專利名稱：人胰高血糖素樣肽-1類似物的融合蛋白及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及重組蛋白及其治療應用，尤其涉及人胰高血糖素樣肽-1(hGLP-l)及其類似物與人胰高血糖素樣肽-2 (hGLP-2)在基因水平融 合后表達的前體藥物形式的重組蛋白，以及該類融合蛋白在用于預防或治 療與GLP-1活性相關的疾病或障礙，尤其是2型糖尿病及其并發(fā)癥中的應用。
背景技術：
糖尿病是世界性的常見病和多發(fā)病，嚴重危害人類健康。2007年， 國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)公布的最新數(shù)據(jù)顯示，目前全球2.46億人正在遭 受著糖尿病的侵襲，在未來20年內糖尿病患者的總人數(shù)將會突破3.8億。 現(xiàn)有患者中，85。/。以上為2型糖尿病，g卩非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)， 其微血管和大血管并發(fā)癥，具有很高的死亡率和病死率。我國目前已有糖 尿病患者4000多萬，居世界第二，其中95%為2型，而且糖尿病患者需 終生用藥。因此，開發(fā)高效、長效、低價的治療2型糖尿病新藥具有重大 意義。2型糖尿病早期可以通過調整飲食、加強鍛煉和控制體重等措施維 持血糖穩(wěn)定。當這些措施無效時，多選用傳統(tǒng)的磺酰脲類、雙胍類等口服 降血糖藥治療，但這些藥物最突出的不良反應就是低血糖，并可能誘發(fā)體 重增加，使其臨床應用受限。此外，由于2型糖尿病的傳統(tǒng)治療側重于緩 解高血糖等癥狀，而不是針對其正發(fā)病原因，致使多數(shù)患者都無法逆轉血 糖控制能力的持續(xù)下降、|3細胞數(shù)量的減少和功能的降低。臨床上對于2 型糖尿病的治療重復著從減少進食，加強鍛煉，到使用單一藥物治療，至 復合藥物治療并最終發(fā)展到必須使用胰島素治療這一病程逐漸加重的過 程，這些治療措施既不能有效地緩解2型糖尿病的進程，又不能有效防止 其并發(fā)癥?？梢?，當前治療藥物在發(fā)揮其治療作用的同時尚存在諸多弊端， 加之糖尿病發(fā)病率在世界范圍內節(jié)節(jié)攀升，現(xiàn)有治療藥物將無法滿足未來 市場需求，因此，針對疾病形成機制，尋找并研發(fā)出更安全有效的新型藥 物以防止和逆轉2型糖尿病的病情發(fā)展，就顯得迫在眉捷。理想的治療糖 尿病藥物在降低血糖的同時，應盡量保護胰島細胞功能，降低高血糖對卩 細胞的毒性作用，改善內源性胰島素的分泌，提高周圍組織對胰島素的敏 感性，促進糖和脂肪代謝及增加葡萄糖依賴性胰島素分泌，長期應用時不 會出現(xiàn)低血糖等副作用。人胰高血糖素樣肽-1 (human glucagon-like peptide-1 ， hGLP-l)是攝食后由腸道L細胞分泌的由30個氨基酸殘基組成的激素樣多肽，是前胰高血 糖素原基因翻譯后加工的產物，分子量約3kDa，與胰高血糖素(glucagon) 具有50%的同源性，也參與調節(jié)體內血糖穩(wěn)定，但卻發(fā)揮著截然不同的效 應。與當前治療糖尿病的一線藥物相比，GLP-1具有7方面優(yōu)點①其促進胰島素分泌作用依賴于血糖水平，從而避免了胰島素過度分泌導致的低 血糖發(fā)生，可以長期安全使用(MojsovS, WeirGC,Habener JF. JClin Invest 1987; 79: 616-19; Kreymann B， Ghatei MA, Williams G et al. Lancet 1987; 2: 1300-04; Orskov C， Hoist JJ， Nielsen OV. Endocrinology 1988; 123: 2009-13.);②能改善周邊組織的胰島素受體敏感性，有助于治療胰島素抗 性；③可以抑制胰高血糖素的分泌(Nauck MA， Hoist JJ,WillmsB.Horm Metab Res 1997; 29 (9): 411-6.);④對于肥胖引起的2型糖尿病，可以通過 抑制胃排空的作用，幫助患者控制飲食或減輕體重(TurtonMD, O，SheaD, Gunn I, et al. Nature 1996; 379: 60-72.);⑤對磺酰脲類藥物無效的患者仍 然有效;⑥能改善患者的糖化血紅蛋白、果糖胺等中長期生化指標(Meeran K, O'Shea D， Edwards CM, et al. Endocrinology 1999; 140(1): 244-50; Larsen PJ, Fledelius C, Knudsen LB, et al. Diabetes 2001; 50: 2530-39.);⑦能夠促 進胰島P細胞的增生(Byrne MM， Pluntke K， Wank U, et al. Eur J Clin Invest 1998;28:72-78.)。此外，將GLP-1應用于1型糖尿病(胰島素依賴型糖尿 病，IDDM)患者，其治療潛能也很突出。研究表明，與NIDDM患者類似， GLP-1通過它的穩(wěn)定胰高血糖素(glucagonostatic)特性，能有效地緩解饑 餓性高血糖癥；還可以通過延長胃排空時間，減少IDDM患者的餐后血糖 偏移?？梢姡珿LP-1對IDDM和NIDDM均有治療作用。正是由于GLP-l這 些特殊的生物學作用，使之成為一種最有開發(fā)潛力的新型抗糖尿病藥物， 有望成為糖尿病治療領域的新藥增長點。然而，天然GLP-l屬肽類激素， 在體內極易被二肽基肽酶IV (DPPIV)降解，而且很容易從腎臟排出， 故其生物半衰期僅2 6分鐘，皮下注射人GLP-l產生的血藥濃度高峰只能 維持很短的時間，在很大程度上限制了其臨床應用。因此，設法延長GLP-l 的作用時間是目前的攻關重點，迫切需要研制出生物半衰期更長、穩(wěn)定性 更好、活性更高的hGLP-l產品應用于臨床。目前以GLP-1為靶點的研究，主要致力于以下三方面(1) DPP IV 抑制劑與GLP-1聯(lián)合用藥，通過抑制DPPIV的活性而延長GLP-1的半 衰期；(2) GLP-1受體激動劑如Amylin公司的Exenatide/Exendin-4， 是目前開發(fā)進展最迅速的GLP-1類似物，2005年已獲得美國FDA批準上 市，每天注射2次即可改善血糖水平，同時可減輕體重；(3) GLP-1分子改造如HGS公司的Albugon，是GLP-1 (DDP-IV抗性突變)和白蛋白 的融合體，在猴子體內的半衰期為3天；加拿大ConjuChem公司的 DAC:GLP1(CJC-1131)，是將GLP-1與一個化學活性基團連接，這樣藥物 進入體內就會與白蛋白共價結合形成復合體，在人體內的半衰期長達 10 12天；還有丹麥NovoNordisk公司的NN2211(Liraglutide)， C端為 具有脂肪酸的GLP-1衍生物，半衰期超過10小時。目前這三種藥物均處 于II期臨床試驗階段。但這些藥物均采用化學合成，而化學合成多肽往往 技術難度大、生產成本高、純化困難且會造成環(huán)境污染，其免疫原性、穩(wěn) 定性和安全性等尚處于進一步考察中。人胰高血糖素樣肽-2 (human glucagon-likepeptide-2， hGLP-2)又稱 人腸生長激素，是腸道L細胞分泌的由33個氨基酸殘基組成的多肽，具 有刺激腸生長的作用。研究還發(fā)現(xiàn)GLP-2具有與GLP-1相類似的抑制攝 食的效應，可以抑制食欲，弓(起厭食;還可以延緩胃排空，抑制胃酸分泌 (Nagell CF, Wettergren A, Pedersen JF, et al. Scand J Gastroenterol 2004; 39: 353-8.)。此外，GLP-2和GUM都是前胰高血糖素原基因(proglucagon， PG)翻譯后加工的產物，且共同從腸道L細胞釋放?；谏鲜隼碚摵蛯嵺`，我們將hGLP-l與hGLP-2，或GLP-1類似物 與GLP-2類似物構建為融合蛋白，那么該融合蛋白將更好地模擬正常生 理狀態(tài)下激素的分泌過程，使二者共同釋放，且有望發(fā)揮出更為理想的雙 重生物學效應。還可將前藥設計思路引入該融合蛋白的設計理念，將多個 hGLP-l與hGLP-2融合為大分子的前體藥物(prodrug),該前體藥物在體 外無生理活性，但進入體內后，在體內特異性酶作用下逐步分解，不斷釋 放出具有生理活性的GLP-1， 一次給藥后可在體內較長時間保持有效的 GLP-1濃度。同時，大分子的前體藥物也不易被腎臟排出，很大程度上延 長了藥物的作用時間。發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供人胰高血糖素樣肽-1類似物的融合蛋白及其應 用，它能夠預防和治療1型和2型糖尿病的融合蛋白以及編碼該融合蛋白 的核苷酸序列，該類融合蛋白是前體藥物，作用時間較長，具有DPP-IV 抗性，能葡萄糖依賴性促胰島素分泌，提高機體對葡萄糖的耐受性，又能 促進胰島卩細胞增殖、再生和減少凋亡，保護胰島功能。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的，人胰高血糖素樣肽-1類似物的融合 蛋白及其應用，該融合蛋白是由n個多肽A和n個多肽B組成，其中，多肽A為GLP-1 (7-37) [SEQ IDNO.l]，其序列為His-Xaa2-Glu畫Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly畫Gln-Ala畫Ala-Lys-Glu-Phe畫11e-Ala-Trp畫Leu-Val誦lys-Gly畫Arg陽Xaa31式中Xaa2為Ala， Ser， Gly， Val， Thr; Xaa31為Gly， Ala，Arg， Lys或被去除；所述的多肽B為GLP-2(l-33) [SEQIDN0.2]，其序列為 His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Xaal9-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp~Leu-Ile-Gin-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp式中Xaal9為Ala， Ser， Thr， Pro， Gly。所述的多肽A和多肽B中間還有接頭，選自Lys-Arg、 Arg-Lys、 Arg-Arg或Lys-Lys，該結構為體內特異性蛋白酶識別位點。所述的多肽A和多肽B及中間接頭構成由多肽A-接頭-多肽B組 成[SEQIDN0.3]，序列為Met-Lys-Arg-His-Xaa5-Glu-Gly畫Thr-Phe-Thr畫Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Ty r-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala畫Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-lys-Gly-Arg -Xaa34-Arg-Arg-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Xaa55-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr畫L ys-Ile-Thr-Asp式中Xaa5為Ala， Ser， Gly， Val， Thr; Xaa34為Gly， Ala， Arg， Lys或被去除；Xaa55為Ala， Ser， Thr， Pro， Gly。所述的多肽A和多肽B及中間接頭構成由多肽A-接頭-多肽B-接 頭-多肽A組成[SEQIDN0.4]，序列為Met-Lys-Arg-His-Xaa5-Glu隱Gly-Thr-Phe誦Thr畫Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Ty r-Leu-Glu-Gly-Gln畫Ala畫Ala-Lys-Giu-Phe-Ile-Ala-Trp陽Leu-Val隱lys-Gly-Arg -Xaa34-Arg-Arg-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp畫Asn-Leu-Ala-Xaa55-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-L ys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-His-Xaa73-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly國Gln-Ala畫Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-lys-G ly-Arg匿Xaa102式中Xaa5， Xaa73為Ala， Ser， Gly， Val， Thr; Xaa34， Xaal02 為:Gly， Ala， Arg， Lys或被去除;Xaa55為'Ala, Ser， Thr， Pro， Gly。所述的多肽A和多肽B及中間接頭構成由多肽A-接頭-多肽B-接 頭-多肽A-接頭-多肽B組成[SEQ IDN0.5]，序列為Met-Lys-Arg-His國Xaa5-Glu-Gly誦Thr-Phe-Thr畫Ser匿Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys畫Glu畫Phe-Ile-Ala-Trp-Leu畫Val-lys-Gly-Arg-Xaa34-Arg-Arg-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Xaa55-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr畫Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-His-Xaa73-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu畫Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu畫Phe-Ile畫Ala-Trp畫Leu-Val-lys-GIy-Arg-Xaal02-Arg-Arg-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Xaa 123 - Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp式中Xaa5， Xaa73為Ala， Ser， Gly， Val， Thr; Xaa34， Xaal02 為Gly， Ala， Arg， Lys或被去除；Xaa55， Xaal23為Ala， Ser， Thr， Pro, Gly。所述的多肽A和多肽B及中間接頭構成由多肽A-接頭-多肽B-接 頭-多肽A-接頭-多肽B-接頭-多肽A組成[SEQ ID N0.6]，序列為Met-Lys-Arg-His-Xaa5-Glu-Gly-Thr畫Phe-Thr-Ser-Asp畫Val-Ser-Ser-Ty r-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-lys-Gly-Arg -Xaa34-Arg-Arg-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Xaa55-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-L ys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-His-Xaa73-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser隱Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe畫Ile-Ala-Trp-Leu-Val-lys-G Iy-Arg-Xaal02-Arg-Arg-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Xaal23-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys畫His-Xaal41-Glu-Gly誦Thr-Phe-Thr-Ser-Au-Val-lys-Gly-Arg-Xaa170 ,式中Xaa5， Xaa73， Xaal41為Ala, Ser， Gly， Val， Thr; Xaa34，Xaal02， Xaal70為Gly， Ala， Arg， Lys或被去除；Xaa55， Xaal23為Ala， Ser， Thr， Pro， Gly。所述的融合蛋白的原核表達載體是pET32a。 所述的融合蛋白是由大腸桿菌表達系統(tǒng)重組表達產生的。 所述的融合蛋白中的多肽A和多肽B在生理狀態(tài)下都釋放于腸道L細胞，都是前胰高血糖素原基因翻譯后加工而成，因此將多肽A和多肽B融合可以模擬生理狀態(tài)下的激素分泌，以利于其更好地發(fā)揮出理想的生物學效應。所述的融合蛋白用于制備治療l型糖尿病、2型糖尿病、肥胖、胰高血糖素瘤、代謝性疾病的用途。本發(fā)明的特點是所述融合蛋白是前體藥物，在體內經酶降解后釋放 出活性GLP-1分子，進而發(fā)揮藥理作用，且生物穩(wěn)定性高，體內半衰期 長。本發(fā)明的范圍延及使用該生產工藝所得產品的治療應用。該融合蛋白可用于治療或預防與GLP-1活性相關的疾病或障礙，尤其是2型糖尿病。其優(yōu)點是1.應用基因工程方法制備人胰高血糖素樣肽類似物的融合蛋白，即前胰高血糖素樣肽(Pro-GLPs)，生產成本遠低于化學合成法，操 作簡便，原料易得。2.本發(fā)明所構建的融合蛋白為人源性序列融合而成， 無免疫原性。3.本發(fā)明所述的融合蛋白Pro-GLPs在體外沒有活性，但進 入體內后，在體內特異性酶的作用下逐步分解，不斷釋放出具有生理活性 的GLP-1， 一次給藥后可在體內較長時間保持有效的GLP-1濃度，并有 效控制糖尿病癥狀。4.由于與之相融合的是GLP-2，因此該種釋藥方式 成功模擬了生理狀態(tài)下的GLP-1釋放，以利于其更好地發(fā)揮積極的生物 學效應。5.融合后產生的大分子的前體藥物也不易被腎臟排出，很大程 度上延長了藥物的作用時間。由此可見，本發(fā)明所述的融合蛋白Pro-GLPs 既保留了 GLP-1的降血糖活性，又解決了 GLP-1及其類似物等短肽在體 內半衰期短的問題，并首次將前藥設計思路引入GLP-1類似物的研發(fā)， 且成功模擬出生理狀態(tài)下的GLP-1釋放過程藥效學研究結果表明，本發(fā)明所述的融合蛋白具有理想的降血糖作 用，有利于緩解由于糖質代謝紊亂而帶來的諸多糖尿病并發(fā)癥癥狀，因此， 本發(fā)明所述的融合蛋白可用于制備治療糖尿病及防治糖尿病并發(fā)癥的藥 物，顯示出廣闊的臨床應用前景。


下面結合實施例附圖對本發(fā)明做進一步說明。圖1為pET32a載體的示意圖；圖2為融合蛋白Pro237重組載體的示意圖；圖3為重組質粒pET32a-Pro237酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳后的成像圖；圖4為融合蛋白Pro237經IPTG誘導后表達的SDS-PAGE電泳結果 的成像圖；圖5為融合蛋白Pro237的Western-blot結果的成像圖；圖6為融合蛋白Pro237經Ni-NTA Sepharose層析分離純化后的SDS-PAGE電泳結果的成像圖；圖7、圖8、圖9為皮下注射融合蛋白Pro237對C57BL/6小鼠的口服葡萄糖耐量試驗結果統(tǒng)計圖；圖7為兩次給予糖負荷后的降血糖作用結果統(tǒng)計圖； 圖8為糖負荷后20 min時不同劑量Pro237的降血糖作用結果統(tǒng)計圖； 圖9為糖負荷后20 min時不同劑量Pro237的血漿胰島素水平統(tǒng)計圖； 圖10、圖11為每日皮下注射融合蛋白Pro237對健康C57BL/6小鼠 及自發(fā)性糖尿病db/db小鼠攝食及體重影響的結果統(tǒng)計圖； 圖10為Pro237對攝食影響的結果統(tǒng)計圖； 圖11為Pro237對體重影響的結果統(tǒng)計圖。
具體實施方式
下列實施例用以幫助描述如何實施本發(fā)明的各種實施方案。這些實施 例是為了舉例說明，而不是以任何方式限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明所述融合蛋白可以為n個多肽A和n個多肽B在基因水平融 合后表達的重組蛋白；其中所述的多肽A為hGLP-l(7-37)或其類似物，其氨基酸序列[SEQ ID NO. 1 ]為His-Xaa2-Glu畫Gly-Thr-Phe-Thr陽Ser畫Asp-Val-Ser-Ser -Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala畫Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-lys-Gly-Ar g-Xaa31,式中Xaa2為Ala， Ser， Gly， Val， Thr; Xaa31為Gly， Ala， Arg， Lys或被去除；所述的多肽B為hGLP-2或其類似物，其氨基酸序 列[SEQ ID NO.2]為His-Ala-Asp畫Gly陽Ser-Phe陽Ser-Asp-Glu -Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Xaal9-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Le u-Ile-Gin國Thr-Lys-Ile-Thr-Asp，式中Xaal9為Ala, Ser， Thr， Pro， Gly; 多肽A的C末端可以通過肽接頭(Linker)與多肽B的N末端融合，多 肽B的C末端也可以通過肽接頭與多肽A的N末端融合。本發(fā)明還提供了制備具有生物活性的上述融合蛋白的方法。本發(fā)明還提供了將多肽A與多肽B融合在一起的接頭，該接頭由多 個氨基酸組成，可選自Lys-Arg、 Arg-Lys、 Arg-Arg或Lys-Lys。該結構為 體內內源性蛋白水解酶的特異性結合位點，能夠使進入體內的融合蛋白被 特異性酶解，釋放出活性片段以發(fā)揮藥理作用。本發(fā)明還提供了上述融合蛋白及其DNA序列和類似物用于制備預防 和治療糖尿病及其相關疾病的藥物的應用。以下實施例中是選取實驗結果最好的Pro-GLPs，即Pro237為例，其 他的融合蛋白同樣按照以下方法進行實驗。本實施例的融合蛋白可以通過基因重組技術獲得。重組方法生產本發(fā) 明融合蛋白的具體技術解決方案如下第1步，通過化學合成獲取本發(fā)明融合蛋白的目的基因。第2步，構建重組表達載體pET32a，pET32a空載體購自德國Novagen公司(屬商業(yè)化表達載體，任何人皆可在市場購買到)。第3步，將目的基因重組到表達載體pET32a質粒中，然后轉化大腸 桿菌B121 (DE3)。第4步，在大腸桿菌中表達本發(fā)明所述融合蛋白。將含有pET32a質 粒的感受態(tài)大腸桿菌B121 (DE3)細胞的單克隆，接種于5mlLB培養(yǎng)基 (含100嗎/ml氨芐青霉素Amp)， 37。C振蕩培養(yǎng)10h。按1:100比例轉 種新培養(yǎng)基，繼續(xù)37"C振蕩培養(yǎng)2h，然后加入異丙基-P-D硫代半乳糖苷 (IPTG)誘導目的蛋白表達，37。C誘導4h后，離心收集菌體。第5步，分離并純化重組產生的蛋白。利用固化Ni瓊脂層析柱純化 帶His-tag的表達的融合蛋白。第6步，融合蛋白的活性檢測口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)。健 康C57BL/6J小鼠(18 22g)，雌雄各半，禁食16-18小時，皮下注射不 同劑量的融合蛋白(0.3nmol/kg ， 3nmol/kg ， 30nmol/kg ) 、 hGLP-l (30nmol/kg)或生理鹽水，注射15min后灌胃給予糖負荷(1.5g/kg體重)， 并分別于注射后0， 10， 20， 30， 60, 90， 120， 150 min后從尾靜脈取血， 用血糖儀測定血糖水平。為長時間觀察該融合蛋白的降糖作用，于150min 時尾靜脈取血后立即再次給予D-葡萄糖(1.5mg/kg)，按相同時間間隔測 定血糖。結果顯示，本發(fā)明所述融合蛋白呈劑量依賴性降低血糖濃度，上 述劑量的該融合蛋白對小鼠正常血糖濃度無影響。等劑量融合蛋白的降糖 作用較GLP-1作用強。實驗表明，糖負荷動物在灌胃給糖后120分鐘血 糖恢復至正常水平。第二次糖負荷(1.5g/kg)，該融合蛋白仍發(fā)揮其降糖 作用。上述結果表明，本發(fā)明所述融合蜜白能夠明顯提高小鼠對糖的耐受 性，不降低正常血糖，劑量依賴性降低過高血糖，不僅具有GLP-1正常 的生物學活性，而且其作用時間較單獨的hGLP-l明顯延長。 實施例l合成Pro237基因序列按照序列Pro237基因-終止密碼子TAG，化學合成長度為513bp的 堿基序列，如下5,H I ，-giMet Lys Arg His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser AspVal Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe lieAla Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg Arg His Ala Asp GlySer Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr lie Leu Asp Asn Leu Ala AaArg Asp Phe lie Asn Tip Leu He Gin Thr Lyslie Thr AspLys Lys His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser SerTyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp LeuVal Lys Gly Arg Gly Arg Arg His Ala Asp Gly Ser Phe SerAsp Glu Met Asn Thr lie Leu Asp Asn Leu Ala Ala Arg AspPhe lie Asn Trp Leu He Gin Thr Lyslie Thr Asp Lys LysHis Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp ValSer Ser Tyr LeuGlu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe He Ala Trp Leu Val Lys歷"趨 GGCCGAGGATAGaagctt誦3'Gly Arg Gly End將該堿基序列克隆至pET32a中，得到含Pro237-終止密碼子TAG的 DNA序列的重組質粒pET32a-Pro237，所述的堿基序列含有限制性內切酶 5amHI和/f/"d111的酶切位點。(見圖l、圖2)圖1為pET32a載體圖。圖2為融合蛋白Pro237重組載體圖。圖1、圖2顯示了重組質粒pET32a-Pro237的構建模式。實施例2用含有Pro237基因序列的表達載體轉化大腸桿菌，獲得 基因工程菌株將構建好的重組質粒pET32a-Pro237轉化至感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)中，冰浴30min，升溫至42。C水浴中維持90s，然后快速轉移至 冰浴中，冷卻2 3min，向轉化混合物中加入500plLB培養(yǎng)液，混勻后 37。C振蕩培養(yǎng)(<180rpm， 30min)，取200pl轉移至含Amp的LB瓊脂 培養(yǎng)板，37。C過夜培養(yǎng)，篩選出Amp抗性的單克隆菌落。通過^m// I 和歷m/m雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對重組質粒5am/n 和雙酶切位點間區(qū)域進行DNA測序，以確證得到含Pro237基因 序列的基因工程菌。(見圖3)圖3為重組質粒pET32a-Pro237酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳結果圖。 圖中，1是pET32a空載體對照，2是重組質粒pET32a-Pro237， 3是 pET32a-Pro237經和歷w/ III雙酶切后的結果圖，4是DNA marker。圖3的結果表明從篩選出的Amp抗性的單克隆菌落中提取的質粒確 實是重組質粒pET32a-Pro237，通過Sami71和/^'"dl11雙酶切后得到大小 為513bp的Pro237。實施例3誘導基因工程菌表達融合蛋白Pro237抽提重組質粒pET32a-Pro237，進一步轉化大腸桿菌BL21 (DE3)， 構建得到基因工程表達菌。挑取單菌落接種于5ml含10(Vg/ml Amp的 LB培養(yǎng)基中，37°C， 180rpm振蕩培養(yǎng)過夜。取50pl的過夜培養(yǎng)物轉種 于5ml LB培養(yǎng)基中，37°C， 210 rpm培養(yǎng)至對數(shù)生長期，測其OD6G。=0.5 0.6時，加入終濃度為0.1 lmM的IPTG進行誘導表達2 4小時，產生 和積累可溶性表達的Pro237融合蛋白，離心，棄上清，收集濕菌體。(見 圖4、圖5)圖4為融合蛋白Pro237經IPTG誘導后表達蛋白的SDS-PAGE電泳 結果圖。圖中，1是低分子量蛋白marker; 2是未經IPTG誘導的蛋白表 達；3是經0.5mM IPTG誘導后的蛋白表達水平；4是經O.lmM IPTG誘 導后的蛋白表達水平。.圖5為融合蛋白Pro237經anti-His'tag檢測后的Western-blot結果圖。 圖中，1是未經IPTG誘導的；2 7是經0.5mMIPTG誘導后的蛋白不同 樣品量電泳后的Western-blot結果。圖4的結果顯示了 O.lmM IPTG即可以誘導融合蛋白Pro237表達。 表達出的融合蛋白經Western-blot檢測后，結果如圖5所示，表明經IPTG 誘導后表達的融合蛋白確實是帶有His，tag的Pro237。由此可見，該方法 正確表達出了融合蛋白Pro237。 實施例4分離純化獲得Pro237融合蛋白離心收集菌體，用0.02M磷酸鹽緩沖液重懸菌體，加入IOO mmol/LPMSF至終濃度1 mmol/L，冰浴中超聲破菌，緩沖液中加入l%TritonX-100 保持30min， 12000rpm/min離心10min，取上清進行NTA-Ni樹脂親和層 析，收集Pro237融合蛋白組分，用截留分子量為1 5kD的Millipore Amicon Ultra-15超濾管將蛋白濃縮至2 5mg/ml以上。收集穿透峰，冷 凍干燥，得到產品Pro237。(見圖6)
圖6為融合蛋白Pro237經Ni-NTA Sepharose層析分離純化后的 SDS-PAGE電泳結果圖。圖中，1 12表示上清經過NTA-Ni樹脂親和層 析柱后收集到的12管(lml/tube)蛋白樣品。
圖6結果表明經IPTG誘導后表達的融合蛋白Pro237分離純化后可 以得到純度較高的融合蛋白Pro237。 實施例5 Pro237的降血糖作用
實驗材料與方法
健康昆明小鼠(清潔級，第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供)； D-葡萄糖(1.5g/kg)， 0.9%Nacl溶液，Pro237， GLP-1 (美國多肽公
司)；
全自動血糖儀(德國羅氏診斷公司，羅康全TM活力型血糖檢測儀)
健康昆明小鼠，雌雄各半，禁食16-18小時，分為5組(n=6-12)。 ①生理鹽水對照組；②陽性對照藥組(GLP-1， 30nmol/kg);③Pro237 (30nmol/kg)組；④Pro237 (3nmol/kg)組； Pro237 (0.3mol/kg)劑 量組。所述的Pro237為實施例1的制備產物。
各組皮下給藥15 min后分別給予糖負荷(1.5 g/kg)，給糖時記為0 時刻。分別于5、 10、 20、 30、 60、卯、120、 150 min從小鼠尾靜脈取血， 用血糖儀測定血糖值。為長時間觀察Pro237降血糖作用，于150 min時 尾靜脈取血后立即再次給予D-葡萄糖(1.5mg/kg)，按相同時間間隔測定 血糖。(見圖7、圖8、圖9)
圖7為皮下注射Pro237對C57BL/6小鼠的口服葡萄糖耐量試驗，兩 次給予糖負荷后的血糖水平的降血糖作用結果統(tǒng)計圖；圖8為皮下注射不 同劑量Pro237對C57BL/6小鼠口服葡萄糖耐量試驗，糖負荷后20 min時 不同劑量的血糖值的降血糖作用結果統(tǒng)計圖；圖9為皮下注射不同劑量 Pro237對C57BL/6小鼠口服葡萄糖耐量試驗，糖負荷后20 min時不同劑 量的血漿胰島素值的降血糖作用結果統(tǒng)計圖。
結果如圖7、圖8、圖9所示，可以看出，Pro237呈劑量依賴性降低 血糖濃度，刺激胰島素分泌。上述劑量的Pro237對小鼠正常血糖濃度無 影響。等劑量Pro237的降糖作用較GLP-l作用強。實驗表明，糖負荷動 物在灌胃給糖后120分鐘血糖恢復至正常水平。第二次糖負荷(1.5 g/kg)，Pro237仍發(fā)揮其降糖作用。上述結果表明Pro237能夠明顯提高小鼠對糖
的耐受性，不降低正常血糖，劑量依賴性降低過高血糖，刺激胰島素分泌，
其降糖作用可以維持3h以上。
實施例6 Pro237抑制攝食、減輕體重的作用
實驗材料與方法
C57BL/6小鼠(SPF級，第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供)； 自發(fā)性糖尿病db/db小鼠(SPF級，南京大學國家模式動物研究所提
供)；0.90/。Nacl溶液，Pro237;
健康C57BL/6小鼠和自發(fā)性糖尿病db/db小鼠各分為2組(n=6-10)。
①生理鹽水對照組；②Pro237 (3nmol/kg)組。所述的Pro237為實施例
1的制備產物。
各組于每天上午9:00和下午6:00皮下給藥，連續(xù)給藥7周.分別于每 日上午11:00時測定各組動物的攝食量及體重。(見圖10、圖ll)。
圖10、圖11為融合蛋白Pro237對攝食量及體重的影響結果圖。其 中，圖10為每日皮下注射Pro237對健康C57BL/6小鼠及自發(fā)性糖尿病 db/db小鼠攝食量的影響的統(tǒng)計結果圖；圖11為皮下注射Pro237對健康 C57BL/6小鼠及自發(fā)性糖尿病db/db小鼠體重的影響的統(tǒng)計結果圖。
圖10、圖11的結果顯示出，Pro237在為期7周的給藥過程中可明顯 減少糖尿病小鼠的攝食量，并減少糖尿病小鼠的體重，但對健康小鼠的攝 食及體重無明顯影響。由此可見，Pro237在一定程度上可用于控制糖尿 病所引起的肥胖癥狀。
權利要求
1、人胰高血糖素樣肽-1類似物的融合蛋白，其特征在于該融合蛋白是由n個多肽A和n個多肽B組成，其中，多肽A為GLP-1(7-37)[SEQ ID NO.1]，其序列為His-Xaa2-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gl y-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-lys-Gly-Arg-Xaa31式中Xaa2為Ala，Ser，Gly，Val，Thr；Xaa31為Gly，Ala，Arg，Lys或被去除；所述的多肽B為GLP-2(1-33)[SEQ ID NO.2]，其序列為His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Xaa19-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gin-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp式中Xaa19為Ala，Ser，Thr，Pro，Gly。
2、 根據(jù)權利要求1所述的人胰高血糖素樣肽-1類似物的融合蛋白， 其特征在于所述的多肽A和多肽B中間還有接頭，選自Lys-Arg、 Arg-Lys、 Arg-Arg或Lys-Lys，該結構為伴內特異性蛋白酶識別位點。
3、 根據(jù)權利要求2所述的人胰高血糖素樣肽-1類似物的融合蛋白， 其特征在于所述的多肽A和多肽B及中間接頭構成由多肽A-接頭-多肽B組成[SEQIDN0.3]，序列為Met-Lys-Arg-His畫Xaa5-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val畫Ser-Ser-Ty r-Leu-Glu-Gly-Gln畫Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-lys-Gly-Arg -Xaa34-Arg-Arg-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Xaa55-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-L ys-Ile-Thr-Asp式中Xaa5為Ala， Ser， Gly， Val， Thr; Xaa34為:Gly， Ala， Arg， Lys或被去除；Xaa55為Ala， Ser， Thr， Pro， Gly。
4、 根據(jù)權利要求2所述的人胰高血糖素樣肽-1類似物的融合蛋白， 其特征在于所述的多肽A和多肽B及中間接頭構成由多肽A-接頭-多肽B-接頭-多肽A組成[SEQIDN0.4]，序列為Met畫Lys-Arg-His畫Xaa5-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser陽Asp-Val-Ser-Ser-Ty r-Leu畫Glu國Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu畫Val-lys-Gly-Arg -Xaa34-Arg-Arg-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Xaa55-Arg-Asp-Phe-Ile畫Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-His-Xaa73-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala國Ala-Lys-Glu-Phe-Ile國Ala畫Trp-Leu-Val-lys-G ly-Arg-Xaa102式中Xaa5, Xaa73為Ala， Ser， Gly， Val， Thr; Xaa34， Xaal02 為Gly， Ala， Arg， Lys或被去除；Xaa55為Ala， Ser， Thr， Pro， Gly。
5、 根據(jù)權利要求2所述的人胰高血糖素樣肽-1類似物的融合蛋白， 其特征在于所述的多肽A和多肽B及中間接頭構成由多肽A-接頭-多肽B-接頭-多肽A-接頭-多肽B組成[SEQIDN0.5]，序列為Met-Lys-Arg-His-Xaa5-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Ty r-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val畫lys-Gly-Arg -Xaa34-Arg-Arg-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Xaa55-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu畫Ile-Gln-Thr-L ys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-His-Xaa73-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala畫Trp-Leu-Val-lys-G Iy-Arg-Xaal02-Arg-Arg-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr畫Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala陽Xaa 123 - Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys畫Ile-Thr-Asp式中Xaa5， Xaa73為Ala， Ser， Qly， Val， Thr; Xaa34， Xaal02 為Gly， Ala， Arg， Lys或被去除；Xaa55， Xaal23為Ala， Ser， Thr， Pro， Gly。
6、 根據(jù)權利要求2所述的人胰高血糖素樣肽-1類似物的融合蛋白， 其特征在于所述的多肽A和多肽B及中間接頭構成由多肽A-接頭-多肽B-接頭-多肽A-接頭-多肽B-接頭-多肽A組成[SEQ ID N0.6]，序 列為 'Met-Lys-Arg-His畫Xaa5-Glu畫Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser陽Ser-Ty r-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-lys-Gly畫Arg -Xaa34-Arg-Arg-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Xaa55-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp~Leu-Ile-Gln-Thr-L ys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-His-Xaa73-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu畫Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-lys誦G Iy-Arg-Xaal02-Arg-Arg-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ah-Xaal23-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-His-Xaal41-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val畫Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp畫Le u-Val-lys-Gly-Arg-Xaa 170式中Xaa5， Xaa73， Xaal41為Ala， Ser， Gly， Val， Thr; Xaa34， Xaal02， Xaal70為Gly， Ala， Arg， Lys或被去除；Xaa55， Xaal23 為Ala， Ser， Thr， Pro, Gly。
7、 根據(jù)權利要求1所述的人胰高血糖素樣肽-1類似物的融合蛋白， 其特征在于所述的融合蛋白的原核表達載體是pET32a。
8、 根據(jù)權利要求1所述的人胰高血糖素樣肽-1類似物的融合蛋白， 其特征在于所述的融合蛋白是由大腸桿菌表達系統(tǒng)重組表達產生的。
9、 根據(jù)權利要求1所述的人胰高血糖素樣肽-1類似物的融合蛋白， 其特征在于所述的融合蛋白中的多肽A和多肽B在生理狀態(tài)下都釋 放于腸道L細胞，都是前胰高血糖素原基因翻譯后加工而成，因此將 多肽A和多肽B融合可以模擬生理狀態(tài)下的激素分泌，以利于其更好 地發(fā)揮出理想的生物學效應。
10、 根據(jù)權利要求1所述的人胰高血糖素樣肽-1類似物的融合蛋白 的應用，其特征在于所述的融合蛋白用于預防或治療與GLP-1活性相 關的疾病或障礙，尤其是1型糖尿病、2型糖尿病、肥胖、胰高血糖素瘤、 代謝性疾病的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及人胰高血糖素樣肽-1(hGLP-1)類似物的融合蛋白及其制備方法，所述融合蛋白是前體藥物，在體內經酶降解后釋放出活性GLP-1分子，進而發(fā)揮藥理作用，且生物穩(wěn)定性高，體內半衰期長。本發(fā)明的范圍延及使用該生產工藝所得產品的治療應用。該融合蛋白可用于治療或預防與GLP-1活性相關的疾病或障礙，尤其是2型糖尿病。本發(fā)明涉及生物技術領域，所述融合蛋白是應用基因工程方法制備的，生產成本遠低于化學合成法，操作簡便，原料易得，為商業(yè)化生產提供了可能。
文檔編號C07K14/435GK101220088SQ20071001873
公開日2008年7月16日 申請日期2007年9月24日 優(yōu)先權日2007年9月24日
發(fā)明者惠宏襄, 羅曉星, 雪 馬 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學