專利名稱：一種用樹脂層析法從磷脂中分離純化磷脂酰膽堿的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種用樹脂層析法從磷脂中分離純化磷脂酰膽堿的方法，屬于磷脂分離純化技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
大豆磷脂是多種磷脂的混合物，其主要成分有磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰絲氨酸(PS)等物質(zhì)。其中磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)，俗稱卵磷脂，是一種在動植物中分布很廣的天然兩性表面活性劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下所示，它無毒、無刺激、易生物降解，具有特殊的生理功效。大豆磷脂中存在的不同磷脂具有結(jié)構(gòu)類似性，PC比其他磷脂的極性強，在pH＝7的時候PC分子膽堿的N帶一個正電荷，磷酸上的O帶一個負(fù)電荷，整個分子呈電中性不帶電荷。
PC的結(jié)構(gòu)式磷脂酰膽堿具有重要的藥物價值，從磷脂中分離磷脂酰膽堿也一直是國內(nèi)外磷脂研究的重要課題，目前國內(nèi)外學(xué)者研究的分離方法主要包括低碳醇法、超濾法、沉淀法、色譜法和超臨界流體法等，其中，色譜法根據(jù)填料的不同可分為以下幾種三氧化二鋁柱層析法、硅膠柱層析法、離子交換柱層析法，上述方法主要是針對PC與PE這兩種磷脂的分離，制得的PC產(chǎn)品純度在90％左右，三氧化二鋁柱對其他磷脂的吸附能力較強只能將極性較強的PC從柱上洗脫下來，洗脫的周期較短但過程中會產(chǎn)生溶血磷脂；硅膠柱可以實現(xiàn)PC、PE、PI等幾種磷脂的分離，但是洗脫周期較長；離子交換樹脂分離磷脂的研究較少，僅對樹脂分離磷脂的可行性進(jìn)行了研究，具體工藝參數(shù)方面的研究不夠系統(tǒng)。根據(jù)分離物結(jié)構(gòu)特點，提出了離子交換樹脂分離磷脂酰膽堿的方法，而且離子交換樹脂可再生重復(fù)使用，成本低、較適合大規(guī)模工業(yè)化制備等特點，目前未見國內(nèi)外關(guān)于此方面的報道文章。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用樹脂層析法從磷脂中分離純化磷脂酰膽堿的方法，對用離子交換樹脂分離純化磷脂酰膽堿的吸附和洗脫的工藝進(jìn)行了研究，實現(xiàn)磷脂酰膽堿的分離純化，并確定了相應(yīng)的工藝參數(shù)。
本發(fā)明的技術(shù)方案用樹脂層析法從磷脂中分離純化磷脂酰膽堿的方法，是以醇溶磷脂為原料，配成濃度3-5mg/mL的醇溶磷脂的乙醇溶液，以1mL/min流速加入到D113-IIIFC樹脂層析柱(2.8×50cm)中，再用95％乙醇以0.5-1mL/min的速度洗脫，收集洗脫液，蒸發(fā)濃縮除去溶劑，真空干燥得到淡黃色塑狀體磷脂酰膽堿產(chǎn)品。
所用D113-IIIFC樹脂使用前須經(jīng)預(yù)處理，D113-IIIFC陽離子交換樹脂預(yù)處理方法取處理樹脂體積兩倍的飽和食鹽水，將樹脂置于飽和食鹽溶液中浸泡18-20小時，然后放盡食鹽水，用清水漂洗凈，使排出水不帶黃色，再用樹脂體積2倍的4％NaOH溶液，在其中浸泡2-4小時，放盡堿液后沖洗樹脂直至排出水接近中性為止，最后用樹脂體積2倍的5％HCl溶液浸泡4-8小時，放盡酸液，用清水漂至中性待用。
所用樹脂進(jìn)行篩選時均需進(jìn)行預(yù)處理，陽離子交換樹脂的預(yù)處理方法同D113-IIIFC樹脂使用前的預(yù)處理。
陰離子交換樹脂的預(yù)處理方法為飽和食鹽水，取約等于處理樹脂體積的兩倍，將樹脂置于食鹽溶液中浸泡18-20小時，然后放盡食鹽水，用清水漂洗凈，使排出水不帶黃色，其次再用5％HCl溶液，用量為樹脂體積的2倍，在其中浸泡4-8小時，放盡酸液后沖洗樹脂直至排出水接近中性為止。最后用4％NaOH溶液，用量為樹脂體積的2倍，浸泡2-4小時，放盡堿液，用清水漂至中性待用。
樹脂再生用95％乙醇洗脫樹脂柱直至流出液為無色，經(jīng)多次使用后樹脂吸附的雜質(zhì)較多，顏色變深，可從柱上端依次加入2％NaOH和5％HCl水溶液洗脫，最后用水洗至流出液為中性即可再用。
樹脂篩選靜態(tài)吸附吸附量和吸附率的測定分別準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的樹脂2g放入150mL的錐形瓶中，再加入一定濃度的醇溶磷脂溶液30mL，靜態(tài)吸附24h后，測定溶液中磷脂酰膽堿的濃度。按下式計算各種樹脂的吸附量和吸附率。
Q=(C0-Ce)×VW]]>E%=C0-CeC0×100%]]>其中
Q-吸附量(mg/g) E％-吸附率C0-吸附原液中磷脂酰膽堿濃度(mg/mL) V-吸附液的體積(mL)Ce-吸附平衡后溶液中磷脂酰膽堿濃度(mg/mL)W-樹脂的重量(g)靜態(tài)解吸率的測定樹脂在分離天然物質(zhì)中有效成分時是利用吸附的可逆性(即解吸)。由于樹脂極性不同，對磷脂酰膽堿吸附強弱不同，解吸難易程度不同。因此，工業(yè)上希望樹脂不僅吸附量大，還要求解吸率高，以保證有效成份最大限度的回收。解吸率測定是樹脂試驗的重要環(huán)節(jié)。
取吸附飽和的6種不同型號樹脂，依次用20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、80％乙醇、95％乙醇、無水乙醇30mL在恒溫震蕩器中震蕩24h，過濾，取濾液定容，測定磷脂酰膽堿含量，按下式計算解吸率B%=C1×V1(C0-Ce)××100%]]>其中B％-解吸率 C1-解吸液中PC的濃度(mg/mL)V1-解吸后體積(mL) C0-吸附原液中PC的濃度(mg/mL)V-吸附液體積(mL)Ce-吸附平衡后溶液中PC的濃度(mg/mL)本發(fā)明的有益效果用本發(fā)明方法處理磷脂得到的產(chǎn)品，產(chǎn)品中磷脂酰膽堿(PC)含量為94.02％(wt％)，產(chǎn)品得率為80.74％。


圖1醇溶磷脂進(jìn)樣液濃度對吸附率的影響。
圖2進(jìn)樣液pH對吸附率的影響。
圖3不同濃度乙醇對PC的洗脫效果。
圖495％乙醇的洗脫曲線。
圖5洗脫流速對洗脫效果的影響。
圖6重復(fù)洗脫的次數(shù)。
具體實施例方式
實施例1樹脂的篩選單位質(zhì)量的樹脂對磷脂酰膽堿的吸附量是設(shè)備設(shè)計的重要參數(shù)。樹脂的吸附性能與被吸附分子的極性、大小以及吸附劑的極性、比表面積、孔徑大小等因素有非常密切的關(guān)系。選擇10種離子交換樹脂，它們對磷脂酰膽堿的靜態(tài)吸附情況見表1。
由表1可知，201×7、201×4、D296具有較高的吸附率，其次是D113-IIIFC、001×7、SQD-88，而D001、SQD-61、D301-III、D318的吸附率較小。根據(jù)工業(yè)應(yīng)用要求，選擇吸附率較高的201×7、201×4、D296、D113-IIIFC、001×7、SQD-88六種樹脂作靜態(tài)解吸實驗。用100％乙醇進(jìn)行解吸，其解吸實驗結(jié)果見表2。由表2可知，D113-IIIFC的解吸率較高，而吸附率很高的陰性離子交換樹脂的解吸率極低。
表1 10種離子交換樹脂對磷脂酰膽堿的吸附量和吸附率

表2 6種樹脂對磷脂酰膽堿的解吸率和解吸量

用不同濃度的乙醇對吸附飽和的D113-IIIFC進(jìn)行靜態(tài)解吸實驗，結(jié)果見表3。由表3可見，60％、80％的乙醇對PC的解吸作用相對較大；濃度較低的乙醇對PC的解吸作用很小，這可能是因為低濃度的乙醇對PC的溶解性較小的原因。
表3 不同濃度乙醇對D113-IIIFC的解吸率

吸附量、解吸率和選擇性是大孔型離子交換樹脂在分離天然產(chǎn)物時需要考慮的重要參數(shù)，它不僅要求吸附樹脂具備較高的吸附量，同時還應(yīng)該具有較高的解吸率和選擇性。因此，從吸附量和解吸率綜合考慮，在分離磷脂酰膽堿的過程中，D113-IIIFC是一種較為理想的吸附型離子交換樹脂，因此選擇D113-IIIFC樹脂進(jìn)行后續(xù)實驗。
實施例2進(jìn)樣液濃度對吸附效果的影響將不同濃度的醇溶磷脂溶液進(jìn)行動態(tài)吸附實驗，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，當(dāng)醇溶磷脂濃度為3～5mg/mL時，樹脂對PC的吸附率均比較理想。當(dāng)醇溶磷脂濃度為3mg/mL時，樹脂對PC的吸附率最大，達(dá)42.97％，故最佳上樣濃度選擇3mg/ml。
實施例3進(jìn)樣液pH對吸附效果的影響在不同pH值下進(jìn)行吸附試驗，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，在弱堿性條件下PC和PE的吸附效果均比較理想，進(jìn)樣液的pH值為7.5左右時即沒有改變原溶液pH的情況下，D113-IIIFC樹脂對PC的吸附率最大，繼續(xù)增加pH則吸附率明顯下降。這是由于樹脂本身是弱酸性的陽離子交換樹脂，在弱堿性條件下更有利于PC和PE與之發(fā)生離子交換，但是當(dāng)pH過大時，由于大量的鈉離子與PC(或PE)發(fā)生競爭吸附，同時堿性過大對樹脂本身不利，從而導(dǎo)致吸附率下降。綜合考慮吸附效果與工藝的簡易性采用不調(diào)節(jié)pH直接進(jìn)行吸附分離。
實施例4吸附流速對吸附效果的影響吸附流速主要是影響溶質(zhì)向樹脂表面的擴散，從而決定了吸附效果。如果流速太快，溶質(zhì)分子來不及擴散到樹脂內(nèi)表面，就會發(fā)生泄露，造成樣品的流失。將醇溶磷脂溶液分別以0.5、1、1.5、2、2.5ml/min吸附流速上柱。按下式計算泄露率。
試驗結(jié)果顯示，吸附流速變化時對樹脂吸附PC(泄漏率36％左右)的效果影響不大，反而在1ml/min的流速時PE的泄漏率最大，88.6％。PE吸附的越少在后續(xù)分離實驗中對PC的富集影響越小，因此選擇1ml/min的吸附流速。
實施例5洗脫液的選擇和洗脫曲線的繪制D113-IIIFC樹脂是一種大孔型丙烯酸系弱酸陽離子交換樹脂，根據(jù)相似相溶原理，依次用不同濃度的乙醇-水溶液作為洗脫劑。將一定濃度的醇溶磷脂溶液上柱，達(dá)到吸附飽和后，在流速1mL/min下，分別用30％、45％、60％、80％、95％乙醇洗脫，洗脫結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，95％乙醇洗脫效果最好，其洗脫峰集中，對稱性較好，無明顯的拖尾現(xiàn)象；30％乙醇幾乎不能洗脫磷脂酰膽堿；45％乙醇洗脫效果較60％乙醇和85％乙醇洗脫效果好，但45％、60％、85％乙醇對PC的洗脫能力相對95％乙醇而言比較弱，而且譜帶較寬。
由圖4可以看出，用4倍柱床體積的95％乙醇基本上可以將PC洗脫下來，且洗脫峰較集中。因此，最佳洗脫劑用量是4倍的柱床體積。從結(jié)果可見，雖然樹脂吸附的PE量交PC少，但PE沒有被洗脫下來。實現(xiàn)PE的回收，并實現(xiàn)樹脂的循環(huán)使用。
實施例6洗脫流速對洗脫效果的影響洗脫流速決定著生產(chǎn)周期，為了保證較高的純度和處理量，必須選擇合適的洗脫流速。將一定濃度的醇溶磷脂溶液吸附在樹脂柱上，然后用95％乙醇洗脫，控制0.5、1、1.5、2、2.5、3mL/min不同的流速，收集相同柱床體積的洗脫液，實驗結(jié)果見圖5。
由圖5可以看出，洗脫流速對洗脫效果有一定的影響。當(dāng)洗脫流速在0.5～1mL/min時，PC的濃度幾乎不變；當(dāng)洗脫流速大于1.5mL/min時，PC的解吸率大幅度下降。實驗結(jié)果表明，洗脫流速越慢洗脫效果越好，但太慢又會使工作周期延長。綜合考慮，洗脫流速為1mL/min為最佳。
實施例7樹脂使用次數(shù)對吸附的影響樹脂使用次數(shù)對吸附效果的影響如圖6所示。化合物經(jīng)樹脂柱吸附之后，在樹脂表面或內(nèi)部還殘存著許多非極性成分，或吸附性成分，這些雜質(zhì)會堵塞樹脂孔道，或使某些官能團失去吸附性能，即毒化樹脂，因此必須在下一次使用時再生樹脂。通常再生樹脂的方法是根據(jù)吸附物質(zhì)的性質(zhì)和樹脂本身的性質(zhì)決定的。
由圖6得出，樹脂在連續(xù)使用6次后對PC的吸附率下降不是很明顯，而對PE的吸附率則在連續(xù)使用4次后就發(fā)生了明顯的下降，因此D113-IIIFC樹脂在制備PC的時候至少可以連續(xù)使用6次后再進(jìn)行再生。
實施例8最佳工藝條件下驗證實驗將醇溶磷脂樣品配成濃度3mg/mL左右的醇溶磷脂的乙醇溶液，1mL/min流速下，加入到D113-IIIFC樹脂層析柱(2.8×50cm)中。再用95％乙醇以1mL/min的速度洗脫，收集洗脫液，蒸發(fā)濃縮除去溶劑，真空干燥得到淡黃色塑狀體PC產(chǎn)品。測定得，產(chǎn)品中磷脂酰膽堿(PC)含量為94.02％(wt％)，產(chǎn)品得率為80.74％。
權(quán)利要求
1.一種用樹脂層析法從磷脂中分離純化磷脂酰膽堿的方法，其特征是以醇溶磷脂為原料，配成濃度3-5mg/mL的醇溶磷脂的乙醇溶液，以1mL/min流速加入到D113-IIIFC樹脂層析柱中，再用95％乙醇以0.5-1mL/min的速度洗脫，收集洗脫液，蒸發(fā)濃縮除去溶劑，真空干燥得到淡黃色塑狀體磷脂酰膽堿產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所用D113-IIIFC樹脂使用前須經(jīng)預(yù)處理，D113-IIIFC陽離子交換樹脂預(yù)處理方法取處理樹脂體積兩倍的飽和食鹽水，將樹脂置于飽和食鹽溶液中浸泡18-20小時，然后放盡食鹽水，用清水漂洗凈，使排出水不帶黃色，再用樹脂體積2倍的4％NaOH溶液，在其中浸泡2-4小時，放盡堿液后沖洗樹脂直至排出水接近中性為止，最后用樹脂體積2倍的5％HCl溶液浸泡4-8小時，放盡酸液，用清水漂至中性待用。
全文摘要
一種用樹脂層析法從磷脂中分離純化磷脂酰膽堿的方法，屬于磷脂分離純化技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以醇溶磷脂為原料，配成濃度3－5mg/mL的醇溶磷脂的乙醇溶液，以1mL/min流速加入到D113－IIIFC樹脂層析柱中，再用95％乙醇以0.5－1mL/min的速度洗脫，收集洗脫液，蒸發(fā)濃縮除去溶劑，真空干燥得到淡黃色塑狀體磷脂酰膽堿產(chǎn)品。本發(fā)明提出了離子交換樹脂分離磷脂酰膽堿的方法，而且離子交換樹脂可再生重復(fù)使用，成本低、較適合大規(guī)模工業(yè)化制備等特點。用本發(fā)明方法處理磷脂得到的產(chǎn)品，產(chǎn)品中磷脂酰膽堿(PC)含量為94.02％(wt％)，產(chǎn)品得率為80.74％。
文檔編號C07F9/00GK101033236SQ20071002121
公開日2007年9月12日 申請日期2007年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月13日
發(fā)明者劉元法, 王興國, 金青哲, 汪燕 申請人:江南大學(xué)