諸如乙氧基異硬脂醇(ethoxylated isostearyl alcohols )、聚氧乙烯山梨醇以及脫水山梨糖醇、微晶纖維素、 偏氫氧化鋁(aluminum metahydroxide )、膨潤土、瓊脂-瓊脂和黃芪月交 及其混合物的助懸劑。
本發(fā)明組合物還可包含助劑，諸如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分 散劑?？赏ㄟ^包含各種抗菌藥和抗真菌藥(例如，帕拉膠、氯丁醇、 苯酚等等)來確保微生物活動的防止。必要的時候組合物中還包括等 滲劑，諸如糖、氯化鈉等等。此外，可注射藥物的延長吸收可通過延 遲吸收的藥劑諸如單硬脂酸鋁和凝膠的夾雜而帶來。
當然，給藥方案經(jīng)過主治醫(yī)師考慮各種改變本發(fā)明的目標化合物 (例如，ActRIIa多肽)作用的因素后作出。所述的各種因素包括但不 限于，需要形成的骨骼重量，骨密度丟失的程度，骨損傷的位置，損 傷骨骼的狀況，患者的年齡、性別和飲食，任何促進骨丟失的疾病的 嚴重程度、施用時間以及其它臨床因素。視情況，劑量可根據(jù)重建中 使用的基質(zhì)類型以及組合物中的化合物類型而變動。其它加到最終的 組合物當中的已知的生長因子也可影響劑量。進程可通過骨骼生長和/ 或修復的定期評估(例如，X射線(包括DEXA)、組織形態(tài)測定以及 四環(huán)素標記)來監(jiān)測。
小鼠實驗證明了當化合物每次間隔給藥而且劑量足夠達到0.2微 克/千克或更高的血藥濃度時，ActRIIa-Fc在骨骼上的效果是可檢測 的，，并且血清藥物水平為1微克/千克或2微克/千克或更高是獲得骨
骼密度和強度的顯著效果所必須的。盡管沒有更高劑量的ActRIIa-Fc 由于會導致副作用而不合需要的跡象，治療方案被設計為達到0.2與 15微克/千克之間的血藥濃度，視情況為1到5微克/千克之間。在人類 中，0.2微克/千克的血清藥物水平可通過0.1毫克/千克或更高的單次劑 量達到，1微克/千克的血清藥物水平可通過0.3毫克/千克或更高的單 次劑量達到。觀察到的分子的血清半衰期在約20天到30天之間，大 體上長于大多數(shù)的Fc融合蛋白，并因此獲得持久有效的血清藥物水平， 例如，通過每周或雙周基礎(chǔ)上的0.2-0.4毫克/千克的劑量，或更高的劑 量與劑量間更長的時間間隔。例如，1-3毫克/千克的劑量可用于每月或 雙月基礎(chǔ)上，并且骨骼上的效果足夠持久，這樣的劑量對于僅僅是每3、 4、 5、 6、 9、 12或更多個月 一次所必須的。
在某些實施方式中，本發(fā)明還提供了體內(nèi)產(chǎn)生ActRIIa多肽的基因 療法。這樣的療法可通過在患有上面所列的疾病的細月包或組織中引入 ActRIIa多核苷酸序列而達到其治療效果。ActRIIa多核苷酸序列的遞 送可通過使用重組表達載體諸如嵌合病毒或膠態(tài)分散體系來完成。優(yōu) 選用于ActRIIa多核普酸序列治療性遞送的是耙向脂質(zhì)體的使用。
本發(fā)明所教導的各種可用于利用來基因治療的病毒載體包括腺病 毒、皰滲病毒、牛痘，或優(yōu)選i也，RNA病毒i者如逆4i錄病毒。優(yōu)選;也， 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是小鼠或鳥類逆轉(zhuǎn)錄病毒的衍生物?？刹迦雴蝹€外源 基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒的例子包括但不限于莫洛尼小鼠白血病病毒 (MoMuLV )、哈維鼠肉瘤病毒(HaMuSV )、鼠乳腺肺瘤病毒(MuMTV ) 以及勞斯肉瘤病毒(RSV)。大量其它的逆轉(zhuǎn)錄病毒可合并多個基因。 所有這些載體可轉(zhuǎn)移或合并基因以選擇性標記使得轉(zhuǎn)導的細胞可被鑒 定和生成。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可通過粘附例如糖、糖脂或蛋白質(zhì)而制成 耙特異性的。優(yōu)選靶向通過采用抗體達到。本領(lǐng)域技術(shù)人員可意識到
特異的多核苷酸序列可插入到逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組或粘附到病毒包膜蛋 白以允許包含ActRIIa多核苷酸的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體靶特異性地遞送。在 一個優(yōu)選的實施方式中，載體靶向骨骼或軟骨。
或者，組織結(jié)構(gòu)細胞可通過常規(guī)的4丐磷酸鹽轉(zhuǎn)染直接以編碼逆轉(zhuǎn) 錄病毒結(jié)構(gòu)基因gag、 pol和env的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。然后這些細胞以包含感 興趣的基因的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。得到的細胞釋放逆轉(zhuǎn)錄病毒載體至培養(yǎng) 基中。
另一個ActRIIa多核苦酸靼向釋放系統(tǒng)是膠體分散系統(tǒng)。膠體分散 系統(tǒng)包括大分子復合物、納米膠嚢、微球體、珠子以及脂質(zhì)體系統(tǒng)包 括油包水乳劑、膠束、混合膠束以及脂質(zhì)體。本發(fā)明優(yōu)選的膠體分散 系統(tǒng)是脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是人工膜嚢泡，其可有效地作為體外或體內(nèi)的 分散載體。RNA、 DNA以及完整的病毒顆粒可與內(nèi)部水溶液一同封裝， 并以生物活性形式分散質(zhì)細;9包(參見，例如，F(xiàn)raley,等，Trends Biochem. Sd.， 6: 77, 1981 )。采用脂質(zhì)體載體高效轉(zhuǎn)染基因的方法是本領(lǐng)域公 知的，參見例如，Mannino，等，Biotechniques, 6: 682, 1988。月旨質(zhì) 體組合物通常是磷脂的組合，通常與類固醇特別是膽固醇組合。也可 以使用其它的磷酸酯或其它的脂質(zhì)。脂質(zhì)體的物理特性依賴于pH、離 子強度以及二價陽離子的存在。
可用于生產(chǎn)脂質(zhì)體的脂質(zhì)的例子包括磷脂酰化合物，諸如磷脂酰 甘油、卵磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、腦苷脂和神 經(jīng)節(jié)苷脂。示例性的磷脂的例子包括蛋黃卵磷脂、二棕櫚酰磷脂酰膽 堿和二硬脂酰磷脂酯膽堿。脂質(zhì)體的耙向也可能基于，例如，器官特 異性、細胞特異性以及細胞器特異性以及本領(lǐng)域已知的其它。
實施例
本發(fā)明在這里是一般性的描述，通過參照下述實施例將更容易理 解，所包括的實施例僅僅用于解釋某些實施方式以及本發(fā)明的某些實 施方式，并不打算用于限制本發(fā)明。
實施例1: ActRIIa-Fc融合蛋白
申請人構(gòu)建了具有融合至人或小鼠Fc結(jié)構(gòu)域的人ActRIIa胞外結(jié) 構(gòu)域的可溶性ActRIIa融合蛋白，兩者間有最小限度的連接子。構(gòu)建物 分別指的是ActRIIa-hFc和ActRIIa-mFc。
純化自CHO細胞系的ActRIIa-hFc ( SEQ ID NO: 7 )如下:
PEMEV
RTPEV VLTVL EEMTK
SKLTV DKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
ActRIIa-hFc和ActRIIa-mFc蛋白表達在CHO細胞系中?？紤]了三 種不同的前導序列
(i)蜜蜂蜂毒肽(HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (SEQ ID NO: 8)
(ii )組織型纖溶酶原激活物(TPA ): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEQIDNO: 9) (iii)天然的MGAAAKLAFAVFLISCS SGA(SEQIDNO: 10) 所選擇的形式采用TPA前導并具有以下未被加工的氨基酸序列
TNQT VEKKD PPCPA VDGVE PVPIE WESNG
LHNH YTQKSLSLSPGK(SEQIDNO: 13)
該肽由下面的核普酸序列所編碼GGAG TCAG AAAC TTTTG TGTT AAAA AATG CAAAT CCAC TCCCC ACAT AACTG GGGA CCTG CAACA GGCA AGATG
AGAG CCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGAATTC (SEQ ID NO: 14)
ActRIIa-hFc和ActRIIa-mFc都顯著性地順應重組表達。如圖1所 示，蛋白質(zhì)純化為單一的良好的蛋白峰形。N末端測序揭示了 ILGRSTQE(SEQIDNO: ll)的單一序列。純化可通過一系列的柱層析 步驟達到，包括，例如，三個或多個以下的步驟，以任意的順序A 蛋白層析、Q瓊脂糖層析、苯基瓊脂糖層析、尺寸阻排層析以及陽離 子交換層析。純化可通過病毒過濾以及緩沖交換而完成。ActRIIa-hFc 蛋白純化至以尺寸阻排層析確定大于98%而以SDS PAGE確定大于95 %的純度。
ActRIIa-hFc和ActRIIa-mFc顯示了與配體特別是activinA的高親 和性。GDF-11或ActivinA ( "ACA")采用標準的氨基酸耦l關(guān)程序固定 在Biacore CM5芯片上。ActRIIa-hFc和ActRIIa-mFc蛋白加載至系統(tǒng)， 并測量其結(jié)合。ActRIIa-hFc以5 x 10"2的解離常數(shù)(KD )結(jié)合至acti糧, 而蛋白質(zhì)以9.96 x l(T9的K。結(jié)合至GDFll。參見圖2。 ActRIIa-mFc 的情況類似。
A-204報告基因分析通過GDF-11和ActivinA來評估ActRIIa-hFc 蛋白在信號傳遞上的效果。細胞系人橫紋肌肉瘤(來源于肌肉)。報 告載體pGL3(CAGA)12 (Described in Dennler等，1998， EMBO 17: 3091-3100.)參見圖3。CAGA12基序存在于TGF-beta反應性基因(PAI-1 基因)，因此這個載體通常用于通過Smad2和3的信號因子。
第一天分離A-204纟田胞入48孔板。
第二天A-204細胞與lOiug pGL3(CAGA)12或pGL3(CAGA)12 (10 pg)+ pRLCMV (1 pg)和Fugene —同轉(zhuǎn)染。
第三天加入因子(稀釋入0.1%BSA基質(zhì))。抑制劑需要在加至 細胞前與因子預孵育1小時。6小時候，細胞以PBS洗滌，并溶解細胞。
隨后是熒光素酶分析。通常在該方法中，沒有任何的抑制劑的存 在，ActivinA顯示出刺激約10倍的報告基因表達并且ED50 ~ 2納克/ 毫升。GDF-11: 16倍刺激，ED50: 1.5納克/毫升。GDF-8顯示類似 GDF-ll的效果。
如圖4中顯示的，ActRIIa-hFc和ActRIIa-mFc在皮摩爾濃度下抑 制GDF-8調(diào)節(jié)的信號。如圖5所示，三種不同的ActRIIa-hFc制劑與接 近200pM的IC50 —起抑制GDF-ll信號。
ActRIIa-hFc在藥代動力學分析中非常穩(wěn)定。大鼠給藥1 mg/kg、 3 mg/kg或10 mg/kg的ActRIIa-hFc多肽，并且蛋白的血漿藥物水平在 24、 48、 72、 144以及168小時測量。在一個單獨的研究中，大鼠的給 藥劑量是lmg/kg、 10 mg/kg或30 mg/kg。在大鼠中，ActRIIa-hFc具 有11-14天的血清半衰期并且藥物的循環(huán)水平在2周后非常高(11 |ig/ml、 110 ^g/ml或304 ng/ml，分別對于1 mg/kg、 10 mg/kg或30 mg/kg 的起始劑量)。在食蟹猴中，血漿半衰期基本上大于14天并且藥物的 循環(huán)水平是25 pg/ml、 304 pg/ml或1440 pg/ml (分別對應于1 mg/kg、 10 mg/kg或30 mg/kg的起始濃度)。人類中的初步結(jié)果顯示，血清藥 物藥物半衰期在約20至30天之間。
實施例2: ActRIIa-hFc在體內(nèi)促進骨骼生長
正常的雌性小鼠(BALB/c)給予1 mg/kg/劑、3 mg/kg/劑或10 mg/kg/劑水平的ActRIIa-mFc,每周給藥2次，骨礦密度和骨礦含量通 過DEXA確定，參見圖6。
在雌性BALB/c中，DEXA掃描顯示作為ActRIIa-mFc的治療結(jié)果， 骨礦密度和含量的顯著增加(> 20% )。參見圖7和8。
因此，ActRIIa的拮抗劑引起正常雌性小鼠的骨密度和含量的增加。 作為后續(xù)步驟，檢測了 ActRIIa-mFc在去除卯巢的小鼠模型上的效果。
Andersson等(2001)，確定去除卵巢的小鼠經(jīng)受相當?shù)墓莵G失(在
術(shù)后6周大概丟失了 50%的松質(zhì)骨)，并且這些小鼠中的骨丟失可通過
候選治療劑諸如甲狀旁腺激素治療。
申請人采用4-5周齡的去除卵巢的(OVX)雌性C57BL6小鼠或假 手術(shù)雌性小鼠。術(shù)后8周，開始用ActRIIa-mFc ( 10 mg/kg,每周兩次) 或?qū)φ?PBS)來治療。通過CT掃描來衡量骨密度。
如圖9顯示的，在6周后，相對于假手術(shù)的小鼠，未治療的、去 除卵巢的小鼠顯示相當?shù)乃少|(zhì)骨密度損失。ActRIIa-mFc處理組保留了 假手術(shù)組水平的骨密度。在6周和12周的治療時，ActRIIa-mFc引起 OVX小鼠松質(zhì)骨相當?shù)脑鲩L。參見圖10。在6周的治療后，相對于 PBS對照組，骨密度增加了24%。在12周后，增加為27%。
在假手術(shù)小鼠中，ActRIIa-mFc也引起了松質(zhì)骨的相當?shù)脑黾印?見圖11。在6周和12周后，相對于對照，治療產(chǎn)生了35%的增長。
在另外一組實驗中，如上所述的去除卵巢(OVX)小鼠或假手術(shù) 小鼠以ActRIIa-mFc ( 10 mg/kg,每周兩次)或?qū)φ?PBS )處理12周 以上。類似于上面描述的ActRIIa-mFc的結(jié)果，接受ActRIIa-mFc的 OVX小鼠展示松質(zhì)骨密度早在處理4周的時候增加了 15%,而在12 周的處理后增加了 15% (圖12)。接受ActRIIa-mFc的的假手術(shù)小鼠同 樣顯示松質(zhì)骨密度早在處理4周的時候增加了 25%,而在12周的處理 后增加了 32% (圖13)。
在以ActRIIa-mFc處理12周后，全身以及間接體內(nèi)股骨DEXA分 析顯示，處理在去除卵巢小鼠以及假手術(shù)小鼠(圖14A和圖14B,分 別地)中均誘導了骨骼密度的增長。這些結(jié)果也被股骨中段的間接體 內(nèi)pQCT分析所支持，其證明了在以ActRIIa-mFc處理12周后，總骨 骼密度以及皮質(zhì)骨密度均顯著上升。載體處理的對照去除卵巢小鼠展 示的骨骼密度與載體處理的對照假手術(shù)小鼠相比較(圖15)。除骨骼密 度之外，骨量也隨ActRIIa-mFc處理而增加。股骨中段的間接體內(nèi)pQCT 分析證明在以ActRIIa-mFc處理12周后總骨量以及皮質(zhì)骨量均顯著上 升，而去除卵巢的小鼠以及假手術(shù)的載體對照處理的小鼠均展示了可 比較的骨量(圖16)。股骨中段的間接體內(nèi)pQCT分析還顯示， ActRIIa-mFc處理的小鼠沒有顯示骨膜周長的變化，而ActRIIa-mFc處 理導致骨內(nèi)膜周長的減小表明皮質(zhì)厚度的增加是由股骨內(nèi)表面的生長 引起的(圖17)。股骨的力學測試確定ActRIIa-mFc可以增加骨骼的外
在特性(最大載荷、剛度以及斷裂能)，其有助于骨骼內(nèi)在特性(極限
強度)的顯著增加。以ActRIIa-mFc處理的去除卵巢的小鼠展示了高于 假手術(shù)的、載體處理的對照水平的增加的骨骼強度，表明骨質(zhì)疏松表 現(xiàn)型的完全逆轉(zhuǎn)(圖18)。
這些數(shù)據(jù)證明activin-ActRIIa拮抗劑可在雌性小鼠中增加骨密度， 并且，此外，在骨質(zhì)疏松的小鼠模型中更正骨密度、骨含量以及最大 骨骼強度的缺陷。
在另一組實驗中，小鼠在第4周去除卵巢或假手術(shù)，在第12周開 始的時候接受安慰劑或ActRIIa-mFc(2次每周，10mg/kg)(如圖19-24 中的RAP-ll)，再進行12周。評估各種骨骼參數(shù)。如圖19所示， ActRIIa-mFc增加OVX和假手術(shù)組的脊推松質(zhì)骨容積與總?cè)莘e的比例 (BV/TV)。 ActRIIa-mFc也改善松質(zhì)骨的結(jié)構(gòu)(圖20 ),增加骨膜厚度 (圖21 )以及改善骨骼強度(圖22)。如圖23所示，ActRIIa-mFc在 從lmg/kg到10mg/kg的劑量范圍內(nèi)產(chǎn)生令人滿意的效果。
骨骼的組織形態(tài)測量在假手術(shù)小鼠的2周時間點進行。在圖24中 呈現(xiàn)的這些數(shù)據(jù)，證明ActRIIa-mFc具有雙重效果，抑制骨骼吸收以及 促進骨骼生長。因此，ActRIIa-mFc促進骨骼生長(合成代謝效果)以 及抑制骨骼吸收(抗分解代謝效果)。
實施例4:替代的ActRIIa-Fc蛋白
一種替代的構(gòu)建物可刪除ActRIIa胞外結(jié)構(gòu)域C末端尾(最后的) 的15個氨基酸。這樣的構(gòu)建物的序列如下(Fc部分以下劃線標出) (SEQ ID NO: 12 ): KGFYPS
DIAVEWESNGOPE麗YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGN VFSCS VMHEAL麗HYTOKSLSLSPGK
參考文獻的整合
本發(fā)明所提到的所有出版物和專利整體地以參考文獻的形式并入 本發(fā)明，如同每個出版物或?qū)＠貏e地且單獨地指示以參考文獻并入。
盡管已對目標事物的特定實施例進行了討論，上面的說明書是示 例性而且是非限制性的。通過閱讀上面的說明書和后面的權(quán)利要求， 諸多變動對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的。本發(fā)明全部的保護范圍 應當參照權(quán)利要求與其相當?shù)谋Ｗo范圍以及說明書與這樣的變動來確 定。
權(quán)利要求
1.一種activin-結(jié)合ActRIIa多肽，其具有由SEQ ID NO7的氨基酸序列組成的氨基酸序列。
2. 權(quán)利要求1所述的activin-結(jié)合ActRIIa多肽，考慮到蛋白質(zhì)雜 質(zhì)，其中所述的多肽的純度至少為95%,其通過尺寸阻排層析確定的。
3. 權(quán)利要求1或2所述的activin-結(jié)合ActRIIa多肽，其中所述的 多肽相對于GDF-11在對activin的解離常數(shù)上顯示至少10倍的選擇性。
4. 一種藥物制劑，包括權(quán)利要求1-3中任一項的activin-結(jié)合 ActRIIa多肽和藥學上可接受的輔料。
5. 權(quán)利要求4所述的藥物制劑，其中所述的制劑大體上是無熱原 物質(zhì)的。
6. —種分離的多核苷酸，包含權(quán)利要求1-3中任一項的activin-結(jié)合ActRIIa多肽的編碼序列。
7. 權(quán)利要求6所述的分離的多核苷酸，其中所述的分離的多核苷 酸包含SEQIDNO: 14的序列。
8 —種重組多核苷酸，包含啟動子序列可操作地連接到權(quán)利要求 6或7所述的多核苷酸。
9. 一種以權(quán)利要求6-8中任一項的重組多核苷酸轉(zhuǎn)化的細胞。
10. —又利要求9所述的細l包，其中所述的細胞是哺乳動物細胞。
11. 權(quán)利要求10所述的細胞，其中所述的細胞是CHO細胞或人類 細胞。
12 一種標記activin-結(jié)合ActRIIa多肽的方法，包括a) 在適合表達可溶性ActRIIa多肽的條件下培養(yǎng)細胞，其中所述的 細胞以權(quán)利要求6-8中任一項的重組多核苷酸轉(zhuǎn)化；并且b) 復性所表達的activin-結(jié)合ActRIIa多肽。
13. —種促進骨骼生長、增加骨骼密度或骨骼強度的方法，該方法 包括對目標施用有效劑量的選自下組的多肽a) 包含與SEQ ID NO: 2具有至少90 %同 一性的氨基酸序列的多肽；b) 包含與SEQ ID NO: 3具有至少90 %同 一性的氨基酸序列的 多肽；以及c) 包含選自SEQ ID NO: 2的至少50個連續(xù)氨基酸的多肽。
14. 權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的多肽具有一個或多個下 述的特性i) 以至少10-7M的Kd結(jié)合至ActRIIa配體；并且ii) 在細胞中抑制ActRIIa信號。
15. 權(quán)利要求13或14的方法，其中所述的多肽是融合蛋白，包括， 除ActRIIa多肽的結(jié)構(gòu)域外的一個或多個多肽部分，所述的多肽部分增 強穩(wěn)定性、體內(nèi)半衰期、攝取/施用、組織定位或分配、蛋白質(zhì)復合物 的形成和/或純化中的 一個或多個。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中所述的融合蛋白包括選自下組的多 肽部分免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域和血清白蛋白。
17. 權(quán)利要求13-16的任一項的方法，其中所述的多肽包括一個 或多個選自下面組的修飾的氨基酸殘基糖基化的氨基酸、聚乙二醇 化的氨基酸、法尼基化的氨基酸、乙酰化的氨基酸、生物素化的氨基 酸、耦聯(lián)至脂質(zhì)部分的氨基酸以及耦聯(lián)至有機衍生物的氨基酸。
18. —種治療骨骼相關(guān)疾病的方法，該方法包4舌，給有此需要的對 象施用有效劑量的activin或ActRIIa拮抗劑。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中所述的activin或ActRIIa拮抗劑是 activin或ActRIIa拮抗劑多肽。
20. 權(quán)利要求19的方法，其中所述的activin或ActRIIa拮抗劑選 自下面的纟且a) 包含與SEQ ID NO: 2具有至少90 %同 一性的氨基酸序列的多肽；b) 包含與SEQIDNO: 3具有至少90 %同 一性的氨基酸序列的 多肽；以及c) 包含選自SEQ ID NO: 2的至少50個連續(xù)氨基酸的多肽。
21. 權(quán)利要求19或20的方法，其中所述的activin或ActRIIa拮抗 劑多肽具有 一 個或多個以下的特性i) 以至少10—7M的KD結(jié)合至ActRIIa配體；并且ii) 在細胞中抑制ActRIIa信號。
22. 4又利要求19-21任一項的方法，其中所述的activin或ActRIIa 拮抗劑多肽是融和蛋白，包括，除ActRIIa多肽的結(jié)構(gòu)域外的一個或多 個多肽部分，所述的多肽部分增強穩(wěn)定性、體內(nèi)半衰期、攝取/施用、 組織定位或分配、蛋白質(zhì)復合物的形成和/或純化中的 一個或多個。
23. 權(quán)利要求22的方法，其中所述的融合蛋白包括選自下組的多 肽部分免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域和血清白蛋白。
24. 4又利要求19-23任一項的方法，其中所述的activin或ActRIIa 拮抗劑多肽包括一個或多個選自下面組的修飾的氨基酸殘基糖基化 的氨基酸、PEG化的氨基酸、法尼基化的氨基酸、乙酰化的氨基酸、 生物素化的氨基酸、耦聯(lián)至脂質(zhì)部分的氨基酸以及耦聯(lián)至有機衍生物 的氨基酸。
25. 權(quán)利要求18-24任一項的方法，其中所述的骨骼相關(guān)的疾病選 自下面的組原發(fā)性骨質(zhì)疏松和繼發(fā)性骨質(zhì)疏松。
26. 權(quán)利要求18-24任一項的方法，其中所述的骨骼相關(guān)的疾病選 自下面的組絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松、性腺功能低下的骨質(zhì)疏松、腫瘤引 發(fā)的骨質(zhì)疏松、癌癥治療引發(fā)的骨質(zhì)疏松、骨轉(zhuǎn)移瘤、多發(fā)性骨髓瘤 以及柏哲氏病。
27. 權(quán)利要求18-26任一項的方法，其中所述的方法還包括施用第 二種骨骼活化劑。
28. 權(quán)利要求27的方法，其中所述的骨骼活化劑選自下面的組 雙膦酸酯、雌激素、選擇性的雌激素受體調(diào)節(jié)劑、甲狀旁腺激素、降 血鈣素、補鈣劑和維生素D補充劑。
29. —種藥物制劑，包含(a) activin或ActRIIa 4吉4元劑；以及(b) 第二骨骼活化劑。
30. —種筌定促進骨骼生長或增加骨密度的制劑的方法，該方法包括a) 筌定與activin或ActRIIa拮抗劑多肽竟爭性結(jié)合至ActRIIa多肽 的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的纟全測藥劑；并且b) 評估藥劑在組織生長上的效果。
31. Activin或ActRIIa拮抗劑多肽在制備用于治療骨骼相關(guān)疾病的 藥物中的應用。
32. —種預防骨錄相關(guān)疾病的方法，該方法包括對有此需要的對象 施用有效劑量的activin或ActRIIa拮抗劑。
33. 權(quán)利要求32的方法，其中所述的對象具有與骨轉(zhuǎn)移瘤相關(guān)的 癌癥。
34. 權(quán)利要求32-33的方法，其中所述的對象對骨密度丟失、骨骼 吸收或骨轉(zhuǎn)移瘤的指示劑是陽性的。
35. 權(quán)利要求32-34任一項的方法，其中所述的對象是與骨丟失相 關(guān)的癌癥治療方案的受者。
36. 權(quán)利要求32-34任一項的方法，其中所述的對象具有與骨丟失 相關(guān)的癌癥。
37. 權(quán)利要求1-3任一項的activin-結(jié)合ActRIIa多肽，權(quán)利要求 4-5或29任一項的藥物制劑，或權(quán)利要求13-28任一項的方法，其中 所述的多肽是糖基化的。
38. —種在患者中促進骨骼生長以及抑制骨骼吸收的方法，所述的 方法包括對患者施用有效劑量的ActRIIa-Fc融合蛋白，其中所述的 ActRIIa-Fc融合蛋白包含與SEQ ID NO: 3的氨基酸序列具有至少90 %同一性的氨基酸序列。
39. 權(quán)利要求38的方法，其中所述的ActRIIa-Fc融合蛋白包含與 SEQ ID NO: 3的氨基酸序列具有至少95 %同 一性的氨基酸序列。
40. 權(quán)利要求38或39的方法，其中所述的ActRIIa-Fc融合蛋白包 含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列。
41. 權(quán)利要求38-40任一項的方法，其中所述的ActRIIa-Fc融合蛋 白包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。
42. 權(quán)利要求38-41任一項的方法，其中所述的方法導致患者骨骼 肌質(zhì)量小于10%的增長。
43. 權(quán)利要求38-41任一項的方法，其中所述的ActRIIa-Fc融合蛋 白施用使得患者體內(nèi)的血藥濃度至少達到0.2 n g/kg。
44. 權(quán)利要求38-43任一項的方法，其中所述的ActRIIa-Fc融合蛋 白具有SEQ ID NO: 7的氨基酸序列。
45. 權(quán)利要求38-44任一項的方法，其中所述的ActRIIa-Fc融合蛋 白具有15到30天的血清半衰期。
46. 權(quán)利要求38-45任一項的方法，其中所述的ActRIIa-Fc融合蛋 白施用給患者不超過每周一次。
47. 權(quán)利要求38-46任一項的方法，其中所述的ActRIIa-Fc融合蛋 白施用給患者不超過每月 一次。
48. 選自下組的多肽在制備促進骨骼生長、增加骨骼密度或增加骨 骼強度的藥物中的應用(a)包含與SEQ ID NO: 2具有至少90%同 一性的氨基酸序列的多肽；(b)包含與SEQ ID NO: 3具有至少90% 同一性的氨基酸序列的多肽；以及(c)包含選自SEQ ID NO: 2的至 少50個連續(xù)氨基酸的多肽。
49. Activin或ActRIIa拮抗劑多肽在制備用于預防骨駱相關(guān)疾病的 藥物中的應用。
50. 包含與SEQIDNO:3的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨 基酸序列的ActRIIa-Fc融合蛋白在制備促進骨骼生長以及抑制骨骼吸 收的藥物中的應用。
51. 選自下面的組的多肽，用于促進骨骼生長、增加骨密度或增加 骨骼強度(a)包含與SEQ ID NO: 2具有至少90 %同 一性的氨基酸 序列的多肽；(b)包含與SEQ ID NO: 3具有至少90 %同 一性的氨基 酸序列的多肽；以及(c)包含選自SEQ ID NO: 2的至少50個連續(xù)氨 基酸的多肽。
52. Activin或ActRIIa拮抗劑多肽用于骨骼相關(guān)疾病的治療。
53. Activin或ActRIIa拮抗劑多肽用于預防骨骼相關(guān)疾病。
54. 包含與SEQ ID NO: 3的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨 基酸序列的ActRIIa-Fc融合蛋白用于促進骨骼生長以及抑制骨骼吸收。
全文摘要
在某些方面，本發(fā)明提供了用于促進骨骼生長以及增加骨密度的組合物和方法。
文檔編號C07K14/705GK101370511SQ200680051538
公開日2009年2月18日 申請日期2006年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月23日
發(fā)明者J·克諾普夫, J·西拉 申請人:阿塞勒隆制藥公司