專利名稱：：胸腺素α1的固相合成工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種C端為Asn的多肽，尤其涉及胸腺素al，特別為胸腺素a1的固相合成工藝。
背景技術(shù)：
：胸腺素a1是哺乳動(dòng)物胸腺中存在的單一組分的多肽化合物，是與免疫細(xì)胞發(fā)育分化相關(guān)的分子，具有使T淋巴細(xì)胞分化、增殖、提高細(xì)胞免疫功能的作用，能破壞其感染的靶細(xì)胞，還可激活NK細(xì)胞活性，促進(jìn)與免疫相關(guān)的細(xì)胞因子的產(chǎn)生。胸腺素a1的活性較胸腺五肽高10到1000倍，是復(fù)合治療慢性乙肝、丙肝、免疫缺陷綜合癥藥物，在非小細(xì)胞肺癌、惡性黑色素瘤治療中也發(fā)揮了較大的作用。胸腺素a1于1997年由意大利賽生(Sciclone)公司開(kāi)發(fā)上市，現(xiàn)已被24個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)用于慢性乙型肝炎(HBV)的治療，在歐美日等國(guó)也用于治療丙型肝炎(HCV)、肝細(xì)胞癌及增強(qiáng)免疫疾病的治療。胸腺素a1的結(jié)構(gòu)是由28個(gè)常規(guī)氨基酸殘基和N端氨基酸乙酰化的多肽。最近的胸腺素al及其類似物的制備方法主要有兩種，其中一種是采用生物合成技術(shù)，在2003年1月1日公開(kāi)的中國(guó)發(fā)明專利(CN1388133A)里，利用人工基因合成技術(shù)獲得胸腺素a1的全序列。另一種為固相合成方法，"化學(xué)學(xué)報(bào)"2004年第55巻第2期《胸腺素a1的DIC固相化學(xué)合成與鑒定》中提到，以WangResin為起始原料，通過(guò)激活試劑010+H0Bt將Fmoc-Asn(Trt)-OH與樹(shù)脂相連接；"天津藥學(xué)"2001年6月第13巻第3期《Fmoc新型固相法合成胸腺素al及其反應(yīng)途徑》中提到，以HMP樹(shù)脂為起始原料，通過(guò)激活試劑00>H0Bt將Fmoc-Asn(Trt)-0H與樹(shù)脂相連接。綜合參考國(guó)內(nèi)外關(guān)于胸腺素al制備方法以及相關(guān)的合成報(bào)道文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)這些技術(shù)都存在一些不足，主要表現(xiàn)在①生物合成技術(shù)單分子大腸桿菌難以表達(dá)，難以規(guī)?；a(chǎn)；②B0C策略合成、裂解時(shí)使用HF，反應(yīng)劇烈，帶有強(qiáng)腐蝕性，對(duì)生產(chǎn)人員和環(huán)境危害較大;③常規(guī)固相合成方法難以獲得高純度(>98%)的胸腺素al，或者收率低(<5°/Q)，導(dǎo)致生產(chǎn)成本高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，提供一種高收率、低成本、反應(yīng)條件溫和、生產(chǎn)安全、環(huán)境污染小、有利于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的胸腺素a1的固相合成工藝。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是胸腺素a1的固相合成工藝，其特征在于該方法包括下列步驟1)以Fmoc-RinkAmideAM樹(shù)脂或者Fmoc-RinkAmideMBHA樹(shù)脂為起始原料，去除Fmoc后與Fmoc-Asp-X的側(cè)鏈羧基相連，得到Fmoc-Asp(樹(shù)脂)-X;2)其余27個(gè)氨基酸按照胸腺素a1依次合成；3)N端氨基酸用乙酸酐和吡啶進(jìn)行乙?；幚?；4)用裂解試劑進(jìn)行切割得胸腺素al粗肽，用乙醚沉淀粗肽；5)用反相高效液相法純化分離。進(jìn)一步地，上述的胸腺素a1的固相合成工藝，其中，步驟l)中羧基保護(hù)基團(tuán)X為0tBu、OAll或Dmab。更進(jìn)一步地，上述的胸腺素al的固相合成工藝，其中，步驟2)中氨基酸的激活試劑為A+B+DIPEA，其中A為T(mén)BTU、HATU、HBTU或HCTU，B為H0Bt、H0AT或C1-H0Bt。更進(jìn)一步地，上述的胸腺素al的固相合成工藝，其中，步驟3)乙酸酐和吡啶的摩爾用量分別為N端自由氨基的5-30倍。再進(jìn)一步地，上述的胸腺素al的固相合成工藝，其中，步驟4)裂解試劑是三氟乙酸/苯甲硫醚/1，2-乙二硫醇/苯甲醚，按照90:5:3:2的體積比配制而成，裂解切割是在室溫下反應(yīng)2-3小時(shí)，沉淀粗肽學(xué)時(shí)乙醚體積用量是裂解試劑8-10倍。與已有的胸腺素a1合成方法相比，本發(fā)明胸腺素a1的固相合成工藝具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)以Fmoc-Asp-X為C端氨基酸，利用Asp側(cè)鏈與氨基功能樹(shù)脂相連，改變肽鏈在樹(shù)脂上的空間位置，有利于后面的氨基酸順利連接。實(shí)驗(yàn)證明，普通以Asn為末端氨基酸的方法，在12位以后氨基酸均存在偶聯(lián)率低等問(wèn)題，合成所得粗肽純度較差，且主峰前后雜峰多、不易純化，純度難以達(dá)到98%，收率一般在5%左右；而采用本發(fā)明Asp方法，不但提高了粗肽的純度，可以達(dá)到60%,而且減少了雜峰，有利于產(chǎn)品的純化分離，分離后產(chǎn)品純度可到99%,收率提高到20%。收率的大幅提高，降低了生產(chǎn)成本，有利于實(shí)現(xiàn)規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。具體如下表對(duì)比所示<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(2)本方法釆用了Fmoc策略，在合成過(guò)程中避免了劇毒、強(qiáng)腐蝕性的氟化氫，反應(yīng)條件更溫和，使生產(chǎn)人員更安全，并大大減輕了環(huán)保壓力。圖l是本發(fā)明總的工藝流程圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開(kāi)了一種多肽C端氨基酸Asp通過(guò)氨基功能樹(shù)脂轉(zhuǎn)變成Asn的方法，主要用于提高胸腺素a1的收率，降低其成本，利于胸腺素a1的規(guī)模化生產(chǎn)。其主要步驟包括a.以Fmoc-RinkAmideAM樹(shù)脂或者Fmoc-RinkAmideMBHA樹(shù)脂為載體，脫Fmoc-保護(hù)后得到H2N-RinkAmideAM樹(shù)脂或者H2N-RinkAmideMBHA樹(shù)脂；b.采用固相合成的方法將Fmoc-Asp-X的側(cè)鏈羧基與樹(shù)脂氨基相連，得到Fmoc-Asp(樹(shù)脂)-X;c.采用Fmoc策略依次固相合成序列剩余氨基酸；d.去除N端氨基酸氨基保護(hù)基Fmoc后用乙酸酐、吡啶乙?；疦端氨基；e.然后用裂解試劑(三氟乙酸/苯甲硫醚/1，2-乙二硫醇/苯甲醚)切割，得到胸腺素a1粗肽；f.粗品經(jīng)HPLC制備分離得胸腺素a1純品。以下對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)描述。(1)以Fmoc-RinkAmideAM樹(shù)脂或Fmoc-RinkAmideMBHA樹(shù)脂為起始原料，替代度為0.7-1.5mmol/g，用DMF溶漲30-50分鐘，用20%DBLK(5+10)min去除Fmoc。路線如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>(2)去除Fmoc后，用DMF洗滌五次，用DCM洗滌2次，加入Fmoc-Asp-X、DIC、H0Bt、DMAP，用DMF做溶劑，室溫反應(yīng)2-5小時(shí)；抽掉反應(yīng)液后用DMF洗滌2次，加入乙酸酐和吡啶室溫反應(yīng)2-8個(gè)小時(shí)，封閉未反應(yīng)的自由氨基，抽掉封閉試劑用DMF洗滌2-3次，用甲醇收縮樹(shù)脂(10+10)min，真空減壓干燥;完成RinkAmide扁Resin與Fmoc-Asp-X的側(cè)鏈羧基相連，得到Fmoc-Asp(樹(shù)脂)-X;用紫外檢測(cè)Fmoc法測(cè)定樹(shù)脂替代度。路線如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(3)將Fmoc-Asp(樹(shù)脂)-X加入到固相反應(yīng)器，用DMF溶漲30-50分鐘，用20。/。DBLK(5+10)min去除Fmoc，用DMF洗滌五次，用DCM洗滌2次，加入Fmoc-Glu(0tBu)-0H、A、B、DIPEA，用DMF做溶劑，室溫反應(yīng)1.5-3小時(shí)；抽掉反應(yīng)液后用DMF洗滌2次后去除Fmoc，重復(fù)上面循環(huán)，依次完成其余26個(gè)氨基酸的固相合成，得到AA1—27-Asp(樹(shù)脂)-X。路線如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(4)N端Ser的乙?；?，加入乙酸酐和吡啶室溫反應(yīng)2_8個(gè)小時(shí)，封閉末端Ser的氨基，抽掉封閉試劑用DMF洗滌2次，用甲醇收縮樹(shù)脂(10+10)min，真空減壓干燥；得到Ac-AA1—27-Asp(樹(shù)脂)-X。(Ac20、Py)H-Ser'(tBu)-AA(2—27)-Asp28-X~^""^"Ac-Ser1(tBu)-AA(2—27)-Asp28-XKinkAmideAMResinRinkAmideAMResin(5)裂解樹(shù)脂，將Ac-AA1—27-Asp(樹(shù)脂)-OtBu加入到圓底燒瓶中，加入裂解試劑R，(三氟乙酸苯甲硫醚1，2-乙二硫醇苯甲醚=90:5:3:2)，攪拌的同時(shí)冰浴，通入氮?dú)?，lOmin后撤走冰浴，室溫反應(yīng)2-3小時(shí)。過(guò)濾樹(shù)脂將濾液分離，濾液滴加到冰乙醚中沉淀，離心、冰乙醚洗滌3次后，減壓干燥后得到胸腺al粗肽。RegentKAc-Se(tBu)-M(2—w-Asp28-X^一Ac-Ser1-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-GluRinkAmideAMResin-lie-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn28-OH(胸腺素a1粗肽)(6)反相高效液相純化，分離得到精肽并確認(rèn)結(jié)構(gòu)。其過(guò)程為1.溶解將粗肽用研缽研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)移至燒杯中，加純水浸泡23小時(shí)，加入DMSO(二甲亞砜)助溶，使其充分溶解。使用0.45um纖維素濾膜進(jìn)行過(guò)濾。2.分離純化a)第一次純化。選取陰離子交換樹(shù)脂，使用1M/LNaOH將樹(shù)脂再生，用純水洗至中性，制成5*40CM的低壓的陰離子交換色譜柱，將溶解好的胸腺素a1粗肽調(diào)節(jié)PH值在2.04.0之間，注入色譜柱后使用，0400mmol/LNaCl溶液離子強(qiáng)度的線形梯度洗脫，用HPLC監(jiān)控主峰，在8(Tl20mmol/L濃度時(shí)流出產(chǎn)物為目的肽，將目的肽進(jìn)行收集。b)第二次純化。使用制備型RP-HPLC進(jìn)行制備，將一次純化收集的目的肽使用RP-HPLC的進(jìn)樣泵直接進(jìn)樣，流動(dòng)相A:0.1%三氟乙酸(TFA)—H20，流動(dòng)相B:100X乙腈，線形梯度(T2min，5%5%;242min,18%22%;流速80ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm。在12min左右時(shí)出峰，收集不同純度的目的產(chǎn)物。c)第三次純化。仍使用RP-HPLC，但流動(dòng)相A:20腿ol/L的NH4HP04流動(dòng)相B:100X乙腈，線形梯度(T2min，5%5%;242min,15%19%;流速80ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm。在l廣15min時(shí)收集純度99%的樣品。3.脫鹽、濃縮及凍干將純化后的樣品上樣至RP-HPLC的制備柱中，將其轉(zhuǎn)換成無(wú)鹽的樣品。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到少量液體后凍干。4.胸腺素a1的分析鑒定色譜柱ChromasiolC18(4.6腿X250ml，5y),流動(dòng)相A35畫(huà)1/LKHP04，流動(dòng)相B100乙腈，線形梯度020min，13%16%B，流速1.Oml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)215nm。目標(biāo)肽的保留時(shí)間約為8min，與對(duì)照品的保留時(shí)間基本一致，得純品純度達(dá)到99%。下面以Fmoc-Asp-X中X=0tBu;樹(shù)脂為Fmoc-RinkAmideAMResin;激活試劑A+B+DIPEAA=HBTU、B=H0Bt為例作具體說(shuō)明。實(shí)施例1:Fmoc-Asp(RinkAmideAMResin)-OtBu的合成將Fmoc-RinkAmideAMResin2g，替代度為1.l聽(tīng)l/g，力口入到固相反應(yīng)器中，加入DCM20ml溶漲樹(shù)脂30min后，用20%DBLK5+10min兩次去除Fmoc保護(hù)，得到NH廠RinkAmideAMResin,DMF洗滌4次，DCM洗滌2次。將Fmoc-Asp-OtBuO.91g、DIC0.4ml、HOBtO.327g溶于4ml的DMF中，冰水低溫活化10min后，加入上述固相反應(yīng)器中，室溫反應(yīng)2h。DMF洗滌2次后加入乙酸酐6.2ml和吡啶5.3ml反應(yīng)4個(gè)小時(shí)，封閉樹(shù)脂上未反應(yīng)的自由氨基。DMF洗滌2次后，用甲醇10+lOmin收縮得到Fmoc-Asp(RinkAmideAMResin)-0tBu，檢測(cè)替代度0.453mraol/g。實(shí)施例2:AA1—27-Asp(樹(shù)脂)-0tBu的合成稱取替代度0.453mmol/g的Fmoc-Asp(RinkAmideAMResin)-OtBu2.2g，加入到反應(yīng)器中用DCM溶漲0.5小時(shí)，再用20%DBLK(5+5)min去除Fmoc，洗滌后連接27位氨基酸Fmoc-Glu(OtBu)-OH,將1.702gFmoc-Glu(0tBu)-0H、1.517gHBTU、0.149gH0Bt溶于5mlDMF中，冰浴10后加入lmlDIPEA;低溫活化10min后，加入上述固相反應(yīng)器中，室溫反應(yīng)l-2小時(shí)，反應(yīng)終點(diǎn)以茚三酮法檢測(cè)為準(zhǔn)。重復(fù)以上步驟，依次類推完成26到1的氨基酸的連接，得到AA1—"-Asp(樹(shù)脂)-0tBu。原料用量氨基酸為1.0mmol，HBTU1.517g、HOBtO.149g、DIPEAlml。實(shí)施例3:Ac-AA""-A印(樹(shù)脂)-0tBu的合成在反應(yīng)器中加入乙酸酐2.8ml吡啶2.4ml，室溫反應(yīng)4小時(shí)，茚三酮法樹(shù)脂無(wú)色透明，反應(yīng)已經(jīng)完全，抽掉乙?；噭肈MF洗滌2次，用甲醇收縮(10+10)min，減壓干燥6小時(shí)后得Ac-AA1—"-Asp(樹(shù)脂)-0tBu4.9g。實(shí)施例4:胸腺素a1粗肽的制備將Ac-AA1—27-Asp(樹(shù)脂)-0tBu4.9g加入到100ml的圓底燒瓶中，加入裂解試劑三氟乙酸45ml、苯甲硫醚2.5ml、1，2-乙二硫醇1.5ml、苯甲醚1.0ml，攪拌的同時(shí)冰浴，通入氮?dú)猓?0min后撤走冰浴室溫反應(yīng)2.5小時(shí)。過(guò)濾樹(shù)脂和濾液滴分離，緩慢將裂解濾液滴加到500ml冰乙醚中沉淀，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心、冰乙醚洗滌四次后，減壓干燥得到粗肽3.286g。實(shí)施例5:胸腺素a1粗肽的純化(1)、溶解。將3.286g粗肽使用研缽研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)移至燒杯中，加50ml純水浸泡2~3小時(shí)，加入DMSO(二甲亞砜)1.0ml助溶，使其充分溶解。使用0.45Um纖維素濾膜進(jìn)行過(guò)濾。(2)、分離純化a.第一次純化。選取陰離子交換樹(shù)脂，使用1M/LNaOH將樹(shù)脂再生，用純水洗至中性，制成5*40CM的低壓的陰離子交換色譜柱，將溶解好的胸腺素a1粗肽調(diào)節(jié)PH值在2.03.0之間，使用蠕動(dòng)泵以50ML/MIN的流速注入色譜柱，后使用，0400mmo1/LNaCl溶液離子強(qiáng)度的線形梯度洗脫，用HPLC監(jiān)控主峰，在8(Tl20mmol/L濃度時(shí)流出產(chǎn)物為目的肽，將目的肽進(jìn)行收集。b.第二次純化。使用制備型RP-HPLC進(jìn)行制備，將一次純化收集的目的肽使用RP-HPLC的進(jìn)樣泵直接進(jìn)樣，流動(dòng)相A:0.1%三氟乙酸(TFA)—H20，流動(dòng)相B:100X乙腈，線形梯度02min，5%5%;242min，18%22%;流速80ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm。在12min左右時(shí)出峰，收集不同純度的目的產(chǎn)物。純化達(dá)到純度97%。c.第三次純化。仍使用RP-HPLC，但流動(dòng)相A:20mmol/L的NH4HP04流動(dòng)相B:100X乙腈，線形梯度02min,5%5%;242min，15%19%;流速80ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm。在1115min時(shí)收集純度99%的樣品。將不是99%的樣品反復(fù)純化，得到99%的樣品。d.脫鹽，濃縮及凍干。將純化后的樣品上樣至RP-HPLC的制備柱中，將其轉(zhuǎn)換成無(wú)鹽的樣品。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到約8ml左右，低溫凍干后得純品603mg，總收率達(dá)到19.4%。胸腺素a1的分析鑒定過(guò)程如下1)色譜柱ChromasiolC18(4.6mmX250ml，5u)，流動(dòng)相A35咖ol/LKHP04,流動(dòng)相B100乙腈，線形梯度020min,13%16%B，流速1.Oml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)215nm。目標(biāo)肽的保留時(shí)間約為8min，與對(duì)照品的保留時(shí)間一致。2)Modi-Tof(M++H):3109.5與目標(biāo)分子量3108.2—致。3)比旋度檢測(cè)得-94.1°,國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)為-90°-100°，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。以上描述當(dāng)中，略語(yǔ)及反應(yīng)式如下-<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>權(quán)利要求1、胸腺素α1的固相合成工藝，其特征在于該方法包括下列步驟1)以Fmoc-RinkAmideAM樹(shù)脂或者Fmoc-RinkAmideMBHA樹(shù)脂為起始原料，去除Fmoc后與Fmoc-Asp-X的側(cè)鏈羧基相連，得到Fmoc-Asp(樹(shù)脂)-X；2)其余27個(gè)氨基酸按照胸腺素α1依次合成；3)N端氨基酸用乙酸酐和吡啶進(jìn)行乙酰化處理；4)用裂解試劑進(jìn)行切割得胸腺素α1粗肽，用乙醚沉淀粗肽；5)用反相高效液相法純化分離。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的胸腺素a1的固相合成工藝，其特征在于步驟l)中羧基保護(hù)基團(tuán)X為0tBu、OAll或Dmab。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的胸腺素a1的固相合成工藝，其特征在于步驟2)中氨基酸的激活試劑為A+B+DIPEA，其中A為T(mén)BTU、HATU、HBTU或HCTU，B為H0Bt、H0AT或C1-H0Bt。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的胸腺素a1的固相合成工藝，其特征在于步驟3)乙酸酐和吡啶的摩爾用量分別為N端自由氯基的5-30倍。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的胸腺素a1的固相合成工藝，其特征在于步驟4)裂解試劑是三氟乙酸/苯甲硫醚/l，2-乙二硫醇/苯甲醚，按照90:5:3:2的體積比配制而成，裂解切割是在室溫下反應(yīng)2-3小時(shí)，沉淀粗肽學(xué)時(shí)乙醚體積用量是裂解試劑8-10倍。全文摘要本發(fā)明涉及胸腺素α1的一種固相合成工藝，屬于多肽固相合成
技術(shù)領(lǐng)域：
。包括如下步驟a.以Fmoc-RinkAmideAM樹(shù)脂或者Fmoc-RinkAmideMBHA樹(shù)脂為載體，脫Fmoc-保護(hù)后得到H₂N-RinkAmideAM樹(shù)脂或者H₂N-RinkAmideMBHA樹(shù)脂；b.采用固相合成的方法將Fmoc-Asp-X的側(cè)鏈羧基與樹(shù)脂氨基相連，得到Fmoc-Asp(樹(shù)脂)-X；c.采用Fmoc策略依次固相合成序列剩余氨基酸；d.去除N端氨基酸氨基保護(hù)基Fmoc后用乙酸酐、吡啶乙?；疦端氨基；e.然后用裂解試劑(三氟乙酸/苯甲硫醚/1，2-乙二硫醇/苯甲醚)切割，得到胸腺素α1粗肽；f.粗品經(jīng)HPLC制備分離得胸腺素α1純品。該方法可顯著提高胸腺素α1的收率，降低其生產(chǎn)成本，利于規(guī)模化生產(chǎn)，具有較好的產(chǎn)業(yè)化前景。文檔編號(hào)C07K1/04GK101104638SQ20071002440公開(kāi)日2008年1月16日申請(qǐng)日期2007年6月18日優(yōu)先權(quán)日2007年6月18日發(fā)明者虹初申請(qǐng)人:蘇州中科天馬肽工程中心有限公司