專利名稱：一種新型天然抗腫瘤活性化合物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型天然抗腫瘤活性化合物及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
楊梅(Myrica ruba Lour，Sieb.Et Zucc.)系楊梅科(Myricae)楊梅屬(Myrica)植物。楊梅的果實(shí)、樹皮、根或核仁均可供藥用。其果實(shí)甘酸、溫，具有生津解渴、和胃消食之功效，可治煩渴、吐瀉、痢疾、腹痛；其樹皮性溫、味苦辛澀，可治痢疾、跌打損傷、牙痛、湯火傷；其根辛、溫，具有理氣、止血、化瘀之功效，可治胃痛、膈食嘔吐、吐血等癥；其種仁可治腳氣。楊梅植物主要含間環(huán)二芳基庚烷、黃酮和三萜等類型天然化合物，但其有效成分并不明確，是否具有抑制腫瘤的作用也未得到進(jìn)一步研究。
癌癥是危害人民生命和健康的重要疾病之一，抗腫瘤活性化合物或先導(dǎo)物的發(fā)現(xiàn)是抗癌藥物研究的重要方面，而尋找天然的抗腫瘤活性化合物更是迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新型天然抗腫瘤活性化合物，從天然植物楊梅獲得。
另一個(gè)目的是提供所述新型天然抗腫瘤活性化合物的制備方法。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供所述新型天然抗腫瘤活性化合物的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的提供了一種新型天然抗腫瘤活性化合物，具有如下的化學(xué)結(jié)構(gòu) 其中，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9，R10，R11，R12選自氫原子(H)，烴基(alkyl)，芳基(aryl)，?；?acyl)，酰氧基(acyloxy)，烷氧基(alkoxy)，醛基(aldehyde)，氧代基(oxo)，羥基(hydroxyl)，鹵素(halogen)，氨基(amino)，烴氨基(alkylamino)，芳氨基(arylamino)，酰氨基(acylamino)，且不全為氫原子(H)；C7，C8，C9，C10，Cn，C12，C13位之間的連接形式為雙鍵或叁鍵或環(huán)氧連接。
所述的新型天然抗腫瘤活性化合物，優(yōu)選例是當(dāng)R3，R4，R5，R6，R8，R9，R10，R11為氫原子(H)，R1，R2為甲氧基(OCH3)，該化合物為(11S)-3，5-二甲氧基-11，17-二羥基-4，19-二酮基-[7，0]-間環(huán)二芳基庚烷。
本發(fā)明提供了上述新型天然抗腫瘤活性化合物的制備方法，是用合適的溶劑浸提楊梅植株粗粉，減壓濃縮得到總浸膏，總浸膏用水分散后，用適宜的有機(jī)溶劑萃取得到萃取物，萃取物經(jīng)分離得到所述化合物。
浸提可采用60％-98％乙醇或甲醇，萃取的有機(jī)溶劑可采用乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚、苯任一種。
還可以通過化學(xué)合成的方法得到(11S)-3，5-二甲氧基-11，17-二羥基-4，19-二酮基-[7，0]-間環(huán)二芳基庚烷類似物。
本發(fā)明提供了所述新型天然抗腫瘤活性化合物的應(yīng)用，主要是在制備作為增強(qiáng)機(jī)體免疫、消炎或抑制腫瘤細(xì)胞藥物方面的應(yīng)用。
本發(fā)明具有以下有益效果1、本發(fā)明提供的新型天然抗腫瘤活性化合物為一全新分子骨架的環(huán)狀二芳基庚烷醌類化合物，結(jié)構(gòu)新穎、抗腫瘤活性強(qiáng)，可來源于楊梅植物資源，安全性高。
2、對(duì)所述化合物的進(jìn)一步研究有望發(fā)現(xiàn)選擇性高、活性強(qiáng)、毒副作用小、抗瘤譜廣、抗多藥耐藥性好的新型抗癌藥物，具有重要的潛在產(chǎn)業(yè)化開發(fā)價(jià)值以及對(duì)人類研究抗癌藥物的重大貢獻(xiàn)。
3、本發(fā)明所述化合物的制備方法簡單安全易行。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明實(shí)施例1楊梅全植株30Kg(干重)，粉碎后用95％乙醇浸提(50L×3次)，減壓濃縮得總浸膏1680g?？偨嗳芙庠?.0L約40-60℃的溫?zé)崴鋮s后用氯仿萃取(1.0L×10次)，減壓濃縮得氯仿部分浸膏250g。氯仿部分浸膏經(jīng)硅膠柱層析，石油醚(60～90℃)-丙酮(石油醚，50∶1，20∶1，10∶1，5∶1，2∶1，丙酮)梯度洗脫，分成9個(gè)部分(TLC作檢測(cè)，相同部分合并到一起)；Fr.4經(jīng)硅膠制備薄層，展開劑為石油醚乙酸乙酯(4∶1，V/V)，分離提純得到化合物1 250mg。
化合物1為桔紅色油狀物，在TLC硅膠薄層板上與10％硫酸乙醇反應(yīng)顯淺藍(lán)色，該化合物的HRMS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 395.1467[M+Na]+，示其分子式為C21H24O6；IR吸收峰νmax3435cm-1，1651cm-1，1602cm-1，1507cm-1表明1中含在羥基、共軛羰基和苯環(huán)；1HNMR信號(hào)δ7.03(1H，dd，J＝8.3，1.6Hz)，6.84(1H，d，J＝8.3Hz)，6.78(1H，d，J＝1.6Hz)顯示分子中存在一個(gè)1，2，4-三取代苯環(huán)。1H-1HCOSY相關(guān)信號(hào)說明分子中存在-(CH2)2CH(OH)(CH2)4-結(jié)構(gòu)單元；13CNMR顯示21個(gè)碳信號(hào)，其中61.3(q)，61.2(q)為兩個(gè)甲氧基信號(hào)，分子骨架共19個(gè)碳信號(hào)，13CNMRδ184.1，184.2顯示含有苯醌結(jié)構(gòu)片斷。綜合上述信息，化合物1應(yīng)為含有醌式結(jié)構(gòu)片斷的二芳基庚烷類化合物。根據(jù)此化合物的1H-1H COSY，HMQC，HMBC和NOESY(見附圖
)，確定1為(11S)-3，5-二甲氧基-11，17-二羥基-4，19-二酮基-[7，0]-間環(huán)二芳基庚烷。具有如下式1所示化學(xué)結(jié)構(gòu)
化合物1的特征在于顏色和狀態(tài)桔紅色油狀物；分子式C21H24O6；比旋光[α]D20+0.027°(c 0.625mg/ml，丙酮)紫外光譜[λmax(MeOH)logε]194nm(0.31)，203nm(0.72)，279nm(0.32)；紅外光譜主要特征譜帶位于3435，2937，1651，1614，1602，1507，1453，1288，1202，1144，1006，822，759cm-1；質(zhì)譜ESI(-)371.2(M-H)-；HRESI(+)395.1467(M+Na)+；核磁共振氫譜(600Hz，CDCl3，δin ppm and TMS as internalstandard)2.40(1H，m，Ha-7)，1.68(1H，m，Hb-7)，1.87(1H，m，Ha-8)，1.30(1H，m，Hb-8)，1.60(1H，m，Ha-9)，1.15(1H，t，J＝13.8Hz，Hb-9)，0.98(1H，m，Ha-10)，0.73(1H，t，J＝12.7Hz，Hb-10)，3.72(1H，t，J＝8.3Hz，H-11)，1.94(1H，dt，J＝13.3，4.1Hz，Ha-12)，1.65(1H，m，Hb-12)，2.66(1H，td，J＝13.4，3.2Hz，Ha-13)，2.82(1H，dt，J＝13.8，3.5Hz，Hb-13)，7.03(1H，dd，J＝8.3，1.6Hz，H-15)，6.84(1H，d，J＝8.3Hz，H-16)，6.78(1H，d，J＝1.6Hz，H-18)，5.93(1H，brs，17-OH)，4.01(3H，s，OCH3)，4.05(3H，s，OCH3)；核磁共振碳譜(125Hz，CDCl3，δin ppm and TMS as internalstandard)120.7(s，C-1)，141.0(s，C-2)，144.9(s，C-3)，184.1(s，C-4)，144.4(s，C-5)，146.5(s，C-6)，34.7(t，C-7)，24.1(t，C-8)，26.4(t，C-9)，26.9(t，C-10)，72.1(d，C-11)，33.6(t，C-12)，39.8(t，C-13)，133.7(s，C-14)，130.5(d，C-15)，117.5(d，C-16)，150.9(s，C-17)，131.1(d，C-18)，184.2(s，C-19)，61.3(q，OMe)，61.2(q，OMe)。
實(shí)施例2本發(fā)明的消炎作用按藥劑學(xué)方法，可以將本發(fā)明提取物用于制備作為增強(qiáng)機(jī)體免疫或消炎的藥物。
下述的藥理實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明提取物具有增強(qiáng)機(jī)體免疫以及消炎等藥理活性將小鼠40只，雌雄各半，體重80～150g，經(jīng)由背部皮下注射0.5％的2，4一ONFB乙醇溶液100pl作為抗原使之增敏，注射2，4一DNFB 4天后增敏成立，第6天在小鼠右耳上涂1％2，4一DNFB一橄欖油溶液作為抗原攻擊，使小鼠產(chǎn)生耳緣接觸性皮膚炎。隨機(jī)等分為4組，楊梅提取物于增敏前一天到2，4一DNFB攻擊當(dāng)天連續(xù)7天經(jīng)口給藥。第1組為蒸餾水對(duì)照組，喂以同體積蒸餾水，第2、3、4組分別灌喂0.02％、0.2％、0.5％本發(fā)明乙醇提取物溶液0.5ml。取下小鼠左右兩耳，測(cè)定左右耳緣18mm重量差及比較浮腫程度。楊梅提取物連續(xù)7天經(jīng)口給藥，對(duì)小鼠耳緣浮腫顯示出一定的抑制效果，與蒸餾水對(duì)照組相比，小鼠左右耳緣18mm重量差分別小15％、25％、30％左右。
實(shí)施例3本發(fā)明的抗腫瘤作用通過SRB法檢測(cè)細(xì)胞的存活率，Hoechst33258核染色法、瓊脂糖凝膠電泳法和流式細(xì)胞術(shù)來檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況，來評(píng)價(jià)化合物1的抗腫瘤活性。
1、試劑DMEM、小牛血清購于GIBCO BRL公司、溴化乙啶(EB)購于上海生工公司、Hoechst33258購于Sigma公司、蛋白酶K(Proteinase K)，100bp DNA ladder購于NEB公司、RNA酶A(RNaseA)購于PROMEGA公司、碘化吡啶(PI)購于Merck公司、瓊脂糖(Argarose)購于西班牙BioWest公司、其余試劑為國產(chǎn)分析純。
2、儀器CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、高速冷凍離心機(jī)、水平電泳裝置、凝膠掃描分析系統(tǒng)、酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀。
3、方法細(xì)胞培養(yǎng)及化合物1處理腫瘤細(xì)胞在含10％小牛血清、100U/L青霉素和100mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于5％CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，0.25％胰酶消化，用培養(yǎng)基調(diào)成1×105/ml的細(xì)胞懸液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
設(shè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組?；衔?處理時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞加入不同濃度的化合物1培養(yǎng)48h。對(duì)照組不加藥物。
細(xì)胞活性測(cè)定(SRB法)取培養(yǎng)于96孔板經(jīng)化合物1處理過的細(xì)胞，每孔加入50％(質(zhì)量體積)的三氯乙酸(TCA)50固定細(xì)胞，TCA的終濃度為10％，輕柔地加在每孔液面上；然后在4℃冰箱中放置1h；培養(yǎng)板各孔用去離子水洗滌5遍，以去除TCA；培養(yǎng)板空氣中干燥；每孔加100μL0.4％(wt/Vol)SRB(溶解于1％醋酸中)，室溫下放置30min；棄去各孔內(nèi)液體后用洗滌5遍，去除未結(jié)合的染料，剩余的1％乙酸沖洗液在水池邊輕輕敲打，保證完全清除沖洗液；接著培養(yǎng)板在空氣中干燥直到?jīng)]有可見的液體；用pH為10.5，10mmol/l unbu-ffered Trisbase(三羥甲基胺基甲烷)溶解，在平板振蕩器上振蕩5min；在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定OD值，用空白對(duì)照(沒有接種細(xì)胞的生長培養(yǎng)基)調(diào)零，所用波長為490～530nm。按下列公式計(jì)算殺傷率∶殺傷率(％)＝(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100％。
Hoechst33258核染色樣本制備收集細(xì)胞(1×106個(gè))，1000r/min，離心5min，將培養(yǎng)基移去，用PBS洗兩次，迅即加入40g/L的多聚甲醛液固定10min。離心后吸去固定液，以蒸餾水清洗一次，用Hoechst33258(5mg/L)染色10min。用蒸餾水清洗2次后取細(xì)胞懸液，滴于載玻片，自然干燥，在熒光顯微鏡下以340nm激發(fā)光觀察并隨機(jī)拍照。Hoechst33258是一種DNA熒光染料，可以插入并結(jié)合于DNA鏈的A-T區(qū)，受到波長200-380nm的紫外線激發(fā)，可釋放420nm的藍(lán)色熒光，在熒光顯微鏡下，活細(xì)胞核呈彌散均勻熒光，核無固縮，故在視野中呈現(xiàn)體積較大的淺染核形態(tài)，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的顆粒塊狀熒光，核出現(xiàn)不同程度的固縮，?？梢奃NA熒光碎片(凋亡小體)。
DNA提取及瓊脂糖凝膠電泳將收集的細(xì)胞(2×106個(gè))1000r/min，離心5min，移去培養(yǎng)基，用PBS洗兩次，加入400μl含有10mmol/LTris-HCl、10mmol/L EDTA、10mmol/L NaCl、1％SDS(pH8.0)的細(xì)胞裂解液，充分混勻后加入蛋白酶K(500μg/ml)，37℃消化過夜。在消化液中加入75μl醋酸鉀(8mol/L)，4℃靜置15min，再加入氯仿750μl，充分混勻。10000r/min，離心10min。將上清吸出，加入750μl無水乙醇，上下輕柔顛倒混合，即可見白色沉淀析出。12000r/min，離心10min，吸棄上清，以70％乙醇洗沉淀1次。將沉淀自然干燥，用40μl TE(10mmol/LTris，1.0mmol/LEDTA，pH7.4，含200μg/ml Rnase A)溶解。于1.0％的瓊脂糖凝膠(含0.4μg/ml EB)上以60V電壓電泳1h，紫外燈下觀察拍照。正常細(xì)胞DNA鏈完整，在加樣孔附近呈現(xiàn)粗條帶，而凋亡的細(xì)胞DNA鏈以核小體為單位被切割降解，被抽提出來以后在凝膠泳道上呈現(xiàn)180bp為間隔的梯狀DNA電泳帶型。
流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞亞二倍體峰(凋亡峰)將收集的單細(xì)胞懸液(1×106個(gè))用PBS洗2次，離心后以70％的4℃乙醇固定過夜。測(cè)定前離心棄乙醇，細(xì)胞重懸于含有50mg/L碘化丙啶(PI)和50mg/LRnase A的染色液中，避光染色30min。以流式細(xì)胞儀進(jìn)樣測(cè)定，每樣本計(jì)數(shù)12000個(gè)細(xì)胞，采用熒光強(qiáng)度值并以儀器所配軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算凋亡率。
統(tǒng)計(jì)方法定量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，采用Microsoft Excel t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，p＜0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果化合物1可濃度依賴性地抑制腫瘤細(xì)胞體外生長活性濃度為32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、1.9μg/ml的化合物1對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的殺傷率分別為90.99％、42.66％、21.53％、19.46％。
權(quán)利要求
1.一種新型天然抗腫瘤活性化合物，其特征在于具有如下的化學(xué)結(jié)構(gòu) 其中，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9，R10，R11，R12選自氫原子(H)，烴基(alkyl)，芳基(aryl)，?；?acyl)，酰氧基(acyloxy)，烷氧基(alkoxy)，醛基(aldehyde)，氧代基(oxo)，羥基(hydroxyl)，鹵素(halogen)，氨基(amino)，烴氨基(alkylamino)，芳氨基(arylamino)，酰氨基(acylamino)，且不全為氫原子(H)；C7，C8，C9，C10，C11，C12，C13位之間的連接形式為雙鍵或叁鍵或環(huán)氧連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型天然抗腫瘤活性化合物，其特征是R3，R4，R5，R6，R8，R9，R10，R11為氫原子(H)，R1，R2為甲氧基(OCH3)，該化合物為(11S)-3，5-二甲氧基-11，17-二羥基-4，19-二酮基-[7，0]-間環(huán)二芳基庚烷。
3.一種權(quán)利要求2所述的新型天然抗腫瘤活性化合物的制備方法，其特征是用合適的溶劑浸提楊梅植株粗粉，減壓濃縮得到總浸膏，總浸膏用水分散后，用適宜的有機(jī)溶劑萃取得到萃取物，萃取物經(jīng)分離得到所述化合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的新型天然抗腫瘤活性化合物的制備方法，其特征是浸提可采用95％乙醇或甲醇，萃取的有機(jī)溶劑可采用乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚、苯任一種。
5.一種權(quán)利要求1所述的新型天然抗腫瘤活性化合物的制備方法，其特征是除了(11S)-3，5-二甲氧基-11，17-二羥基-4，19-二酮基-[7，0]-間環(huán)二芳基庚烷以外，其他化合物可以以(11S)-3，5-二甲氧基-11，17-二羥基-4，19-二酮基-[7，0]-間環(huán)二芳基庚烷為基礎(chǔ)通過化學(xué)合成的方法得到。
6.一種權(quán)利要求1所述的新型天然抗腫瘤活性化合物的應(yīng)用，其特征是在制備作為增強(qiáng)機(jī)體免疫或消炎的藥物方面的應(yīng)用。
7.一種權(quán)利要求1所述的新型天然抗腫瘤活性化合物的應(yīng)用，其特征是在制備抑制腫瘤細(xì)胞藥物方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新型天然抗腫瘤活性化合物，是一種具有全新分子骨架的化合物，結(jié)構(gòu)新穎、抗腫瘤活性強(qiáng)，可來源于楊梅植物資源，安全性高；同時(shí)公開了其制備方法，浸提楊梅植株粗粉，減壓濃縮，用水分散后，用適宜的有機(jī)溶劑萃取，分離提純得到所述的化合物，所述化合物在制備抗腫瘤藥物領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊，為醫(yī)學(xué)上開發(fā)攻克腫瘤的天然藥物打下了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C07C46/00GK101050170SQ20071002745
公開日2007年10月10日 申請(qǐng)日期2007年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月6日
發(fā)明者王定勇, 臧林泉, 謝啟宇, 劉恩桂, 潘雪刁, 陳健 申請(qǐng)人:廣東藥學(xué)院