專利名稱：新型長效胸腺肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用基因工程技術(shù)合成的一種新型的長效胸腺肽蛋白的制備及其應(yīng)用，包括含有該基因的重組載體，用該載體轉(zhuǎn)化的宿主。
背景技術(shù)：
胸腺是體內(nèi)重要的免疫器官，在淋巴系統(tǒng)發(fā)育和維持免疫系統(tǒng)的正常功能中起重要作用，尤其在抗感染、抗腫瘤、移植和自身免疫性疾病等作用中具有特殊的意義。隨著機(jī)體年齡老化，胸腺會逐漸萎縮退化，從而導(dǎo)致機(jī)體對腫瘤、感染、免疫缺陷等疾病的耐受降低。1961年，在Miller等發(fā)現(xiàn)了胸腺與抗體的免疫功能及淋巴細(xì)胞的發(fā)育有密切的依賴關(guān)系以后，掀開了人類利用胸腺肽的研究。1966年Goldstein[1]首先從小牛胸腺組織中提取出該活性物質(zhì)，命名為胸腺肽(Thymosin)，美國1974年開始把小牛胸腺肽應(yīng)用于臨床，主要是治療原發(fā)性細(xì)胞免疫缺陷病和某些腫瘤。
胸腺肽是由胸腺上皮細(xì)胞所分泌的一類多肽類激素混合物，其水平與機(jī)體的免疫功能關(guān)系密切。其中胸腺肽的混合物中第5組分(thymosin fraction 5，TF-5)最為重要。該組分TF-5根據(jù)等電點(diǎn)(isoelectricpoint，pI)可分成分為三個區(qū)域pI小于5.0的組分的為胸腺肽α，介于5.0～7.0的之間的組分為胸腺肽β，而大于7.0以上的組分，但含量很少，為胸腺肽γ[1][2]。
β族胸腺素由幾種分子量小，高度保守的酸性蛋白質(zhì)組成，在免疫、細(xì)胞移動、血管生成、神經(jīng)再生、腫瘤侵潤、創(chuàng)傷愈合和炎癥反應(yīng)等許多方面具有重要的生物學(xué)功能[3][4]。其中與人類密切相關(guān)且研究較多的是胸腺素β4，β10和β15。。Low T[3]，研究證實(shí)胸腺肽β4能誘導(dǎo)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)的活性，在T細(xì)胞成熟的早期階段發(fā)揮作用。胸腺肽β4廣泛分布在哺乳動物和其他脊椎動物，尤其在脾和腹膜巨噬細(xì)胞中含量最高。胸腺肽的活性部位主要集中在α區(qū)，而在胸腺肽α中最主要的活性組分是胸腺肽α1(thymosin α1，Tα1)。
胸腺肽α1是一種具有熱穩(wěn)定性的酸性多肽，由28個氨基酸組成，等電點(diǎn)為4.2，相對分子量3108，且不含有甲硫氨酸、半胱氨酸及芳香族氨基酸。1977年Dardenne等從豬血清中分離提取出一種9肽分子，命名為血清胸腺因子(factor thymique serique，serum thymicfactor，F(xiàn)TS)，即胸腺九肽，其與鋅結(jié)合后方具有生物活性，主要參與機(jī)體免疫功能[4]。1984年，Haritos等從大鼠胸腺分離出一種含有111個氨基酸殘基的多肽，其N端含已發(fā)現(xiàn)的所有胸腺肽α家族成員的序列，因此命名為胸腺肽α原，認(rèn)為是Tα1的前體分子。Goodall等學(xué)者的研究表明，Tα1是ProTα的降解產(chǎn)物，也有研究表明Tα1和ProTα在完整的胸腺組織中同時存在。ProTα具有與Tα1相似的生物學(xué)活性，它不僅能調(diào)節(jié)免疫功能，而且對細(xì)胞的增殖等也具有調(diào)節(jié)作用[5，6]。此后，美國G.Goldstein又發(fā)現(xiàn)了一個胸腺五肽，稱為(thymopentin，TP-5)，是胸腺素的活性中心，由5個氨基酸構(gòu)成，具有與胸腺肽α1相似的生物活性[7]。
胸腺肽是一種免疫調(diào)節(jié)劑，能誘導(dǎo)前T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為有細(xì)胞免疫功能的T淋巴細(xì)胞。還可以使胸腺和脾臟等免疫器官增大、巨噬細(xì)胞吞噬功能增強(qiáng)、活性增加?？梢杂糜诜乐坞婋x輻射造成的損傷，并使免疫功能低下的機(jī)體胸腺淋巴細(xì)胞cAMP和cGMP含量升高，而對正常機(jī)體無明顯作用，是治療原發(fā)性和繼發(fā)性免疫缺陷病、急慢性病毒性肝炎、難治性肺結(jié)核、銀屑病、支氣管哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡、以及輔助治療白血病和惡性腫瘤等的有效生化藥物，還用于抗衰老[8]。
Tα1在體外可以促進(jìn)致敏細(xì)胞生成淋巴因子，增加細(xì)胞因子高親合力受體的表達(dá)；能夠增加T細(xì)胞在各種抗原或致有絲分裂原激活后產(chǎn)生IFNα、IL-2和IL-3等淋巴因子的分泌，增加T細(xì)胞表面淋巴因子受體的水平；Tα1還能影響NK前體細(xì)胞的募集，使其在暴露于淋巴因子后變得更有細(xì)胞毒性，調(diào)控骨髓前體細(xì)胞和脾細(xì)胞的末端脫氧核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)活性；增強(qiáng)骨髓前體細(xì)胞Thy1和Lyt1，2，3的表達(dá)；拮抗胸腺細(xì)胞成熟過程中的凋亡。Tα1在體內(nèi)能增加ConA激活后的小鼠淋巴細(xì)胞增加分泌IL-2，并增加IL-3受體的表達(dá)，配伍其它細(xì)胞因子具有抗腫瘤作用，體內(nèi)應(yīng)用結(jié)果也表明其在T細(xì)胞發(fā)育和功能重建中具有重要意義，可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞分泌IL-2和IL-3受體的表達(dá)；增強(qiáng)宿主的抗感染能力促進(jìn)病毒的清除；增強(qiáng)免疫功能有抗氧化、抑制癌細(xì)胞生長等重要作用[8]。Tα1臨床用途廣泛，已應(yīng)用于治療乙肝、丙肝、癌癥、及免疫缺陷等疾病的治療中，是一種針對T淋巴細(xì)胞的免疫增強(qiáng)劑，并可以作為疫苗輔助劑使用，是目前臨床使用療效確切的一類藥物[9-11]。
目前臨床用胸腺肽類藥物主要有兩大類一類是從動物胸腺中提取的天然多肽的混合物，含有40-50種多肽成分。國內(nèi)生產(chǎn)的大部分胸腺肽主要是該類藥物[12]，但是該胸腺肽制劑含有的活性成分Tα1尚不足1％，不僅該藥物生產(chǎn)受到原料來源的限制，而且主要成分未經(jīng)純化，部分具有動物抗原性，加之生產(chǎn)廠家不同而產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，臨床使用副作用較多，療效不是很理想，市場急需換代。另一類胸腺肽類藥物是胸腺中分離的單一組分，主要以化學(xué)合成的為主。目前國外化學(xué)合成的胸腺肽α1(Thymosinal)已進(jìn)入我國市場，商品名為“日達(dá)仙”；該藥屬于化學(xué)合成多肽，純化難度大，因此生產(chǎn)成本高，高昂的價格使得大多數(shù)患者無法負(fù)擔(dān)，治療質(zhì)量因此下降。此外，國內(nèi)還有一種化學(xué)合成的胸腺五肽(thymopentin，TP-5)。相對于胸腺肽Tα1 2小時的半衰期，胸腺五肽的半衰期僅為30秒，雖然較胸腺肽α1有相對較低的生產(chǎn)成本，但是其較短的半衰期，極大地限制了該藥在臨床中的應(yīng)用。
人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是由585個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，分子量約為66.5KD，是血漿的主要成分，也是許多內(nèi)源因子和外源藥物的載體。由于正常情況下不易透過腎小球，在血漿中的半衰期較長，可達(dá)14-20天，而且體內(nèi)分布極廣，沒有酶學(xué)和免疫學(xué)活性，因而是一種理想的生物活性蛋白載體[14-16]。
胸腺肽療效確切，屬臨床常用急需藥物，目前上市產(chǎn)品都存在無法避免的缺憾，一定程度上降低了該藥物的治療質(zhì)量。利用現(xiàn)代蛋白質(zhì)工程技術(shù)將血清白蛋白與胸腺肽在酵母中表達(dá)為融合蛋白，該蛋白不僅保持原有胸腺肽的生物活性，具有較長的半衰期，而且在酵母中表達(dá)生產(chǎn)成本較低、效率高，因此，利用基因工程技術(shù)進(jìn)行此類藥物的研究與生產(chǎn)具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新型的長效胸腺肽蛋白。目的是解決傳統(tǒng)胸腺肽在治療上的不足?？傊?，與常規(guī)的胸腺肽相比，本發(fā)明的新型重組胸腺肽蛋白具有下列優(yōu)點(diǎn)1)能夠在酵母中實(shí)現(xiàn)高表達(dá)，表達(dá)后無需復(fù)性，便于純化。2)新型重組胸腺肽蛋白在體內(nèi)的半衰期延長；3)能調(diào)節(jié)并促進(jìn)機(jī)體的免疫應(yīng)答；能起到最大的治療作用以及減少傳統(tǒng)胸腺肽潛在的副作用或毒性；4)重組表達(dá)生產(chǎn)成本較低、效率高。
本發(fā)明的新型的長效胸腺肽蛋白，是指將血清白蛋白分子，或其變體或片段或結(jié)構(gòu)域與胸腺肽分子或其變體或片段融合所形成。
本發(fā)明的新型的長效胸腺肽蛋白，包括與序列表SEQ ID No1中血清白蛋白或者與血清白蛋白至少85％序列同源的第一區(qū)，連接在血清白蛋白C-末端的與序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽或者與胸腺肽至少85％序列同源的第二區(qū)，和連接在血清白蛋白N-末端的與序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽或者與胸腺肽至少85％序列同源的第三區(qū)，所述的蛋白可以由上述的第一區(qū)，第二區(qū)和第三區(qū)同時連接構(gòu)成，也可以由第一區(qū)和第三區(qū)或者第一區(qū)和第二區(qū)直接連接構(gòu)成。
其中優(yōu)選的是包括與序列表中SEQ ID No1血清白蛋白至少95％序列同源的第一區(qū)，連接在血清白蛋白C-末端的與序列表中SEQ ID No2-5人胸腺肽至少95％序列同源的第二區(qū)，和連接在血清白蛋白N-末端的與序列表中SEQ ID No2-5人胸腺肽至少95％序列同源的第三區(qū)。最優(yōu)選的是包括與序列表中SEQ ID No1人血清白蛋白序列相同的第一區(qū)，連接在血清白蛋白C-末端的與序列表中SEQ ID No2-5人胸腺肽序列相同的第二區(qū)，和連接在血清白蛋白N-末端的與序列表中SEQ ID No2-5人胸腺肽序列相同的第三區(qū)，或上述三區(qū)的功能等同物。
所述的功能等同物是指在不改變本發(fā)明所述的新型的長效胸腺肽蛋白特性的前提下，對融合蛋白中個別氨基酸殘基的取代、缺失或插入得到的蛋白。但這些改變不能明顯改變白蛋白的一個或多個有用的配體結(jié)合和非免疫原的特性，或在胸腺肽中則是非免疫原性及可結(jié)合并激活胸腺肽受體的能力。特別的，將人血清白蛋白和人血清白蛋白片斷中天然發(fā)生的多態(tài)性變體包括在內(nèi)，融合蛋白中的白蛋白和胸腺肽可來自任何脊椎動物，特別是任何哺乳動物，如牛、羊豬、雞或鮭魚。融合蛋白中的白蛋白和胸腺肽可以來自不同的動物。
可以通過對本發(fā)明的新型的長效胸腺肽蛋白中個別氨基酸殘基進(jìn)行取代、缺失或插入，得到與正常血清白蛋白或胸腺肽具有至少85％的序列同源性的變體(優(yōu)選地是至少具有，90％，95％，或99％的同源性)。相對于正常的血清白蛋白，血清白蛋白變體應(yīng)至少包含或是由血清白蛋白的一個完整的結(jié)構(gòu)域組成，如結(jié)構(gòu)域1(1-194)，2(195-387)，3(388-585)，或者是三個結(jié)構(gòu)域的不同組合。此外，每個結(jié)構(gòu)域本身由兩個同源亞結(jié)構(gòu)組成，這些亞結(jié)構(gòu)域稱為1-105，120-194，195-291，316-387，388-492，512-585。優(yōu)選融合蛋白的血清白蛋白部分至少包含一個血清白蛋白的亞結(jié)構(gòu)域，或結(jié)構(gòu)域。相對于正常的胸腺肽，胸腺肽變體應(yīng)能結(jié)合并激活胸腺肽受體，具有胸腺肽活性，一般至少具有5個氨基酸，優(yōu)選的至少含有9，28，110個氨基酸。
組成本發(fā)明的長效胸腺肽蛋白核苷酸序列，與其相似的核苷酸序列具有至少85％的序列同源性的核苷酸，其包括即使有多達(dá)15％的核苷酸個體可以被替換、刪減或插入等，均與本發(fā)明所指的核苷酸序列相同。無論是在5’或3’端，或在兩端之間的任何位點(diǎn)發(fā)生的突變，還是以單體或多體發(fā)生的突變。
當(dāng)應(yīng)用本領(lǐng)域公認(rèn)的軟件或其他任何具有類似的DNA序列對比分析時，某一特定的序列如與本發(fā)明所提出的序列有85％以上的序列同源性，均認(rèn)為與本發(fā)明長效胸腺肽蛋白所述的序列相同源。
本發(fā)明的新型的長效胸腺肽蛋白，所述連接在血清白蛋白C-末端的與序列表中SEQ IDNo2-5胸腺肽氨基酸序列相同的第二區(qū)和連接在血清白蛋白N-末端的與序列表中SEQ IDNo2-5胸腺肽氨基酸序列相同的第三區(qū)，可以是相同的序列，也可以是不同的序列。所述連接在血清白蛋白C-末端的與序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽同源的第二區(qū)和連接在血清白蛋白N-末端的與序列表中SEQ ID No2-5第三區(qū)同時連接在血清白蛋白的C-末端及N-末端，所述與血清白蛋白同源的第一區(qū)位于胸腺肽蛋白的中間。也可以是與血清白蛋白同源的第一區(qū)與連接在血清白蛋白的C-末端的與序列表中SEQ ID No2-4胸腺肽同源的第二區(qū)連接，而不與連接在血清白蛋白的N-末端的與序列表中SEQ ID No2-4胸腺肽同源的第三區(qū)連接形成融合蛋白。也可以是與血清白蛋白同源的第一區(qū)可以與連接在血清白蛋白的N-末端的與序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽同源的第三區(qū)連接，而不與連接在血清白蛋白的C-末端的與序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽同源的第二區(qū)連接形成融合蛋白。
本發(fā)明的新型長效胸腺肽蛋白中，可以是所述與血清白蛋白同源的第一區(qū)與胸腺肽同源的第二區(qū)、血清白蛋白同源的第一區(qū)與胸腺肽同源的第三區(qū)直接連接，不設(shè)連接肽。即可以是胸腺肽—血清白蛋白—胸腺肽，或胸腺肽—血清白蛋白，也可以是血清白蛋白—胸腺肽。
本發(fā)明的新型的長效胸腺肽蛋白，可以是所述與血清白蛋白同源的第一區(qū)與胸腺肽同源的第二區(qū)，血清白蛋白同源的第一區(qū)與胸腺肽同源的第三區(qū)之間設(shè)有連接肽，即可以是胸腺肽—連接肽—血清白蛋白—連接肽—胸腺肽，胸腺肽—血清白蛋白—連接肽—胸腺肽，胸腺肽—連接肽—血清白蛋白—胸腺肽，也可以是血清白蛋白—連接肽—胸腺肽，胸腺肽—連接肽—血清白蛋白。
為了使胸腺肽最大地保持其生物活性，連接肽的較優(yōu)選的長度為2-100個氨基酸，更優(yōu)選的連接肽的長度為5-50個氨基酸，最優(yōu)選的是14-30個氨基酸。優(yōu)選的連接肽的通式是[GlyGlyGlyGlySer]n，其中n為1-10的整數(shù)，優(yōu)選的n為1-5的整數(shù)。連接肽長度可短至白蛋白大分子對胸腺肽形成的位阻保持最小，連接肽的加入有利于胸腺肽與其受體結(jié)合。但是連接肽的加入可能使融合蛋白在作為藥物的使用時產(chǎn)生額外的免疫原性，最優(yōu)選的是沒有連接肽，即胸腺肽—血清白蛋白—胸腺肽，或胸腺肽—血清白蛋白，也可以是血清白蛋白—胸腺肽。
本發(fā)明的新型長效胸腺肽蛋白可以是分泌型的蛋白，可與胸腺肽的特異性抗體相結(jié)合，也可與人的特異性血清白蛋白抗體相結(jié)合，優(yōu)選的，是與胸腺肽的特異性抗體相結(jié)合。
本發(fā)明重點(diǎn)描述的是胸腺肽α1-血清白蛋白—胸腺肽α1的制備，其他種類的胸腺肽家族成員能用同樣的方法制備新的胸腺肽類似物。其中的胸腺肽家族成員可以是胸腺肽α1，胸腺肽α原，胸腺五肽，胸腺九肽等有相似生物活性的多肽。
本發(fā)明還包括所有在體內(nèi)、體外具有胸腺肽生物功能的蛋白。特別是包括，但不局限于胸腺肽α1，胸腺肽α原，胸腺五肽，胸腺九肽以及其他的胸腺肽。
本發(fā)明目的是提供本發(fā)明長效胸腺肽蛋白的蛋白質(zhì)序列和基因序列。包括與序列表中SEQID No1血清白蛋白序列至少85％同源的第一區(qū)，連接在血清白蛋白的C-末端與序列表中SEQID No2-5胸腺肽序列至少85％同源的第二區(qū)，和連接在血清白蛋白的N-末端與序列表中SEQID No2-5胸腺肽序列至少85％同源的第三區(qū)的融合蛋白的蛋白質(zhì)序列和基因序列。
本發(fā)明的另一個目的是提供攜帶編碼本發(fā)明融合蛋白基因序列的重組表達(dá)載體，包括pPIC9K/HSA-Tα1、pPIC9K/Tα1-HSA-Tα1、pPIC9K/HSA-(Gly4Ser)n-Tα1、pPIC9 K/Tα1-(Gly4Ser)n-HSA-(Gly4Ser)n-Tα1、pPIC9K/TP5-HSA-Tα1等。
本發(fā)明的再一個目的是提供表達(dá)本發(fā)明長效胸腺肽蛋白編碼基因的宿主。本發(fā)明的宿主可以是被重組表達(dá)載體或重組表達(dá)載體的一部分轉(zhuǎn)化，含有本發(fā)明的新型的長效胸腺肽蛋白編碼基因的細(xì)菌、酵母、動物細(xì)胞或植物細(xì)胞以及含有本發(fā)明融合蛋白基因序列的轉(zhuǎn)基因動、植物；其中優(yōu)選的是酵母，更優(yōu)選的是畢赤酵母，最優(yōu)選的是GS115。
本發(fā)明提供的長效胸腺肽蛋白適用于畢赤酵母中表達(dá)，構(gòu)建的載體整合至畢赤酵母的基因組中，十分穩(wěn)定，不易丟失。畢赤酵母具有許多高等真菌細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)所具有的優(yōu)點(diǎn)，能進(jìn)行蛋白質(zhì)的加工和折疊，轉(zhuǎn)錄后的修飾，而且易于大規(guī)模培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵。與其他的表達(dá)系統(tǒng)如哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)相比具有更簡潔、快速表達(dá)和產(chǎn)量更高的優(yōu)點(diǎn)。畢赤酵母能以甲醇為單一碳源進(jìn)行代謝，含有是可調(diào)控的醇氧化酶強(qiáng)啟動子，重組蛋白表達(dá)高。此外，畢赤酵母表達(dá)的重組蛋白高效分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)液中，避免了由酵母細(xì)胞抽提物中分離純化蛋白的難題，不但提高表達(dá)蛋白的活性，而且非常有利于重組蛋白的純化，純化步驟簡潔高效，同時酵母分泌的蛋白僅占全部酵母蛋白的很小部分，終產(chǎn)品無毒性，利于臨床使用[17-18]。
本發(fā)明的新型長效胸腺肽蛋白，編碼血清白蛋白和胸腺肽的DNA序列可以用PCR，RT-PCR方法、人工合成的方法和構(gòu)建篩選cDNA文庫等本領(lǐng)域周知的方法獲得[20，21]。其中上述方法所采用的mRNA或cDNA可以來源于任何含有相應(yīng)mRNA或cDNA的組織(細(xì)胞)和文庫等。對多聚核苷酸進(jìn)行的突變、缺失、插入以及其他多聚核苷酸鏈接，可用本領(lǐng)域公知的方法。可以用PCR等方法，在編碼序列的兩側(cè)引入限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，進(jìn)行編碼白蛋白和編碼胸腺肽多聚核苷酸的融合，通過酶切產(chǎn)生粘性末端用DNA連接酶連接后從而獲得編碼融合蛋白的基因。
本發(fā)明的長效胸腺肽蛋白的表達(dá)載體和其對應(yīng)的宿主可以是，如酵母表達(dá)載體pPIC9，pPIC9K，pPIC3.5K，pAO815，pPICZα，pHIL-S1，pGAPZ，pPICZ等，動物細(xì)胞表達(dá)載體pSVK3，pMSG等，這些質(zhì)粒及對應(yīng)的宿主菌等可以從商業(yè)公司購得。其中優(yōu)選的質(zhì)粒為帶有His4選擇性標(biāo)記的酵母整合型質(zhì)粒，如pPIC9，pPIC9K等，通過將編碼本發(fā)明的新型的長效胸腺肽蛋白或多肽的核酸克隆到這些酵母表達(dá)載體中。優(yōu)選的啟動子為醇氧化酶AOX1。
本發(fā)明長效胸腺肽蛋白的表達(dá)宿主可以是細(xì)菌、酵母、動物細(xì)胞或植物細(xì)胞以及含有本發(fā)明融合蛋白基因序列的轉(zhuǎn)基因動、植物等。融合蛋白或多肽的表達(dá)可以是胞內(nèi)，也可以分泌至表達(dá)宿主胞外的培養(yǎng)液中。優(yōu)選的表達(dá)方式是分泌至培養(yǎng)液中，形成可溶性的蛋白。
本發(fā)明的長效胸腺肽蛋白可以經(jīng)白蛋白天然信號肽分泌到酵母菌的培養(yǎng)液中。含有血清白蛋白胸腺肽融合蛋白可以由信號肽主導(dǎo)并通過分泌途經(jīng)而得到加工。分泌所用的信號肽，優(yōu)選的是天然的人血清白蛋白的信號肽，或釀酒酵母配對因子α因子，或這兩種信號肽的類似物。更優(yōu)選的用天然的人血清白蛋白的信號肽，這些信號肽在成熟的白蛋白釋放到周圍介質(zhì)中即被酵母切割。融合蛋白也可以不用信號肽，而在酵母中以胞內(nèi)可溶形式表達(dá)。編碼融合蛋白的核酸，可以插入至宿主染色體，或以游離質(zhì)粒形式存在。
宿主細(xì)胞可以利用周知的方法經(jīng)遺傳工程(轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)將攜帶由本發(fā)明融合蛋白核苷酸序列的質(zhì)粒載體以侵入方式、病毒感染、噬菌體等形式轉(zhuǎn)入到宿主中表達(dá)。其中轉(zhuǎn)化融合蛋白核苷酸序列至宿主細(xì)胞中可用周知的方法，如電穿孔，制備感受態(tài)的原生質(zhì)體，化學(xué)轉(zhuǎn)化等。成功轉(zhuǎn)化并含有本發(fā)明融合蛋白核苷酸序列構(gòu)建體的細(xì)胞，可通過常用的方法進(jìn)行鑒定，如提取DNA，然后PCR方法鑒定?；蛘呤占?xì)胞破碎液或胞外培養(yǎng)液中的蛋白，用抗白蛋白抗體或抗胸腺肽抗體進(jìn)行ELISA檢測鑒定。
本發(fā)明的新型長效胸腺肽蛋白的生產(chǎn)，可以通過培養(yǎng)含有本發(fā)明核苷酸序列構(gòu)建體的宿主菌體如，重組酵母，細(xì)菌，動、植物細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因動植物等獲得。宿主菌體(或細(xì)胞)的培養(yǎng)可以是人們熟知的方法，如用搖瓶或生物反應(yīng)器等，生產(chǎn)時優(yōu)選的為生物反應(yīng)器。適合菌體(或細(xì)胞)生長和產(chǎn)物表達(dá)的培養(yǎng)基，應(yīng)通過實(shí)驗(yàn)獲得，應(yīng)能提供菌體(或細(xì)胞)生長表達(dá)產(chǎn)物所需的氮源、碳源、pH緩沖成分，無機(jī)鹽，微量元素等。
本發(fā)明的新型長效胸腺肽蛋白的純化處理，其中包括如鹽析、沉淀、超濾、液相層析等技術(shù)及這些技術(shù)的組合。其中液相層析可以用凝膠排阻、親和、離子交換、疏水、反相等層析技術(shù)。
通過本發(fā)明獲得的新型長效胸腺肽蛋白。能夠使其在不喪失激活受體和刺激機(jī)體增強(qiáng)免疫功能的情況下，血漿中的半衰期將會得到顯著的延長。這樣就會降低了給藥頻率和劑量，卻發(fā)揮出與胸腺肽相似的藥效作用。
本發(fā)明的新型長效胸腺肽蛋白可以有各種衍生物，這些衍生物可以是但不局限于其不同形式的鹽、修飾產(chǎn)物等。如在多肽的氨基、羧基、羥基、巰基上再進(jìn)行修飾。所用修飾劑可以但不局限于聚乙二醇，葡聚糖等。
本發(fā)明的新型長效胸腺肽蛋白及其衍生物可以單獨(dú)以純品使用，也可以與一個或多個藥學(xué)上可以接受的載體一起組成藥物制劑的形式使用，其中優(yōu)選的是組成藥物制劑，并可通過任何本領(lǐng)域已知的方法制備。常用的藥物載體一般為水、鹽水、糖類、醇類或氨基酸。藥物制劑可以單位劑量的形式存在，優(yōu)選的藥物制劑包含含水的液體制劑和含水量低于10％或不含水的凍干制劑。這些制劑可以含有緩沖劑，鹽類，糖類等，使藥物的滲透性與受體血液中的滲透性相等或相似。
本發(fā)明的新型長效胸腺肽蛋白及其衍生物或其藥物組合物可以用于哺乳動物，優(yōu)選的是人類，可以通過任何已知的方法，包括但不局限于口服、注射、皮下或經(jīng)非腸胃，腹腔膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、靜脈輸注、舌下、吸入、肌肉、腸內(nèi)、唾液腺、鼻內(nèi)、脂質(zhì)法，通過吸入、注射、陰道、眼內(nèi)等方法給藥。優(yōu)選的方法為靜脈輸注或注射給藥。治療包括在一段時間內(nèi)使用單一劑量或復(fù)合劑量。
本發(fā)明的新型長效胸腺肽蛋白及其衍生物或其藥物組合物，作為免疫調(diào)節(jié)劑藥物可用于治療機(jī)體免疫功能低下如復(fù)發(fā)性口瘡、麻風(fēng)、重癥感染、慢性腎炎等，病毒性肝炎(乙肝、丙型肝炎等)及其它的病毒感染性疾病、腫瘤、類風(fēng)濕等各種適應(yīng)性疾病的治療。
采用基因工程方法表達(dá)胸腺肽是一種簡潔有效的途徑。生物工程技術(shù)的成熟使得胸腺肽在不同工程菌中的表達(dá)不存在技術(shù)障礙，這一點(diǎn)從國內(nèi)外文獻(xiàn)[11，12，21]中關(guān)于其在不同工程菌中的成功表達(dá)的報(bào)道中不難發(fā)現(xiàn)，但是作為小分子蛋白其表達(dá)后往往純化困難，難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，這也是目前該藥的臨床應(yīng)用主要來源于動物組織的提取及固相人工合成的主要原因。盡管也有文獻(xiàn)報(bào)道了將胸腺肽與硫氧環(huán)蛋白進(jìn)行的融合表達(dá)[22]。但是這種方法表達(dá)的融合蛋白還要經(jīng)過一次酶切后才能獲得最終的重組胸腺肽，這樣就要經(jīng)過兩次純化，不僅會因此影響胸腺肽的活性而且不利于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。白蛋白是機(jī)體正常存在的大分子蛋白，不具有酶學(xué)和免疫學(xué)特性，也是很多藥物的載體，本發(fā)明采用將胸腺肽與白蛋白融合表達(dá)，無需酶切即得到大分子的具有生物活性的重組蛋白，易于純化，而且胸腺肽的半衰期得到延長。這一結(jié)論業(yè)已得到我們的實(shí)驗(yàn)支持，而且我們還驚喜的發(fā)現(xiàn)，胸腺肽與白蛋白的融合在不同的連接方式即白蛋白C-和N-同時連接胸腺肽，與白蛋白C-或者N-連接胸腺肽，會產(chǎn)生不同的效果。我們的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，重組的Tα1-HSA-Tα1要比HSA-Tα1，HSA-TP5，具有高更的生物活性和半衰期。這一點(diǎn)將在我們下面的例證加以說明。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。


SEQ ID NO1為人血清白蛋白的基因和蛋白質(zhì)序列
SEQ ID NO2為胸腺肽α1的基因和蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO3為胸腺肽九肽的基因和蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO4為胸腺肽α原的基因和蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO5為胸腺肽五肽的基因和蛋白質(zhì)序列圖1為質(zhì)粒pPIC9K/HSA-Tα1的構(gòu)建過程圖2為質(zhì)粒pPIC9K/Tα1-HSA-Tα1的構(gòu)建過程圖3為質(zhì)粒pPIC9K/HSA-(Gly4Ser)n-Tα1的構(gòu)建過程圖4為質(zhì)粒Tα1-(Gly4Ser)n-HSA-(Gly4Ser)n-Tα1融合蛋白的構(gòu)建過程圖5為質(zhì)粒pPIC9K/HSA-TP5的構(gòu)建過程圖6為重組胸腺肽蛋白的分離純化結(jié)果其中1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，2為超濾濃縮液，3為DEAE純化樣品，4為親和層析bule-sepharose純化樣品，5為疏水純化樣品圖7為重組胸腺肽蛋白的活性分析圖8為重組胸腺肽蛋白大鼠單劑量靜注給予后的藥時曲線
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1HSA cDNA的克隆構(gòu)建提取的人肝臟組織mRNA，將100mg人肝臟組織直接放入研缽中，加入少許液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，如此三次，加TRIzol試劑1ml，轉(zhuǎn)入離心管，室溫放置5min。4℃(12000g)離心10min，取上清。加入0.2ml氯仿，蓋緊離心管蓋，手搖劇烈震蕩15s，然后冰浴放置15min，于4℃(12000g)離心15min，RNA存于上層水相中。轉(zhuǎn)移水相至另一個干凈的離心管中，加異丙醇0.5ml，混勻，室溫放置10min以沉淀RNA，然后于4℃(12000g)離心10min。移去上清液，加75％乙醇1ml洗滌沉淀，經(jīng)漩渦振蕩，然后于4℃(7500g)離心5min，回收RNA沉淀。移去上清液，將離心管置空氣中干燥，揮去乙醇，沉淀用50ul無核糖核酸酶(RNase)的水(焦碳酸二乙酯處理)溶解，65℃放置15min使變性，立即置冰上備用或凍于-70℃冰箱中保存。肝組織總RNA2μl，水4μl，隨機(jī)引物4μl，總體積20μl振蕩混勻，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成相應(yīng)的cDNA。
按照GENBANK中的人血清白蛋白成熟肽序列合成引物，上下游引物分別引入EcoRI和BspTI的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。
上游引物序列5’-ATGCGAATTCGATGCACAAGAGTGAGGTT-3’下游引物序列5’-ATGCCTTAAGTAAGCCTAAGGCAGCTTGACT-3’引物委托上海英駿生物公司合成。PCR方法為100μl反應(yīng)體系中加入1.5μl的肝組織cDNA，20μmol/L的上下游引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP，10μl，10×反應(yīng)緩沖液10μl，TaqDNA聚合酶5U，(dNTP、反應(yīng)緩沖液、Taq DNA聚合酶均為上海申能博彩生物科技有限公司產(chǎn)品)。用Bio-Rad公司的PCR儀擴(kuò)增DNA，PCR條件為94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性40秒，54℃退火45秒，72℃延伸3分鐘，循環(huán)30次。通過凝膠電泳分析反應(yīng)物顯出一預(yù)期大小(約1.8kb)的條帶，PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒純化回收。取純化的HSA cDNA3μl，加入1μlpGEM-T載體，5μl 2×反應(yīng)緩沖液，1μlT4 DNA連接酶催化連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，輔于x-gal、IPTG和氨芐青霉素(100μg/μL)的LB瓊脂平板，挑選陽性克隆，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定，所得陽性克隆委托上海英駿生物公司測序，測序結(jié)果與已公布的序列一致。
實(shí)施例2Tα1基因的合成根據(jù)已知的胸腺肽α1基因序列，合成兩條寡核苷酸引物，利用兩條引物互相作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增Tα1基因。并在Tα1基因的兩端分別引入BspTI和NotI的酶切位點(diǎn)。
上游引物序列5’-ATGCCTTAAGTGATGCTGCTGTTGATACTAGTAGTGAAATTACTACTAAGGATTTGAAG-3’下游引物序列5’-ATTCGCGGCCGCTTAGTTTTCAGCTTCTTCAACAACTTCCTTCTTTTCCTTCAAATCCT-3’引物委托上海英駿生物公司合成。100μl反應(yīng)體系中加入20μmol/L的上下游引物各3μl，2mmol/L的dNTP 10μl，10×反應(yīng)緩沖液10μl，pfu DNA聚合酶5U，(dNTP、反應(yīng)緩沖液、pfu DNA聚合酶均為上海申能博彩生物科技有限公司產(chǎn)品)。用Bio-Rad公司的PCR儀擴(kuò)增DNA，PCR條件為94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，循環(huán)25次。通過凝膠電泳分析反應(yīng)物顯出一預(yù)期大小(約0.1kb)的條帶，PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒純化回收，4℃保存。
實(shí)施例3HSA-Tα1融合蛋白的構(gòu)建[23]為使表達(dá)的融合蛋白能分泌到酵母胞外，選擇pPIC9K質(zhì)粒作為載體，在該載體的MCS的EcoRI和NotI位點(diǎn)插入融合蛋白的基因。將實(shí)施例1、實(shí)施例2得到的產(chǎn)物及pPIC9K質(zhì)粒分別用EcoRI/BspTI，BspTI/NotI和EcoRI/NotI酶切。將酶切后純化的HSA cDNA片段、Tα1基因片段和線性化的pPIC9K質(zhì)粒按照合適的摩爾比用T4DNA連接酶催化連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，輔于含氨芐青霉素(100μg/μL)的LB瓊脂平板，挑選陽性克隆，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定，所得陽性克隆委托上海英駿生物公司測序，因此獲得陽性克隆大腸桿菌DH5α(pPIC9K/HSA-Tα1，簡稱pPIC9K/H-T)，質(zhì)粒的構(gòu)建過程如圖1所示(實(shí)驗(yàn)中的內(nèi)切酶、連接酶、試劑盒等購自天為時代公司)。
實(shí)施例4Tα1-HSA-Tα1融合蛋白的構(gòu)建以pPIC9K/HSA-Tα1為模板，依SOE-PCR(splicing by overlap extension，簡稱SOE)原理，構(gòu)建出融合蛋白Tα1-HSA-Tα1。其引物可用T15’-ATGCGAATTCAGTGATGCTGCTGTTGATACTAGTAGTGAAATTACTACTAAGGATTTGA-3’T25’-ATGCGAATTCAGTGATGCTGCTGTTGATACTAGTAGTGAAATTACTACTAAGGATTTGA-3’T35’-TAATTCGCGGCCGCTTAGTTTTCAGCTTCTTC-3’引物委托上海英駿生物公司合成。PCR方法為在100μl反應(yīng)體系中加入2μl的pPIC9K/H-T重組質(zhì)粒，20μmol/L的T2、T3引物各3μl，2mmol/L的dNTP，10μl，10×反應(yīng)緩沖液10μl，pfu DNA聚合酶5U，(dNTP、反應(yīng)緩沖液、pfu DNA聚合酶均為上海申能博彩生物科技有限公司產(chǎn)品)。PCR條件為94℃變性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸3分鐘，循環(huán)30次。通過凝膠電泳分析反應(yīng)物顯出一預(yù)期大小(約2kb)的條帶，PCR產(chǎn)物T2HT3用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒純化回收，4℃保存。另在100μl反應(yīng)體系中加入2μl的PCR產(chǎn)物T2HT3，20μmol/L的T1、T3引物各3μl，2mmol/L的dNTP，10μl，10×反應(yīng)緩沖液10μl，pfu DNA聚合酶5U，(dNTP、反應(yīng)緩沖液、pfu DNA聚合酶均為上海申能博彩生物科技有限公司產(chǎn)品)。PCR條件為94℃變性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸3分鐘，循環(huán)30次。通過凝膠電泳分析反應(yīng)物顯出一預(yù)期大小(約2kb)的條帶，PCR產(chǎn)物T1HT3用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒純化回收，4℃保存。pPIC9K載體用EcoRI/NotI酶切，回收線性化的載體；另將上述PCR產(chǎn)物T1HT3用EcoRI/NotI切，用凝膠回收試劑盒直接回收。將線性化的載體及回收的PCR產(chǎn)物T1HT3用T4 DNA連接酶催化連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，輔于含氨芐青霉素(100μg/μL)的LB瓊脂平板，挑選陽性克隆，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定，所得陽性克隆委托上海英駿生物公司測序，因此獲得陽性克隆大腸桿菌DH5α(pPIC9K/Tα1-HSA-Tα1)。質(zhì)粒的構(gòu)建過程如圖2所示(實(shí)驗(yàn)中的內(nèi)切酶、連接酶、試劑盒等購自天為時代公司)。
實(shí)施例5HSA-(Gly4Ser)n-Tα1融合蛋白的構(gòu)建[24，25]以實(shí)施例3中構(gòu)建的質(zhì)粒pPIC9K/HSA-Tα1為模板，在HSA基因的XbaI位點(diǎn)處設(shè)計(jì)引物，在HSA和Tα1間可以加入多種柔性接頭，如[Gly Gly Gly Gly Ser]n，n可以是1-10。
如用[Gly Gly Gly Gly Ser]2作為接頭時，可合成寡聚核苷酸H2a5’-CCACTCTAGAGAAGTGCTGTGC-3’H2b5’-ACCTCCGGATCCACCGCCCCCTAA-3’T2a5’-GCGGTGGATCCGGAGGTGGGGGCTCTAGTGATGCTGCTGTTGATACTAGT-3’T2b5’-TAATTCGCGGCCGCTTAGTTTTCAGCTTCTTC-3’如用[Gly Gly Gly Gly Ser]3作為接頭時，可合成寡聚核苷酸H3a5’-CCACTCTAGAGAAGTGCTGTGC-3’H3b5’-CTCCGGATCCACCGCCCCCAGACCCACCTCCACCTAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCA-3’T3a5’-GCGGTGGATCCGGAGGTGGGGGCTCTAGTGATGCTGCTGTTGATACTAGT-3’T3b5’-TAATTCGCGGCCGCTTAGTTTTCAGCTTCTTC-3’引物委托上海英駿生物公司合成。PCR方法為100μl反應(yīng)體系中加入2μl的pPIC9K/H-T重組質(zhì)粒，20μmol/L的H2a、H2b(或H3a、H3b)引物各3μl，2mmol/L的dNTP 10μl，10×反應(yīng)緩沖液10μl，pfu DNA聚合酶5U，(dNTP、反應(yīng)緩沖液、pfu DNA聚合酶均為上海申能博彩生物科技有限公司產(chǎn)品)。用Bio-Rad公司的PCR儀擴(kuò)增DNA，PCR條件為94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分鐘，循環(huán)30次。通過凝膠電泳分析反應(yīng)物顯出一預(yù)期大小(約0.75kb)的條帶，PCR產(chǎn)物H2(或H3)用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒純化回收，4℃保存。另在100μl反應(yīng)體系中加入2μl的pPIC9K/H-T重組質(zhì)粒，20μmol/L的T2a、T2b(或T3a、T3b)引物各3μl，2mmol/L的dNTP，10μl，10×反應(yīng)緩沖液10μl，pfu DNA聚合酶5U。PCR條件為94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，循環(huán)30次。通過凝膠電泳分析反應(yīng)物顯出一預(yù)期大小(約0.1kb)的條帶，PCR產(chǎn)物T2(或T3)用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒純化回收，4℃保存。將前述的PCR產(chǎn)物H2(或H3)、T2(或T3)，分別用限制性內(nèi)切酶BamHI酶切后，產(chǎn)物用T4DNA連接酶催化連接，得產(chǎn)物HT。首先pPIC9K/H-T質(zhì)粒用EcoRI/XbaI酶切成三段，回收大小約1kb的H小片段；pPIC9K載體用EcoRI/NotI切，回收線性化的載體；另將上述連接產(chǎn)物HT用XbaI/NotI酶切，用凝膠回收試劑盒直接回收。將大小約1kb的H小片段、線性化的載體及回收的HT的酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶催化連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，輔于含氨芐青霉素(100μg/μL)的LB瓊脂平板，挑選陽性克隆，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定，所得陽性克隆委托上海英駿生物公司測序，因此獲得陽性克隆大腸桿菌DH5α(pPIC9K/HSA-(Gly4Ser)2-Tα1)、陽性克隆大腸桿菌DH5α(pPIC9K/HSA-(Gly4Ser)3-Tα1)。這些質(zhì)粒的構(gòu)建過程如圖3所示(實(shí)驗(yàn)中的內(nèi)切酶、連接酶、試劑盒等購自天為時代公司)。
實(shí)施例6Tα1-(Gly4Ser)n-HSA-(Gly4Ser)n-Tα1融合蛋白的構(gòu)建以實(shí)施例5中構(gòu)建的質(zhì)粒pPIC9K/HSA-(Gly4Ser)n-Tα1為模板，依SOE-PCR(splicingby overlap extension，簡稱SOE)原理，構(gòu)建出融合蛋白Tα1-(Gly4Ser)n-HSA-(Gly4Ser)n-Tα1。
如用[Gly Gly Gly Gly Ser]3作為接頭時，可用合成寡聚核苷酸T15’-ATGCGAATTCAGTGATGCTGCTGTTGATACTAGTAGTGAAATTACTACTAAGGATTTGAAGGAAAAGAAGGAAGTTGTTGAAGAAGC-3’T25’-AAAAGAAGGAAGTTGTTGAAGAAGCTGAAAACGGGGGCGGTGGATCGGGAGGTGGGGGCTCTGGTGGAGGTGGGTCTGATGCACACA-3’T35’-TAATTCGCGGCCGCTTAGTTTTCAGCTTCTTC-3’
引物委托上海英駿生物公司合成。PCR方法為在100μl反應(yīng)體系中加入2μl的pPIC9K/HSA-(Gly4Ser)3-Tα1重組質(zhì)粒，20μmol/L的T2、T3引物各3μl，2mmol/L的dNTP，10μl，10×反應(yīng)緩沖液10μl，pfu DNA聚合酶5U，(dNTP、反應(yīng)緩沖液、pfu DNA聚合酶均為上海申能博彩生物科技有限公司產(chǎn)品)。PCR條件為94℃變性30秒，48℃退火30秒，72℃延伸3分鐘，循環(huán)30次。通過凝膠電泳分析反應(yīng)物顯出一預(yù)期大小(約2kb)的條帶，PCR產(chǎn)物T2HT3用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒純化回收，4℃保存。另在100μl反應(yīng)體系中加入2μl的PCR產(chǎn)物T2HT3，20μmol/L的T1、T3引物各3μl，2mmol/L的dNTP，10μl，10×反應(yīng)緩沖液10μl，pfu DNA聚合酶5U，(dNTP、反應(yīng)緩沖液、pfu DNA聚合酶均為上海申能博彩生物科技有限公司產(chǎn)品)。PCR條件為94℃變性30秒，48℃退火30秒，72℃延伸3分鐘，循環(huán)30次。通過凝膠電泳分析反應(yīng)物顯出一預(yù)期大小(約2kb)的條帶，PCR產(chǎn)物T1HT3用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒純化回收，4℃保存。pPIC9K載體用EcoRI/NotI切，回收線性化的載體；另將上述PCR產(chǎn)物T1HT3用EcoRI/NotI切，用凝膠回收試劑盒直接回收。將線性化的載體及回收的PCR產(chǎn)物T1HT3用T4 DNA連接酶催化連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，輔于含氨芐青霉素(100μg/μL)的LB瓊脂平板，挑選陽性克隆，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定，所得陽性克隆委托上海英駿生物公司測序，因此獲得陽性克隆大腸桿菌DH5α(pPIC9K/Tα1-(Gly4Ser)n-HSA-(Gly4Ser)n-Tα1)。這些質(zhì)粒的構(gòu)建過程如圖4所示(實(shí)驗(yàn)中的內(nèi)切酶、連接酶、試劑盒等購自天為時代公司)。
實(shí)施例7HSA/TP5融合蛋白的構(gòu)建以實(shí)施例4中構(gòu)建的質(zhì)粒pPIC9K/HSA-Tα1為模板，在HSA基因的XbaI位點(diǎn)處設(shè)計(jì)引物，依SOE-PCR原理，構(gòu)建出融合蛋白HSA/TP5。
其引物可用H55’-CCACTCTAGAGAAGTGCTGTGC-3’T55’-TAATTCGCGGCCGCTTAGTAAACATCCTTTCTTAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGC-3’引物委托上海英駿生物公司合成。PCR方法為100μl反應(yīng)體系中加入2μl的pPIC9K/HSA-Tα1重組質(zhì)粒，20μmol/L的H5，T5引物各3μl，2mmol/L的dNTP，10μl，10×反應(yīng)緩沖液10μl，pfu DNA聚合酶5U，(dNTP、反應(yīng)緩沖液、pfu DNA聚合酶均為上海申能博彩生物科技有限公司產(chǎn)品)。用Bio-Rad公司的PCR儀擴(kuò)增DNA，PCR條件為94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分鐘，循環(huán)25次。通過凝膠電泳分析反應(yīng)物顯出一預(yù)期大小(約0.75kb)的條帶，PCR產(chǎn)物T5用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒純化回收。首先pPIC9K/H-T重組質(zhì)粒用EcoRI/XbaI酶切成三段，回收1kb的H小片段；pPIC9K載體用EcoRI/NotI切，回收線性化的載體；另將上述PCR產(chǎn)物用XbaI/NotI切，直接回收。將1kb的H小片段、線性化的載體及回收的PCR產(chǎn)物用T4DNA連接酶催化連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，輔于含氨芐青霉素(100μg/μL)的LB瓊脂平板，挑選陽性克隆，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定，所得陽性克隆委托上海英駿生物公司測序，因此獲得陽性克隆大腸桿菌DH5α(pPIC9K/HSA-TP5)。質(zhì)粒的構(gòu)建過程如圖5所示(實(shí)驗(yàn)中的內(nèi)切酶、連接酶、試劑盒等購自天為時代公司)。
實(shí)施例8畢赤酵母工程菌的構(gòu)建及高拷貝工程菌株的篩選[26]將實(shí)施例3、例4、例5、例6、例7中構(gòu)建的陽性克隆大腸桿菌DH5α(pPIC9K/HSA-Tα1)、陽性克隆大腸桿菌DH5α(pPIC9K/Tα1-HSA-Tα1)、陽性克隆大腸桿菌DH5α(pPIC9K/HSA-(Gly4Ser)n-Tα1)、陽性克隆大腸桿菌DH5α(pPIC9K/HSA-TP5)、陽性克隆大腸桿菌DH5α(pPIC9K/Tα1-(Gly4Ser)n-HSA-(Gly4Ser)n-Tα1)分別培養(yǎng)擴(kuò)增后，各純化質(zhì)粒約10μg，用SalI酶切。線性化后分別轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115(Invitrogen Corp.USA公司酵母表達(dá)試劑盒提供的方法)，轉(zhuǎn)化后的GS115，分別鋪于MD瓊脂平皿(2％瓊脂，1.34％無氨基酸酵母氮源(YNB，Digco Cotp)，4×10-5％生物素，2％葡萄糖)，30℃培養(yǎng)2-5天，挑取His+克隆。用滅過菌的牙簽將每個克隆同時點(diǎn)種于MM、MD[2％瓊脂，1.34％無氨基酸酵母氮源(YNB，Digco Cotp.)，4×10-5％生物素，2％甲醇]平板的對應(yīng)位置上，30℃培養(yǎng)3-6天，平板上菌落均會有所生長，只有在MM平板上生長的菌落和MD平板上生長的菌落大小相差不多的菌株才為Mut+表型。將獲得的His+Mut+轉(zhuǎn)化子分別用牙簽點(diǎn)種于不同濃度的G418平板，G418濃度分別為0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml，30℃培養(yǎng)3-6天。根據(jù)各克隆耐受G418的情況，選出含有不同拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化子。挑選經(jīng)篩選的單菌落，置于裝有50mlYPD(1％酵母浸出粉，2％胰蛋白胨，2％葡萄糖)培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，30℃、250rpm培養(yǎng)24小時。按照1％接菌量取菌液接入BMGY[1.34％無氨基酸酵母氮源(YNB，Digco Cotp.)，4×10-5％生物素，1％酵母浸出粉，2％胰蛋白胨，1％甘油，10％磷酸鉀緩沖液(pH6.0)]培養(yǎng)基中，30℃、250rpm培養(yǎng)至OD600＝2-8，室溫下10000rpm離心5min，收集菌體，用1/5原培養(yǎng)體積的BMMY[1.34％無氨基酸酵母氮源(YNB，Digco Cotp.)，4×10-5％生物素，1％酵母浸出粉，2％胰蛋白胨，1％甲醇，10％磷酸鉀緩沖液(pH6.0)]培養(yǎng)基重懸菌體，放置于30℃、250rpm的搖床上繼續(xù)生長，每24h向BMMY培養(yǎng)基中添加甲醇至終濃度0.5％，按時間點(diǎn)分別取菌液樣品，取樣0.5ml，置于1.5mlEP管中，12000rpm離心5min，收集上清，SDS-PAGE凝膠電泳分析，篩選出表達(dá)量最高的菌株，以其作為表達(dá)融合蛋白的目標(biāo)菌株。
實(shí)例9工程酵母的發(fā)酵以實(shí)施例4構(gòu)建的Tα1-HSA-Tα1表達(dá)融合蛋白的工程酵母發(fā)酵和融合蛋白的純化為例，其他工程酵母的發(fā)酵和融合蛋白的純化可用相同或相似的方法。
方案1從斜面上各挑取一環(huán)菌分別接入5瓶25ml/250ml三角燒瓶的YPD培養(yǎng)基(酵母提取物10g/L，胰蛋白胨20g/L，葡萄糖10g/L)中，30℃，250r/min振蕩培養(yǎng)24小時；按1％接菌量取0.5ml上述培養(yǎng)的菌液接入25瓶50ml/500ml三角燒瓶的BMGY培養(yǎng)基中(酵母提取物10g/L，胰蛋白胨20g/L，pH6.0的0.1mol/L磷酸鉀緩沖液，1.34％YNB，4×10-5％生物素(過濾除菌)，甘油10g/L)，30℃，250r/min振蕩培養(yǎng)30小時；離心上述菌液收集菌體，用BMMY培養(yǎng)基(酵母提取物10g/L，胰蛋白胨20g/L，0.1mol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.0)1.34％YNB，4×10-5％生物素(過濾除菌))洗滌菌體沉淀，一并轉(zhuǎn)入50ml/500ml BMMY三角燒瓶的培養(yǎng)基中；30℃，250r/min振蕩培養(yǎng)12小時，補(bǔ)加甲醇至終濃度0.5％，每24小時補(bǔ)加一次，誘導(dǎo)表達(dá)4-7天，8000r/min離心收集上清，得大約1L的發(fā)酵液。
方案2工程酵母接種100mLYPD培養(yǎng)基(酵母提取物10g/L，胰蛋白胨20g/L，葡萄糖10g/L)搖床30℃，250轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)30小時。接種至裝有15L基礎(chǔ)培養(yǎng)基的20L發(fā)酵罐(B.BranCorp.Germany)，其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制方法為85％的磷酸3.7mL/L，CaSO40.16g/L，K2SO42.6g/L，MgSO4.7H2O 1.95g/L，KOH 0.68g/L，30ml/L的甘油，121℃高壓滅菌20分鐘，1ml/LPTM(包括CuSO4.5H2O 6.0g/L，Cocl22H2O 3.0g/L，MnSO4.H2O 3.0g/L，H3BO40.02g/L，F(xiàn)eSO47H2O 65.0g/L，NaMoO42H2O 0.2g/L，ZnSO47H2O 20.0g/L，KI 0.1g/L，濃H2SO45ml/L，0.5ml/L 0.02％生物素，過濾除菌)。接種前用濃氨水將培養(yǎng)基pH調(diào)至5.8-6.0，發(fā)酵過程控制溫度為30℃，溶氧大于20％飽和度，pH用25％氨水維持在5.8-6.0，培養(yǎng)至甘油耗盡后，此時溶氧陡然上升，開始流加甘油(50％的甘油含12ml/L的PTM)，繼續(xù)培養(yǎng)，至菌體密度OD600值約為350時，開始補(bǔ)加甲醇(分析純甲醇含12ml/L的PTM)誘導(dǎo)。誘導(dǎo)培養(yǎng)48-72小時。
實(shí)例10融合蛋白的純化方案1收集發(fā)酵液樣品，8000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，離心取上清超濾，收集濾液。利用全自動蛋白層析系統(tǒng)通過陽離子交換層析，疏水層析和陰離子交換層析對目的融合蛋白進(jìn)行純化，SDS-PAGE分析呈電泳純?yōu)榫粭l帶。
方案2收集發(fā)酵液樣品，8000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，離心取上清超濾，收集濾液。取濾液離心取上清，用bule-sepharose(Amersham產(chǎn)品)親和色譜進(jìn)行分離，上樣緩沖液為pH為4.0-6.0緩沖液，上樣平衡后用2.0M的Nacl進(jìn)行吸脫，收集含有目的蛋白的洗脫峰；超濾濃縮后用Phenyl Sepharose 6 F.F(Amersham產(chǎn)品)疏水填料進(jìn)行柱層析分離，為6.0-8.0的緩沖液，上樣平衡后用0-1.5M的緩沖液進(jìn)行剃度吸脫，收集吸脫液；超濾濃縮后用DEAESepharose(Amersham產(chǎn)品)陰離子交換色譜進(jìn)行分離，上樣緩沖液為pH為6.0-8.0的緩沖液，上樣平衡后用0-1.0M的Nacl進(jìn)行剃度吸脫，收集目的峰，即為純化的融合蛋白，SDS-PAGE分析呈電泳純?yōu)榫粭l帶。如圖4。其中1為分子量標(biāo)準(zhǔn)，自上而下分別為94，67，43，30KD。
實(shí)例11新型胸腺肽融合蛋白的生物活性及非臨床藥動學(xué)評價細(xì)胞活性分析1制備小鼠脾細(xì)胞懸液(1)脫臼處死小鼠，置75％乙醇中浸泡消毒。剪開腹腔，分離脾臟，在不同的平皿中用Hanks液洗凈血跡，去除結(jié)締組織。(2)在有少量細(xì)胞培養(yǎng)液的平皿中，用無菌注射器芯將脾臟擠壓過100目的鋼絲網(wǎng)，得到單個細(xì)胞。(3)用1％臺盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞活力，計(jì)數(shù)細(xì)胞。再用含10％小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液將脾細(xì)胞配成6-8×10-6個細(xì)胞/mL，將細(xì)胞懸液，以100μl/孔鋪96孔板。2MTT法測定細(xì)胞增殖(1)將純化的樣品用0.22μm濾膜無菌過濾，不同剃度稀釋；市售人工合成的胸腺肽α1和胸腺五肽作為陽性對照溶解后同法處理稀釋；另以緩沖液作為陰性對照。每孔加100μl樣品，復(fù)3孔。(2)將96孔板置于37℃，5％CO2孵箱中44h后用MTT法測定。結(jié)果見圖7，說明等摩爾的重組胸腺肽蛋白HSA-Tα1與等摩爾對照胸腺肽α1，等摩爾的HSA-TP5與等摩爾的對照TP5相比，顯示重組胸腺肽蛋白的活性較對照為低，但差異不明顯。等摩爾的重組蛋白Tα1-HSA-Tα1活性要明顯好于等摩爾的對照，而且等摩爾的重組胸腺肽Tα1-HSA-Tα1的活性也要明顯好于HSA-Tα1和HSA-TP5。
大鼠靜脈注射給予重組HSA-Tα1，HSA-TP5，Tα1-HSA-Tα1胸腺肽蛋白，分別于0.016，0.083，0.167，0.25，0.5，1，2，4，6，8，12，24，36，48，72，120小時的不同的時間采樣，用碘示蹤法測定血中胸腺肽濃度，其中藥—時曲線見圖8，實(shí)驗(yàn)結(jié)果中不同大鼠的個體差異比較明顯，胸腺肽蛋白Tα1-HSA-Tα1，HSA-Tα1，HSA-TP5顯示了比胸腺肽Tα1更長的半衰期，Tα1-HSA-Tα1顯示了比HSA-Tα1，HSA-TP5更長的半衰期。
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SEQ ID NO1為人血清白蛋白的基因和蛋白質(zhì)序列1GAT GCA CAC AAG AGT GAG GTT GCT CAT CGG TTT AAA GAT TTG GGA451Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly1546 GAA GAA AAT TTC AAA GCC TTG GTG TTG ATT GCC TTT GCT CAG TAT9016 Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr3091 CTT CAG CAG TGT CCA TTT GAA GAT CAT GTA AAA TTA GTG AAT GAA13531 Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu45136 GTA ACT GAA TTT GCA AAA ACA TGT GTT GCT GAT GAG TCA GCT GAA18046 Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu60181 AAT TGT GAC AAA TCA CTT CAT ACC CTT TTT GGA GAC AAA TTA TGC22561 Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys75226 ACA GTT GCA ACT CTT CGT GAA ACC TAT GGT GAA ATG GCT GAC TGC27076 Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys90271 TGT GCA AAA CAA GAA CCT GAG AGA AAT GAA TGC TTC TTG CAA CAC31591 Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His105316 AAA GAT GAC AAC CCA AAC CTC CCC CGA TTG GTG AGA CCA GAG GTT360106 Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val120361 GAT GTG ATG TGC ACT GCT TTT CAT GAC AAT GAA GAG ACA TTT TTG405121 Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu135406 AAA AAA TAC TTA TAT GAA ATT GCC AGA AGA CAT CCT TAC TTT TAT450136 Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr150451 GCC CCG GAA CTC CTT TTC TTT GCT AAA AGG TAT AAA GCT GCT TTT495151 Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe165496 ACA GAA TGT TGC CAA GCT GCT GAT AAA GCT GCC TGC CTG TTG CCA540166 Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro180541 AAG CTC GAT GAA CTT CGG GAT GAA GGG AAG GCT TCG TCT GCC AAA585181 Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys195586 CAG AGA CTC AAG TGT GCC AGT CTC CAA AAA TTT GGA GAA AGA GCT630196 Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala210
631 TTC AAA GCA TGG GCA GTA GCT CGG CTG AGC CAG AGA TTT CCC AAA675211 Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys225676 GCT GAG TTT GCA GAA GTT TCC AAG TTA GTG ACA GAT CTT ACC AAA720226 Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys240721 GTC CAC ACG GAA TGC TGC CAT GGA GAT CTG CTT GAA TGT GCT GAT765241 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp255766 GAC AGG GCG GAC CTT GCC AAG TAT ATC TGT GAA AAT CAA GAT TCG810256 Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser270811 ATC TCC AGT AAA CTG AAG GAA TGC TGT GAA AAA CCT CTG TTG GAA855271 Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu285856 AAA TCC CAC TGC ATT GCC GAA GTG GAA AAT GAT GAG ATG CCT GCT900286 Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala300901 GAC TTG CCT TCA TTA GCT GCT GAT TTT GTT GAA AGT AAG GAT GTT945301 Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val315946 TGC AAA AAC TAT GCT GAG GCA AAG GAT GTC TTC CTG GGC ATG TTT990316 Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe330991 TTG TAT GAA TAT GCA AGA AGG CAT CCT GAT TAC TCT GTC GTG CTG1035331 Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu3451036 CTG CTG AGA CTT GCC AAG ACA TAT GAA ACC ACT CTA GAG AAG TGC1080346 Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys3601081 TGT GCC GCT GCA GAT CCT CAT GAA TGC TAT GCC AAA GTG TTC GAT1125361 Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp3751126 GAA TTT AAA CCT CTT GTG GAA GAG CCT CAG AAT TTA ATC AAA CAA1170376 Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln3901171 AAT TGT GAG CTT TTT GAG CAG CTT GGA GAG TAC AAA TTC CAG AAT1215391 Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn4051216 GCG CTA TTA GTT CGT TAC ACC AAG AAA GTA CCC CAA GTG TCA ACT1260406 Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr4201261 CCA ACT CTT GTA GAG GTC TCA AGA AAC CTA GGA AAA GTG GGC AGC1305421 Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser4351306 AAA TGT TGT AAA CAT CCT GAA GCA AAA AGA ATG CCC TGT GCA GAA1350
436 Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu4501351 GAC TAT CTA TCC GTG GTC CTG AAC CAG TTA TGT GTG TTG CAT GAG1395451 Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu4651396 AAA ACG CCA GTA AGT GAC AGA GTC ACC AAA TGC TGC ACA GAA TCC1440466 Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser4801441 TTG GTG AAC AGG CGA CCA TGC TTT TCA GCT CTG GAA GTC GAT GAA148548l Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu4951486 ACA TAC GTT CCC AAA GAG TTT AAT GCT GAA ACA TTC ACC TTC CAT1530496 Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His5101531 GCA GAT ATA TGC ACA CTT TCT GAG AAG GAG AGA CAA ATC AAG AAA1575511 Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys5251576 CAA ACT GCA CTT GTT GAG CTC GTG AAA CAC AAG CCC AAG GCA ACA1620526 Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr5401621 AAA GAG CAA CTG AAA GCT GTT ATG GAT GAT TTC GCA GCT TTT GTA1665541 Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val5551666 GAG AAG TGC TGC AAG GCT GAC GAT AAG GAG ACC TGC TTT GCC GAG1710556 Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu5701711 GAG GGT AAA AAA CTT GTT GCT GCA AGT CAA GCT GCC TTA GGC TTA1755571 Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly LeuSEQ ID NO2為胸腺肽α1的基因和蛋白質(zhì)序列1AGT GAT GCT GCT GTT GAT ACT AGT AGT GAA ATT ACT ACT AAG GAT451Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp1546 TTG AAG GAA AAG AAG GAA GTT GTT GAA GAA GCT GAA AAC8416 Leu Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn28SEQ ID NO3為胸腺肽九肽的基因和蛋白質(zhì)序列1GAA GCT AAG AGT GAA GGC GGC AGT AAC271Glu Ala Lys Ser Gln Gly Gly Ser Asn9
SEQ ID NO4為胸腺肽α原的基因和蛋白質(zhì)序列1ATG TCA GAC GCA GCC GTA GAC ACC AGC TCC GAA ATC ACC ACC AAG451Met Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys1546 GAC TTA AAG GAG AAG AAG GAA GTT GTG GAA GAG GCA GAA AAT GGA9016 Asp Leu Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly3091 AGA GAC GCC CCT GCT AAC GGG AAT GCT AAT GAG GAA AAT GGG GAG13531 Arg Asp Ala Pro Ala Asn Gly Asn Ala Asn Glu Glu Asn Gly Glu45136 CAG GAG GCT GAC AAT GAG GTA GAC GAA GAA GAG GAA GAA GGT GGG18046 Gln Glu Ala Asp Asn Glu Val Asp Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly60181 GAG GAA GAG GAG GAG GAA GAA GAA GGT GAT GGT GAG GAA GTG GAT2256l Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Asp Gly Glu Glu Val Asp75226 GGA GAT GAA GAT GAG GAA GCT GAG TCA GCT ACG GGC AAG CGG GCA27076 Gly Asp Glu Asp Glu Glu Ala Glu Ser Ala Thr Gly Lys Arg Ala90271 GCT GAA GAT GAT GAG GAT GAC GAT GTC GAT ACC AAG AAG CAG AAG31591 Ala Glu Asp Asp Glu Asp Asp Asp Val Asp Thr Lys Lys Gln Lys105316 ACC GAC GAG GAT GAC TAG333106 Thr Asp Glu Asp Asp End11lSEQ ID NO5為胸腺肽五肽的基因和蛋白質(zhì)序列1AGA AAG GAT GTT TAC151Arg Lys Asp Val Tyr權(quán)利要求
1一種新型的長效胸腺肽蛋白，包括與序列表中SEQ ID No1血清白蛋白或者與血清白蛋白至少85％序列同源的第一區(qū)，連接在血清白蛋白C-末端的與序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽或者與胸腺肽至少85％序列同源的第二區(qū)，和連接在血清白蛋白N-末端的與序列表中SEQID No2-5胸腺肽或者與胸腺肽至少85％序列同源的第三區(qū)，所述的胸腺肽蛋白可以由上述的第一區(qū)，第二區(qū)和第三區(qū)同時連接構(gòu)成，也可以由第一區(qū)和第三區(qū)或者第一區(qū)和第二區(qū)連接構(gòu)成。
2根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型長效胸腺肽蛋白，其特征是所述胸腺肽蛋白包括與序列表中SEQ ID No1血清白蛋白氨基酸序列相同的第一區(qū)，連接在血清白蛋白C-末端的與序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽氨基酸序列相同的第二區(qū)和連接在血清白蛋白N-末端的與序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽氨基酸列相同的第三區(qū)，或者上述三區(qū)的功能等同物。所述功能等同物是在不改變所述融合蛋白特性的前提下，對融合蛋白個別氨基酸殘基的取代、缺失或加入得到的多肽。
3根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的新型長效胸腺肽蛋白，其特征是所述連接在血清白蛋白C-末端的與序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽氨基酸列相同的第二區(qū)和連接在血清白蛋白N-末端的與序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽氨基酸列相同的第三區(qū)，可以是相同的序列，也可以是不同的序列。
4根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的新型長效胸腺肽蛋白，其特征是所述連接在血清白蛋白C-末端的與序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽同源的第二區(qū)和連接在血清白蛋白N-末端的與序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽同源的第三區(qū)同時連接在血清白蛋白的C-末端及N-末端，所述與血清白蛋白同源的第一區(qū)位于胸腺肽蛋白的中間。
5根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的新型長效胸腺肽蛋白，其特征是所述與血清白蛋白同源的第一區(qū)可以與連接在血清白蛋白的C-末端的與序列表中SEQ ID No2-4胸腺肽同源的第二區(qū)連接，而不與連接在血清白蛋白的N-末端的與序列表中SEQ ID No2-4胸腺肽同源的第三區(qū)連接形成融合蛋白。
6根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的新型長效胸腺肽蛋白，其特征是所述與血清白蛋白同源的第一區(qū)可以與連接在血清白蛋白的N-末端的與序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽同源的第三區(qū)連接，而不與連接在血清白蛋白的C-末端的與序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽同源的第二區(qū)連接形成融合蛋白。
7根據(jù)權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)所述的新型長效胸腺肽蛋白，其特征是所述與血清白蛋白同源的第一區(qū)與連接在血清白蛋白C-末端的與序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽同源的第二區(qū)、血清白蛋白同源的第一區(qū)與連接在血清白蛋白N-末端的與序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽同源的第三區(qū)直接連接，不設(shè)連接肽。
8根據(jù)權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)所述的新型長效胸腺肽蛋白，其特征是所述與血清白蛋白同源的第一區(qū)與連接在血清白蛋白的C-末端的與序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽同源的第二區(qū)，血清白蛋白同源的第一區(qū)與連接在血清白蛋白N-末端的序列表中SEQ ID No2-5胸腺肽同源的第三區(qū)之間設(shè)有連接肽，連接肽的較優(yōu)選的長度為2-100個氨基酸殘基，更優(yōu)選的連接肽的長度為5-50個氨基酸殘基。其中優(yōu)選的連接肽的通式是[GlyGlyGlyGlySer]n，n為1-10的整數(shù)，更優(yōu)選的是1-5。
9根據(jù)權(quán)利1-8中要求，一種編碼任一的多肽、蛋白、融合蛋白的多聚核苷酸序列。攜帶有該多聚核苷酸序列的載體，其中提供攜帶編碼融合蛋白的基因序列的重組表達(dá)載體，較優(yōu)選的是以pPIC9、pPIC9K為載體的重組表達(dá)載體。
10根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型長效胸腺肽蛋白，其特征是表達(dá)融合蛋白的宿主是細(xì)菌、酵母、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞以及含有本發(fā)明融合蛋白基因序列的轉(zhuǎn)基因動、植物。優(yōu)選的是酵母，更優(yōu)選的是畢赤酵母，最優(yōu)選的是GS115。
11根據(jù)權(quán)利要求1-10中任何一項(xiàng)所述的新型長效胸腺肽蛋白，在免疫性缺陷性疾病及各種適應(yīng)性疾病治療中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型長效胸腺肽的制備及其醫(yī)療用途，包括編碼該蛋白的DNA序列，攜帶該DNA序列的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的新型長效胸腺肽蛋白包括與血清白蛋白至少85％序列同源的第一區(qū)，連接在血清白蛋白C－末端與胸腺肽至少85％序列同源的第二區(qū)和與連接在血清白蛋白N－末端與胸腺肽至少85％序列同源的第三區(qū)，可以是由第一二三區(qū)同時構(gòu)成，也可以由第一區(qū)與第二和第三區(qū)任意連接構(gòu)成。本發(fā)明長效胸腺肽蛋白的第一區(qū)與第二區(qū)之間，第一區(qū)與第三區(qū)之間可以設(shè)有連接肽，連接肽可以是一個也可以是多個；實(shí)驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明的長效胸腺肽既有胸腺肽的生物活性，又具有較長的半衰期，這種長效胸腺肽可用于免疫缺陷性疾病及各種適應(yīng)性疾病的治療。
文檔編號C07K14/435GK101067000SQ20071002164
公開日2007年11月7日 申請日期2007年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月20日
發(fā)明者陳建華, 張新國, 閆璐穎, 殷藝偉, 唐莉 申請人:中國藥科大學(xué)