專利名稱：用于獲得永生化抗體分泌細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于獲得分泌抗體的永生化(無限增殖化，
immortalized)細(xì)胞的方法，尤其是那些人類起源且分泌對(duì)醫(yī)學(xué)感興 趣抗原具有高度特異性的抗體。
背景技術(shù)：
抗體是由免疫系統(tǒng)產(chǎn)生以4氐抗感染并消除致病因子的天然蛋 白?？贵w通過結(jié)合蛋白抗原或非蛋白抗原并觸發(fā)用于消除抗原的防 御反應(yīng)而發(fā)揮它們的作用。
近年來，已經(jīng)4艮據(jù)針對(duì)人類和非人類分子的抗體的抗原結(jié)合特 征建立了 一種整體治療方法(即，纟皮動(dòng)免疫療法或^皮動(dòng)血清療法)。 凈皮動(dòng)免疫療法包括給予患者包含對(duì)致病分子(例如，毒素、蛋白、 病毒、寄生蟲或細(xì)胞)具有明確抗原特異性的治療性抗體的藥物組 合物，其中患者的免疫系統(tǒng)不能產(chǎn)生所述抗體，所給予量和/或特異 性可阻斷和/或消除該病原體(Dunman PM and Nesin M， 2003; Keller MA肌d Stiehm ER, 2000 )。
該方法在20世紀(jì)80年^早期已^皮成功引入臨床實(shí)踐中，而且 從那時(shí)起，治療性抗體的應(yīng)用已迅速擴(kuò)展了用于治療多種疾病的機(jī) 會(huì)，包4舌感染性疾病、免疫介導(dǎo)的疾病和癌癥，促成了治療性單克 隆抗體領(lǐng)域持續(xù)增長(zhǎng)(Chatenoud L， 2005; Pavlou A and Belsey M， 2005; Laffy E and Sodoyer R， 2005 )。
適合用于^皮動(dòng)免疫療法的治療性抗體是那些特異性和活性明 確的同源性抗體。對(duì)單克隆抗體(即，由單克隆抗體分泌細(xì)胞分泌 的抗體)，可非常準(zhǔn)確可靠地確定這些特性，而對(duì)于多克隆抗體(即， 由抗體分泌細(xì)胞的不同克隆體分泌的抗體復(fù)合物)則不然。
20世紀(jì)70年代以來，已經(jīng)開發(fā)了不同的技術(shù)用以分離、繁殖 和{呆持大扣匕細(xì)月包系，每一種細(xì)月包系均來源于分泌單克隆抗體(mAb ) 的單一單克隆細(xì)胞培養(yǎng)物，可利用恰當(dāng)?shù)姆治鰴z測(cè)所述抗體，以鑒
定那些具有期望性能的細(xì)胞培養(yǎng)物。
所有這些方法均共有的兩個(gè)重要技術(shù)問題是
a)如何在進(jìn)行任何體內(nèi)實(shí)驗(yàn)之前提供用于鑒定和表征該抗體 所需功能測(cè)定的足量抗體；
b )如^H呆i正該治療性抗體本身不凈皮患者免疫系統(tǒng)識(shí)別為抗原， 從而觸發(fā)該治療性抗體的消除和/或可能對(duì)患者有危險(xiǎn)的免疫炎性 反應(yīng)。
第一個(gè)問題在于，將天然抗體分泌細(xì)胞在培養(yǎng)基中繁殖和保持 足夠的時(shí)間以獲得該生物物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)比較困難。這種不便已經(jīng)通 過在培養(yǎng)基中永生化并j呆持原^U元體分泌細(xì)胞(其中編碼該抗體的 核酸最初已^皮生產(chǎn)和表達(dá))或者通過采用重組DNA 一支術(shù)乂人這些細(xì) 胞中分離編碼抗體的核酸并將其轉(zhuǎn)移入永生化細(xì)胞(在該細(xì)胞中， 該抗體可表達(dá)并^f呆持)中而得以解決。
過去，已經(jīng)通過將其與已永生化的細(xì)胞融合(形成更易于保持 的雜種細(xì)力包或雜交瘤)或者通過利用以Y吏細(xì)力包幾乎無限繁殖的方式 而改變?cè)贵w分泌細(xì)胞的細(xì)胞機(jī)制的試劑(如病毒)，在細(xì)胞培 養(yǎng)條件下使原代抗體分泌細(xì)胞永生化。體的基因(利用重組DNA技術(shù)進(jìn)行的"人源化"過程)而解決了 保證患者安全的問題。
總之，被動(dòng)免疫療法可對(duì)感染和其他病理4是供有效而快速的保 護(hù)。然而，每一種用來分離、篩選和生產(chǎn)與人類治療完全相容的單 克隆抗體的方法均具有不同類型的缺陷，如下文簡(jiǎn)要綜述的。
雜交瘤才支術(shù)，由Kohler和Milstein ( Kohler G and Milstein C， 1975 )首次描述，允許在融合于恰當(dāng)?shù)挠郎?xì)胞類型之后分離持 續(xù)生長(zhǎng)的抗體分泌細(xì)胞克隆。雜交瘤來源于人類抗體分泌細(xì)胞 (Olsson L and Kaplan H， 1980 ),但由于缺乏恰當(dāng)?shù)娜祟惞撬枇龌?類淋巴母細(xì)胞融合伴侶(配體)以及人類/人類同源雜交瘤和人類/ 鼠類異源雜交瘤不穩(wěn)定性，因此尚未證實(shí)產(chǎn)生人類雜交瘤的工藝是 靈活有效的。
通過將鼠類單克隆抗體的抗原結(jié)合區(qū)移植到人類抗體分子的 骨架上產(chǎn)生嵌合分子并通過用其他人類氨基酸取代特定鼠類殘基 以通過分子學(xué)方法降j氐抗原性，可實(shí)^見鼠類抗體的人源化(Hwang W and Foote J， 2005; Carter P, 2006 )。
目前已存在多種可應(yīng)用或供臨床試驗(yàn)使用的"人源化"抗體。 然而，這些抗體仍然包含5-10%鼠類(或非完全人類)蛋白序列并 且可能引發(fā)限制這些藥物治療效果的免疫反應(yīng)。另外，人源化過程 比較費(fèi)力且有時(shí)會(huì)引起抗體結(jié)合的改變。
因此，該方法大多數(shù)與起源于用相關(guān)抗原免疫接種的嚙齒類動(dòng) 物的抗體分泌細(xì)胞一起使用?？紤]到鼠類起源的序列可在人類體內(nèi) 具有免疫原性，因此所得mAb可引發(fā)有毒的人抗鼠反應(yīng)而^f吏抗體
依賴性細(xì)胞毒性受損和/或快速?gòu)纳眢w清除。此外，即使可變區(qū)相同
的抗體也可以呈現(xiàn)不同的功能和免疫原性能(Torres M et al., 2005 )。
用于生產(chǎn)完全人源化單克隆抗體的主要方法基于利用重組 DNA才支術(shù)而克隆和表達(dá)人類免疫球蛋白基因。
在第一種情況中，編碼抗體片段(包含抗原結(jié)合區(qū))的DNA 序列文庫(kù)可乂人人類組織擴(kuò)增并插入噬菌體中，乂人而實(shí)現(xiàn)在該嗟菌體 表面上"顯示，，抗原結(jié)合片段及隨后的篩選。從來源于患者、利用 噬菌體顯示技術(shù)克隆和篩選的大型抗體庫(kù)開始，已經(jīng)生產(chǎn)了針對(duì)人 類病原、體的單克隆4元體(Mancini N et al., 2004 )。
然而，如在大多數(shù)情形下采用的，這些文庫(kù)對(duì)于鑒定治療性抗 體可能不是有效的，因?yàn)榭贵w基因不是如同免疫系統(tǒng)在體內(nèi)那樣進(jìn) 行選擇的， 一方面，用于去除人類抗體庫(kù)中可能引發(fā)免疫反應(yīng)的序 列，而另一方面，用于選4奪由于親和力成熟而得到的抗體序列。因 此，有時(shí)需要復(fù)雜的體外親和力成熟和允許直接序列改變的其他技 術(shù)以？文進(jìn)來自這些文庫(kù)的4元體(HoetRetal., 2005 )。
在第二種情況下，表達(dá)人類抗體基因的轉(zhuǎn)基因小鼠可用感興趣 抗原免疫接種以產(chǎn)生表達(dá)完全人源性抗體的鼠類細(xì)胞(Kellermann S and Green L, 2002 )。這種方法比傳統(tǒng)的。藍(lán)菌體顯示法具有優(yōu)勢(shì)， 因?yàn)榭贵w在體內(nèi)進(jìn)行選擇并且可能包含頻率增高的高親和力抗體。 然而，在小鼠體內(nèi)環(huán)境中起作用的小鼠免疫系統(tǒng)可能不會(huì)生產(chǎn)具有 恰當(dāng)特異性的人類抗體而用于有效的治療用途。
因此，用于被動(dòng)免疫療法的理想治療性抗體是來源于人類免疫 細(xì)月包(其在人體內(nèi)成熟)的人類單克隆抗體。然而，這種抗體的選 擇和生產(chǎn)是一個(gè)復(fù)雜而耗時(shí)的過程，這是由于用于生產(chǎn)和分離在細(xì)
胞培養(yǎng)條件下分泌抗體的存活永生化人類細(xì)胞的傳統(tǒng)方法是無效的。
人們已經(jīng)深入綜述了人類B細(xì)胞的發(fā)育和增殖過程(形成其抗 原特異性和長(zhǎng)期體內(nèi)反應(yīng))以及利用從免疫系統(tǒng)獲得的細(xì)胞來研究 體夕卜過牙呈的4晉施(Banchereau J and Rousset, F， 1992; Crotty S and Ahmed R, 2004; Carsetti R， 2004; McHeyzer- Williams L and McHeyzer- Williams M， 2005 )。然而，甚至當(dāng)可才企測(cè)到相關(guān)結(jié)合或 中和活性時(shí)，現(xiàn)有技術(shù)仍不能生產(chǎn)穩(wěn)定的人類抗體分泌細(xì)胞系，因 此表達(dá)感興趣mAb的人類B細(xì)胞的分離受到抗體分泌阻礙。
')必
(例如，幼稚、已4妾種的、或多或少新近感染的和血清陽性的個(gè)體)
并從B細(xì)胞存在其中且發(fā)揮其活性的不同組織(例如，血液、扁桃 體、脾、淋巴結(jié))中分離(Viau M and Zouali M， 2005 )。
人類單克隆抗體的鑒定需要廣泛篩選永生化B細(xì)胞種群，其中 在細(xì)胞培養(yǎng)條件下每一個(gè)細(xì)胞均分泌足夠量的特異性單克隆抗體 用于其表;f正(Cole S et al.， 1984; James K and Bell G， 1987; Borrebaeck C, 1989 )。然而，用于抗體分泌細(xì)胞選4奪、活化和永生 化的技術(shù)仍然存在技術(shù)問題(抗體產(chǎn)率、永生化效率、某些同種型 的過度提呈、細(xì)胞穩(wěn)定性和生長(zhǎng))，導(dǎo)致用于篩選分析的細(xì)胞和所 分泌抗體的lt量不足。
考慮到從人類抗體分泌細(xì)胞獲得穩(wěn)定雜交瘤的困難， 一種已經(jīng) 廣泛用來生產(chǎn)和分離人類抗體分泌細(xì)胞的方法是用EB病毒(EBV) 永生化人類B纟田月包，已知EB病毒可用來誘導(dǎo)多克隆B細(xì)胞活化和 增殖(Sugimoto M et al" 2004; Bishop G and Busch LK, 2002 )。
抗體分泌細(xì)胞已經(jīng)通過利用不同來源的人類B纟田月包通過EBV
永生化而生成，這些來源例如利用標(biāo)記抗原預(yù)選的健康對(duì)象外周血
(Casali P et al. 1986)、淋巴結(jié)、脾或來自患者的外周血(Yamaguchi H et al" 1987; Posner M et al" 1991; Raff H et al" 1988; Steenbakkers P et al.， 1993; Steenbakkers P et al" 1994 )、扁沖兆體(Evans L et al" 1988 )或胸月莫液(Wallis R et al.， 1989 )。
然而，由于EBV感染的人類B細(xì)胞的4交4氐可轉(zhuǎn)化性、4交^f氐可 克隆性以及固有的不穩(wěn)、定性和異質(zhì)性，所以有用的抗體分泌型B細(xì) 胞經(jīng)常在該過程中丟失(Chan M et al., 1986; James K and Bell G, 1987 ),使得在EBV感染后必須采用進(jìn)一步的細(xì)胞融合步驟(Bron D et al" 1984; Yamaguchi H et al" 1987; Posner M et al" 1991 )。實(shí)際 上， 一些作者總結(jié)到，用于生產(chǎn)穩(wěn)定的人類IgG抗體分泌型人類單 克隆細(xì)胞培養(yǎng)物的最佳方法基于人類淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系的 鬲蟲合(Niedbala W and Stott D， 1998; Li J et al., 2006 )，盡管存在上文 論及的利用人類雜交瘤的技術(shù)困難。
針對(duì)改進(jìn)永生化過程，已經(jīng)進(jìn)行了各種嘗試，例如，通過在單 一過程中聯(lián)用不同的方法(用致癌病毒永生化，用癌基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化， 樣t電禹蟲^， 'J、》1—入類異〉原鬲蟲合)(US4997764; Steenbakkers P et al.， 1993; Dessain SK et al.， 2004 )。已通過在細(xì)胞培養(yǎng)中聯(lián)用各種處理 而將人類單克隆抗體從已活化且永生化的B細(xì)胞中分離(在抗原存 在或不存在的十青;兄下)(Borrebaeck C et al" 1988; Davenport C et al" 1992; Laroche-Traineau J et al" 1994; Morgenthaler N et al" 1996; NiedbalaWand Kurpisz M, 1993; Mulder A et al" 1993; WO 91/09115; Hur D et al" 2005; Traggiai E et al" 2004; Tsuchiyama L et al" 1997; WO 04/076677; WO 8薩642; WO 90/02795; WO 96/40252; WO 02/46233 )。
通常，關(guān)于分離并永生化抗體分泌細(xì)胞(尤其是人類起源的)
的方法，文獻(xiàn)未4是供對(duì)如祠、殳計(jì)獲纟尋最大的7JC生^^元體分泌細(xì)力包庫(kù)
的整個(gè)過程(即從生物樣品中純化表達(dá)抗體的細(xì)胞直至篩選在細(xì)胞 培養(yǎng)條件下分泌的抗體)的清晰理解。
很明顯，提供用于建立較優(yōu)化過程的方法將是有好處的，其中， 通過在細(xì)胞培養(yǎng)中采用特定手段和條件而以抗原依賴性方式改進(jìn)
抗體分泌細(xì)胞的選纟奪和存活H旦具有感興趣的特定同種型)，所分 泌抗體的高通量分析可在保存于細(xì)胞培養(yǎng)條件下的最大可能的永 生化抗體分泌細(xì)力包種群上進(jìn)行。這個(gè)過程還將加速利用分子學(xué)途徑 來克隆抗體基因的方法的進(jìn)程，因?yàn)榫哂懈信d趣同種型的抗體從其 克隆的B細(xì)胞種群可以對(duì)檢測(cè)分泌具有期望活性的抗體的細(xì)胞進(jìn) 行重復(fù)分析并以存活狀態(tài)保存用于將來的分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于以下^見察結(jié)果，即文獻(xiàn)中尚未以有效方式選4奪和組 合用于選纟奪、刺激和永生化抗體分泌細(xì)/l包的條件和方法(手^:， means )，以改進(jìn)培養(yǎng)條件下的細(xì)胞存活性及其對(duì)永生化試劑的敏感性。
事實(shí)上，人們驚奇地發(fā)現(xiàn)，這些條件和方法的特定組合不4又改 善了細(xì)力包永生化而且顯著增強(qiáng)了整個(gè)過程的通量和再現(xiàn)性，該整個(gè) 過#呈用來以不依賴抗原的方式生產(chǎn)大量分泌特定同種型抗體并且 可以存活狀態(tài)保存的永生化細(xì)胞種群。
實(shí)際上，本發(fā)明的方法提供了可作為抗體分泌型、同種型特異 性細(xì)胞文庫(kù)使用和保持的多克隆細(xì)胞種群。利用該方法，在細(xì)胞培 養(yǎng)條件下分泌具有不同功能和/或結(jié)合活性的抗體的特定寡克隆或 單克隆細(xì)胞種群可在任何希望的時(shí)刻檢測(cè)和分離(圖1 )。
本發(fā)明提供了一種用于永生化可分泌一種或多種特定同種型
抗體的細(xì)力包種群的方法，包4舌以下步-驟
a )以不依賴抗原的方式且基于至少 一種細(xì)月包表面標(biāo)記物的表 達(dá)而從一種或多種生物樣品中選擇分泌抗體的細(xì)胞種群；
b )在細(xì)胞培養(yǎng)條件下用至少 一種刺激劑刺激所選定的細(xì)胞種
群；
c ) 乂人細(xì)胞培養(yǎng)物中去除刺激劑；
d) 從細(xì)胞培養(yǎng)物中選擇表達(dá)該特定同種型抗體的受刺激細(xì)胞 種群；
e) 使所選定且已刺激的細(xì)胞種群在細(xì)胞培養(yǎng)條件下暴露于永 生化試劑；
f) 從細(xì)胞培養(yǎng)物中去除永生化試劑；其中永生化試劑是病毒永 生化試劑。
另外，在步-驟f)之后可以進(jìn)4亍以下步-驟
g) 在細(xì)胞培養(yǎng)條件下保持從細(xì)胞培養(yǎng)物獲得的細(xì)胞種群；
h )確定細(xì)胞培養(yǎng)物中分泌特定同種型抗體的細(xì)胞種群的數(shù)量、 存活性和/或增殖活性。
該示意過程可通過采用額外的條件和手^殳進(jìn)^于整合和^修改，涉 及到
-可從其分離細(xì)胞的供體或生物樣品的鑒定；
-用于選"t奪、刺激和/或永生化抗體分泌細(xì)胞的特定手段；
-在細(xì)胞培養(yǎng)條件下允許永生化抗體分泌細(xì)胞種群保持、生長(zhǎng)和 增殖的細(xì)胞培養(yǎng)條件；-用于確定細(xì)胞培養(yǎng)物中分泌特定同種型抗體的細(xì)胞種群的數(shù)
量、存活和/或增殖活性的方法；
-抗體的期望性能以及經(jīng)選才奪用于篩選永生化抗體分泌細(xì)胞的 相關(guān)測(cè)定。
在獲得可在細(xì)胞培養(yǎng)條件下作為永生化細(xì)胞種群保持的細(xì)胞 的最大多樣性和數(shù)量的范圍內(nèi)，本發(fā)明的方法提供了用于優(yōu)化抗體 分泌細(xì)胞的選擇、刺激、永生化和克隆的手段與條件。事實(shí)上，所 得細(xì)胞種群可看作是分泌抗體并且可在其根據(jù)本發(fā)明方法生產(chǎn)后 立即4姿受期望的篩選分析或者部分或全部一皮冷凍并在以后的一種 或多種篩選分析中使用的永生化細(xì)胞文庫(kù)。
通過本發(fā)明方法獲得的細(xì)胞種群可分成多個(gè)在細(xì)胞培養(yǎng)條件 下分泌抗體，尤其是分泌具有期望抗原特異性和/或生物學(xué)活性的單 克隆抗體的寡克隆或單克隆細(xì)胞種群。事實(shí)上，這些細(xì)胞培養(yǎng)物的
的培養(yǎng)物。該抗原結(jié)合特異性和/或生物學(xué)活性可針對(duì)任何感興趣的 人類、哺乳動(dòng)物、病毒、細(xì)菌、植物、寄生蟲、有才幾或無才幾抗原。
這些細(xì)胞種群的成功分離取決于這些纟田月包的生長(zhǎng)、用來篩選細(xì) 胞種群的分析方法以及起始材料(通常為來自 一個(gè)供體或一組供體 的外周血)中抗原特異性B細(xì)胞的頻度。事實(shí)上，永生化抗體分泌 細(xì)月包應(yīng)當(dāng)在允i午最大細(xì)月包增殖和免疫J求蛋白分泌以及直4妻l吏用細(xì) 胞培養(yǎng)物上清液來檢測(cè)期望活性的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。如果需要，細(xì) 胞種群可以進(jìn)一步細(xì)分用于篩選表現(xiàn)出期望抗原特異性和/或生物 學(xué)活性的細(xì)胞池，直至分離出一種或多種細(xì)胞培養(yǎng)物，其中每一種 均在該細(xì)胞上清液中分泌具有期望抗原特異性和/或生物學(xué)活性的 單克隆抗體。
因jt匕,通過才廣i曽纟田月包i咅養(yǎng)4勿以及,人"^亥纟田月包igr " i、 化單克隆抗體可生產(chǎn)具有期望抗原特異性和/或生物學(xué)活性的單克 隆抗體。另外，隨后可分離編碼單克隆抗體的DNA并用于該^t體 在宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是通過本發(fā)明方法獲得且在細(xì)胞培養(yǎng)條 件下保持的永生化抗體分泌細(xì)力包種群(尤其是抗體分泌細(xì)胞的多克 隆、寡克隆和單克隆細(xì)胞培養(yǎng)物)，其中本發(fā)明方法可用于鑒定和 生產(chǎn)具有期望抗原特異性和/或生物學(xué)活性的單克隆抗體抗體分泌 抗體分泌。這些抗體可直接從細(xì)胞培養(yǎng)物純化或者利用編碼抗體的 DNA序列作為重組蛋白生產(chǎn)并/人特定細(xì)月包i咅養(yǎng)物分離。另外，包 含編碼一種或多種特定同種型抗體序列的DNA序列的DNA文庫(kù)可 利用從本發(fā)明的細(xì)胞種群尤其是從已證實(shí)分泌具有感興趣的結(jié)合 和/或生物學(xué)活性中任一種的抗體的細(xì)胞種群分離的核酸進(jìn)行制備。
本發(fā)明的其4也目的涉及通過本發(fā)明方法乂人抗體分泌細(xì)力包獲得 的細(xì)胞種群、細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞培養(yǎng)物上清液以及DNA文庫(kù)用于 鑒定和生產(chǎn)單克隆抗體。這些通過本發(fā)明的方法獲得的產(chǎn)品也可包 括在用于鑒定和生產(chǎn)具有期望抗原結(jié)合特異性和/或生物學(xué)活性的 單克隆抗體的試劑盒中，或者用于確定個(gè)體(或個(gè)體種群)對(duì)(自 體)同源或異源抗原、病毒、細(xì)菌細(xì)胞、毒素、寄生蟲細(xì)胞或疫苗 的同種型特異性免疫反應(yīng)的特征。
通過本發(fā)明方法獲得細(xì)胞種群和細(xì)胞培養(yǎng)物可包括在用于生 產(chǎn)在細(xì)月包培養(yǎng)物上清液中分泌單克隆抗體且可在純化單克隆抗體 的范圍內(nèi)擴(kuò)增的細(xì)月包;咅養(yǎng)物的方法中。
實(shí)施例提供的手段與條件可用于在生產(chǎn)EBV永生化的人類B 細(xì)胞種群的范圍內(nèi)使用本發(fā)明的方法而從相同生物樣品獲得表達(dá) 抗原特異或病毒特異的人類IgG抗體的單克隆或寡克隆細(xì)胞種群。


圖1: 一個(gè)包括用于獲得永生化抗體分泌細(xì)胞的本發(fā)明方法的 用于分離和表達(dá)單克隆抗體的過程的示意圖。
圖2:對(duì)IL-2 ( 1000 U/ml)單獨(dú)存在或與CpG2006、 LPS、 SAC 或CD40L共同(組合)存在的情況下培養(yǎng)的原代B細(xì)胞增殖的影 響。通過磁性分離將人類CD22陽性B纟田月包從5個(gè)供體合并(pool) 的PBMC中純化。B細(xì)胞在指定濃度化合物存在的情況下培養(yǎng)4天。 僅在最后一天將3H-胸苷加入培養(yǎng)基中，將該細(xì)胞與標(biāo)記的核苷酸 一起孵育8-12小時(shí)。在所有實(shí)驗(yàn)中提供用僅培養(yǎng)基、含IL-2的培 養(yǎng)基或含CpG2006的培養(yǎng)基培養(yǎng)的樣品。如所指出的，檢測(cè)IL-2 與刺纟敫劑LPS (A) /SAC (B)和CD40L (C)組合物的效應(yīng)。以 三個(gè)重復(fù)孔的平均值報(bào)告每分鐘計(jì)數(shù)的值(cpm)。 (A)、 (B)和(C) 之間絕對(duì)cpm值的差異是由于每一個(gè)實(shí)驗(yàn)使用的3&胸苷批次的特 定活性差異。
圖3: CpG2006對(duì)人類CD22陽性B細(xì)胞增殖的劑量依賴性效 應(yīng)。人類CD22陽性B細(xì)胞通過磁性分離從合并自5個(gè)供體的PBMC 中純化獲得。B細(xì)胞用指定濃度的CpG2006和IL-2 ( 1000 U/ml) 培養(yǎng)2天。存活細(xì)胞的數(shù)量通過臺(tái)盼藍(lán)染料排除法在顯孩"竟下確定。 平行地，將來自每一種指定培養(yǎng)條件的一萬個(gè)情形(細(xì)胞)通過流 式細(xì)胞4義(B)進(jìn)4亍分析， 一企測(cè)存活細(xì)胞(黑色條)和母細(xì)月包(即 具有較高前向和正交散射的細(xì)胞，白色條)的百分?jǐn)?shù)。
圖4:對(duì)通過》茲性分離乂人5個(gè)供體合并的PBMC中純化的CD22 或CD 19陽性B細(xì)胞的存活性和母細(xì)胞形成進(jìn)行基于FACS的分析。 培養(yǎng)4天之前(A )或之后(B )聯(lián)用CpG2006 ( 1 fig/ml )和IL-2 (100U/ml) (B)進(jìn)行該分析。在每個(gè)圖中，通過正向散射(水平 軸)和正交散射(垂直軸)分析10,000個(gè)細(xì)胞，分別作為大小和粒
度的測(cè)量值。在Rl區(qū)對(duì)存活B細(xì)胞設(shè)定門控。在R1外部，具有 較低正向散射的死細(xì)胞沿垂直軸排列。存在母細(xì)胞分化的細(xì)胞具有 4交高的正向和正交散射。
圖5:用刺激劑(CpG2006與IL-2組合物)刺激的B細(xì)胞中細(xì) 月包增殖和細(xì)胞存活的動(dòng)力學(xué)。人類CD22陽性B細(xì)胞通過石茲性分離 從5個(gè)供體合并的PBMC中選擇。在CpG2006 ( 1 pg/ml )和IL-2 (1000/1 )存在的情況下，培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到指定時(shí)間點(diǎn)。增殖通過311-胸苦摻入(incorporation)來評(píng)估。
圖6: CpG2006與IL-2組合物對(duì)EBV-介導(dǎo)的人類B細(xì)胞永生 化的影響。(A ) CD22陽性B細(xì)胞通過石茲珠選擇從5個(gè)供體池中純 化并在《又培養(yǎng)基(黑色條)或含CpG2006 ( 1 pg/ml)和IL-2 ( 1000 /1)的培養(yǎng)基(白色條)中培養(yǎng)2天。然后清洗細(xì)胞并通過細(xì)胞分 選排除IgM陽性細(xì)月包。CD22陽性、IgM陰性細(xì)月包通過在含EBV的 上清液/細(xì)胞培養(yǎng)基(50% V/V )中過夜培養(yǎng)而永生化。移去含EBV 的細(xì)胞培養(yǎng)基并將細(xì)胞在含IL-2 ( 1000 U/ml)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以 受輻照同種PBMC作為飼養(yǎng)層，培養(yǎng)達(dá)到指定的天凄t。 (B)CD22 陽性、IgM陰性B細(xì)胞通過》茲玉朱選擇從5個(gè)供體的混合物中純化并 通過用含EBV的培養(yǎng)基(30% V/V )培養(yǎng)而永生化，其中在CpG2006 (1 fig/ml)和IL-2 ( 1000 /1)存在(白色條)或不存在(黑色條) 的情況下，利用受輻照同種PBMC作為飼養(yǎng)層。在(A)和(B) 中，存活淋巴母細(xì)胞(大細(xì)胞)的數(shù)量通過臺(tái)盼藍(lán)染料排除法在顯 《效鏡下進(jìn)行評(píng)價(jià)。
圖7:用CpG2006和IL-2預(yù)刺激2天后、永生化后和培養(yǎng)10 天后，CD22卩曰性、IgM陰性B細(xì)胞的表型、EBV (在不存在EBV 和CpG2006的情況下，含IL-2和受輻照同種PBMC飼養(yǎng)層)。(A ) 通過FACS點(diǎn)-線分析對(duì)一萬個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析，其中垂直軸表示IgM 焚光水平而水平軸表示正向散射(作為細(xì)胞大小的測(cè)量值)。存活
母細(xì)胞(具有高水平的正向散射)都包含在右側(cè)象限內(nèi)。IgM陰性
細(xì)胞在下邊兩個(gè)象限中表示，其中不表達(dá)IgM抗體的存活母細(xì)胞 (且大多數(shù)表達(dá)IgG抗體)在右下象限中示出。(B)利用EBV永 生化、CD22卩曰性、IgM陰性B細(xì)胞(如根據(jù)(A)刺激和選擇的) 上清液進(jìn)行的免疫擴(kuò)散分析。測(cè)定前將用過的培養(yǎng)基濃縮5倍。該 測(cè)定利用同種型特異抗體來評(píng)價(jià)細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中所分泌的總 人類免疫球蛋白(ahlg )、人類IgM ( cchlgM )和人類IgG ( cchlgG )。
圖8: 4安照BASIC(基礎(chǔ))、COMBINED(組合)和SEQUENTIAL (依次)方法所獲得多克隆的細(xì)胞種群的比較。(A)按照BASIC、 COMBINED和SEQUENTIAL方法用于制備多克隆細(xì)月包種群的步 驟概述。(B)根據(jù)細(xì)胞總數(shù)(通過流式細(xì)胞儀測(cè)定)和存活細(xì)胞的 比例(通過石典化丙4t排除法和流式細(xì)胞儀測(cè)定，如在材料和方法中 描述的)比較這些種群。
圖9: CD22陽寸生、IgG卩日'l"生B細(xì)月包利用BASIC、 COMBINED 和SEQUENTIAL方案(如在圖8和實(shí)施例2中描述的)進(jìn)行制備。 IO天培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，通過流式細(xì)胞儀(利用碘化丙錠排除法；左圖) 分析所得細(xì)胞種群的CD23表達(dá)，尤其是那些在R2下形成門控的 細(xì)胞(利用直接免疫熒光；右圖)。在這些細(xì)胞(基本上是存活淋 巴母細(xì)胞)中CD23的表達(dá)水平在水平軸上以熒光的log值表示(高， 中)，表達(dá)特定量CD23的細(xì)胞相對(duì)數(shù)量則在垂直軸上示出。利用標(biāo) i己的、同種型匹配的陰性對(duì)照抗體，可確定作為陰性(neg)考慮 的熒光水平。
圖10:利用BASIC、 COMBINED和SEQUENTIAL方法制備 的細(xì)胞培養(yǎng)物中IgG分泌的分析。培養(yǎng)10天后收集無細(xì)胞上清液 (參見圖8A)，并利用總?cè)祟怚gGELISA商品化試劑盒在系列稀釋 的上清液中測(cè)量IgG濃度。每個(gè)上清液中的IgG絕對(duì)量通過與 ELISA試劑盒制造商提供的純化人類IgG標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較而測(cè)
得，其中線性范圍在 150 pg/ml達(dá)到平臺(tái)。來自連續(xù)過程上清液的 所有稀釋液均得到超出標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍的測(cè)量結(jié)果，并且可4叉/人 這些測(cè)量結(jié)果外推，總lgG的濃度超過200 fig/ml。因此，將結(jié)果 用混亂的線繪出。
圖11:用于鑒定可分泌結(jié)合和/或中和人類巨細(xì)月包病毒的IgG 抗體的人類B細(xì)胞的通用過程示意圖，包括本發(fā)明的方法，用于永 生化抗體分泌細(xì)月包如人類B纟田月包。
圖12:利用圖11中改進(jìn)的過程獲得的EBV永生化的、IgG分 泌型人類B細(xì)胞培養(yǎng)物的鑒定，用于分離具有不同活性的IgG抗體。 (A )來自CMV血清陽性供體的EBV永生化B細(xì)月包培養(yǎng)物的上清 液與指定的人類巨細(xì)胞病毒(CMV)的分離抹一起孵育，然后加入 指定的人類細(xì)胞中。AD169是人類CMV的實(shí)驗(yàn)用菌林。VR1814 是人類CMV的臨床分離林。HELF是人胚肺成纖維細(xì)胞，而HUVEC 是人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。所選的包含細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的人類IgG 抗體的中和活性以CMV感染活性的降j氐表示U戈表至少兩種測(cè) 定)。通過檢測(cè)CMV早期速發(fā)抗原(IEA)的免疫組織學(xué)染色而獲 得數(shù)據(jù)。陰性對(duì)照僅含細(xì)胞培養(yǎng)基。(B)合并來自EBV永生化人 類B細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液(5個(gè)上清液/池)，并在ELISA中檢測(cè)結(jié) 合人類HSP60蛋白的人類IgG抗體。數(shù)據(jù)表示平行孔的平均值。線 表示參照值(是僅利用細(xì)胞培養(yǎng)基(RPMI-1640和10% FCS )所觀 察到水平的3倍)。陽性對(duì)照樣品(針對(duì)HSP60的商品化小鼠抗人 類抗體，在指定濃度下)和陰性對(duì)照樣品(mlgG,非特異性小鼠 IgG)用抗小鼠IgG顯色。所有其他對(duì)照樣品(兩個(gè)僅含培養(yǎng)基的 陰性對(duì)照或不相關(guān)的人類IgG、 hlgG)以及含細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的 樣品用商品化抗人類IgG抗體顯色。
圖13: 二接照本發(fā)明的方法制備永生化抗體分泌細(xì)力包種群的步驟 概述，從表現(xiàn)出CMV中和活性的人類供體的血液開始。永生化的
寡克隆和單克隆細(xì)力包種群已經(jīng)4艮據(jù)在細(xì)月包培養(yǎng)物上清液中鑒定的
抗體性能加以鑒定分泌結(jié)合總CMV蛋白提取物的抗體(如利用 試劑盒，BEIA-CMV ELISA測(cè)定的)、結(jié)合特定抗原的抗體(利用 CMV蛋白gB和gH的片段測(cè)定的)和/或在體外分析中中和CMV 感染的#元體。
圖14:已經(jīng)利用圖13中改進(jìn)的過程獲得的EBV永生化、IgG 分泌型人類B細(xì)胞培養(yǎng)物的鑒定，用于分離結(jié)合CMV蛋白的IgG 抗體。來自血清中具有中和活性的CMV供體的CD22陽性、IgG 陽性B細(xì)胞利用如在實(shí)施例2中描述的SEQUENTIAL方案制備。 收集利用所得種群生成的細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)10天(CMV5批量培養(yǎng)) 的上清液并保存于4°C，并用在材料和方法中描述的BEIA-CMV ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。然后，將該細(xì)胞培養(yǎng)物以20個(gè)細(xì)胞/孔分 到96 3L才反中并在受輻照同種PBMC飼養(yǎng)層、CpG2006和IL-2存在 的情況下培養(yǎng)4周。從含活躍增殖的細(xì)胞種群的孔制備的無細(xì)胞上 清液利用BEIA-CMV ELISA試劑盒進(jìn)行篩選。陽性對(duì)照(校準(zhǔn)物2， 10AU/ml)包含于ELISA試劑盒中并按照制造商說明書使用。陰性 對(duì)照為僅含培養(yǎng)基(含L-谷酰胺、NEAE、 10%FCS、 CpG2006和 IL-2的IMDM )。圖中示出了 20個(gè)代表性細(xì)胞培養(yǎng)物的結(jié)果。水平 線示出了用于該測(cè)定的2 4咅截?cái)?lt;直。
圖15:孔9G8中細(xì)胞所分泌抗體的重鏈(A; VH; SEQ ID NO:3 ) 和輕鏈(B; VL; SEQ ID NO: 8)中可變區(qū)的蛋白序列(參見圖14)。 重鏈的CDR序列(HCDR1, SEQ ID NO: 4; HDCR2, SEQ ID NO: 5; HCDR3, SEQ ID NO: 6 )和輕鏈的CDR序列(LCDRl， SEQ ID NO: 9; LDCR2, SEQ ID NO: 10; LCDR3, SEQ ID NO: 11 )基于由IMGT ( Giudicelli V. et al., 2004; available at http: 〃im gt. c ines. fr/IMGT vq uest/share/textes/i ndex. htm 1)才是^6勺t匕專交 已知抗體序列的不同方法如V-Quest力o以預(yù)測(cè)并強(qiáng)調(diào)。來自該細(xì)胞
i告養(yǎng)物的 一 萬個(gè)細(xì)"包用于利用標(biāo)準(zhǔn)方案確定兩個(gè)序列。沉淀細(xì)"包并
4是耳又mRNA以1更利用簡(jiǎn)并VH和VL引物通過5， RACE擴(kuò)增生成 cDNA,然后將該序列克隆入用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞的質(zhì)粒中。編碼重 鏈(SEQIDNO:2)和輕鏈(SEQ ID NO:7 )中可變區(qū)的共有DNA 序列利用至少4個(gè)獨(dú)立細(xì)菌細(xì)胞克隆體的序列而確定。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明4是供用于改善效力的方法，通過該方法可生產(chǎn)永生化抗 體分泌細(xì)月包并才艮據(jù)所分泌抗體的抗原特異性和/或生物學(xué)活性而加 以'滯選。
特別地，實(shí)施例示出了在細(xì)胞培養(yǎng)條件下如何通過對(duì)從供體分 離的原代細(xì)胞恰當(dāng)聯(lián)用手段與條件而改善人類B細(xì)胞(其利用EB 病毒而7lc生4匕)的增殖活性、存活和4元體分泌。
已發(fā)現(xiàn)，選擇與細(xì)胞選擇和刺激相關(guān)的特定手段與條件對(duì)于獲 得存活的增殖性抗體分泌細(xì)胞具有意外而重要的增強(qiáng)作用，有助于 得到密度和數(shù)量4交大的永生化抗體分泌細(xì)胞，其隨后可直接利用細(xì) 胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行篩選。
實(shí)施例還示出了可根據(jù)一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)記物對(duì)來自生 物樣品的細(xì)胞進(jìn)行初步選擇，隨后是刺激階段，其中細(xì)胞暴露于一 種或多種刺激劑。然而，在確定的濃度比下，刺激劑只有施予特別 選擇的細(xì)胞種群達(dá)恰當(dāng)?shù)臅r(shí)期，才能發(fā)揮其最大活性，而不影響細(xì) 月包的存活和增殖。此外，在刺;敫步和7夂生4匕步之間應(yīng)形成明顯的時(shí) 間和物理區(qū)別，如果將細(xì)胞同時(shí)暴露于刺激劑和永生化試劑則負(fù)向 作用明顯。
特別地，實(shí)施例示出了如何將這些因素結(jié)合起來以構(gòu)建對(duì)人
IgM陰性(或IgG陽性)B細(xì)胞的EBV永生化有效且可重復(fù)的方 法，隨后B細(xì)力包可4艮據(jù)其所生產(chǎn)抗體的結(jié)合和/或功能特性(例如 中和人類細(xì)胞的巨細(xì)胞病毒感染)利用其細(xì)胞培養(yǎng)物上清液而克隆 和篩選，最后，該人類B細(xì)月包可被分離并克隆用于進(jìn)一步的表征和 抗體(以重組蛋白形式)生成。
在僅涉及抗原特異性細(xì)胞種群(其已提前在體外免疫接種)的 文獻(xiàn)中，已經(jīng)纟皮露了關(guān)于細(xì)胞選4奪和活化的獨(dú)立步驟的連續(xù)方法， 除了(或代替)病毒永生化試劑外常常利用與骨髓瘤細(xì)胞的融合。
因此，初始B細(xì)胞種群可利用細(xì)胞毒性試劑排除特定細(xì)胞型然 后暴露于結(jié)合有細(xì)月包因子和生長(zhǎng)因子的抗原(Borrebaeck C et al.， 1988; Davenport C et al.， 1992; Laroche-Trai職u J et al" 1994 )或者暴 露于抗原特異性淘選程序，然后于飼養(yǎng)細(xì)胞層上進(jìn)行擴(kuò)增后加以篩 選(Steenbakkers P et al.， 1993; Steenbakkers P et al" 1994 )。
現(xiàn)在抗體分泌已可利用標(biāo)準(zhǔn)EBV 7JC生化或者聯(lián)用EBV和癌基 因介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(US4997764)、 EBV永生化或非特異性細(xì)胞活化后 與骨髓瘤細(xì)胞系融合(NiedbalaWand Stott D, 1998; WO 02/46233 )、 EBV永生化后選擇表達(dá)具有特定同種型的抗體的細(xì)胞 (Morgenthaler N et al.， 1996 )或者細(xì)胞選4奪后在B細(xì)月包活化劑存在 的i青況下采用EBV 7Jc生孑匕(WO 91/09115; Hur D et al.， 2005; Traggiai E et al" 2004; Tsuchiyama L et al" 1997; WO 04/076677 )來 永生化抗體分泌細(xì)胞種群。
然而，這些文獻(xiàn)中沒有 一個(gè)l是供了連結(jié)永生化之前獲得細(xì)胞選 擇和活化的手段和條件與提供(尤其是)多克隆細(xì)胞種群的病毒永 生化過浮呈效力的有效過禾呈，該多克隆細(xì)月包種群可廣泛且直4妾用于鑒
定表達(dá)具有期望同種型和生物學(xué)活性的抗體的寡克隆或單克隆細(xì) 胞種群。
本發(fā)明的主要目的在于一種用于永生化分泌一種或多種特定
同種型抗體的細(xì)胞種群的方法，包括以下步驟
a)以不依賴抗原的方式且基于至少 一種細(xì)胞表面標(biāo)記物的表 達(dá)而從一種或多種生物樣品選4奪分泌抗體的細(xì)胞種群；
b )在細(xì)胞培養(yǎng)條件下用至少 一種刺激劑刺激所選定的細(xì)胞種
群；
c )從細(xì)月包培養(yǎng)物中去除刺激劑；
d )從細(xì)胞培養(yǎng)物選4奪表達(dá)特定同種型抗體的受刺激細(xì)胞種群；
e) 使所選定且已刺激的細(xì)胞種群在細(xì)胞培養(yǎng)條件下暴露于永 生化試劑；
f) 乂人細(xì)胞i咅養(yǎng)物中去除永生化試劑； 其中該永生化試劑是病毒永生化試劑。
該方法可與 一 系列通過采用該方法獲得的細(xì)力包種群分析及應(yīng) 用相關(guān)的其j也步駛《加以整合(圖1)。特別i也，以下兩個(gè)步-驟應(yīng)在步 驟f)之后進(jìn)行，因?yàn)樗鼈儗?duì)于建立包含該細(xì)胞種群的細(xì)胞培養(yǎng)物 非常重要
h )確定細(xì)胞培養(yǎng)物中分泌特定同種型抗體的細(xì)胞種群的數(shù)量、 存活和/或增殖活性。
正文和附圖4是供了關(guān)于如何應(yīng)用本發(fā)明的方法的進(jìn)一步細(xì)節(jié)， 尤其是應(yīng)用于從外周血樣品分離的人類B纟田月包，從而提供分泌感興 趣抗體的單克隆細(xì)力包i條養(yǎng)物。
事實(shí)上， 一方面，本發(fā)明方法允"i午獲得以不依賴抗原的方式有 效表現(xiàn)出從個(gè)體取出并通過病毒永生化捕獲的原代細(xì)胞中所表達(dá) 的期望同種型抗體庫(kù)異質(zhì)性的細(xì)胞種群。
另一方面，通過本發(fā)明方法獲得的存活更加均一且高度增殖的 永生化抗體分泌細(xì)胞種群允許借助于可在細(xì)胞培養(yǎng)條件下(例如細(xì) 胞種群、抗體含量高的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液)或作為其他分子實(shí)體(例 如，利用從寡克隆細(xì)胞種群提取的核酸制備的DNA文庫(kù))獲得的 不同生物學(xué)產(chǎn)物對(duì)這種抗體庫(kù)進(jìn)4亍更加深入的分牙斤。
此外，本發(fā)明方法提供可以獲得足夠抗體以及可分泌在細(xì)月包培 養(yǎng)物中直接表征的抗體的永生化細(xì)胞的可能性，其中該細(xì)胞培養(yǎng)物 通過劃分經(jīng)統(tǒng)計(jì)包含20個(gè)或更少細(xì)月包的池中的多克隆永生4匕抗體 分泌細(xì)胞(新鮮制備的或提前制備的、冷凍的以及解凍的)種群而 生成，并在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)。克隆步驟較少(理論上僅一個(gè)，而非 常頭見的兩個(gè)或多個(gè)步-驟)縮短了用于鑒定分泌感興趣抗體的永生4匕 細(xì)月包的時(shí)間，減少了其在亞克隆步驟中丟失的風(fēng)險(xiǎn)并加速了在不同 體內(nèi)或體外分析中抗體的表征過程。這對(duì)于可較快速和成功實(shí)現(xiàn)特 異于治療靶標(biāo)的稀少抗體的分離尤其重要。
因此，本發(fā)明方法可加以修改并整合于較復(fù)雜方法中，用于鑒 定和生成正文(特別參見實(shí)施例3)和附圖(特別參見圖1、 11和 13)中總結(jié)的特定同種型單克隆抗體。
接下來的段落中提供適用于本發(fā)明方法的手段與條件的定義 和進(jìn)一步的細(xì)節(jié)并描述該方法和可利用該方法獲得的產(chǎn)品(細(xì)胞種 群、細(xì)月包i咅養(yǎng)物、細(xì)月包i咅養(yǎng)物上清'液和抗體，特別是人類單克隆抗 體)的可能用途。
術(shù)語細(xì)胞"種群"通常是指利用相同標(biāo)準(zhǔn)分離或利用相同方法 生產(chǎn)的任何細(xì)胞群(本發(fā)明中為抗體分泌細(xì)胞)。例如，細(xì)胞種群 是那些從選擇步驟(例如細(xì)胞分選)、處理(例如利用刺激劑或病 毒永生化試劑)或者將細(xì)月包培養(yǎng)物或細(xì)月包種群劃分為經(jīng)統(tǒng)計(jì)含相同 細(xì)胞量的較小細(xì)胞池(例如，亞克隆細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)或制備小瓶永生 化細(xì)胞以長(zhǎng)期冷凍保存時(shí))而得到的種群。細(xì)胞種群應(yīng)當(dāng)是存活的 但并非必需發(fā)揮特定的生物學(xué)活性(例如，生長(zhǎng)、增殖或分泌抗體)， 如在細(xì)胞培養(yǎng)條件下所表現(xiàn)的情形。
術(shù)語細(xì)胞"培養(yǎng)物"是指在使細(xì)胞表現(xiàn)出生物學(xué)活性(例如， 生長(zhǎng)、增殖或分泌抗體)和/或用特定化合物(例如，刺激劑或病毒 永生化試劑)處理所述細(xì)胞的范圍內(nèi)，保存于容器(例如培養(yǎng)板的 孔、皮氏培養(yǎng)皿、燒瓶、玻璃瓶)中的細(xì)胞種群。這些實(shí)驗(yàn)條件(即， 細(xì)胞培養(yǎng)條件)包括采用培養(yǎng)箱，其保持在經(jīng)恰當(dāng)選擇而適于細(xì)胞 生長(zhǎng)和增殖的溫度和大氣(與細(xì)胞培養(yǎng)基聯(lián)合運(yùn)用)中。
因此，細(xì)胞培養(yǎng)物由細(xì)胞種群以及細(xì)胞培養(yǎng)基(含血清、生長(zhǎng) 因子、細(xì)胞因子、營(yíng)養(yǎng)素等)構(gòu)成，如果是抗體分泌細(xì)胞，則還包 括培養(yǎng)用于支持所述細(xì)胞種群生長(zhǎng)和增殖的其他細(xì)胞(所謂的"飼
養(yǎng)細(xì)胞")。幾天或幾周之后，細(xì)胞培養(yǎng)基的組成發(fā)生了改變，不僅 由于細(xì)胞消耗還由于細(xì)胞分泌或當(dāng)其進(jìn)入凋亡或死亡時(shí)簡(jiǎn)單釋放 的各種分子。因此，定期用新培養(yǎng)基替換細(xì)胞培養(yǎng)基，或者可取出 部分以分析該細(xì)胞培養(yǎng)基的含量。用過的培養(yǎng)基(文獻(xiàn)中定義為細(xì)
月包i咅養(yǎng)物的"上清-液"，以及"廢(spent)"或"舊(conditioned)" 細(xì)胞培養(yǎng)基)可在固定時(shí)間點(diǎn)收集，以確定例如細(xì)胞培養(yǎng)條件下細(xì) 胞種群所分泌抗體的含量和活性。應(yīng)該采用該信息以及關(guān)于這些細(xì) 胞存活和增殖的數(shù)據(jù)來確定細(xì)l包培養(yǎng)物的狀態(tài)和可能用途(例如， 在篩選分析中用于分離mRNA，用于純化單克隆抗體，用于收集待 冷凍的細(xì)力包等)。
術(shù)語"多克隆"是指表達(dá)大量不同抗體(例如，103、 104、 105
或更多)的細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞種群，它們中的每一種均由該培養(yǎng)物 或種群內(nèi)的單個(gè)細(xì)胞或一群細(xì)胞表達(dá)。特別地，它適用于通過本發(fā) 明方法獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞種群(由于其從生物樣品中存在的 細(xì)胞以不依賴抗原的方式而生成)，其在培養(yǎng)物或種群中未加以劃
分，或者至多在最初含50個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞(例如200、 500、 1000 或更多細(xì)胞)的培養(yǎng)物或種群中加以劃分，如可經(jīng)統(tǒng)計(jì)根據(jù)原始多 克隆培養(yǎng)物或種群的稀釋度而確定的。
術(shù)語"寡克隆"是指由細(xì)胞培養(yǎng)物或種群分成最初包含少于50 個(gè)細(xì)胞(40、 20、 10、 5、 1或少于1個(gè)細(xì)月包)的培養(yǎng)物或種群而獲 得的細(xì)胞培養(yǎng)物或種群，如經(jīng)統(tǒng)計(jì)一艮據(jù)原始培養(yǎng)物或種群的稀釋度 而確定的。
由細(xì)月包培養(yǎng)物或種群分成最初包含20個(gè)或更少細(xì)胞的培養(yǎng)物 或種群而得到的寡克隆細(xì)胞培養(yǎng)物或種群非常重要。事實(shí)上，如果 在所得細(xì)胞培養(yǎng)物中檢測(cè)到單一或很大程度上顯著的生物學(xué)特征 (例如抗體，其可利用生物學(xué)分析鑒定為細(xì)月包培養(yǎng)物上清液中分泌 的蛋白或利用RT-PCR鑒定為從該培養(yǎng)物分離的mRNA中的轉(zhuǎn)錄基 因)，則可i人為這種細(xì)月包培養(yǎng)物是單克隆細(xì)月包i咅養(yǎng)物。
"單克隆細(xì)胞培養(yǎng)物"是僅(絕大多數(shù))包括彼此相同的細(xì)胞 的細(xì)胞培養(yǎng)物，通過單個(gè)細(xì)胞(克隆體)增殖(以及，可選地，分 化)起源的，至少由于它可基于用來選擇細(xì)月包培養(yǎng)物的特定生物學(xué) 特征(例如分泌特異性抗體)進(jìn)4于評(píng)價(jià)。因此，來源于這種培養(yǎng)物 的抗體、細(xì)胞種群或細(xì)力包培養(yǎng)物可表示為"單克隆"的，即使可能 需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)活動(dòng)，從而以較精確的方式證實(shí)克隆形成能力。
術(shù)語"永生化的"通常指在所選定且已刺激的細(xì)胞種群暴露于 病毒永生化試劑之后，4艮據(jù)本發(fā)明方法獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物和種群。
即使病毒永生化可能與特定病毒產(chǎn)物(例如，蛋白，轉(zhuǎn)錄本)的存 在相關(guān)，但是當(dāng)細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)條件下表現(xiàn)為連續(xù)生長(zhǎng)和增殖時(shí)也 將其定義為永生化。如在實(shí)施例中示出的，乂人生物樣品獲得且表達(dá)
抗體的原代人類B細(xì)胞已成功用來獲得多克隆細(xì)胞種群，其隨后用 來生產(chǎn)包含至少104個(gè)細(xì)月包的寡克隆細(xì)月包培養(yǎng)物。當(dāng)培養(yǎng)物從IOO、 50、 20或甚至5個(gè)細(xì)力包開始時(shí)，該細(xì)胞總IH又與細(xì)胞分裂次^: ( 10 次或更多次細(xì)胞分裂)相容，通常僅永生化細(xì)胞可在細(xì)胞培養(yǎng)條件 下發(fā)生分裂。
術(shù)語"抗體分泌細(xì)胞"指包含用于表達(dá)抗體的基因且能夠向胞 外空間(例如，體內(nèi)血液中或體外細(xì)月包i咅養(yǎng)物上清液中)分泌抗體 的原代細(xì)胞。
術(shù)語"永生化抗體分泌細(xì)胞"指暴露于病毒永生化試劑之后， 在細(xì)胞培養(yǎng)條件下無限或至少一段時(shí)期生長(zhǎng)、增殖和分泌抗體的抗 體分泌細(xì)胞和/或多種細(xì)胞的分裂次數(shù)在很大程度上優(yōu)于如果該原 代細(xì)胞未暴露于病毒永生化試劑所觀察到的情形抗體分泌。特別 地，通過本發(fā)明方法得到的的多克隆細(xì)胞種群富含存活的生長(zhǎng)性淋 巴母細(xì)胞(其是永生化抗體分泌細(xì)胞)，其隨后在細(xì)胞培養(yǎng)條件下 形成寡克隆和單克隆細(xì)"包種群。
術(shù)語"刺激劑"指化合物或化合物特定組合，其能夠在細(xì)胞培 養(yǎng)條件下產(chǎn)生由抗體分泌細(xì)胞介導(dǎo)的刺激反應(yīng)、抗體分泌誘導(dǎo)這些 細(xì)胞的增殖和芽殖狀態(tài)以及形成淋巴母細(xì)胞(較大的存活細(xì)胞，如 通過顯微鏡和通過在FACS上的前向/正交散射所檢測(cè)到的)。
術(shù)語"刺激階段"是指一個(gè)時(shí)期，在該時(shí)期內(nèi)所選定的抗體分 泌細(xì)胞暴露于刺激劑。
術(shù)語"病毒永生化試劑"是指病毒粒子、DNA或蛋白中的任 一種，其允許從分離自生物樣品的原代細(xì)胞生產(chǎn)永生化細(xì)胞。在本 發(fā)明中，該原代細(xì)胞是抗體分泌細(xì)胞，尤其是人類B細(xì)胞，現(xiàn)在已 經(jīng)鑒定了用于人類B細(xì)胞的不同的病毒永生化試劑。
術(shù)語"永生化階段"指一個(gè)時(shí)期，在該時(shí)期內(nèi)所選定且已刺激 的抗體分泌細(xì)力包暴露于病毒永生化試劑。
實(shí)施本發(fā)明方法前的預(yù)備步驟是鑒定應(yīng)從其分離包含抗體分 泌細(xì)月包的生物樣品的個(gè)體或組織。
如在本發(fā)明背景技術(shù)中指出的，表達(dá)和分泌抗體的細(xì)胞已經(jīng)從 不同組織和器官包括血液、扁桃體、脾、生物體液(如腦脊髓或胸 膜液)、淋巴結(jié)以及其他'淋巴器官分離并永生化。
可利用本發(fā)明方法:永生<t的細(xì)月包應(yīng)乂人這些哺乳動(dòng)物組織和器 官提取。很明顯，優(yōu)選人類起源的細(xì)胞用于生產(chǎn)分泌具有治療或診 斷用途的人類單克隆抗體的細(xì)力包i咅養(yǎng)物。然而，這些方法還可應(yīng)用
于非人類抗體分泌細(xì)胞(例如，嚙齒類或猿猴起源的細(xì)胞)。
可從人類供體分離到多種不同類型的原代抗體分泌細(xì)胞種群， 根據(jù)免疫細(xì)胞供體的狀態(tài)以及所尋求抗體的同種型和活性，供體具 有的抗體語是較合適的。。
本發(fā)明方法可應(yīng)用于鑒定通過選自供體的人類B細(xì)胞所表達(dá)
的單克隆抗體，供體例如暴露于感染試劑或患特定形式癌癥或自身 免疫疾病的患者。因此，該供體可以是天然的、4妄種的、受一種或 多種疾病或感染累及的、已經(jīng)暴露和/或耐受特定治療性處理的、呈 現(xiàn)特定臨床指數(shù)或狀態(tài)的、非有意暴露于病原體等的。
供體的血清本身可初步確定其對(duì)抗原的血清陽性，這是由于適 應(yīng)性免疫反應(yīng)的特異性和長(zhǎng)期保持(甚至在末次暴露于該抗原之后 幾年)可以允許進(jìn)行定性檢測(cè)，這足夠用于篩選供體。所采用篩選 分析的性質(zhì)和靈敏度在鑒定最適供體時(shí)非常關(guān)鍵，并且優(yōu)選地，用 來篩選供體血清的分析應(yīng)與用來從永生化抗體分泌型B細(xì)胞篩選 上清液且設(shè)計(jì)用來檢測(cè)具有期望功能活性(即，防止病毒進(jìn)入細(xì)胞， 或結(jié)合肺瘤相關(guān)抗原)的抗體的分析相同。
在臨床上，細(xì)胞從其純化的組織或器官的選4奪可以足量從細(xì)胞 可利用度來指示，用于實(shí)施整個(gè)過程。考慮到細(xì)胞可以較小量從人 類臨床樣品獲得和/或在不同于可實(shí)施永生化方法的位置制備，則這 些細(xì)胞可從冷凍樣品和/或從來自多個(gè)個(gè)體的樣品而獲得，其中該多 個(gè)樣品已混合以提供足夠起始材料。
因此，可利用包含抗體分泌細(xì)胞的樣品(如總外周血或血清) 抗體分泌對(duì)一組候選供體進(jìn)行初步篩選。特別地，可利用用于分離
外周血單核細(xì)胞(PBMC)的標(biāo)準(zhǔn)分離技術(shù)如梯度離心，從血液或 、淋巴組織分離單核細(xì)月包。在該分離步-驟之后和/或之前，血清(或血 漿)、細(xì)胞培養(yǎng)物上清液或細(xì)胞的樣品(獲自不同患者、不同組織、 和/或不同時(shí)間點(diǎn))可利用用于沖企測(cè)抗體和抗體分泌細(xì)月包存在的標(biāo)準(zhǔn) 方法(例如，ELISA、 BIACORE、蛋白質(zhì)印跡、FACS、 SERPA、 抗原陣列、在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中中和病毒感染或ELISPOT分析)進(jìn) 行初步篩選。
文獻(xiàn)4是供了這些4支術(shù)的若干實(shí)例，其示出了例如ELISPOT用 于表征接種供體中免疫反應(yīng)的用途(Crotty S et al.， 2004 )、抗原微 陣列作為用于新近感染患者的診斷工具的用途(Mezzasoma L et al.， 2002 ),以及用于^r測(cè)抗原特異性免疫反應(yīng)的其他4支術(shù)(Kern F et al., 2005 )。還可根據(jù)特定病毒的血清陽性與胂瘤形成相關(guān)改變之間的 關(guān)耳關(guān)性而選4奪供體(Butel J， 2000 )。
種型特異活性水平進(jìn)行評(píng)價(jià))應(yīng)允許鑒定具有表達(dá)較高抗體效價(jià)的 B細(xì)胞的供體，該抗體針對(duì)期望純化抗原(例如，涉及癌癥的特定 人類重組蛋白或特定病毒蛋白)、相關(guān)抗原的混合物(例如，獲自 部分純化的病毒制品)或生物測(cè)定(例如病毒感染的中和)。
一旦選擇了一個(gè)或多個(gè)供體，則B細(xì)胞來源可以是脾、血液、 淋巴結(jié)、骨髓、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞、來自慢性感染/炎癥部位的淋巴 細(xì)胞。然而，外周血通常更易于從供體得到、保存以及在指定時(shí)期 內(nèi)監(jiān)4空4十對(duì)抗原的血清學(xué)反應(yīng)。
例如，乂人5-50 ml的外周血可純4匕出大于1千萬-1億個(gè)PBMC
(外周血單核細(xì)月包)，利用本發(fā)明方法永生化后，該細(xì)胞凄t量應(yīng)當(dāng) 能夠獲得待篩選的足夠大的抗體分泌細(xì)胞種群。
在從生物樣品分離PBMC之后，可利用文獻(xiàn)中描述的多種方法 之一抗體分泌，根據(jù)其表面的細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)(如果恰當(dāng)， 其他蛋白的表達(dá))以及該細(xì)胞的增殖活性、代;射狀態(tài)和/或形態(tài)學(xué)狀 態(tài)而特異性選4奪抗體分泌細(xì)胞。
特別地，用于從人類樣品純化抗體分泌細(xì)胞的各種技術(shù)利用用 于陽性或陰性選擇的不同手段與條件。通過物理分離那些可表達(dá)細(xì) 月包表面標(biāo)記物(其特異于表達(dá)并分泌抗體的細(xì)月包，如人類B細(xì)胞) 的細(xì)胞，這些細(xì)胞可以較容易且有效地進(jìn)行選擇。特定方案可在文 獻(xiàn)中查到(參見Callard R and Kotowicz K "Human B-cell responses to cytokines" in Cytokine Cell Biology: A practical Approach. Balkwill F. (ed.) Oxford University Press, 2000， pg. 17-31 )。
所述選擇通常利用特異性結(jié)合這些細(xì)胞表面蛋白之一且可連 接于固態(tài)支持物(例如微珠或塑料板)或標(biāo)記有熒光染料的抗體來
實(shí)施，該焚光染料可利用熒光活化細(xì)胞分選儀(FACS)進(jìn)行檢測(cè)。 例如，人類B細(xì)胞已經(jīng)基于EBV永生化前其對(duì)結(jié)合CD19、 CD27 和/或CD22微珠的支持物(如微珠)的親和力或者缺乏對(duì)特異于某 同種型的4元體的結(jié)合親和力而加以選^奪(Li H et al.， 1995， Ber鵬coni N et al.， 2003; Traggiai E et al.， 2004 )。
然而，細(xì)"包標(biāo)記物的選l奪可能與永生化過程的效力有關(guān)，可能
上，本專利申請(qǐng)的實(shí)施例證實(shí)了 ， CD22 (其是控制抗原識(shí)別和B 細(xì)胞活化相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的B細(xì)胞限制性跨膜蛋白(Nitschke L， 2005 )似乎是用于初始B細(xì)胞選擇的優(yōu)選分子。由于CD22陽性種 群包含的細(xì)胞表達(dá)具有不同同種型和特異性的抗體，所以可采用其 他細(xì)胞表面標(biāo)記物在刺激階段之前或之后選擇細(xì)胞。
可替換地或另外地，抗體分泌除基于CD22的選擇之外可通過 采用基于CD27的選4奪而實(shí)現(xiàn)抗體分泌細(xì)胞的特定富集。已知CD27 是用于具有體細(xì)胞突變性可變區(qū)基因的人類B細(xì)胞的標(biāo)記物(Borst J et al., 2005 )。其j也才示i己4勿^口 CD5 、 CD24、 CD25、 CD86、 CD38、 CD45、 CD70或CD69可用來4非除或富集期望的細(xì)月包種群。因此， 根據(jù)供體暴露于抗原(例如，病毒、細(xì)菌、寄生蟲)的歷史、抗體 效<介，可決定采用總B細(xì)力包、CD22富集的B細(xì)胞還是進(jìn)一步富集 的B纟田月包亞群^口 CD27卩曰性B纟田月包。
細(xì)胞選擇之后，但在永生化階段之前，細(xì)胞種群應(yīng)暴露于恰當(dāng) 的刺激劑。在本發(fā)明中，認(rèn)為三種主要的化合物為可采用(尤其是 以組合方式)的適用性刺激劑。
第一組刺激劑由固有免疫反應(yīng)的活化劑如B細(xì)胞上表達(dá)的Toll 樣受體的激動(dòng)劑代表。已知Toll樣受體(TLR)在細(xì)菌寡核苷酸以 及其他可引發(fā)固有免疫和獲得性免疫中涉及的各種各樣細(xì)胞多克
隆活化的化合物的識(shí)別中發(fā)揮重要作用(Akira S and Takeda K, 2004; Peng S， 2005 )。這個(gè)部分由Toll受體介導(dǎo)的固有免疫反應(yīng)通^各是身 體對(duì)侵入性有機(jī)物的最早反應(yīng)之一 ，并且在形成引發(fā)由適應(yīng)性免疫 反應(yīng)的B和T細(xì)胞介導(dǎo)的有效且特異反應(yīng)所需的恰當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞因 子微環(huán)境中發(fā)揮重要作用(Gay et al.， 2006 )。人類細(xì)胞系和原代細(xì) 胞的這種反應(yīng)性來源于一些Toll樣受體(TLR2， TLR4， TLR6， TLR7, TLR8, TLR9, TLR10 )，其中每一種受體均具有特異表達(dá)譜、首選配 體和識(shí)別條件。
特別地，人類TLR9識(shí)別寡核芬酸，較具體地，基于CpG的 寡核香酸(Hemmi H et al., 2000 )。通過CpG基化合物如其中 一種 稱為CpG2006的化合物，TLR9介導(dǎo)的活化觸發(fā)細(xì)胞氧化還原平衡 的改變，并誘導(dǎo)包括促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和NKkB 的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，隨后生產(chǎn)促炎細(xì)胞因子、干擾素和趨化因子 (Takeshita F et al.， 2001; Hartmann G et al" 2000; Hartma皿G and Krieg A， 2000; UlevitchR, 2004)。由于TLR表達(dá)的嚴(yán)密調(diào)節(jié)，人類 初始和i己憶B細(xì)力包亞型可適應(yīng)多克隆刺〗敫物如CpG寡核苷g交而具 有沖寺異的i曾歹直斗口分^匕'l"生負(fù)fe。 ( Bernasconi N et al.， 2003, Bernasconi N et al., 2002; Bourke E et al.， 2003 )。 CpG寡核普酸誘導(dǎo)固有免疫的激 活并且可保護(hù)免受多種病原體的致死性攻擊(KriegA， 2002 )。例如， 那些包含稱為CpG-B基序的寡核香酸是特別有效的原代B細(xì)胞 Primary B cell ;舌4匕劑(Krieg A et al., 1995; Gursel M et al.， 2002; Kli歸an D, 2004; Eaton-Bassiri A et al" 2004 )。
現(xiàn)在已經(jīng)鑒定了幾種作為 一種Toll樣受體激動(dòng)劑而活化的化合 物(Coban C et al.， 2005; Kandimalla ER et al" 2005; Hayashi E et al" 2005; Bourke E et al" 2003; Ambach A et al" 2004; Sen G et al" 2004 ) 并且已經(jīng)存在特異篩選4支術(shù)，同樣用于確定免疫^求蛋白類和亞類的 產(chǎn)量差異(He聽lt M et al" 2005; Cog腦se F. et al" 2005 )。
第二組刺激劑由細(xì)胞因子代表，特別是已知具有這種免疫刺激
活性(IL-2, IL-4， IL-6， IL-IO， IL- 13 )且已在文獻(xiàn)中估文過比較的白介 素(參見Callard R and Kotowicz K "Human B-cell responses to cytokines" in Cytokine Cell Biology: A practical Approach. Balkwill F (ed.) Oxford University Press, 2000, pg. 17-31 )。
第三組刺激劑由TNF受體家族的細(xì)胞膜受體激動(dòng)劑代表，尤 其那些激活B細(xì)胞中NK-kB通路和的增殖的激動(dòng)劑，如APRIL、 BAFF或CD40L( Schneider P， 2005; He B et al" 2004; Craxton A et al" 2003; Tangye S et al.， 2003 )。
應(yīng)該指出，刺激劑的選擇和濃度、其組合以及刺激階段的時(shí)間 長(zhǎng)短必須加以選擇，這對(duì)于獲得細(xì)胞刺激和蛋白表達(dá)的最佳效應(yīng)從 而實(shí)現(xiàn)或促進(jìn)抗體分泌纟田胞的永生化非常重要抗體分泌。
實(shí)施例表明有用的刺激劑，特別是當(dāng)病毒永生化試劑是EB病 毒時(shí)，可在以下化合物組合中進(jìn)行選擇
a) 基于CpG的寡核苷酸與細(xì)胞因子的組合；
b) TNF受體家族的細(xì)胞膜受體激動(dòng)劑與細(xì)胞因子的組合。
根據(jù)其刺激性能，已將CpG2006與EBV同時(shí)使用以生產(chǎn)永生 化人類B細(xì)胞(Traggiai et al., 2004; WO 04/76677 ),如已經(jīng)與可溶 性CD40配體或針對(duì)CD40的;敫動(dòng)性抗體一起使用的(WO 91/09115; WO 94/24164; Tsuchiyama L et al., 1997; Imadome K et al" 2003 )。
然而，類似的方法對(duì)永生化B細(xì)胞的保存和篩選有負(fù)向影響， 因?yàn)橐阎嗫寺』?匕劑如CpG2006對(duì)克隆和/或隨后篩選過禾呈期間 細(xì)胞培養(yǎng)物中可能存在的多種細(xì)胞類型均具有強(qiáng)有效的作用 (Hartmann G and Krieg A， 2000; Hartmann G et al.， 2000 )。對(duì)爭(zhēng)另寸；也，
CpG是細(xì)胞因子如單核細(xì)胞所分泌IL-12和IFN-y的有效誘導(dǎo)劑， 在后續(xù)生物測(cè)定中尤其是篩選抗病毒抗體時(shí)應(yīng)當(dāng)避免這些細(xì)胞因 子的存在(Klinman D et al.， 1996， Fearon K et al., 2003; Abel K et al.， 2005 )。
實(shí)施例示出了 了人類CD22陽性B細(xì)胞是如何通過利用特定濃 度的化合物而獲得對(duì)CpG2006和IL-2組合物的最適反應(yīng)的，且表 明大量其他已知的刺激劑(例如LPS或SAC )并不提供這種反應(yīng)。
所選定的抗體分泌細(xì)力包暴露于刺激劑的時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)于構(gòu)建永 生化這種細(xì)胞的有效方法特別重要。事實(shí)上，實(shí)施例表明刺激劑 (CpG2006和IL-2 )的組合對(duì)細(xì)胞存活和增殖尤其是在特定時(shí)間范 圍(例如約2至約4天的刺激)內(nèi)發(fā)揮了了最大作用。然而，刺激 劑和時(shí)間范圍的可替換組合對(duì)EBV永生化或?qū)ζ渌《居郎?劑可以是同等有效的。
如果已證明對(duì)獲得抗體分泌細(xì)胞的較好反應(yīng)是有用的，則在永 生化階^:之前可將刺激劑的組合物同時(shí)或依次(例如，在初始細(xì)胞 選4爭(zhēng)之后立即加入第一種刺;敫劑而在幾小時(shí)或幾天之后加入第二 種刺激劑)加入細(xì)月包培養(yǎng)基中。
刺激劑可直接從稀釋的原溶液加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，或者在利用 例如脂質(zhì)體或其他可改善其吸收和免疫刺激活性的化合物恰當(dāng)配 制之后加入(Gursel I et al.， 2001 )。還可將刺激劑連接于固體基質(zhì) (樣O朱或直接連接于細(xì)胞培養(yǎng)纟反上)，且能允許4交有效去除該刺激劑。
考慮到上文對(duì)在本發(fā)明方法的特定步驟應(yīng)用刺激劑達(dá)特定時(shí) 期的重要性所做的觀察，抗體分泌隨后應(yīng)以可有效去除刺激劑的方 式才喿作抗體分泌細(xì)力包，以避免對(duì)細(xì)力包培養(yǎng)條件下后續(xù)永生化和保存 的任何負(fù)向影響。
因此，細(xì)月包可用新鮮培養(yǎng)基清洗一次或多次，并且可選地，保 存于正常細(xì)胞培養(yǎng)基中(例如，達(dá)1天至6天)，以便進(jìn)一步降低 并去除刺激劑的任何殘留效應(yīng)，該殘留效應(yīng)甚至可通過將特定化合 物力口入細(xì)月包;咅養(yǎng)物中而水卩制。
的細(xì)胞暴露于永生化試劑之前(即，刺激階段和永生化階段之間) 可根據(jù)所表達(dá)抗體的同種型而進(jìn)一步選擇的細(xì)胞。
應(yīng)通過采用陽性選擇(實(shí)現(xiàn)特定細(xì)胞的分離)或陰性選擇(實(shí) 現(xiàn)對(duì)不需要的細(xì)胞的去除)的手段來開展基于同種型的細(xì)胞選擇。
例如，考慮到批準(zhǔn)用于醫(yī)藥用途的大多數(shù)治療性抗體都是IgG( Laffy E and Sodoyer R， 2005 ),則^又受刺激的IgG陽性細(xì)月包種群可^皮陽性 (通過FACS或磁性細(xì)胞分離器)選擇，或通過耗盡細(xì)胞種群中表 達(dá)IgM的細(xì)胞，由此富集表達(dá)IgG的細(xì)胞。利用焚光活化或磁性細(xì) 月包分離器的抗體分泌細(xì)月包分離4支術(shù)在文獻(xiàn)中已經(jīng)為人所知(Li H et al.， 1995; Traggiai E et al., 2004 )。 4艮據(jù)抗體分泌細(xì)胞的來源及其最終 用途，可能需要排除(或富集)表達(dá)IgD或IgA的細(xì)胞。
如果需要這種精確選4,，則可采用類似方法4艮據(jù)特定亞類而分 離細(xì)胞(例如，區(qū)別表達(dá)IgGl、 IgG2、 IgG3或IgG4抗體的人類B
細(xì)胞)。
所選定且已刺激而表達(dá)具有特定同種型抗體的細(xì)胞種群現(xiàn)在 即可利用病毒永生化試劑進(jìn)行永生化。文獻(xiàn)表明，對(duì)抗體分泌細(xì)胞 可采用不同的永生化試劑抗體分泌，有時(shí)甚至在單個(gè)過程中進(jìn)行組 合以^更獲得永生化抗體分泌細(xì)胞。在病毒永生化試劑中，優(yōu)選將感染并永生化抗體分泌細(xì)月包的病 毒應(yīng)用于本發(fā)明方法中。具有這種優(yōu)先性的病毒通常稱為親淋巴病 毒并且歸組到皰疹病毒屬的Y類。該病毒家族的成員以物種特異性 方式感染淋巴細(xì)力包，且與'淋巴組織增殖失調(diào)和若干種惡性肺瘤的形
成有關(guān)(Nicholas J， 2000; Ricki扁n A， 2001 )。
EBV (EB病毒，也稱為皰滲病毒4)和HHV-8 (人類皰滲病 毒8，也稱為KSHV，卡波西式肉瘤相關(guān)皰滲病毒)感染并永生化 人類淋巴細(xì)胞。MHV-68 (鼠類皰滲病毒68 )、 HVS(+〉鼠猴皰滲病 毒)、RRV(羅斯河病毒)、LCV (靈長(zhǎng)類淋巴隱病毒)、EHV-2(馬 皰瘆病毒2 )、 HVA (蛛猴皰滲病毒)以及AHV-1 (狷羚皰滲病毒1 ) 是其他致癌性親淋巴皰滲病毒，它們之間具有一些保守的共同遺傳 特征，且在不同哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中具有類似致病作用。無論何時(shí) 將本發(fā)明方法應(yīng)用于從這些哺乳動(dòng)物獲得的抗體分泌細(xì)胞，均可采 用這些病毒。
然而，不僅完全病毒可永生化B細(xì)胞，且包含由這些特定病毒 和其他病毒所獲得的特殊病毒蛋白的重組DNA構(gòu)建體也已成功用 來7么生4匕B纟田月包(Damania B 2004; Kilger E et al., 1998 )。包含病毒 基因的類似載體可轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞中，有時(shí)利用反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)或病毒樣粒 子轉(zhuǎn)導(dǎo)入包裝細(xì)胞系(反過來，其提供用于這些粒子形成的所有必 要因子)中，也可用于本發(fā)明的方法中。
永生化階段可持續(xù)1至幾小時(shí)，達(dá)2-4天，即使實(shí)施例表明較 長(zhǎng)永生化階段對(duì)于細(xì)胞存活可能是有害的，并且至少在EBV永生 化中，4小時(shí)已足以構(gòu)建淋巴母細(xì)胞的多克隆種群(較大的存活細(xì) 月包，如通過顯孩"竟和/或FACS 4企測(cè)的；參見圖9),其才是供永生化 抗體分泌細(xì)月包。
實(shí)施例表明，如果首先對(duì)CD22表達(dá)進(jìn)行選擇，然后利用刺激 劑的恰當(dāng)組合(CpG2006和IL-2 )刺激達(dá)恰當(dāng)時(shí)間(約2天至約4 天)，最后根據(jù)優(yōu)選的同種型(IgG陽性或富集的；IgM陰性或排除 的)進(jìn)行選擇，則可利用EBV上清液有效地永生化人類B纟田月包。
EBV介導(dǎo)的B細(xì)胞永生化需要細(xì)胞表面受體CD21的表達(dá)，其 中CD21被認(rèn)為是主要EBV受體。CD21存在于大多數(shù)B細(xì)胞亞群 上，并通過與CD19及B細(xì)力包抗原受體形成復(fù)合物而調(diào)節(jié)B細(xì)力包反 應(yīng)(Fearon D and Carroll M, 2000 )。然而，細(xì)月包廣泛活化之后及當(dāng) B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞時(shí)，CD21從細(xì)胞表面丟失。因此，用EBV轉(zhuǎn) 化細(xì)胞的能力可以通過加入B細(xì)胞刺激劑而得以增強(qiáng)，但是所述條 件必須確保CD21保持于細(xì)胞表面上，從而實(shí)現(xiàn)高效EBV永生化。
本發(fā)明示出了如何有效獲得永生化抗體分泌細(xì)胞種群。事實(shí) 上，富集了被選擇且已永生化的B細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物種群具有較強(qiáng) 的生產(chǎn)有用治療性抗體的可能性，同時(shí)在用EBV病毒永生化時(shí)將 其生長(zhǎng)能力保持為潛伏而非細(xì)胞溶解的狀態(tài)。不同于其中B細(xì)胞可 以被刺激以分泌IgG的其他方法，永生化過程允許該種群以高度增 殖且能夠分泌IgG的狀態(tài)被"捕獲"。來自永生化B細(xì)胞種群的上 清液可用于分析具有期望活性的抗體的存在情況。隨后永生化B細(xì) 胞種群可經(jīng)克隆以分離抗體分泌細(xì)胞的克隆體，通過分子學(xué)方法分 離抗體基因或者以冷凍狀態(tài)保存而用于將來的分析。
EBV介導(dǎo)的永生化是一個(gè)復(fù)雜過程，涉及由于EBV所表達(dá)蛋 白的B細(xì)胞永生化，隨后是受EBV與宿主細(xì)胞蛋白之間相互作用 i周節(jié)的7Jc生《匕(Sugimoto M et al" 2004; Bishop G e and Busch LK, 2002 )。事實(shí)上，該永生化過程之后可^r測(cè)特定EBV蛋白和轉(zhuǎn)錄本 如EBNA2、 EBNA1、 LMP2、 LMP1或EBER的表達(dá)(Thorley-Lawson DA， 2001 )。這些蛋白可通過PCR、免疫焚光、蛋白質(zhì)印跡或其他 允許沖全測(cè)感染細(xì)月包中EBV DNA和蛋白的方法進(jìn)4亍4企測(cè)(Schlee M
et al., 2004; Park CH et al" 2004; Humme S et al" 2003; Konishi K et al., 2001; Haan K et al., 2001 )。
力口入細(xì)月包;t告養(yǎng)物中的EBV上清液的量可以是文獻(xiàn)中通常指定 的量(10%、 20%、 30%或更大)，^f旦々乂乎方法可在EBV上清液的 量相對(duì)較高(50% V/V )但暴露相對(duì)較短(約4至約24小時(shí))的條 件下恰當(dāng)運(yùn)行。
然而，重要的是，通過例如在新鮮細(xì)l包培養(yǎng)基中清洗和培養(yǎng)細(xì) 胞種群而去除病毒永生化試劑(類似于對(duì)刺激劑所指出的)。
可利用以EBV實(shí)驗(yàn)、部分缺失或重組菌林中任一種(以及微 EBV和其他EBV基栽體)感染人類或嚙齒動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物的通用 技術(shù)并從富含EBV的上清液中分離感染的細(xì)胞而生成用于本發(fā)明 方;去的EBV上-青液(Speck P et al.， 1999; Oh HM et al.， 2003; Bass H and Darke C， 2004; Radons J et al" 2005; US5798230 )。
實(shí)施例中提供的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，通過其他永生化試劑可采用類 似的方法。對(duì)用于從生物樣品純化抗體分泌細(xì)胞的選沖奪手l殳的恰當(dāng) 組合、在細(xì)胞培養(yǎng)條件下刺激劑的恰當(dāng)組合(如上文所述)以及保 持于幾小時(shí)或幾天范圍內(nèi)的刺激階段的恰當(dāng)組合(但始終與永生化 階段分開)不僅可改善由EBV介導(dǎo)的永生化而且可改善由其他病 毒永生化試劑介導(dǎo)的永生化，如通過其他致癌病毒的感染和/或由癌 基因介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。
在從細(xì)胞培養(yǎng)物中去除病毒永生化試劑之后，所得到的細(xì)胞種 群特別富含(相比于其他方法)存活的增殖性淋巴母細(xì)胞(參見圖 9)，而無瀕死或者分化的細(xì)胞，后者對(duì)于構(gòu)建寡克隆和單克隆細(xì)月包 培養(yǎng)物是不可用的，且會(huì)在細(xì)胞培養(yǎng)基中釋放可負(fù)向影響所選定且
已刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和/或抗體分泌的物質(zhì)(如細(xì)胞因子、反應(yīng)性 氧中間體)。
在該意義上，才艮據(jù)本發(fā)明方法獲得的多克隆細(xì)月包種群特別有 用，通過劃分這種多克隆種群獲得的寡克隆或單克隆細(xì)胞種群(包 含永生化抗體分泌細(xì)胞)也特別有用。
這些細(xì)胞種群可用于一系列應(yīng)用中，尤其是與抗體分離、表征 和生成有關(guān)的應(yīng)用。
例如，包含編碼一種或多種特定同種型抗體的DNA序列的 DNA文庫(kù)，其中該DNA文庫(kù)利用從這些細(xì)胞種群分離的核酸而制 備。利用常用分子生物學(xué)技術(shù)，mRNA或基因組DNA可從細(xì)胞樣 品3是耳又，并在作為4寺篩選重組蛋白而表達(dá)這些序列的范圍內(nèi)特定地 反轉(zhuǎn)錄(如有必要)并擴(kuò)增樣品中存在的編碼抗體的所有序列的整 體或部分(例如，4義結(jié)合抗原的可變區(qū))，如文獻(xiàn)中所述用于免疫 4妻種的動(dòng)物或雜交瘤的抗體(Gilliland LK et al.， 1996; Lightwood D et al.， 2006 )。
因此，本發(fā)明方法提供可用于鑒定和生產(chǎn)具有期望抗原結(jié)合特 異性和/或生物學(xué)活性的細(xì)胞種群、細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞培養(yǎng)物的上清 液以及DNA文庫(kù)。
可替換地，如果獲自由個(gè)體提供的抗體分泌細(xì)胞，則這種生物 學(xué)產(chǎn)品可用于確定對(duì)特定個(gè)體中對(duì)自體同源或異源性抗原、病毒、
如，鑒定由該個(gè)體的免疫系統(tǒng)普遍生成的抗體和/或普遍識(shí)別的抗 原)。
考慮到這些生物學(xué)產(chǎn)品(即，本發(fā)明的細(xì)力包種群、細(xì)胞培養(yǎng)物、
細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液以及DNA文庫(kù))的廣泛應(yīng)用和穩(wěn)定性(作為 冷凍樣品)，可將其包括在用于鑒定和生產(chǎn)具有期望抗原結(jié)合特異 性和/或生物學(xué)活性的單克隆抗體的試劑盒中。例如，試劑盒的使用 者可在實(shí)馬全室內(nèi)篩選一組細(xì)月包i咅養(yǎng)物上清液或一組DNA文庫(kù)中具 有期望性能的單克隆抗體。
本發(fā)明4是供了利用上述方法獲得的永生化抗體分泌細(xì)胞的多 克隆種群。這些細(xì)胞種群可在用于生產(chǎn)分泌單克隆抗體(其具有期 望抗原特異性和/或生物學(xué)活性)的細(xì)月包培養(yǎng)物的方法中使用，該方 法包纟舌以下步駛《
a) 在細(xì)胞培養(yǎng)物中劃分權(quán)利要求5的細(xì)胞種群或權(quán)利要求6 的細(xì)月包培養(yǎng)物，每一個(gè)均包含50個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞；
b) 篩選細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液，用于才企測(cè)那些表現(xiàn)出期望抗原 結(jié)合特異性和/或生物學(xué)活性的細(xì)胞培養(yǎng)物；
c )在細(xì)胞培養(yǎng)物或種群中劃分表現(xiàn)出期望抗原特異性和/或生 物學(xué)活性的細(xì)月包i咅養(yǎng)物；
d)對(duì)所述細(xì)胞培養(yǎng)物重復(fù)步驟(b)和(c)直至一個(gè)或多個(gè) 細(xì)胞培養(yǎng)物，每一個(gè)均在細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液中分泌具有期望抗原 結(jié)合特異性和/或生物學(xué)活性的單克隆抗體。
可替換地，這些細(xì)力包種群可在用于生產(chǎn)分泌單克隆抗體(其具 有期望抗原特異性和/或生物學(xué)活性)的細(xì)胞培養(yǎng)物的方法中使用， 該方法包4舌以下步駛《
a)篩選通過片又利要求6的多個(gè)種群獲得的細(xì)月包培養(yǎng)物的上清 液，用于檢測(cè)分泌具有期望抗原特異性和/或生物學(xué)活性的抗體的一 個(gè)或多個(gè)種群；
b) 確定由該細(xì)胞培養(yǎng)物中每一個(gè)分泌且在上清液中表現(xiàn)出所 述活性的抗體的序列；
c) 分離在細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中分泌具有這些活性的單克隆抗 體的細(xì)力包i告養(yǎng)物。
為了恰當(dāng)實(shí)施這些方法，多克隆、寡克隆和單克隆細(xì)胞種群必 須保持在恰當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)條件下，以;險(xiǎn)測(cè)其性能，尤其是與其在細(xì) 胞培養(yǎng)物上清液中所分泌抗體的抗原結(jié)合和/或功能活性有關(guān)的性能。
在該意義上，永生化階段后細(xì)胞培養(yǎng)條件的選4奪非常重要，以 便支持永生化抗體分泌細(xì)胞的存活、增殖和抗體分泌。
在本發(fā)明中，細(xì)胞培養(yǎng)條件的選擇對(duì)于構(gòu)建、選擇以及培養(yǎng)寡 克隆和單克隆細(xì)月包培養(yǎng)物是決定性的。在該范圍內(nèi)，抗體分泌細(xì)胞 混合物可保持在含有一種或多種刺激B細(xì)胞生長(zhǎng)的試劑的細(xì)胞培 養(yǎng)基中。
在EBV介導(dǎo)的永生化中，EBV感染應(yīng)保持在潛伏期，以增強(qiáng) 細(xì)胞的存活、增殖和IgG產(chǎn)量。然而，特定細(xì)胞培養(yǎng)條件的選擇可 以增強(qiáng)克隆效力和感興趣單克隆細(xì)胞培養(yǎng)物的選4奪，如過去已綜述 過的(James K and Bell G, 1987 )。
第一個(gè)重要的方面是用于在永生化階段之后培養(yǎng)抗體分泌細(xì) 胞的飼養(yǎng)層(當(dāng)細(xì)胞以低密度培養(yǎng)時(shí))。飼養(yǎng)層可通過受照射的非 同種/同種外周血細(xì)胞制劑、類淋巴母細(xì)胞或成纖維細(xì)胞系、臍帶血 淋巴細(xì)胞或不同類型的胚胎細(xì)胞構(gòu)成。具有這些性質(zhì)的細(xì)胞系的一 個(gè)實(shí)例是EL4-B5，為可有效支持B細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的突變EL4胸 腺瘤細(xì)胞系(Ifversen P et al.， 1993; Wen et al., 1987 )。
第二個(gè)重要的方面是如何利用容器將這些細(xì)胞保存于培養(yǎng)基 中?？刹捎貌煌某绦蚝筒牧?，包括靜止培養(yǎng)(在孔或燒并瓦中)、 均質(zhì)懸浮培養(yǎng)(在連續(xù)攪拌反應(yīng)器或滾筒瓶中)、或者固定培養(yǎng)(在 中空纖維或其他支持物上)。
第三個(gè)重要的方面是細(xì)胞培養(yǎng)基的選擇，以在實(shí)施本發(fā)明方法 和永生化階段之后培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)保持細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)。特別是在該
后一個(gè)時(shí)期內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)基(如IMDM或RPMI-1640 )的選4奪和細(xì) 胞營(yíng)養(yǎng)素(例如氨基酸，血清)的選擇對(duì)于增強(qiáng)細(xì)胞種群的生長(zhǎng)和 復(fù)制非常重要，甚至當(dāng)以低細(xì)胞密度接種時(shí)，如在寡克隆細(xì)胞培養(yǎng) 物中。
最后，第四個(gè)重要的方面是在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加特殊B細(xì)月包促 生長(zhǎng)劑，如那些在刺激階段中所采用試劑中任一種，如上文概述的 (例如CpG-基寡核苷酸、白介素)，或者已知對(duì)永生化抗體分泌細(xì)
物，如4-羥基壬烯醛(Ranjan D et al.， 2005 )、石克氧還蛋白的形式 (Wendel-Hansen V et al.， 1994 )、可;容'〖生CD40酉己體或4十只于CD40的 對(duì)抗性抗體(WO 91/09115; WO 94/24164; TsuchiyamaLetal., 1997; Imadome K et al" 2003 )或環(huán)孑包菌素(Ta羅r JE and Menezes J， 1994; ChenCet al.， 2001 )。
B細(xì)胞促生長(zhǎng)劑的選擇以及施加該試劑的時(shí)期的選擇(例如， 僅在細(xì)胞永生化后緊接著的幾天中)還取決于之后采用的篩選分析 的類型。在細(xì)胞水平的分析中，如果這種試劑可通過改變靶細(xì)胞的 反應(yīng)而干護(hù)L,則細(xì)胞培養(yǎng)物上清液在該分析中不能直接4吏用，除非 該特定試劑已乂人細(xì)胞培養(yǎng)基中去除或替^?？商鎿Q地，抗體可以至 少部分/人細(xì)月包;咅養(yǎng)物上清液中純4匕(例如，通過蛋白沉淀、透碎斤和 /或親和力純化)。然而，優(yōu)選在接種細(xì)胞混合物之后盡快地利繼續(xù) 進(jìn)行篩選，同時(shí)通過構(gòu)建不會(huì)在篩選分析中引發(fā)問題的恰當(dāng)條件、
通過清洗細(xì)胞或通過改變細(xì)胞培養(yǎng)基而無需去除B細(xì)胞促生長(zhǎng)劑 (或細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中存在的任何其他成分)。
抗體生產(chǎn)細(xì)胞4艮據(jù)本發(fā)明方法進(jìn)行分離、刺激和永生化，隨后
可在細(xì)分為獨(dú)立i條養(yǎng)的(例如在6、 12、 24、 32或96孔板中)若 干池(每一個(gè)代表一個(gè)細(xì)胞種群，)之前在原始培養(yǎng)基中保存不同 的天數(shù)(例如，1天直至10天，或者更長(zhǎng)的時(shí)期如2-4周)。
在細(xì)胞培養(yǎng)條件下保持的該原始多克隆細(xì)月包種群可以利用已 在血清上實(shí)施的分析進(jìn)行檢測(cè)，以選擇供體，或者利用與細(xì)胞以后 應(yīng)用相關(guān)的任何其他測(cè)定，以便確認(rèn)細(xì)胞的存在。此外，可將多克 隆細(xì)胞種群的一些等分試樣置于小瓶中并作為冷凍細(xì)胞保存(如通 常對(duì)于構(gòu)建的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系實(shí)施的)，以備以后再次解凍和培養(yǎng)。
細(xì)月包池有多個(gè)，可達(dá)10個(gè)至幾百個(gè)(或者甚至幾千個(gè)，如實(shí) 施例3中所示)，經(jīng)鄉(xiāng)充計(jì)每一個(gè)均包含10、 102、 103、 104、 105或更 多細(xì)月包。實(shí)施例示出了分泌抗體的細(xì)月包培養(yǎng)物可如4可/人經(jīng)統(tǒng)計(jì)包含 5、 20、 50和IOO個(gè)細(xì)月包的種群開始而構(gòu)建。在不同的天凄欠(例如， 1天直至10天，或者更長(zhǎng)時(shí)期如2-4周)之后，這些細(xì)胞池所分泌 抗體的量應(yīng)足夠用于其表4正，例如通過在細(xì)胞水平或4壬何其他結(jié)合 測(cè)定中利用細(xì)胞培養(yǎng)物上清液(直接地或其中所包含的抗體部分純 化之后)。
包含至少103、 104或105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物可分泌一定量的 抗體，在細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中累積(例如共1至300 pg/ml或更大)， 該量易于利用商品化ELISA試劑盒檢測(cè)且通常足夠用于實(shí)施類似 的體外分沖斤。o):匕夕卜，105、 104、 103個(gè)或甚至更少的細(xì)月包足以通過^是 耳又、擴(kuò)增、克隆和測(cè)序來自這些細(xì)力包的相關(guān)mRNA而獲纟尋所分泌抗 體的序列(如實(shí)施例3中所示)。
因此，隨后可能在平^f亍實(shí)^r中通過系列稀釋的培養(yǎng)物上清液或 部分純化的抗體制劑(例如，通過蛋白A柱上的親和層析所獲得) 利用用劑量反應(yīng)分析，以高通量方式篩選細(xì)胞培養(yǎng)物上清液等分試 樣的結(jié)合和/或功能活性，以便鑒定呈現(xiàn)期望活性的陽性孔。
陽性細(xì)胞池(即，那些表現(xiàn)出期望抗原特異性和/或生物學(xué)活性 的)隨后可用來生產(chǎn)一系列新的細(xì)胞池以進(jìn)一步將篩選限制在細(xì)胞 培養(yǎng)物水平，并由此分離出分泌具有期望特異性和活性的單克隆抗 體的細(xì)胞培養(yǎng)物，至少在初始篩選分析的水平。然后所選單克隆抗 體應(yīng)利用其他更嚴(yán)才各的功能分析進(jìn)^f亍再評(píng)1"介，并在利用可應(yīng)用于B 細(xì)胞的重組DNA技術(shù)將其從穩(wěn)定EBV 7Jc生化克隆體分離之后，在 同種型水平和VH/VL序列水平進(jìn)行表征。
如果由利用相關(guān)模式和臨床實(shí)驗(yàn)所獲得的進(jìn)一步數(shù)據(jù)加以證 實(shí)，則這種初始表征可從而鑒定從上清液純化的單克隆抗體(或之 后作為重組蛋白而表達(dá))具有診斷和/或治療用途。特別地，如果已 經(jīng)根據(jù)本發(fā)明的方法永生化的原始細(xì)胞種群是人類B細(xì)月包的IgG陽 性種群，則該單克隆抗體即可直接用于治療人類感染和疾病的人類 單克隆IgG抗體。
頭見才莫化抗體生產(chǎn)可利用哺乳動(dòng)物、細(xì)菌或植物細(xì)胞系統(tǒng)來實(shí) 施，其中，編碼所選抗體的重鏈和輕鏈全長(zhǎng)(或4又其抗原結(jié)合區(qū)) 的克隆序列利用載體進(jìn)^亍克隆并作為重組蛋白表達(dá)。
本發(fā)明方法提供可根據(jù)期望抗原特異性和/或生物學(xué)活性進(jìn)行 分離的抗體分泌細(xì)胞的永生化寡克隆和單克隆細(xì)月包培養(yǎng)物，因?yàn)槠?可例如通過篩選從抗體分泌細(xì)胞的原始多克隆種群和抗體分泌細(xì) 胞的寡克隆或單克隆細(xì)胞培養(yǎng)物獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液而加以 確定。然后這些細(xì)胞可用于鑒定和生產(chǎn)具有期望抗原特異性和/或生 物學(xué)活性的單克隆抗體。在該范圍內(nèi)，特定技術(shù)應(yīng)進(jìn)行自動(dòng)化，允^N元體生成通量乂人若干單克隆細(xì)月包i咅養(yǎng)物可以顯著增加(Chambers R， 2005 )。
應(yīng)對(duì)與細(xì)胞培養(yǎng)物上清液和純化制品一起使用的篩選分析加 以選擇和構(gòu)建，以便以最高可能的精確性檢測(cè)感興趣抗體。篩選分 析應(yīng)包含有恰當(dāng)?shù)年栃院完幮詫?duì)照(例如，來源于其他篩選或商業(yè) 來源的其4也抗體)并且也應(yīng)足夠靈壽文，以在適用于抗體期望應(yīng)用(例 如，用于診斷、治療或預(yù)防用途)的濃度范圍內(nèi)檢測(cè)結(jié)合和/或功能 活性。
例如，如果子貞期抗體可用作治療性4匕合物，則所述分析應(yīng)表明， 在100、 10或1 |ag/ml (或更低)的抗體濃度下可片企測(cè)到顯著活性。 然而，在所述抗體表征的早期階段，通過該分析所測(cè)定活性的每文感 性通常 <又足以在某些方面對(duì)治療有用的活性進(jìn)行預(yù)測(cè)。關(guān)于治療效 果以及可能給藥的聯(lián)合劑量，對(duì)純化或重組IgG所4故的其他分析是 更加嚴(yán)格的。
篩選分析應(yīng)加以構(gòu)建以確定抗體涉及的抗原結(jié)合特異性和/或 生物學(xué)活性，并且可利用自身抗原/異型抗原(人類、哺乳動(dòng)物、細(xì) 菌、病毒、寄生蟲、有機(jī)物、化學(xué)品或任何其他抗原/變應(yīng)原化合物)，
相互作用特異性或?qū)?xì)^^、組織、病毒或動(dòng)物才莫型作用的i侖i正。
可^齊換地，還可構(gòu)建所述分析用于確定針對(duì)復(fù)雜的生物學(xué)、非 純化靶標(biāo)如細(xì)胞或組織的抗原結(jié)合特異性和/或生物學(xué)活性(例如， 在內(nèi)皮細(xì)月包中的遷移，致癌性細(xì)月包生長(zhǎng)等)。
在細(xì)胞培養(yǎng)條件下，對(duì)細(xì)胞的多克隆、或者較好的，寡克隆種 群上實(shí)施的這些測(cè)定的結(jié)果可用于選擇種群，其應(yīng)保存在冷凍小if瓦
中或者用于構(gòu)建包括編碼一種或多種特定同種型抗體的DNA序列 的DNA文庫(kù)。
文獻(xiàn)中已經(jīng)描述若干技術(shù)用于在體外篩選抗體，該技術(shù)可能與 單克隆抗體的特定用途相關(guān)且還允許精確且高通量表征抗體。與更 經(jīng)典的技術(shù)如免疫沉淀、蛋白質(zhì)印跡、ELISA和免疫焚光一起，較 精細(xì)的方法則可利用小器官細(xì)胞/器官培養(yǎng)物、芯片或多色納米顆 粒，用于有效的篩選分析(Bradbury A et al., 2003; Haab BB， 2005; Lai SP et al., 2002; Olivo P， 1996; Potera C， 2005; WO 05/82926; WO 05/003379; WO 05/83064; WO 05〃6013 )。
根據(jù)抗體分泌細(xì)胞的來源和用于選擇特定單克隆細(xì)胞培養(yǎng)物 和表征單克隆抗體的篩選分析的來源，可想象這些抗體的多種不同 用途，如作為診斷工具(用于病毒、細(xì)菌或寄生蟲感染、腫瘤或細(xì) 胞分型)、作為預(yù)防或治療工具(尤其是用于治療惡性腫瘤、感染、 免疫介導(dǎo)的疾病或炎性失調(diào)，或者用在移植患者的治療中)、用于 考察免疫系統(tǒng)(通常是臨床相關(guān)的抗原)。因此，這些抗體，尤其 是人類單克隆抗體可用于制備包括單克隆抗體或抗體片段以及藥 用載體的藥物組合物，用于制備治療患者的藥劑以及用于診斷人類 的感染、致癌性、自身免疫或過壽文性疾病。
本發(fā)明還4是供了一種用于生產(chǎn)單克隆抗體的方法，包括以下步
驟
a) 擴(kuò)增通過上述方法生產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)物；以及
b) 從細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液純化單克隆抗體。
特別地，EBV永生化的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)在于，在已經(jīng)對(duì)所分泌抗體 進(jìn)行了初始表征和驗(yàn)證之后，細(xì)胞培養(yǎng)物可直接用來純化足夠量的
抗體(從微克至毫克范圍)，以利用體外或體內(nèi)分析(進(jìn)一步的生 化、組織水平或細(xì)月包水平的分析，在嚙齒動(dòng)物中建立的疾病才莫型， 用于親和力一企測(cè)的生物物理方法、表位定位等)實(shí)施更深入的抗體 表征和驗(yàn)證。
在該范圍內(nèi)，控制培養(yǎng)物的克隆形成能力之后，原始細(xì)胞培養(yǎng) 物可通過改變用于維持細(xì)胞生長(zhǎng)和改進(jìn)抗體表達(dá)及分泌的培養(yǎng)基
和條件而進(jìn)一步伊C/f匕(Ling N, 2000 )。隨后通過采用乂人文獻(xiàn)得知的 用于利用親和層析從復(fù)雜蛋白混合物分離抗體的l支術(shù)而從細(xì)月包培 養(yǎng)物上清液純化抗體(Nisnevitch M and Firer MA， 2001; Huse K et al., 2002 )。這些用于抗體純化的方法可以基于抗體對(duì)底物如蛋白A、 蛋白G或合成底4勿的總、親,口力(VerdolivaAet al.， 2002; Roque AC et al" 2004; Danczyk R et al., 2003 )以及通過基于抗原或表位的親和層 析(Murray A et al" 2002; Sun L et al., 2003; Jensen LB et al., 2004 )。 已經(jīng)精心設(shè)計(jì)了其他用于抗體的制備性分離裝置，例如基于電泳的 裝置(Thomas TM et al.， 2003 )。
明顯地，單克隆細(xì)胞培養(yǎng)物還可用來鑒定編碼單克隆抗體的 DNA序列，通過擴(kuò)增并將其克隆入載體中，然后繼續(xù)在恰當(dāng)宿主 細(xì)胞中表達(dá)重組抗體。所選定克隆細(xì)月包培養(yǎng)物分泌抗體的蛋白序列 易于利用文獻(xiàn)中已知的重組DNA才支術(shù)來分離編碼這些抗體的核酸 而力口以確定(Poul MA et al.， 1995; Jovelin F et al., 1995; Heinrichs A et al" 1995; Dattamaj畫dar AK et al.， 1996; Norderhaug L et al., 1997; Chardes T et al" 1999; Jarrin A and Andrieux A, 1999; Essono S et al.， 2003 )。
這些纟支術(shù)還可用于治療性抗體進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)和功能表征及優(yōu) 化(Kim SJ et al., 2005 )或者用于生產(chǎn)允許單克隆抗體穩(wěn)定體內(nèi)遞 送的載體(Fang J et al" 2005 )。
簡(jiǎn)而言之，mRNA可從細(xì)胞培養(yǎng)物制備并且逆轉(zhuǎn)錄到cDNA文 庫(kù)中，其可用作用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的模板，包括用于特異 性擴(kuò)增重鏈和輕鏈全長(zhǎng)或者僅擴(kuò)增這些鏈部分(如可變區(qū))的簡(jiǎn)并 引物。在其中僅分離可變區(qū)(負(fù)責(zé)抗原結(jié)合)的情況下，可將這些 序列克隆入載體中，乂人而允許該序列融合至期望同種型(例如人類 IgGyl)的恒定(Fc)區(qū)。PCR擴(kuò)增的DNA片段可利用連接子或 限制性位點(diǎn)直接測(cè)序或克隆入載體中，用于編碼序列的測(cè)序，其可 改變并再克隆入其他栽體中用于將抗體表達(dá)為重組蛋白的編碼序 列。
多克隆或寡克隆細(xì)胞種群的mRNA還可用于構(gòu)建特異于特定 同種型抗體分泌細(xì)胞的cDNA文庫(kù)，其可例如作為p藍(lán)菌體顯示文庫(kù)、 細(xì)菌文庫(kù)、酵母菌文庫(kù)或者可用于復(fù)制和4呆持DNA,尤其是編碼 蛋白的DNA的任何其他形式的生物學(xué)文庫(kù)。例如，重組抗體序列 的文庫(kù)可以利用/人一種或多種寡克隆細(xì)月包種群^是耳又的mRNA生產(chǎn)， 用于在細(xì)菌或真核宿主細(xì)胞中生產(chǎn)抗體，然后用于在鑒定一種或多 種具有期望抗原特異性和/或生物學(xué)活性的抗體范圍內(nèi)篩選這種抗 體。
一旦被克隆和表征，抗體可在原核生物(例如大腸桿菌； Sore認(rèn)n H and Mortensen K, 2005; Venturi et al., 2002 )、植物(Ma JK et al., 2005 )或真核細(xì)月包，尤其是人類、嚙齒動(dòng)物或其{也作為瞬時(shí) 或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞而允許高水平表達(dá)的真核細(xì)胞系(例如CHO、COS、 HEK293 ) ( Schmidt F, 2004 )中表達(dá)為重組蛋白，這一點(diǎn)尤其當(dāng)抗 體的表征必須利用更復(fù)雜分析(包括體內(nèi)分析)時(shí)是必需的。宿主 細(xì)胞可才艮據(jù)所克隆的單克隆抗體的重組表達(dá)水平進(jìn)一步篩選。
在這個(gè)范圍內(nèi)，克隆的4元體序列可4又在DNA水平(例如，消 除或插入限制性位點(diǎn)，優(yōu)化密碼子選擇，適配轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)節(jié)序 列)或在DNA和蛋白水平(例如，添加其他蛋白序列或修飾內(nèi)部
氨基酸)，利用PCR或其他重組DNA技術(shù)進(jìn)行修飾。此外，可利 用重組DNA技術(shù)而生成基于這些抗體的片段(Fv, Fab, F(ab)，或 F(ab)")或融合蛋白。
例如，還可通過選4奪將融合于可變區(qū)的特異Fc區(qū)(Furebring C etal., 2002)、通過添加穩(wěn)、定4匕肽序列(WO 01/49713 )、通過生成重 組單鏈抗體片,殳(Gilliland LK et al.， 1996)或通過將放射化學(xué)物質(zhì) 或聚合物添加到化學(xué)小務(wù)飾的殘基(Chapman A et al.， 1999 )而在結(jié)構(gòu) 和/或活性水平修飾重組抗體。
已將不同栽體系統(tǒng)用于生產(chǎn)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系池(Aldrich TL et al.， 2003; Bianchi A and McGrew JT， 2003 )，且已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了重組抗 體的高7JC平、伊"匕、,急定的表達(dá)(Schlatter S et al.， 2005; Dinnis D and James D， 2005; Kretzmer G， 2002),這是由于細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化 (Grunberg J et al" 2003; Yoon SK et al" 2004 )以及通過選擇或設(shè)計(jì) 改造具有較高抗體生產(chǎn)水平的克隆體(Bohm E et al.， 2004; Borth N， 2002; Chen K et al" 2001; Butler M, 2005 )。
來自細(xì)胞培養(yǎng)物的非重組/重組抗體的純化可利用文獻(xiàn)中描述 的技術(shù)以及其他改進(jìn)的技術(shù)來實(shí)施(Hale G et al.， 2004; Horenstein AL et al,， 2003 )。然而，臨床開發(fā)和應(yīng)用應(yīng)基于抗體藥動(dòng)學(xué)和藥效 學(xué)的表征(LoboEetal., 2004)并符合用于人類治療和體內(nèi)診斷用 途的鼠類、人類和遺傳改造的單克隆抗體生成和質(zhì)量控制的國(guó)際要 求(EUDRA document 3AB4a )。
現(xiàn)在本發(fā)明將借助于以下實(shí)施例進(jìn)行描述，這些實(shí)施例不應(yīng)以 任何方式解釋為限制本發(fā)明。
實(shí)施例
實(shí)施例1:用于細(xì)胞純化和刺激的方法對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)務(wù)陣下B細(xì) 月^活和增殖的影響
材料和方法
入類S細(xì)/《的為、離和/術(shù)存
通過在Ficoll/Hypaque上的常規(guī)密度梯度離心從外周血純化新 鮮的外周血單核細(xì)胞(PBMC)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的不同，隨后將細(xì)胞利用 來自單一供體的PBMC或來自5個(gè)不同供體的混合PBMC進(jìn)行處 理，以便評(píng)估對(duì)不同實(shí)驗(yàn)條件的平均反應(yīng)并減少由于供體變異而導(dǎo) 致的差別。
利用如由生產(chǎn)商所描述的VarioMACS才支術(shù)(Miltenyi Biotec Inc.),通過免疫磁性細(xì)胞分選從PBMC中分離人類B細(xì)胞。簡(jiǎn)而 言之，將PBMC懸浮于補(bǔ)充了 0.5。/。BSA(牛血清白蛋白)和2mM EDTA (乙二胺-N,N,N'，N'-四乙酸西旨)的PBS (石粦酸鹽緩沖鹽水) 中并與不同的微珠結(jié)合抗體(針對(duì)CD19、 CD22或CD27) —起孵 育。隨后洗滌微珠結(jié)合細(xì)胞并使其在磁場(chǎng)中通過用于其陽性選擇的 柱子(LS柱；Miltenyi cod. 30-042-401 )。然后依照生產(chǎn)商的i兌明書 (Miltenyi Biotec Inc.)，矛J用MACS MultiSort釋方文劑(20 pl/ml) 于4GC使細(xì)胞從微珠釋放達(dá)10分鐘。
依照生產(chǎn)商的"i兌明書，通過細(xì)胞分選對(duì)IgM陽性細(xì)胞進(jìn)4亍陰性 選才奪或者通過利用VarioMACS才支術(shù)(Miltenyi Biotec Inc.)對(duì)IgG 陽性細(xì)胞進(jìn)行》茲選而獲得IgG陽性B細(xì)胞。為了進(jìn)行細(xì)胞分選，將 CD22陽性B細(xì)胞(在有或沒有提前刺激的情況下)與最適濃度的 抗人類IgM-FITC ( Becton Dickinson n.555782 ) —起冰上孵育1小
時(shí)。細(xì)胞用PBS徹底清洗，然后利用高速分選儀(MoFlo 高效細(xì) 胞分選儀)在無菌條件下分為IgM陽性和IgM陰性細(xì)胞。
將所選細(xì)胞懸浮并保存在補(bǔ)充了 10% (v/v)熱滅活FCS (胎 牛血清)、lmM丙酮酸鈉、100 ug/ml鏈霉素和100U/ml青霉素的 RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基中，并于370C和5% C02下在24孔板中進(jìn) 行培養(yǎng)。
》辦激細(xì)y^^1,4^ ^的5細(xì)/S
CpG2006 ( 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-S' ; SEQ ID NO: 1)購(gòu)自Coley制藥集團(tuán)(Coley Pharmaceutical Group )。重組 人類白介素2 (IL-2 )通過Roche獲得。重組人白介素4 (IL-4 )獲
自Peprotech。重組人CD40配體(包含氨基酸108-261的可溶性片 段)獲自 R&D Systems 。
金黃色酉良膿葡萄球菌柯萬菌才朱
(Staphylococcus aureus Cowan strain ) ( SAC )和月旨多糖類(LPS ) 購(gòu)自Sigma。
遞過3//-*夯凝承承;/定^細(xì)應(yīng)增磁
將細(xì)月包(2 x lOVml )在指定的培養(yǎng)條件下以一式三^f分的4羊品4妾 種到96孔板(50 pl/孔)中并通過實(shí)-瞼結(jié)束前8-16小日寸添力口 3ji-胸 芬(NET-027X胸香，甲基JH;特異活寸生20 Ci/mmol; PerkinElmer ) (0.5 ^Ci/孔)力。以標(biāo)記。通過將細(xì)胞收集到利用(3 -計(jì)數(shù)器(Wallach Instrument)計(jì)數(shù)的玻璃纖維過濾器中來測(cè)定3H-胸苷的攝取。
々/^7 FJCS為N^表面^^記4^的表達(dá)
一夸纟田月包(3 x 10V才羊品)懸浮于含0.5%牛血清白蛋白的PBS中， 并與所選的針對(duì)CD22 (用FITC標(biāo)記)的單克隆抗體一起于4GC孵
育30分鐘。洗滌之后，利用FACSCalibur流式細(xì)胞儀和CellQuest 軟件(Becton Dickinson )分析熒光。單克隆抗體的背景結(jié)合活性借 助于同種型匹配的陰性對(duì)照單克隆抗體進(jìn)行評(píng)估。所分析細(xì)胞的數(shù) 量為10000。
差f化CS"的細(xì)應(yīng)為、逸
利用MoFlo⑧高效細(xì)胞分選儀(Dako)來進(jìn)行纟田月包分選。IgG 表達(dá)細(xì)胞的陰性選擇從細(xì)胞(107/ml )與抗人類單克隆IgM-FITC( 10 (^1/106個(gè)細(xì)月包；Becton Dickinson Cat. No. 555782 )或4元人類多克隆 IgM-FITC ( 2 |^1/106個(gè)細(xì)月包；Jackson, Cat. No. 309-096-043 ) —起在 4GC孵育1小時(shí)開始，然后清洗細(xì)胞并懸浮于分選緩沖液(含5mM EDTA、 25 mM Hepes (羥乙基哌。秦乙石黃酸)和1% FCS的PBS )中 (10-20 x 106/ml)。根據(jù)形態(tài)學(xué)參數(shù)(Rl )對(duì)細(xì)胞設(shè)立門控。CD22 陽性、IgM陰性B細(xì)月包在Rl區(qū)i或內(nèi)選擇。
結(jié)果
文獻(xiàn)提供的關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)條件下純化和刺激B細(xì)胞的不同方 法對(duì)細(xì)胞存活和增殖的影響的對(duì)比信,包、較少。
白介素2 (IL-2)用作參照化合物，是因?yàn)榭紤]到該細(xì)胞因子 對(duì)細(xì)月包培養(yǎng)物中原代人類B細(xì)月包已確定的促生長(zhǎng)作用(Banchereau J and Rousset F, 1992 )。利用原 B細(xì)月包進(jìn)4亍首次比4交，該原4戈B細(xì) 胞才艮據(jù)其表面上CD22的表面表達(dá)從人類PBMC純化然后用熟知的 多克隆B細(xì)胞刺激劑CpG2006、脂多糖類(LPS )、可溶性CD40 配體(CD40L)和金黃色葡萄J求菌對(duì)可萬菌4朱(SAC)協(xié)同刺激。
在4天的3H胸苷揭_耳又測(cè)定中，當(dāng)LPS、 SAC和CD40L與IL-2 一起加入細(xì)胞培養(yǎng)基中時(shí)，可測(cè)得對(duì)細(xì)胞增殖的正向劑量反應(yīng)。然
而，以文獻(xiàn)(Bernas,i N et al., 2003; Traggiai E et al" 2004 )中通 常描述的濃度而加入的CpG2006組合表明，當(dāng)與IL-2組合時(shí)，該 化合物具有顯著4交高的i秀導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)物中B細(xì)胞增殖的能力(圖 2)。類似于用CpG2006與IL-2的組合獲得的那些結(jié)果，在該分析 中通過聯(lián)合可溶性CD40L (以至少0.5昭/ml的濃度)與另 一種細(xì) 胞因子IL-4 (至少20 ng/ml)可獲得誘增殖效應(yīng)的結(jié)果，表明一旦 已確定對(duì)IgG分泌的最佳動(dòng)力學(xué)和作用，則該化合物組合可用作本 發(fā)明方法中的刺激劑。
考慮到聯(lián)用IL-2與CpG2006鑒定的效應(yīng)程度，則利用濃度范 圍為0直至2.5昭/ml的CpG2006而進(jìn)行CpG2006對(duì)最佳B細(xì)胞增 殖和母細(xì)月包形成的滴定，同時(shí)〗呆持IL-2濃度的恒定。
在濃度4氐至0.15 pg/ml處4企測(cè)到CpG2006所i秀導(dǎo)的CD22陽性 人類B細(xì)胞的顯著增殖，在0.3 ng/ml處達(dá)到平臺(tái)(圖3A)。當(dāng)通 過FACS分析相同細(xì)胞種群中存活細(xì)胞和母細(xì)胞(具有高度前向散 射的大細(xì)胞)的百分比時(shí)，最佳CpG2006濃度似乎稍微較高(在 0.6和1.25jag/ml之間)，這是由于在這些濃度下可產(chǎn)生較高百分?jǐn)?shù) 的母細(xì)胞(圖3B )。
這個(gè)關(guān)于CpG2006/IL-2組合的證據(jù)，盡管確認(rèn)之前表明 CpG2006的B細(xì)胞刺激作用的結(jié)果可在低于lng/ml的濃度下獲得， 表明受刺激CD22陽性B細(xì)力包的增殖和母細(xì)力包形成可在一個(gè) CpG2006濃度范圍(0.3-1昭/ml)內(nèi)獲得。
在這些實(shí)-瞼中，以恒定濃度(1000 U/ml)加入IL-2，但是在 IL-2濃度不同而CpG2006濃度恒定時(shí)可進(jìn)行類似的劑量反應(yīng)，以 進(jìn)一步確定能夠在CpG2006存在時(shí)誘導(dǎo)人類B細(xì)胞增殖和母細(xì)胞 形成的最佳IL-2濃度。后續(xù)實(shí)驗(yàn)還表明，IL-2可在100U/ml和1000 U/ml之間的濃度范圍內(nèi)使用。
因此，除了選擇多克隆B細(xì)胞刺激劑之外，確定特定化合物應(yīng) 當(dāng)采用(單獨(dú)或組合)的濃度對(duì)于獲得對(duì)細(xì)胞增殖的期望作用非常
重要。以CD19/CD27陽性細(xì)胞為例，示出了 B細(xì)胞對(duì)基于CpG2006 的活4匕劑和細(xì)月包因子的反應(yīng)性和增殖(Bernasconi et al.， 2002; Jung J et al., 2002 )。然而，似乎文獻(xiàn)(Hartmann et al" 2000; Klinmann D et al.， 1996; Fearon K et al.， 2003 )中已殺口 CpG2006只于B細(xì)月包存活的負(fù) 向作用中至少一部分通過采用特定條件、濃度及化合物的組合可被 降低。
從生物樣品中純化原代B細(xì)胞的方法可以成為構(gòu)建一個(gè)過程 要考慮的另一要素，其中該過程中，這些原代B細(xì)胞的存活和增殖 能力在刺激劑存在時(shí)不會(huì)受到細(xì)胞培養(yǎng)條件和體外操作的危害。
文獻(xiàn)中主要描述了兩種細(xì)胞表面標(biāo)記物對(duì)于利用例如固體支 持物CD19和CD2而陽性地選擇人類B細(xì)胞非常有用，可將聯(lián)用 IL-2和CpG2006的刺纟敫方案應(yīng)用到利用CD19或CD22特異'l"生樣吏J朱 純化的人類B細(xì)胞上。
在刺激之前和之后對(duì)細(xì)胞存活和母細(xì)胞形成進(jìn)行基于FACS的 分析。這兩種用于細(xì)胞純化的方法之間的比較清楚地表明，純化之 后不久，CD22陽性細(xì)胞種群比CD19陽性種群更均質(zhì)(圖4A)。 當(dāng)CD22陽性種群比CD19陽性種群具有4交高頻率的存活細(xì)胞和顯 著較大比例的活化大細(xì)胞時(shí)，這種對(duì)純化方法的細(xì)胞反應(yīng)在刺激4 天后甚至更明顯(圖4B )。利用加載有CD22特異性抗體(而非CD19 特異性抗體)的微珠純化的B細(xì)胞存活性增加，可能是由于由兩種 不同選4奪手革殳對(duì)這些細(xì)月包生長(zhǎng)潛力所發(fā)4軍的下游效應(yīng)不同。
此夕卜，CD22陽性B細(xì)胞可通過應(yīng)用其他選4奪手段如用于陽性 選擇IgG表達(dá)細(xì)月包、或4壬4可其他相關(guān)B細(xì)月包亞群如CD27陽性記憶 B細(xì)胞的微珠進(jìn)行選擇和刺激。
一旦表明用于細(xì)胞刺激和選擇的手段的選擇影響細(xì)胞存活和
增殖，則可能涉及的另一個(gè)要素即CD22卩曰性人類B細(xì)月包對(duì)用IL-2 學(xué)。 、、、 - 、 -
細(xì)胞存活和增殖在開始刺激后2、 4、 6天進(jìn)行檢測(cè)，表明 CpG2006 ( 1昭/ml)和IL-2 ( 1000 U/ml)的聯(lián)合效應(yīng)提供了獨(dú)特的 動(dòng)力學(xué)。單獨(dú)由CpG2006誘導(dǎo)的最大SH-胸苷纟參入早至培養(yǎng)2天即 可觀察到，其后快速下降。對(duì)單獨(dú)IL-2的細(xì)力包增殖反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是較 為漸進(jìn)性的，其中直至培養(yǎng)的第6天？H-胸苷摻入還在不斷增加。 然而，利用CpG2006和IL-2的聯(lián)合刺激提供了類似于CpG2006的 &-胸苷摻入動(dòng)力學(xué)，但第2天出現(xiàn)顯著增強(qiáng)的效應(yīng)，持續(xù)至第4 天并在培養(yǎng)的第6天下降(圖5 )。平行地，檢測(cè)通過CpG2006和 IL02刺激的培養(yǎng)物中存活細(xì)胞總數(shù)，再次表明在第2天和第4天出 現(xiàn)較高的存活細(xì)胞數(shù)。
因此，聯(lián)用兩種刺激劑的優(yōu)勢(shì)顯然較為重要，尤其是在培養(yǎng)的 第4天，》匕時(shí)分別由IL-2和CpG2006觸發(fā)的步文應(yīng)(具有相反方向 的動(dòng)力學(xué))之間達(dá)到平衡。這些數(shù)據(jù)還表明，通過同時(shí)以及依次加 入刺激劑(即，刺激階段開始時(shí)加入一種，幾小時(shí)或幾天之后加入 另一種)均可能對(duì)抗體分泌細(xì)月包的細(xì)月包增殖和存活發(fā)4軍類似或甚至 更好的作用抗體分泌。
實(shí)施例2:于細(xì)力包純4匕和刺、激的方法對(duì)利用EBV7Jc生^t的B 細(xì)胞存活、增殖和抗體分泌的影響
才才泮+和方法
6細(xì)應(yīng)增磁和存活的逸脊和為Vf
除非另有指明，人類B細(xì)胞的選擇、其刺激及分析如實(shí)施例1 中所指出的那樣而實(shí)施。
遞過/^CS 乂,衷面^^記務(wù)褒這迷/f為、^f
如上文對(duì)CD22所指出的，利用抗-CD21-PE結(jié)合物(Caltag Laboratories, Cat. No. MHCD2104， batch 04061206 )，通過免疫焚光 和流式細(xì)胞4義可才企測(cè)CD21陽性細(xì)月包。
￡3病毒6&SFJ丄清濕的斜務(wù)
將產(chǎn)生EBV的B95-8狨猴淋巴瘤細(xì)胞(ATCC No. CRL-1612; 5 x 10Vml)在補(bǔ)充了 10% FCS (完全培養(yǎng)基)的RPMI-1640細(xì)胞培
養(yǎng)基中培養(yǎng)4天。
^!尋指^:生長(zhǎng)的B95畫8細(xì)胞用100 nM 4弗波酯(phorbol ester )(例 ^口PMA; Sigma)刺;效2小時(shí)(OhHMetal., 2003 ),然后用HBSS (Hank，s平衡鹽溶液；Sigma )徹底清洗以除去溶液中的PMA。將 PMA刺激的B95-8細(xì)月包在添加了 10% FCS的完全RPMI-1640細(xì)胞 培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)，并收集上清液、離心并通過0.22 jam膜過濾。
永生化效力在來自不同血液供體的3種不同的CD22陽性B細(xì) 胞制品上加以評(píng)估。在所有情形下，均觀察到快速永生化并且獲得 表現(xiàn)出快速?gòu)?fù)制的多克隆類淋巴母細(xì)胞系。在缺少PMA刺激時(shí)， 利用在常規(guī)條件下制備的一批病毒平行實(shí)施永生化，表現(xiàn)為復(fù)制較慢。
己力/激的人類/gM厲7^S細(xì)y敏的五SF^^化
在用IL一2 ( 1000 U/ml)和CpG2006 ( 1 pg/ml )刺;效4天后， 用新鮮培養(yǎng)基徹底清洗CD22陽性、IgM陰性細(xì)胞，以在暴露于EBV 上清液之前去除刺;敫劑。
細(xì)胞的批量永生化如下實(shí)施通過將其(106/ml)與EBV上清 液(在添加了 10% FCS的RPMI-1640中，50%V/V ) —起印孚育至少 4小時(shí)直至18小時(shí)，然后用新鮮i咅養(yǎng)基清洗。用50。/。EBV上清液 處理4-18小時(shí)的細(xì)力包增殖和存活與用30%EBV上清液處理7天相當(dāng)。
隨后濃縮細(xì)月包(在添力口了 10% FCS和1000U/ml IL畫2的 RPMI-1640中，106/ml)并以0.5 x 105受輻照的(3000 rad )同種 PBMC/孔在24孔才反上4妻種，達(dá)8-16天。
W刀7大蘭化人類5 -皮/《的不^7才法趁果的定^和定量^
一乂
人類B細(xì)胞已經(jīng)作為從5個(gè)正常供體混合的CD22陽性外周血 單核細(xì)胞(PBMC)通過》茲選而分離，如實(shí)施例1所述，然后分到 三個(gè)細(xì)月包池中，每一個(gè)均暴露于基于EBV的不同方法，用于B細(xì) 月包7Jc生^匕。
在BASIC方法中，這些細(xì)月包中的IgG陽性部分利用MoFIo高 速細(xì)月包分選4義(MoFIo Cytomation)和4元人類IgG FITC ( Becton Dickinson)通過細(xì)胞分選而選擇。隨后，將8xl()5個(gè)CD22陽性、 IgG陽性細(xì)月包利用EBV上清液(如上所述制備的)培養(yǎng)12小時(shí)、 清洗并在受輻照同種PBMC飼養(yǎng)層存在下，以1.5 x 106個(gè)細(xì)月包/011 的密度在補(bǔ)充了 L-谷酰胺、非必需氨基酸(NEAE)和10%FCS的 IMDM培養(yǎng)基(Gibco-BRL )中37。C培養(yǎng)10天。
在COMBINED方法中，已經(jīng)如同BASIC方法中所述分離了 8 xl()5個(gè)CD22陽性、IgG陽性細(xì)胞離，然后在受輻照同種PBMC詞 養(yǎng)層存在下，以1.5 x 1()6個(gè)細(xì)胞/ml的密度利用CpG2006 ( 1昭/ml) 和IL-2 ( 200 U/ml )以及EBV上清液(如上文所述制備)在補(bǔ)充了 L-谷酰胺、NEAE和10% FCS的IMDM培養(yǎng)基(Gibco-BRL )中， 37GC培養(yǎng)10天。
在SEQUENTIAL方法中，在#卜充了 L-谷酰胺、NEAE和10% FCS的IMDM培養(yǎng)基(Gibco-BRL )中，首先用CpG2006 ( 1 pg/ml) 和IL-2 ( 200 U/ml)的組合物于37QC預(yù)刺激CD22陽性PBMC，然 后用PBS清洗細(xì)胞并如上所述通過磁選富集IgG陽性細(xì)胞。然后將 預(yù)刺激的細(xì)月包(8 x 105個(gè)CD22卩日性IgG陽性PBMC )利用EBV 上清液(如在BASIC方法中)37化感染12小時(shí)、清洗并在受輻照 同種PBMC飼養(yǎng)層存在下，以1.5 x 1()6個(gè)細(xì)胞/ml的密度在IMDM 培養(yǎng)基(含L-谷酰胺、NEAE和10% FCS )中370C培養(yǎng)10天。
遞i2^4化丙錠和》悉^細(xì)/《僅^，!/細(xì)/《數(shù)量和存活#
B細(xì)胞總數(shù)通過顯樣￡鏡計(jì)數(shù)而檢測(cè)，其存活性則通過利用 FACSCalibur臺(tái)式流式細(xì)月包4義和CellQuest壽欠件(Becton Dickinson Biosciences);險(xiǎn)測(cè)DNA嵌入的焚光染料硤化丙錠排除而檢測(cè)。簡(jiǎn) 而言之，將細(xì)胞在室溫下暴露于碘化丙錠(PI， Sigma;在PBS中 的終濃度為2.5 pg/ml )，并在30分鐘內(nèi)通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。 存活的細(xì)胞定義為那些具有較高前向和正交散射(淋巴細(xì)胞和淋巴 母細(xì)胞的特性)且排除PI的細(xì)胞。用PI染色且具有較低前向散射 的細(xì)胞代表死亡細(xì)胞和石卒片。
或面表這的為、^f
如實(shí)施例1所述，利用抗人類CD23-PE結(jié)合物(Becton Dickinson, catalog no. 555711 )的直4妾免疫焚光(R2區(qū)i或)禾口-充式 細(xì)胞儀通過FACS設(shè)置電子門控，在存活淋巴母細(xì)胞中檢測(cè)CD23 的表達(dá)。
摩為、泌/gG的^W
培養(yǎng)物上清液中總?cè)祟怚gG的分泌」疾照生產(chǎn)商的"^兌明書利用 ELISA( Immuno畫Tek/Zeptometrics, cat. no. ZMC 0801182 )進(jìn)4亍才全測(cè)。 簡(jiǎn)而言之，培養(yǎng)物上清液從培養(yǎng)物收集并在4。C保存。將上清液樣 品系列稀釋并與ELISA試劑盒中包含的純化人類IgG標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行 比較。測(cè)量結(jié)果反映10天培養(yǎng)期內(nèi)培養(yǎng)物中累積的IgG總量。
結(jié)果
由于整個(gè)工藝(方法)的范圍是以最直接的方式生產(chǎn)永生化的 人類抗體分泌型細(xì)胞，所以選擇EBV作為永生化試劑，對(duì)于構(gòu)建 和應(yīng)用利用來自受該病毒感染細(xì)"包的上清液是十分直4妾的。然而， 為人熟知的是，實(shí)際上僅一部分暴露于EBV的細(xì)胞被感染，可能 由于CD21 (—種存在于細(xì)胞表面上為病毒利用進(jìn)入細(xì)胞的受體) 的表達(dá)有卩艮(Jondal and Klein， 1973; Nemerow et al" 1985; Boyd and Fecondo， 1988 )。因此，判斷CD21表達(dá)受上述所選用于細(xì)胞刺激和 純化的手段與條件正向還是負(fù)向影響，非常重要。
在該范圍內(nèi)，用IL-2 ( 1000 U/ml)和CpG2006 ( 1 |ig/ml)刺 激4天之后，根據(jù)不同細(xì)胞標(biāo)記物H叉CD22卩曰性，CD22陽性和 CD27卩日性，CD22和IgG陽性，CD22卩曰性和IgM陰性)所選B細(xì) 胞種群的增殖動(dòng)力學(xué)，并在不同時(shí)間點(diǎn)4企測(cè)CD21卩曰性細(xì)胞的比例。 在所有實(shí)驗(yàn)中，CD21在〉90%的存活和增殖細(xì)胞中表達(dá)，也證實(shí)了 在本發(fā)明方法中采用雙重選4奪途徑的可能性。
因此，在證實(shí)由所選用于纟田胞刺激和純化的手段與條件對(duì)細(xì)胞
增殖活性發(fā)揮的強(qiáng)大正向作用之后，檢測(cè)該途徑還可如何改善B細(xì) 胞對(duì)永生化試劑的反應(yīng)。事實(shí)上，已知在B細(xì)胞暴露于EBV之后， 大部分的細(xì)胞停止生長(zhǎng)并在培養(yǎng)的第一周內(nèi)死亡，隨后通過EBV 永生化細(xì)胞重新恢復(fù)增殖(James K and Bell G, 1987 )。因此，理解 適當(dāng)比例經(jīng)恰當(dāng)刺激和選擇的人類B細(xì)胞是否可利用EBV永生化， 并理解這些永生化B細(xì)胞能否較好地克服EBV永生化后的關(guān)鍵時(shí) 期，將非常重要。
在用或不用CpG2006和IL-2提前刺激時(shí)，將人類CD22陽性、 IgM陰性B細(xì)胞過夜暴露于EBV上清液、清洗并用包含IL-2 ( 100 U/ml )的培養(yǎng)基在受輻照同種PBMC的飼養(yǎng)層上接種。接下來的幾 天內(nèi)沖全測(cè)這些細(xì)胞的增殖。以這種方式，可證實(shí)用CpG2006和IL-2 對(duì)B細(xì)胞的預(yù)處理引起在EBV永生化后B細(xì)胞恢復(fù)增殖的速度和 程度增強(qiáng)。這一點(diǎn)可在暴露于EBV上清液之后第7天最清楚地證 實(shí)，其中相比于未經(jīng)預(yù)刺激的細(xì)胞，幾乎50%以上的細(xì)胞存在于經(jīng) 過預(yù)刺激的培養(yǎng)物中(圖6A )。當(dāng)經(jīng)過預(yù)刺激的CD22陽性B細(xì)胞 未額外4非除IgM陽性細(xì)月包時(shí)，也可i正實(shí)該^L察結(jié)果。
之前的方法描述了在其利用EBV上清液永生化的過程中(而 不僅之前)應(yīng)用多克隆B細(xì)胞活化劑的益處，其中并沒有從細(xì)胞培 養(yǎng)物中去除活4匕劑的步-驟(WO 91/09115; Hur D et al.， 2005; Traggiai E et al.， 2004; Tsuchiyama L et al., 1997; WO 04/076677 )。因jt匕，在 CpG2006 ( 1 pg/ml )和IL-2 ( 1000 u/ml)存在與否的十青況下，；險(xiǎn)測(cè) 暴露于EBV上清液7天的CD22陽性、IgM陰性B細(xì)胞培養(yǎng)物中 的細(xì)胞凄t量。然而，在EBV永生化過程中CpG2006和IL-2的存在 導(dǎo)致存活B細(xì)胞數(shù)量減少，如可通過顯微鏡計(jì)數(shù)細(xì)胞所證實(shí)的(圖 6B)。相比于僅暴露于EBV上清液的細(xì)胞這種減少已經(jīng)很顯著，但
在考慮通過獨(dú)立預(yù)刺激階段獲得的數(shù)據(jù)時(shí)這一點(diǎn)甚至更加重要(圖
6A )。
這些數(shù)據(jù)表明，其中人類B細(xì)胞培養(yǎng)物用刺激劑(單獨(dú)或組合 使用，如CpG2006和IL-2 )處理的獨(dú)特刺激階段對(duì)利用EBV的B 細(xì)胞選擇和永生化的整個(gè)過程均發(fā)揮有益作用。這種正向作用可通 過利用刺激劑的其他特定組合(例如，濃度降低的CpG2006和/或 IL-2)和/或通過將刺激階段局限于其中B細(xì)胞表現(xiàn)出最佳增殖活性 和相關(guān)標(biāo)記物(如CD21 )表達(dá)的時(shí)期(例如，2到4天之間)而進(jìn) 一步增強(qiáng)。如果CD22陽性B細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活受到刺激劑與EBV 上清液連續(xù)而廣泛存在的負(fù)向影響，則永生化階段之前刺激劑的去 除對(duì)于從該方法獲得最好結(jié)果非常關(guān)鍵。
上文4是供的lt據(jù)不僅證實(shí)將該方法應(yīng)用于根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)記 物(例如，CD21、 CD23、 CD24、 CD27和/或CD22 )表達(dá)而確定 的人類B細(xì)胞特定亞群的可能性，而且證實(shí)了進(jìn)一步應(yīng)用與B細(xì)胞 分泌抗體相關(guān)的篩選標(biāo)準(zhǔn)的可行性。在本發(fā)明中，在繼續(xù)永生化前 采用去除表達(dá)特定同種型(IgM)抗體的細(xì)胞的技術(shù)。
事實(shí)上，EBV感染后10天對(duì)CD22卩日性、經(jīng)CpG2006/IL-2刺 激、排除IgM的、EBV永生化的B細(xì)力包進(jìn)行的基于FACS的分析 證實(shí)幾乎全部存活細(xì)胞(由兩個(gè)右側(cè)象限中4交高的前向散射表示 的)持續(xù)保持IgM陰性(右下象限)，是一種用于治療性抗體生成 更理想的表型(圖7A)。人類永生化同種型特異性B細(xì)胞培養(yǎng)物可 利用本發(fā)明方法生成和保持的進(jìn)一步證據(jù)，通過在免疫擴(kuò)散測(cè)定中 檢測(cè)上述B細(xì)胞的上清液而獲得，如文獻(xiàn)中通過免疫擴(kuò)散而實(shí)施的 (Mancini G et al., 1965 )，確認(rèn)了這種B細(xì)胞基本上是IgG分泌型 細(xì)月包(圖7B )。 這種在EBV永生化之前耦接B細(xì)力包特異性刺激和基于同種型 的B細(xì)胞選擇的意外陽性效應(yīng)可通過包括其他B細(xì)胞選擇手段而得 到進(jìn)一步改善。
這種方法的效力可根據(jù)CD22 P日性、用CpG2006/IL-2刺激的 IgM陰性B細(xì)胞的克隆效率而沖全測(cè)。所得到的細(xì)月包在CpG2006和 IL-2存在時(shí)體外擴(kuò)增2-4天，然后通過陽性或基于IgM的陰性選擇 而富集IgG陽性亞群。將CD22陽性、IgM陰性B細(xì)月包用EBV感 染并通過感染后l-4周在96孔4反中有限稀釋而進(jìn)行克隆。批量培養(yǎng) 物的克隆步文率可通過在該:批量培養(yǎng)物的每一個(gè)4企測(cè)牙希釋度(例如， 1:5, 1:10， 1:25, 1:50, 1:100， 1:200)或在每孔的各個(gè)細(xì)月包濃度下(例 如每孑L為1， 5， 10, 20， 25, 50， 100, 200或更多個(gè)細(xì)月包)下對(duì)包含生長(zhǎng) 細(xì)胞的孔數(shù)計(jì)分而進(jìn)行評(píng)價(jià)。
當(dāng)實(shí)施EBV永生化時(shí)最重要的考慮之一是保持細(xì)胞的存活性 而用于隨后的克隆。在試圖鑒定可能在外周血中以極低頻率 (<1:1000)存在的抗原特異性B細(xì)胞時(shí)尤其如此。現(xiàn)在已經(jīng)公認(rèn)， EBV是一種多克隆B細(xì)胞刺激劑，但是B細(xì)胞暴露于EBV導(dǎo)致培 養(yǎng)4勿中纟田月包死亡的#刀士臺(tái)其月(Sugimoto M et al.， 2004 )。
支持本發(fā)明的進(jìn)一步數(shù)據(jù)已經(jīng)通過比較在從5個(gè)正常供體集中 的CD22陽性外周血單克隆細(xì)胞(PBMC)的相同起始種群上實(shí)施 EBV介導(dǎo)的三種細(xì)月包永生4匕方法的結(jié)果而得到(圖8A)。
在BASIC方法中，采用了一種非常簡(jiǎn)單的方法，其中CD22 陽性、IgG陽性細(xì)胞僅暴露于包含EBV的上清液達(dá)12小時(shí)、清洗 并在恰當(dāng)細(xì)月包培養(yǎng)基和飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)10天。在COMBINED方法 中，CD22陽性、IgG陽性細(xì)胞同時(shí)暴露于細(xì)月包培養(yǎng)基中的EBV和 多克隆活4匕{式劑(CpG2006和IL-2 )達(dá)10天，類如乂于文獻(xiàn)中關(guān)于 同時(shí)4吏用這些4匕合物的4苗述(Traggiai E et al.， 2004; Tsuchiyama L et al.， 1997)。 SEQENTIAL方法是應(yīng)用本發(fā)明方法的一種可能方式， CD22陽性細(xì)力包首先暴露于CpG2006和IL-2的組合物并清洗，然后 純化IgG陽性細(xì)胞并將CD22陽性、IgG陽性細(xì)胞暴露于含EBV的 上清液中達(dá)12小時(shí)，清洗并再次在恰當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)基中和飼養(yǎng)細(xì)胞 上培養(yǎng)10天。
由于CD22陽性、IgG陽性細(xì)月包的絕乂十^:量乂于在初始暴露于
EBV時(shí)的所有條件均進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化，所以由IO天培養(yǎng)結(jié)束時(shí)細(xì)胞 培養(yǎng)物和上清液分析測(cè)得的數(shù)據(jù)應(yīng)纟是供這三種方法的精確比專交結(jié)
果。事實(shí)上，BASIC和SEQENTIAL方法使細(xì)胞總數(shù)增加，得到初 始細(xì)胞數(shù)的幾乎2倍(200%),比COMBINED方法所獲得的增加 (1.5倍(150%))更顯著。更重要的，當(dāng)確定了存活細(xì)胞的數(shù)量時(shí)， 利用SEQENTIAL方法獲得的細(xì)胞種群表明相比于BASIC方法， 并且甚至更顯著地，相比于COMBINED方法，存活細(xì)胞的數(shù)量增 加(圖8B )。
隨后，利用不同的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)利用所述三種方法獲得的細(xì)胞種群進(jìn) 4亍更加定性的分析。
FACS分析表明，除了所有細(xì)胞均表達(dá)IgG的細(xì)胞種群之外， 其組成是不同的，作為一個(gè)整體，特別是在對(duì)應(yīng)于正在生長(zhǎng)和分裂 的存活淋巴母細(xì)胞的區(qū)域(碘化丙錠染色陰性且具有較高正向散 射；圖9中的R2區(qū)域)。相比于利用BASIC方法獲得的細(xì)胞種群 并且甚至更顯著i也，相比于利用COMBINED方法獲纟尋的，利用 SEQUENTIAL方法獲得細(xì)胞種群似乎在該區(qū)域中顯著較濃縮。由 于石輿4匕丙4定累積而具有4交高水平熒光的細(xì)"包是死亡的或者瀕死細(xì) 胞，利用BASIC和COMBINED方法獲得的種群都積累了較多這種 細(xì)胞，其將不能用于任何進(jìn)一步的亞克隆或篩選分析(圖9，左圖)。
還分析了存在于樣品中的存活淋巴母細(xì)胞種群的CD23表達(dá)， CD23是一種細(xì)胞表面標(biāo)記物，在大多數(shù)外周血B細(xì)胞以低水平存 在但其表達(dá)通常通過活化得以增強(qiáng)(Azim T and Crawford D, 1988 )。 因?yàn)镃D23表達(dá)與IgG分泌之間的直接關(guān)聯(lián)已經(jīng)在EBV永生化的 人類B細(xì)胞種群中得到證實(shí)(Wroblewski J et al., 2002 )，因此才是出 該指ft作為證據(jù)非常重要。CD23的表達(dá)水平在水平軸上以對(duì)-數(shù)值 示出并且表達(dá)給定的CD23量的相對(duì)細(xì)胞凄t在垂直軸上示出(圖9， 右圖)。很明顯，與利用COMBINED方法獲得細(xì)胞種群中所觀察的 相比，BASIC和SEQUENTIAL方法在比例顯著4交大的細(xì)月包中"i秀導(dǎo) 高水平的CD23表達(dá)，在COMBINED方法中很明顯僅極少數(shù)細(xì)胞 表達(dá)高水平的CD23,而出現(xiàn)CD23表達(dá)陰性或較低的細(xì)胞的積累。
對(duì)按照上述三種方法從相同原代B細(xì)胞池生產(chǎn)的細(xì)胞種群做 定性分析，提供了關(guān)于本發(fā)明方法的特定正向特性的重要信息。事 實(shí)上，已經(jīng)"i正實(shí)了將EBV永生化與多克隆刺激分開，而不是〗吏細(xì) 胞同時(shí)暴露于兩種類型的試劑， -提供的細(xì)胞種群存活性、CD23表 達(dá)和增殖潛力有所改善。此外，F(xiàn)ACS分析表明，本發(fā)明方法4是供 的細(xì)胞種群在某些方面類似于通過BASIC方法獲得細(xì)胞種群，但 具有4交高頻率的存活、母細(xì)胞樣細(xì)胞(參見圖9，左圖)。
該方面似乎對(duì)用于比4交不同方法的主要因素具有才各外重要和 驚人的影響細(xì)胞種群在相對(duì)較短細(xì)月包培養(yǎng)期(8-10天)內(nèi)在細(xì)胞 培養(yǎng)物上清液中所積累IgG的量J艮明顯，這些培養(yǎng)物上清液中IgG 分泌水平的任何改進(jìn)均正向影響其對(duì)抗體的篩選，因?yàn)槠淇梢钥s短 用于分離表達(dá)這種抗體的寡克隆或單克隆細(xì)胞培養(yǎng)物的時(shí)間周期。
對(duì)在相同的初始細(xì)胞種群上利用這三種方法獲得細(xì)月包培養(yǎng)物 中累積的總IgG進(jìn)行比較(其也已在暴露于EBV之前定量地標(biāo)準(zhǔn) 化)進(jìn)一步確認(rèn)了基于本發(fā)明方法的SEQUENTIAL方法的優(yōu)點(diǎn)。 事實(shí)上，如果BASIC和COMBINED方法提供相似濃度的總IgG
(80-100嗎/ml )，則從SEQUENTIA方法獲得的細(xì)胞上清液提供的 細(xì)胞，其表達(dá)的總IgG遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出用于所有^r測(cè)的稀釋因子的EUSA 試劑盒( 150昭/ml)線性范圍的水平(圖IOA)。
因此，不僅根據(jù)本發(fā)明方法獲得的多克隆細(xì)胞種群由活躍增殖 且存活的細(xì)胞構(gòu)成，而且表達(dá)的總IgG水平足以進(jìn)行多種不同的篩 選分析，而對(duì)化合物諸如多克隆刺激劑無任何可能的干擾，最后加 速確定表達(dá)感興趣IgG抗體的細(xì)胞存在的過程。
實(shí)施例3:表達(dá)可結(jié)合或中和治療扭標(biāo)的IgG抗體的人類B細(xì) 胞的選擇、刺激、永生化和篩選
材料和方法
表這/gG拔體的人類永i化S細(xì)/《的蘭成
圖11中提供了該程序的概述。所述條件和手段是實(shí)施例1和2 中確定的那些條件和手段。
CA/F微中和濕;/定
將人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)鋪到(2.0-2.5xl()4/孔)96孔板 的平底孔上并在37DC下培養(yǎng)24小時(shí)，每個(gè)孔中含100 pl補(bǔ)充了 10% 胎牛血清(FCS )、 1 mM丙酮酸鈉(NaP )、 2 mM谷酰胺、100 U/ml 青霉素和ioo嗎/ml鏈霉素(GPS)的伊格爾最低必需培養(yǎng)基 (MEM )。
將來自每一個(gè)B細(xì)胞培養(yǎng)物/克隆體的50 (J上清液與實(shí)驗(yàn)用菌 才朱CMV—起在96孔才反的圓底孔中(AD169;在50 pl補(bǔ)充了 5% FCS 的MEM中為500 pfu;混合物總體積為100 pi) 37°C孵育1小時(shí)。 棄去來自HELF培養(yǎng)物的培養(yǎng)基并用病毒混合物取代，隨后將該板
以2000g離心30分鐘并在C02中37°C孵育90分鐘。然后棄去培 養(yǎng)基，添加100 pi生長(zhǎng)培養(yǎng)基并將該培養(yǎng)物在培養(yǎng)箱中再保持72 小時(shí)。
B細(xì)胞上清液對(duì)CMV感染活性的影響通過HELF細(xì)胞的間接 免疫過氧化酶染色對(duì)人類CMV早期速發(fā)抗原(IEA)進(jìn)行染色而 檢測(cè)。將細(xì)胞單層用50%丙酮和50%曱醇(保存在-20GC)溶液室 溫(RT)固定1分鐘，然后用PBS清洗。將所述細(xì)胞在含1%H202 0.1% Triton X-100/PBS中滲透5分鐘，然后用PBS清洗。內(nèi)源性過 氧化酶用含50%曱醇和0.6% H202的PBS在暗處室溫封閉30分鐘， 然后用PBS清;先。力口入50 (J蛋白佳十閉劑(Ultra Tech HRP 500—600 Test; Streptavidin-Biotin Universal Detection System; PN IM2391 ), RT 放置10分鐘，然后用PBS清洗。將最佳濃度的一抗(抗人類CMV IEA; Argene Biosoft; RefNo. 11-003 )力口入孑L中，RT方文置60分鐘。 清洗孔，然后將50 pi生物素化二抗(Ultra Tech HRP 500-600 Test; Streptavidin-Biotin Universal Detection System; Ref. No. PN IM2391 ) 力口入孔中，RT方文置10分鐘。用PBS徹底清洗孔，并加入DAB底 物(MERCK; ref. no. 1.02924.0001 )/0.1% H202,于暗處RT放置30-45 分鐘。通過用PBS稀釋而終止反應(yīng)并在顯樣"竟下計(jì)數(shù)IEA陽性核。
B纟田月包上清液也利用人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和臨床 CMV菌才朱VR1814進(jìn)4亍才企測(cè)。
作為陰性對(duì)照，采用包含不相關(guān)IgG抗體的B細(xì)胞上清液。作 為陽性對(duì)照，采用來源于患者血清且特異于CMV的商品〗匕人類IgG 抗體制品(Cytotect; Biotest)(利用漸進(jìn)性稀釋，從125嗎/ml開始)。
^ ^V會(huì)兩CMF潛合蛋白的差于的為、^f 第一次分析利用用于檢測(cè)結(jié)合人類血清或血漿中CMV蛋白提 耳又物的特異性IgG抗體的商品化定量酶4關(guān)免疫吸附測(cè)定(ELISA ) 而實(shí)施。該商品化ELISA試劑盒(BEIA CMV IgG Quant Kit; Bouty ) 按照制造商說明書使用并通過特異于CMV且以50 U/ml使用的商 品4匕IgG 4元體混合物(Cytotect; Biotest)進(jìn)^f亍-驗(yàn)ii。
簡(jiǎn)而言之，^尋用滅活的CMV蛋白混合物(來源于實(shí)-瞼用菌才朱 AD169)覆蓋的可斷裂條置于微板中并與1:81稀釋(將10 pl上清 液加入800 pl的BEIA系統(tǒng)的樣品稀釋液中)的B細(xì)月包上清液一起 孵育，并將該板室溫下孵育30分鐘。清洗周期之后，加入提前稀 釋、與辣根過氧化酶(100 結(jié)合的單克隆抗人類IgG抗體并將 才反在室溫下再孵育30分4中。在第二個(gè)清洗周期之后，加入^是前^希 釋的底物-TMB溶液(100 pl )并將該板再在室溫下孵育15分鐘。 利用終止溶液(100 ^tl/孔)終止反應(yīng)并在450/620納米處以二色性 測(cè)定光學(xué)密度。
其他測(cè)定利用實(shí)-瞼室中建立的ELISA而實(shí)施，其中ELISA采 用固定在固態(tài)表面上的特異性肽或重組CMV蛋白。
重組CMV抗原gB免疫顯性區(qū)與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST) 一起作為重組融合蛋白而生成，并通過親和力純4匕(GST親和性純 化；Biodesignlnt, cat. No. R18102),或者作為一種肽而生成。重組 CMV抗原gH免疫顯性區(qū)(VR1814菌才朱)也在大腸桿菌中生成并 根據(jù)GST親和力從細(xì)菌細(xì)胞裂解物中純化。這些ELISA通過應(yīng)用 常規(guī)ELISA步驟以做了較小改變的96孔模式實(shí)施。簡(jiǎn)而言之，將 抗原以2嗎/ml PBS稀釋在PBS中，并將50 (al該蛋白溶液通過40C 過夜孵育用于包凈皮EIA聚苯乙烯板的每 一 個(gè)孔(Nunc, cat. No.469949 )。去除蛋白溶液并將孔用100 pi清洗緩沖液(包含0.05% 吐溫20的PBS )清洗四次。隨后通過在每一個(gè)孔中分配100 pi含 1%奶的PBS并于37 GC孵育該板1小時(shí)而進(jìn)行封閉非特異性結(jié)合的 處理。在用150 (al清洗H沖液實(shí)施4個(gè)清洗循環(huán)之后，將50jal來 自細(xì)胞培養(yǎng)物的等分細(xì)胞培養(yǎng)物上清液分配到每一個(gè)孔中，以50 pl 細(xì)胞培養(yǎng)基/孔用作陰性對(duì)照。37 GC孵育2小時(shí)之后，在將50 pl 辣根過氧化酶標(biāo)記的抗人類IgG抗體(Fc特異性羊抗人IgG抗體； Sigma, cat. No. AO 170)(已在清洗緩沖液中1:30000稀釋)分配到每 一個(gè)孔中之前，將板用150 |il清洗緩沖液清洗4次。室溫孵育1小 時(shí)之后，在分配50 nl/孔的底物-TMB溶液(3,3', 5， 5'-四曱基聯(lián)苯胺； Sigma, cat no. T0440 )之前，將4反用150 pi清洗鄉(xiāng)爰沖液清洗4次。 室溫印孕育30分鐘之后，用100 ial/孔的終止溶液(1N石危酸)終止顯 色反應(yīng)并在450 nm處測(cè)定光學(xué)密度。
差于五ZJ5^的//57M0錯(cuò)合為\一#
用于檢測(cè)結(jié)合HSP-60的抗體的ELISA利用50 ml以1 (ag/ml 稀釋于NaHCO3 0.1MpH9.6中的重組人類HSP60蛋白(Stressgen ) 包被的EIA/RIA孔條進(jìn)行構(gòu)建，并于室溫保存過夜。用含0.05% 吐溫-20 pH 7.4的PBS清洗這些條3次，并且用含1% BSA和5% 蔗糖的PBS在室溫下封閉非特異性結(jié)合部位達(dá)30分鐘。清洗4 次之后，將這些條用 一組一抗抗人類HSP60 (以5或10g/ml稀 釋于含1% BSA的PBS中；Santa Cruz Biologicals )、小鼠IgG同 種型陰性對(duì)照(以5 g/ml溶于含1% BSA的PBS中)、不相關(guān)人類 重組IgG抗體(Herceptin, 5 |ig/ml )、 ^又細(xì)月包培養(yǎng)基以及來自EBV 永生化人類IgG分泌型B細(xì)胞的上清液，在室溫下孵育3小時(shí)。 清洗4次之后，將條與辣根過氧化酶結(jié)合的抗-小鼠IgG或抗-人類 IgG ( Dako )(其在具有1% BSA的PBS中稀釋) 一起室溫孵育1 小時(shí)。清洗4次之后，將底物-TMB 〉容液加至條上并允許在室溫下 形成顏色反應(yīng)?！?反在450 nm處讀凄t。
結(jié)果
本發(fā)明方法已在從供體獲得的人類B細(xì)胞上測(cè)試過，其中已證
實(shí)所述供體的血液包含結(jié)合和/或中和人類病毒尤其是人類巨細(xì)胞
病毒(CMV)(—種引起出生缺陷并對(duì)免疫缺陷患者高度致病的卩 痕滲病毒)的4元體(Landolfo S et al., 2003 )。
CMV是可由按照本發(fā)明方法選4奪、刺激并永生化的人類B細(xì) 胞自然分泌的抗體所中和的臨床感興趣病毒靶標(biāo)的良好實(shí)例，如 在圖11中粗略^L括的。此外，在用于CMV的不同治療策略中， 請(qǐng)爭(zhēng)月永內(nèi)癥合予CMV免疫王求蛋白(以Cytotect或CytoGam的名稱銷 售)代表一種用于阻斷CMV感染僅部分滿意的溶液，尤其是在免 疫在夾陷患者中，經(jīng)常同時(shí)^會(huì)予強(qiáng)有效的抗病毒劑(Bonaros NE et al.， 2004; Kocher AA et al.， 2003; Kruger腿et al" 2003 )。這些制品已 被表征可用于臨床應(yīng)用，但僅來源于具有高效價(jià)抗CMV抗體的人 類混合血漿中。CMV感染的治療將得益于具有更強(qiáng)有效的制品 (包括通過批準(zhǔn)用于調(diào)節(jié)目的而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)而獲得的 純化人類單克隆抗體)。
表達(dá)中和CMV的抗體的人類B細(xì)胞可從基于一種或多種免疫 學(xué)篩選分沖斤(如免疫印跡、ELISA或ELISPOT )或基于抗原《敬陣 列選擇的供體獲得，其可從商業(yè)來源獲得(Sorin Biomedica, Italy; BioMerieux， France )。
人類B細(xì)胞分離自所選供體的臨床樣品，該供體血液中提供較 高效價(jià)抗CMV抗體，如通過ELISA、 ELISPOT或中和測(cè)定所測(cè) 得的)。然后將這些細(xì)胞應(yīng)用于本發(fā)明方法(圖11 )。所得到的CD22 陽性、IgM陰性、EBV永生化的人類B細(xì)胞種群直接或間接利用 細(xì)胞培養(yǎng)物上清液進(jìn)行篩選，細(xì)胞培養(yǎng)物通過亞克隆用于檢測(cè)那 些包含中和CMV和/或結(jié)合CMV的IgG抗體的種群的原始種群而 -彈到。在克隆編；馬這些抗體的DNA并測(cè)序的范圍內(nèi)，生成這些4元 體的原始B細(xì)月包隨后可在其后的亞克隆步4聚中分離。第一種類型的初始篩選分析應(yīng)用于96孔板上超過400個(gè)亞培 養(yǎng)物，每一個(gè)孔包含大約100個(gè)B細(xì)月包。在CMV樣吏中和測(cè)定中， 篩選來自這些孔的上清液阻斷人類CMV的實(shí)-驗(yàn)用菌4朱(AD169) 或臨床菌抹(VR1814)感染人類細(xì)胞的能力。在所篩選的453個(gè) B細(xì)胞培養(yǎng)物中有4個(gè)在利用實(shí)驗(yàn)用CMV分離抹的重復(fù)實(shí)驗(yàn)中表 現(xiàn)出顯著的中和活性,特別是有1個(gè)在重復(fù)測(cè)定中表現(xiàn)為可中和臨 床CMV分離才朱(圖12A)。
第二種類型的初始篩選分析應(yīng)用于從不同CMV血清陽性供體 獲4尋的B細(xì)J包種群并再次應(yīng)用于本發(fā)明方法。在該情況下，利用 更靈每丈的商用ELISA可4企測(cè)到CMV特異的反應(yīng)性。CMV P日性亞 培養(yǎng)物，如上文表;f正的那些，可用來在鑒定所述細(xì)^I包培養(yǎng)物和對(duì) 應(yīng)于與中和或結(jié)合CMV的活性(利用初始篩選分析可檢測(cè)到)有 關(guān)的抗體序列的范圍內(nèi)開始亞克隆過程。
這些抗體，如來自人類B細(xì)胞上清液的純化制品或作為重組蛋 白表達(dá)的，可利用文獻(xiàn)中已知的器官水平或細(xì)胞水平的體外分析 而進(jìn)一步驗(yàn)證(Reinhardt B et al., 2003; Forthal DN et al.， 2001; Goodrum FD et al., 2002 )。此外，相關(guān)的臨床前試驗(yàn)可在CMV感 染的動(dòng)物中進(jìn)行，尤其是在其中人類宿主細(xì)胞可移植入免疫缺陷 口齒齒^力計(jì)勿體內(nèi)的才莫型中(Gosselin J et al., 2005; Thomsen M et al., 2005 )d由這些抗體識(shí)別的CMV抗原/表位可通過利用CMV特異 性截短蛋白或合成肽例如基于ELISA或蛋白質(zhì)印跡或者基于與該 抗原/表位已知的其他CMV特異性抗體竟?fàn)幍牟煌w外測(cè)定加以 鑒定(Greijer A et al" 1999; Schoppel K et al.， 1996; Ohlin M et al., 1993 )。
進(jìn)一步的篩選分析可利用檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物上清液對(duì)人類巨細(xì) 胞病毒的中和或結(jié)合情況而實(shí)施。事實(shí)上，大量IgG分泌型細(xì)胞 的可利用性允許鑒定大量對(duì)不同CMV表位或抗原(可能與CMV 感染有關(guān))具有結(jié)合特異性的人類IgG。例如，已知?jiǎng)用}粥樣硬化
患者的血液包含高水平識(shí)別人類熱休克蛋白60(HSP60)片段(其 于CMV蛋白)的抗體。特別地，其中一種稱為US28的蛋白在內(nèi) 皮細(xì)胞表面上表達(dá)，結(jié)合該蛋白的抗體可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，提 示CMV感染可觸發(fā)牽涉于動(dòng)3永粥才羊石更4匕致病才幾理中的自身免疫 反應(yīng)(Bason C et al" 2003 )。
因此，65個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物上清液池(每一個(gè)均包含從CMV血清 陽性個(gè)體獲得的原代B細(xì)胞生成的EBV永生化細(xì)胞的5個(gè)孔的上 清液)通過采用重組人類HSP60的ELISA對(duì)HSP60免疫反應(yīng)性 進(jìn)行篩選。6個(gè)池在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出高于ELISA上背景3倍的 統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的反應(yīng)活性(圖12B)。這些永生化抗體分泌細(xì)力包的培 養(yǎng)物可在細(xì)月包池中進(jìn)4亍亞克隆、重復(fù)篩選和亞克隆過禾呈直至分離 出可分泌結(jié)合人類HSP60的人類單克隆IgG抗體的細(xì)胞培養(yǎng)物。
第二種類型的初始篩選分析應(yīng)用于從特異性CMV血清陽性供 體獲得的B細(xì)力包種群并再次應(yīng)用于本發(fā)明方法。在該情況下，CMV 特異反應(yīng)活性在^人單個(gè)原代B細(xì)胞種群選4奪永生化細(xì)胞的寡克隆 或單克隆種群(每一個(gè)表達(dá)針對(duì)不同CMV特異性表位的抗體)的 范圍內(nèi)，利用一組不同試-瞼平行進(jìn)4亍才企測(cè)，由此才是供對(duì)個(gè)體中 CMV感染的免疫反應(yīng)的總體圖示(圖13)。
EBV永生化細(xì)胞的多克隆種群劃分為大約4000個(gè)用于在96 孔板中構(gòu)建細(xì)胞培養(yǎng)物(經(jīng)統(tǒng)計(jì)每一個(gè)均包含20個(gè)細(xì)胞)的池中， 其中每一個(gè)孔包含一個(gè)寡克隆細(xì)胞種群。然而，考慮到產(chǎn)生特異 于指定抗原的抗體的細(xì)胞頻率較低，則這些細(xì)胞培養(yǎng)物(其上清 液中可一全測(cè)到CMV特異性IgG )的4壬一個(gè)均可能是表達(dá)人類單克 隆抗體的單克隆細(xì)力包培養(yǎng)物。
初始試-瞼評(píng)價(jià)由寡克隆/單克隆細(xì)胞培養(yǎng)物(特異于CMV蛋白 混合物或已知可由CMV中和抗體識(shí)別的特異性抗原)所生成抗體 的CMV結(jié)合性能。然后，那些對(duì)這些測(cè)定中至少一種為陽性的細(xì) 月包培養(yǎng)物則進(jìn)一步在CMV樣丈中和測(cè)定中進(jìn)行評(píng)價(jià)。
選擇兩種特異性CMV抗原用于寡克隆/單克隆細(xì)胞種群的初始 篩選包膜糖蛋白gB和gH。這些蛋白在病毒附著和融合中發(fā)揮 關(guān)鍵作用，是用于人類CMV中和抗體(已存在關(guān)于該抗體較詳細(xì) 的資料)的靶標(biāo)。來自血清陽性個(gè)體的血清以及針對(duì)這些糖蛋白 的單克隆抗體抑制體外細(xì)胞培養(yǎng)物的HCMV感染。針對(duì)gB和gH 的抗體在4足進(jìn)人類血清病毒中和能力方面的有效作用已經(jīng)通過抗 -gB和抗-gH效價(jià)與恢復(fù)期人類血清的總體中和活性之間的關(guān)聯(lián)以 及通過在gB-和gH-特異性抗體吸附之后血清中和能力的顯著下降 而清楚地證實(shí)(reviewed In Cytomegaloviruses. Molecular Biology and Immunology. Reddehase, M. (ed.) Norfolk: Caister Academic Press (2006), and in particular Boehme K and Compton T p. 111-130, Mach M pp.265-283 )。
如圖13中總結(jié)的，利用其中細(xì)^^活5^增殖的寡克隆細(xì)^I包培養(yǎng) 物(占全部4妻種細(xì)胞孔的大約35%)，可以在特異于指定CMV蛋 白(gB-或gH-ELISA)或總CMV蛋白4是耳又物(BEIACMV ELISA ) 的測(cè)定的至少一種中鑒定包含與CMV蛋白反應(yīng)的IgG的孔。特別 地， 一些孔包含可中和體外CMV感染的人類IgG。
在僅BEIA CMV ELISA中為陽性的8個(gè)寡克隆細(xì)胞培養(yǎng)物中， 命名為9G8的孔包含CMV反應(yīng)活性為高度陽性的人類IgG (圖 14 )。包含來自孔9G8的10000個(gè)細(xì)月包的樣品用來生成cDNA，并 且用于通過PCR特別擴(kuò)增人類IgG重鏈和輕4連可變區(qū)的序列。將 擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行克隆并測(cè)序，確認(rèn)了 9G8是分泌具有特定可 變區(qū)且結(jié)合CMV的一種新型人類IgG的單克隆細(xì)胞培養(yǎng)物(圖
15)。編碼該抗體可變區(qū)的DNA也用來確定特定CDR序列，其由 9G8單獨(dú)或組合4是供，可用來生成結(jié)合CMV的抗體。
因此，包括本發(fā)明用于永生化抗體分泌細(xì)胞的方法的過程(工 藝)可允許鑒定來自直"t妄從已永生化的多克隆細(xì)胞種群生成的寡 克隆細(xì)月包;咅養(yǎng)物的新型VH和VL序列?？贵w如9G8或包含該抗 體一個(gè)或多個(gè)CDR的4壬4可蛋白(侈'H口Y又HCDR3; HCDR1 、 HCDR2 和HCDR3; LCDR1 、 LCDR2和LCDR3 )在CMV相關(guān)的臨床和 實(shí)馬全應(yīng)用中非常有用，特別是用于生物樣品中的CMV沖企測(cè)。
本發(fā)明方法還用來永生化從HIV-1、HSV-1和/或HSV-2血清陽 性個(gè)體獲得的原代B細(xì)胞。
例如，選擇6個(gè)HSV-1/HIV-1血清陽性個(gè)體，因?yàn)槔蒙唐坊?ELISA試劑盒(BoutyBEIAHSV-I; cat no. 20921 ),其血漿可表現(xiàn)出 高效《介結(jié)合HSV-1蛋白的IgG抗體?；旌蟻碜赃@些個(gè)體的PBMC 并利用上述用于從供體CMV5所獲得PBMC的相同方法進(jìn)行永生化。
最初的7千萬個(gè)PBMC形成含190萬個(gè)CD22陽性、IgM陰性 細(xì)胞的種群，其所分泌HSV-1特異性IgG抗體的量足以在細(xì)胞培養(yǎng) 物上清液中利用ELISA試劑盒及利用檢測(cè)中和HSV-1感染的抗體 的體外測(cè)定進(jìn)行檢測(cè)，所述體外測(cè)定基于其中g(shù)C編碼序列由lacZ 基因代替的無效突變病毒(Laquerre S et al.， 1998 )。
該多克隆細(xì)月包種群部分在用于鑒定分泌具有HSV-1中和活性 的抗體的細(xì)胞的篩選分析中使用，通過在細(xì)胞培養(yǎng)物制備后立即接 種凄丈百個(gè)寡克隆細(xì)月包i咅養(yǎng)物，經(jīng)統(tǒng)計(jì)每一個(gè)均包含50-100個(gè)細(xì)月包。 另外，永生化后所獲得細(xì)月包培養(yǎng)物的等分試樣在小弁瓦中冷凍，如通 常冷凍已建立的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系一樣。幾個(gè)月后解凍這些小并瓦中的
一部分，將細(xì)胞作為初始多克隆細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)數(shù)天，然后用于制 備數(shù)千個(gè)寡克隆細(xì)胞培養(yǎng)物，經(jīng)統(tǒng)計(jì)每一個(gè)均包含5個(gè)細(xì)胞。
HSV-1中和測(cè)定在兩種類型的寡克隆細(xì)月包i咅養(yǎng)物(即通過每個(gè) 孔立即接種50-100個(gè)細(xì)胞而獲得或者通過在解凍包含原始多克隆 細(xì)胞種群等分試樣的小瓶之后每孔接種5個(gè)細(xì)胞而獲得)中實(shí)施， 兩種過程均可對(duì)表達(dá)中和體外HSV-1的人類IgG抗體的寡克隆細(xì)胞 培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定。
特別i也，乂人后一個(gè)過禾呈獲得的分泌HSV-1中和抗體的細(xì)月包在 20個(gè)以上這種寡克隆細(xì)力包;咅養(yǎng)物中進(jìn)4于鑒定。即〗吏可以i正明在這些 細(xì)胞培養(yǎng)物的若干個(gè)，所述抗體是相同的，^f旦是大量陽性孔和通過 RT-PCR技術(shù)直接鑒定這種抗體序列的可能性可提供用以檢測(cè)多種 用于后期選擇的可替換性寡克隆細(xì)胞培養(yǎng)物(可能以不同速度生 長(zhǎng))的手^殳。事實(shí)上，不僅抗體的序列可鑒定和表征，而且感興趣 的單克隆抗體可直接純化用于一企測(cè)活性而無需將其作為重組蛋白 克隆和表達(dá)，加快了最感興趣的人類單克隆抗體的鑒定。
結(jié)論
實(shí)施例中示出的結(jié)果i正明了本發(fā)明方法的多個(gè)優(yōu)點(diǎn)和相對(duì)于 現(xiàn)有技術(shù)的顯著改進(jìn)。
選擇、刺激和永生化步驟的恰當(dāng)順序提供了特別有用的多克隆 細(xì)胞種群，其根據(jù)同種型但獨(dú)立于其所分泌抗體的特異抗原結(jié)合性 質(zhì)而分離，可用于4企測(cè)與從單個(gè)供體或供體池獲得的細(xì)胞性質(zhì)不同 的抗體。
進(jìn)行篩選和選擇的多克隆、寡克隆或單克隆細(xì)胞種群。如實(shí)施例2
中所示，個(gè)體體內(nèi)抗體庫(kù)的多樣性通過本發(fā)明方法以沖是供大量存活 且增殖的細(xì)胞(其以高水平分泌抗體，適于廣泛的篩選分析)的方 式而捕獲。此外，所得細(xì)胞種群較均勻的組成允許(無需額外的細(xì) 胞選擇或分選)接近極廣泛(若非全部)的抗體多樣性，其由供體
以無偏差的方式4是供。如在用于抗-CMV和抗-HSP60的連續(xù)篩選中 表明的，如果對(duì)血清進(jìn)行特定分析，以選擇用于待永生化細(xì)胞的供 體，則所得細(xì)月包種群以后可以用來在用于具有廣"i普性能的抗體研究 中吾'J沖斤dissect免疫反應(yīng)。
此外，可能直接生成并利用以極低細(xì)胞密度接種的細(xì)胞培養(yǎng) 物，用于鑒定單克隆抗體。所得細(xì)胞培養(yǎng)物也可平行保持和篩選， 用于應(yīng)用不同的細(xì)胞培養(yǎng)條件(例如飼養(yǎng)細(xì)胞、培養(yǎng)基、生長(zhǎng)因子) 或者用于檢測(cè)一組抗原和生物學(xué)活性(如從供體CMV5獲得的細(xì)胞 所表明的)，但總是從單個(gè)細(xì)胞種群開始的。
最后，該方法適合用于生產(chǎn)多克隆的永生化抗體分泌細(xì)胞種
群，其可用來以自動(dòng)化方式在數(shù)百或數(shù)千寡克隆細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行 選擇抗體分泌及用于得到一系列待冷凍的小瓶，每一個(gè)均包含通過
本發(fā)明的方法獲得的細(xì)胞種群的等分試樣。
特別地，在4交深入分析或再次分析永生化細(xì)力包種群的期望抗體 特異性的范圍內(nèi)，可i人為這些細(xì)胞是可才艮據(jù)需要解凍和檢測(cè)的抗體 分泌細(xì)胞文庫(kù)，如在利用從HSV-1血清陽性供體所獲得細(xì)胞的實(shí)施 例中表明的。因此，具有期望性能的單克隆抗體的鑒定和生產(chǎn)，甚 至可針對(duì)選^奪供體時(shí)或?qū)⒓?xì)胞種群永生化并以冷凍等分試樣^諸存 時(shí)未考慮的靶標(biāo)而實(shí)現(xiàn)。
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權(quán)利要求
1.一種用于永生化分泌一種或多種特定同種型的抗體的細(xì)胞種群的方法，包括以下步驟:a)以不依賴抗原的方式且基于至少一種細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)而從一種或多種生物樣品選擇表達(dá)抗體的細(xì)胞種群；b)在細(xì)胞培養(yǎng)條件下用至少一種刺激劑刺激所選定的細(xì)胞種群；c)從所述細(xì)胞培養(yǎng)物中去除所述刺激劑；d)從所述細(xì)胞培養(yǎng)物選擇表達(dá)所述一種或多種同種型抗體的受刺激細(xì)胞種群；e)使所選定且受刺激的細(xì)胞種群在細(xì)胞培養(yǎng)條件下暴露于永生化試劑；f)從所述細(xì)胞培養(yǎng)物中去除所述永生化試劑；其中所述永生化試劑是病毒永生化試劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟(a)中的所述細(xì)胞 種群是人類B細(xì)胞，所述細(xì)胞表面標(biāo)記物是CD22、 CD19或 CD27。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述刺激劑選自a) 基于CpG的寡核苷酸和細(xì)胞因子的組合；b) TNF受體家族的細(xì)胞膜受體的激動(dòng)劑與細(xì)胞因子的組合；而所述病毒永生化試劑是EB病毒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟d)中的 所述細(xì)胞種群表達(dá)IgG抗體。
5. 利用權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法獲得的細(xì)胞種群。
6. 通過在統(tǒng)計(jì)性地包含20個(gè)或更少這種細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物中劃 分權(quán)利要求5所述細(xì)胞種群而荻得的寡克隆或單克隆細(xì)胞種群。
7. 包含權(quán)利要求5或6所述細(xì)胞種群的細(xì)胞培養(yǎng)物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液。
9. 包括編碼一種或多種特定同種型抗體的DNA序列的DNA文 庫(kù)，其中，所述DNA文庫(kù)利用從權(quán)利要求5或6的細(xì)胞種群 分離的核酸而制備。
10. 權(quán)利要求5或6的細(xì)胞種群、權(quán)利要求7的細(xì)胞培養(yǎng)物、權(quán)利 要求8的上清液、或權(quán)利要求9的DNA文庫(kù)在鑒定和生產(chǎn)具 有期望抗原結(jié)合特異性和/或生物學(xué)活性的單克隆抗體中的應(yīng) 用。
11. 權(quán)利要求5或6的細(xì)胞種群的細(xì)胞培養(yǎng)物、權(quán)利要求7的細(xì)胞 培養(yǎng)物、權(quán)利要求8的上清液、或從由個(gè)體4是供的抗體分泌細(xì) 胞獲得的纟又利要求9的DNA文庫(kù)在確定所述個(gè)體對(duì)自體同源 或異源抗原、病毒、細(xì)菌細(xì)月包、毒素、寄生蟲細(xì)月包或疫苗的同 種型特異性免疫反應(yīng)特性中的應(yīng)用。
12. —種用于鑒定和生產(chǎn)具有期望抗原結(jié)合特異性和/或生物學(xué)活 性的單克隆抗體的試劑盒，其中，所述試劑盒包括權(quán)利要求5 或6的細(xì)胞種群、權(quán)利要求7的細(xì)胞培養(yǎng)物、權(quán)利要求8的上 清液或權(quán)利要求9的DNA文庫(kù)。
13. —種用于生產(chǎn)分泌具有期望抗原結(jié)合特異性和/或生物學(xué)活性 的單克隆抗體的細(xì)胞培養(yǎng)物的方法，包括以下步驟a) 在每一個(gè)均含50個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞的細(xì)月包培養(yǎng)物中，劃 分權(quán)利要求5的細(xì)胞種群或權(quán)利要求6的細(xì)胞培養(yǎng)物；b) 篩選所述細(xì)月包i咅養(yǎng)物的上清液，用于沖企測(cè)那些表5見出 所述期望抗原結(jié)合特異性和/或生物學(xué)活性的細(xì)力包種群；c) 在細(xì)胞培養(yǎng)物或種群中，劃分表現(xiàn)出所述期望抗原特 異性和/或生物學(xué)活性的細(xì)胞培養(yǎng)物；d) 在所述細(xì)胞培養(yǎng)物上重復(fù)步驟(b)和(c)直到分離 出一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物，其中每一個(gè)均在細(xì)胞上清液中分泌 具有期望抗原結(jié)合特異性和/或生物學(xué)活性的單克隆抗體。
14. 一種用于生產(chǎn)可分泌具有期望抗原結(jié)合特異性和/或生物學(xué)活 性的單克隆抗體的細(xì)胞培養(yǎng)物的方法，包括以下步驟a)篩選利用權(quán)利要求6的多個(gè)種群獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物的 上清液，用于4企測(cè)可分泌具有所述期望抗原特異性和/或生物 學(xué)活性的抗體的 一 個(gè)或多個(gè)細(xì)胞種群；b )確定由在所述上清液中表現(xiàn)出所述活性的細(xì)胞培養(yǎng)物 中的每一個(gè)分泌的抗體的序列；c )分離可分泌具有這種活性的單克隆抗體的細(xì)胞培養(yǎng)物。
15. —種用于生產(chǎn)單克隆抗體的方法，包括a) 擴(kuò)增通過根據(jù)權(quán)利要求13或14的方法生產(chǎn)的細(xì)胞培 養(yǎng)物；以及b) 乂人所述細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液中純化所述單克隆抗體。
16. 根據(jù)權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述期望抗 原結(jié)合特異性和/或生物學(xué)活性針對(duì)人類、哺乳動(dòng)物、病毒、 細(xì)菌、4直物、寄生蟲、有才幾或無枳4元原。
全文摘要
本發(fā)明提供用于永生化可分泌一種或多種特定同種型抗體的細(xì)胞的新型方法。利用本發(fā)明方法獲得的多克隆、寡克隆和單克隆細(xì)胞種群可在細(xì)胞培養(yǎng)條件下，基于它們分泌的抗體的功能和/或結(jié)合活性(如針對(duì)醫(yī)學(xué)感興趣的人類或病毒起源的抗原)進(jìn)行篩選。利用這些方法，已通過EB病毒將可分泌結(jié)合人類巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒或HSP60蛋白的抗體的人類B細(xì)胞有效地永生化。
文檔編號(hào)C07K16/08GK101374944SQ200680052807
公開日2009年2月25日 申請(qǐng)日期2006年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月16日
發(fā)明者瑪麗安娜·墨菲, 詹尼·加羅塔, 阿達(dá)·富納羅 申請(qǐng)人:里博瓦克斯生物工藝有限公司