專(zhuān)利名稱：一種穿心蓮根提取物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥領(lǐng)域，具體涉及中藥提取物，特別是穿心蓮根提取物。
背景技術(shù)：
穿心蓮為爵床科植物穿心蓮Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees，其根主要含有黃酮類(lèi)、穿心蓮內(nèi)酯等成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，穿心蓮黃酮類(lèi)成分具有心血管藥理活性。目前市場(chǎng)上已有較多的以穿心蓮為主要原料的中藥制劑，如穿心蓮片、穿心蓮膠囊、穿心蓮內(nèi)酯滴丸、穿心蓮注射液、復(fù)方穿心蓮片等；但這些品種均以穿心蓮的莖葉部分為原料，成品中主要含有內(nèi)酯類(lèi)成分，主要用于清熱解毒、抗菌消炎，而且其質(zhì)量控制體系也多以穿心蓮內(nèi)酯類(lèi)成分進(jìn)行構(gòu)建；幾乎沒(méi)有以穿心蓮黃酮類(lèi)為主藥的制劑，因?yàn)辄S酮類(lèi)物質(zhì)主要存在于穿心蓮根，這一部分在穿心蓮藥物的制備中不被利用，往往都是丟棄，造成浪費(fèi)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種穿心蓮根提取物。
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)上述目的技術(shù)方案是一種穿心蓮根提取物，該提取物是將穿心蓮根用乙醇回流提取后經(jīng)大孔樹(shù)脂純化得到，其中含有質(zhì)量百分比為53.28～68.53％的下列總黃酮7-O-甲基漢黃芩素、穿心蓮黃酮、5-羥基-7，8，2’3’-四甲氧基黃酮、5-羥基-3，7，8，2’-四甲氧基黃酮和5，2’-二羥基-7，8-二甲氧基黃酮。
本發(fā)明所述的一種穿心蓮根提取物，其中總黃酮中5，2’-二羥基-7，8-二甲氧基黃酮的質(zhì)量百分比含量為穿心蓮根提取物的6.85～11.38％。
本發(fā)明所述穿心蓮根提取物的制備方法是(1)取穿心蓮根粗粉，每次加40～70％乙醇10～30倍，在常壓下加熱回流提取1.0～1.5小時(shí)，重復(fù)提取2～3次，過(guò)濾，合并提取液；(2)將乙醇提取液減壓濃縮至無(wú)醇味，然后在5～20℃下，1000～3000rpm高速離心，取上清液，以0.5～2BV/h(倍柱體積每小時(shí))的流速上大孔吸附樹(shù)脂柱，待吸附飽和后，先用5～10BV水以0.5～2BV/h的流速洗脫，分別用20％，60％，90％乙醇進(jìn)行梯度洗脫，收集60％和90％乙醇的洗脫液，濃縮，噴霧干燥即得。
所述的提取所用的乙醇濃度最佳是40％。
所述的乙醇回流提取次數(shù)最好為2次，提取時(shí)間分別為1.5和1.0小時(shí)；所述的離心速度最佳是2000rpm，上柱流速最佳是1.5BV/h，洗脫流速最佳是1BV/h。
本發(fā)明所述的提取物是將穿心蓮根用乙醇回流提取后經(jīng)大孔樹(shù)脂純化得到的，該方法不需要長(zhǎng)時(shí)間在高溫下進(jìn)行，穿心蓮中的天然活性成分，如7-O-甲基漢黃芩素、穿心蓮黃酮、5-羥基-7，8，2’3’-四甲氧基黃酮、5-羥基-3，7，8，2’-四甲氧基黃酮、5，2’-二羥基-7，8-二甲氧基黃酮不易分解破壞，很好地保留了穿心蓮根的天然特征。
本發(fā)明所述的提取物可用于制備治療抗血栓的藥物，該藥物可以是腸溶膠囊、軟膠囊、滴丸、分散片、顆粒劑等。
所述的腸溶膠囊由本發(fā)明提取物與HPMC、微粉硅膠和硬脂酸鎂組成。其制備方法是，先將本發(fā)明提取物與賦型劑HPMC和微粉硅膠按1∶1.5∶0.5的比例混合，制粒，干燥，再加入0.2％的潤(rùn)滑劑硬脂酸鎂充分混合均勻，填充腸溶膠囊殼制成。
所述的軟膠囊由本發(fā)明提取物與適量植物油、3％～5％的蜂蠟及少量潤(rùn)濕劑組成。其制備方法是，先將本發(fā)明提取物與輔料的混合物按1∶2.5的比例混合，再上扎囊機(jī)壓制而成。
所述滴丸由本發(fā)明提取物與PEG4000及PEG6000混合組成。其制備方法是，先將本發(fā)明提取物與PEG4000及PEG6000按1∶0.5∶2.5的比例混合，再熔融，滴入冷卻劑中制成。
所述分散片由本發(fā)明提取物與HPMC、乳糖及淀粉混合組成。其制備方法是，先將本發(fā)明提取物與HPMC、乳糖及淀粉按1∶0.7∶0.5∶1的比例混合，制粒，干燥，整粒，再加入1％硬脂酸鎂混合均勻，再上壓片機(jī)壓制而成。
所述顆粒劑由本發(fā)明提取物與β-環(huán)糊精及淀粉混合組成。其制備方法是，先將本發(fā)明提取物與2倍量的β-環(huán)糊精包合，再加入1.5倍量淀粉，混合，過(guò)篩，攪拌，制粒，干燥，整粒，分包裝，即得顆粒劑。
本發(fā)明所述的提取物可以通過(guò)以下方法鑒定1、定量分析1.1紫外分光光度法測(cè)總黃酮含量(1)儀器、試劑與實(shí)驗(yàn)材料Agilent 8453E紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；Satorius電子分析天平(Sartorius Co.Ltd.Germany)；盧丁(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供)；所用試劑均為AR。
(2)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備分別精密稱取蘆丁對(duì)照品3.2mg及4.0mg，加入60％乙醇溶解，分別定容至25mL及10mL，濃度分別為128ug·mL-1及400ug·mL-1。
(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線及其線性范圍分別取已配制好的濃度為128ug·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品液0.1mL，0.2mL，0.3mL，0.4mL，0.5mL，1.0mL，2.0mL，3.0mL，4.0mL，5.0mL，6.0mL，濃度為400ug·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品液1.0mL，3.0mL，5.0mL至25mL量瓶，加1.0mL的0.1mol·L-1Alcl31.0mL，以60％乙醇稀釋至刻度。于282nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。以吸收度對(duì)濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y＝0.0009x+0.0084；γ＝0.9995。線性范圍為0.512ug·mL-1～80ug·mL-1。
(4)樣品測(cè)定取本發(fā)明提取物1mg，甲醇溶解并定容至10ml，制成0.1mg·mL-1的供試品溶液。精密吸取上述溶液2mL至25mL容量瓶中，加1.0mL的0.1mol·L-1AlCl31.0mL，以60％乙醇稀釋至刻度，放置30min后，于282nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液所得的回歸方程計(jì)算總黃酮的質(zhì)量X。
1.2高效液相色譜法測(cè)5，2’-二羥基-7，8-二甲氧基黃酮含量(1)色譜條件Kromasil RP-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；甲醇-水(65∶35)；流速0.8mL/min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)276nm；進(jìn)樣量10μL；5，2’-二羥基-7，8-二甲氧基黃酮的理論塔板數(shù)不應(yīng)低于6000，保留時(shí)間為17.62min。
(2)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備精密稱取5，2’-二羥基-7，8-二甲氧基黃酮(R6)對(duì)照品適量，加甲醇溶解并定容，分別制成濃度為0.11mg/mL的溶液，備用。
(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線及其線性范圍 分別精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)混和溶液1、2、4、6、8、10μL，依選定的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見(jiàn)圖1，5，2’-二羥基-7，8-二甲氧基黃酮的保留時(shí)間為19.31min；以峰面積(Y)對(duì)5，2’-二羥基-7，8-二甲氧基黃酮成分質(zhì)量(X)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y＝3365.9.5X-7.3058，γ＝0.9999，線性范圍110～1100ng；γ為線性系數(shù)。
(4)樣品測(cè)定 精密稱取本發(fā)明所述提取物樣品1mg，加甲醇定容至10ml，超聲使其溶解，進(jìn)樣前以0.20μm微孔濾膜過(guò)濾。精密吸取5μl，依選定的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，樣品溶液的色譜圖見(jiàn)圖2，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液所得的回歸方程計(jì)算5，2’-二羥基-7，8-二甲氧基黃酮的質(zhì)量X。
2、定性分析高效液相色譜指紋圖譜法。
(1)色譜條件Kromasil RP-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；水-乙腈-甲醇三元梯度洗脫；流速0.8mL/min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)276nm；進(jìn)樣量5μL。
(2)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備精密稱取7-O-甲基漢黃芩素(R1)、穿心蓮黃酮(R3)、5-羥基-7，8，2’3’-四甲氧基黃酮(R4)、5，2’-二羥基-7，8-二甲氧基黃酮(R6)各1mg，加甲醇溶解并定容5mL量瓶，再各取1mL混合，進(jìn)樣前以0.2μm的微孔濾膜過(guò)濾，備用。
(3)樣品測(cè)定 精密稱取本發(fā)明所述提取物樣品1mg，加甲醇定容至10mL，超聲使其溶解，進(jìn)樣前以0.20μm微孔濾膜過(guò)濾。精密吸取5μL，依選定的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。
(3)標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖如3所示，R1為7-O-甲基漢黃芩素，R3為穿心蓮黃酮，R4為5-羥基-7，8，2’3’-四甲氧基黃酮，R6為5，2’-二羥基-7，8-二甲氧基黃酮。
(4)本發(fā)明提取物成分色譜指紋圖譜的建立本發(fā)明提取物的指紋峰共有18個(gè)，為便于辨認(rèn)和分析比較，將其特征峰指紋圖譜分成I、II、III三組。第I組包括5～15min(1～5#峰)，第II組包括16～30min(6～10#峰)，第III組包括35～50min(11～18#峰)。如圖4所示，黃酮類(lèi)物質(zhì)基本上都集中在第III組峰內(nèi)，其中13#峰的滯留時(shí)間為37.8min，與標(biāo)準(zhǔn)品中R6峰相同，為5，2’-二羥基-7，8-二甲氧基黃酮；16#峰的滯留時(shí)間為43.4min，與標(biāo)準(zhǔn)品中R1峰相同，為7-O-甲基漢黃芩素；17#峰的滯留時(shí)間為44.2min，與標(biāo)準(zhǔn)品中R3峰相同，為穿心蓮黃酮；18#峰的滯留時(shí)間為46.1min，與標(biāo)準(zhǔn)品中R4峰相同，為5-羥基-7，8，2’3’-四甲氧基黃酮。
以下通過(guò)具體實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的有益效果1、抗血小板凝集實(shí)驗(yàn)40只大鼠隨機(jī)分為40組，每組10只，分別標(biāo)號(hào)為正常組、本發(fā)明提取物給藥組(低、中、高劑量)。給藥組按10mg·kg-1，20mg·kg-1，40mg·kg-1劑量，以下述制備例1所得的提取物灌胃，每天1次，連續(xù)3周。
(1)本發(fā)明提取物對(duì)二磷腺苷(ADP)誘導(dǎo)大鼠血小板聚集的抑制作用研究給藥3星期之后，乙醚麻醉大鼠，眼眶取血，插入聚乙烯管眼眶取血4毫升，置事先放有枸櫞酸鈉抗凝的硅化試管中，(血與抗凝劑的比例為9∶1)將血液與抗凝劑輕輕混勻，離心(1000rpm)10分鐘，吸取上層米黃色溶液，即為富血小板血漿(PRP)。
精密稱取1mgADP，加入1毫升生理鹽水為備用液，分裝成50uL小瓶共20瓶?jī)?chǔ)存，用時(shí)取1小瓶50uL加入生理鹽水1.25mL生理鹽水為應(yīng)用液(聚集劑)，每個(gè)標(biāo)本加聚集劑40～50uL，標(biāo)本量是0.45mL富血小板血漿。聚集劑一定遮光、冰箱保存。
抗血小板聚集活性測(cè)定打開(kāi)3-9D型血流變四用儀，選擇血小板聚集功能，取富血小板血漿0.45mL，裝入聚集孔中，放入綜合傳感器箱中的中間孔(工作孔)。加入攪拌棒，打開(kāi)攪拌開(kāi)關(guān)，蓋上小蓋，調(diào)節(jié)傳感器中電位器，調(diào)初值10左右，然后揭開(kāi)小蓋，加入聚集劑，蓋上小蓋，打開(kāi)聚集儀菜單，選擇聚集操作，計(jì)算機(jī)倒計(jì)時(shí)，到時(shí)報(bào)警。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用T-test檢驗(yàn)，各劑量組均與對(duì)照組比較，從表1、2、3、4可知，服用本提取物后可明顯影響血小板的聚集功能，使其受到明顯抑制，表明本提取物具有顯著的抗血小板聚集作用。
表1本提取物抗血小板聚集率(x±s，n＝10)

注與正常對(duì)照組比較*P＜0.05，#P＜0.01。(表2、3、4同)
表2本提取物抗血小板聚集率(x±s，n＝10)

表3本提取物抗血小板聚集率(x±s，n＝10)

表4本提取物抗血小板聚集率(x±s，n＝10)

(2)本發(fā)明提取物對(duì)不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的血小板聚集抑制作用研究大鼠頸動(dòng)脈取血后，置事先放有枸櫞酸鈉抗凝的硅化試管中，(血與抗凝劑的比例為9∶1)將血液與抗凝劑輕輕混勻，離心(1000rpm)10分鐘，吸取上層米黃色溶液，即為富血小板血漿(PRP)。隨后立即高速離心(3000rpm)十分鐘，得貧血小板血漿(PPP)。
抑制血小板聚集實(shí)驗(yàn)取PRP和PPP入聚集杯中，在等量PRP中分別加入PBS對(duì)照和低、中、高濃度的穿心蓮黃酮液，孵育5min；再分別加入終濃度為二磷酸腺苷(ADP)2mmol·L-1、花生四烯酸(AA)176mmol·L-1、腎上腺素5mmol·L-13種誘導(dǎo)劑，記錄血小板聚集曲線。結(jié)果見(jiàn)表5。
表5血小板聚集抑制作用比較結(jié)果(x±s，n＝10)

注與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與低劑量組比較，#P＜0.05；與中劑量組比較，△P＜0.05。
結(jié)果表明，低、中、高劑量組的本發(fā)明提取物均可明顯抑制ADP、AA、腎上腺素誘導(dǎo)的血小板聚集(P＜0.01，ADP誘導(dǎo)的血小板聚集穿心蓮黃酮半抑制濃度(Ic50)為23.3mg·L-1，AA誘導(dǎo)的Ic50為19.8mg/L，腎上腺素誘導(dǎo)的Ic50為21.4mg/L；高劑量組穿心蓮黃酮對(duì)ADP、AA、腎上腺素誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制率分別為77.38％、96.62％和92.67％。
3、本發(fā)明提取物對(duì)麻醉犬心肌耗氧量的影響15只犬隨機(jī)分為3組，生理鹽水組(1mL·kg-1)、心達(dá)康組(24mg·kg-1)和本發(fā)明提取物組(8mg·kg-1)，上述實(shí)驗(yàn)用藥均在實(shí)驗(yàn)前配成混懸液以備灌胃給藥。參照徐叔云主編《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》，麻醉犬，氣管插管連接麻醉呼吸機(jī)。分離右側(cè)股動(dòng)脈，開(kāi)胸，游離左冠狀動(dòng)脈前降支上部，放置電磁流量計(jì)探頭測(cè)冠脈流量。分離右側(cè)頸靜脈，插心導(dǎo)管入冠狀靜脈竇。同步抽取冠狀竇及股動(dòng)脈血標(biāo)本(0.5％肝素抗凝)，用血?dú)夥治鰞x測(cè)定動(dòng)脈和靜脈血氧含量。灌胃給予生理鹽水或藥物，分別分析給藥前及給藥后30、60、90、120min時(shí)動(dòng)脈和靜脈血?dú)?。?shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱重心臟和控血重，用于計(jì)算心肌耗氧量。公式為心肌耗氧量[mL·min-1·(100g)-1I＝冠脈血流量[mL·min-1·(100g)-1]×(動(dòng)脈血氧含量-冠狀竇血氧含量)。心肌氧攝取率(％)＝(動(dòng)脈血氧含量-冠狀竇血氧含量)/動(dòng)脈血氧含量×100％。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，用SPSS11.0軟件進(jìn)行方差分析，作顯著性檢驗(yàn)。本發(fā)明提取物組灌胃后心肌耗氧量同生理鹽水組相比有所下降，從30min開(kāi)始至120min各時(shí)間點(diǎn)心肌耗氧量變化率與生理鹽水組比差異有極顯著性(P＜0.01)。心達(dá)康可顯著降低心肌耗氧量，降低率與生理鹽水組同時(shí)間點(diǎn)相比，3.0～120min差異顯著(P＜0.01)，結(jié)果見(jiàn)表6。本發(fā)明提取物灌胃后可顯著降低心肌氧攝取率；降低率與生理鹽水組同時(shí)間點(diǎn)相比，從30min至120min各時(shí)間點(diǎn)差異均有極顯著性(P＜0.01)。陽(yáng)性對(duì)照心達(dá)康可顯著降低心肌氧攝取率，結(jié)果見(jiàn)表7。本發(fā)明提取物可增加冠脈流量，增加率與生理鹽水組同時(shí)間點(diǎn)相比，在30、60min差異顯著(P＜0.05)。陽(yáng)性對(duì)照藥心達(dá)康也可明顯增加冠脈流量，作用時(shí)間從30～90min，結(jié)果見(jiàn)表8。
可見(jiàn)，本發(fā)明提取物能顯著降低心肌耗氧量，與心達(dá)康相比，具有見(jiàn)效快，服用劑量低的優(yōu)點(diǎn)。
表6本發(fā)明提取物對(duì)犬心肌耗氧量的影響(n＝5)

注與給藥前比較，a)P＜0.05，b)P＜0.01；與生理鹽水組比較，c)P＜0.05，d)P＜0.01(表7、8同)。
表7本發(fā)明提取物對(duì)對(duì)犬心肌氧攝取率的影響(n＝5)

表8本發(fā)明提取物對(duì)犬冠脈流量的影響(n＝5)

4、本發(fā)明提取物對(duì)高血脂大鼠血脂水平的影響參照《現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法》，采用高脂飼料喂養(yǎng)方法制備大鼠高脂血癥模型。選用SD大鼠(180～200g)60只，雌雄各半，在本研究室環(huán)境中喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料5d，測(cè)血清TC、TG正常值。然后隨機(jī)分4組，即高脂血癥模型組，丹香降脂顆粒組(陽(yáng)性藥對(duì)照組)、本發(fā)明提取物小劑量組及大劑量組，給予高脂飼料喂養(yǎng)。高脂飼料配方79％基礎(chǔ)飼料，1％膽固醇，10％蛋黃粉，10％豬油。連續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)10d，取血，離心，測(cè)血清TC值，證明均已形成高脂血癥，各組選擇10只繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)，并分別給予相應(yīng)藥物，模型組給予等容積NS，均灌胃給予。每日1次，于14d及28d分別取血測(cè)TC、TG，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS11.0軟件統(tǒng)計(jì)處理，用x±s表示。各組大鼠連續(xù)給藥14d和28d測(cè)得的血清TC值如表9所示。表9結(jié)果顯示本發(fā)明提取物有降低高血脂大鼠TC作用，其降脂作用強(qiáng)度強(qiáng)于丹香清脂顆粒藥。連續(xù)給予本發(fā)明提取物14d及28d測(cè)得的TG值，見(jiàn)表10。
表9本發(fā)明提取物對(duì)高血脂大鼠TC的影響(x±s，n＝10)

注與高血脂模型組比較，*P＜0.05，#P＜0.01，(表10同)表10本發(fā)明提取物對(duì)高血脂大鼠TG的影響(x±s，n＝10)

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提取物可明顯降低血清TC和TG水平，與高血脂模型組相比有顯著差異，與丹香清脂顆粒組相比，本發(fā)明提取物40mg·kg-1的降脂作用更強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為臨床應(yīng)用本發(fā)明提取物于高血脂癥提供了藥理學(xué)依據(jù)。
5、本發(fā)明提取物的活血化瘀作用研究3月齡清潔級(jí)Wista大鼠(180～220g)共50只，隨機(jī)分為5組①模型對(duì)照組生理鹽水(10mL·kg-1)；②活血化瘀藥物對(duì)照組復(fù)方丹參滴丸(67.9mg·kg-1)；③本發(fā)明提取物高劑量組(100mg·kg-1)；④本發(fā)明提取物中劑量組(50mg·kg-1)；⑤本發(fā)明提取物低劑量組(25mg·kg-1)；。實(shí)驗(yàn)每組各10只。
各組大鼠分籠飼養(yǎng)于不銹鋼金屬籠內(nèi)，每籠5只，室溫調(diào)節(jié)在(26±2)℃，濕度控制在40％～70％，自由飲食和攝水。每天灌胃1次，連續(xù)21d。第21天，停藥禁食不禁水。于第22天，對(duì)各組均給予1mg/kg的鹽酸腎上腺素生理鹽水溶液，用20％氨基甲酸乙酯(0.70ml/100g)腹腔麻醉，先觀測(cè)動(dòng)物的腸系膜微循環(huán)，然后分離大鼠腹主動(dòng)脈取血，分別制備血清和抗凝血(抗凝劑分別為2％EDTANa2、3.8％枸櫞酸鈉)，檢測(cè)血液流變學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS11.0軟件統(tǒng)計(jì)處理，用x±s表示。
本發(fā)明提取物大劑量組可有效抑制低剪切速下大鼠的血液黏度，降低1.0s-1、5.0s-1剪切速下的血液黏度值，和模型對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.01)，結(jié)果見(jiàn)表11。同時(shí)，高劑量組對(duì)造模后大鼠的紅細(xì)胞聚集指數(shù)具有顯著降低作用，和模型對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.05)，對(duì)紅細(xì)胞變形性無(wú)顯著作用，和模型對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性，見(jiàn)表12。造模后，本發(fā)明提取物中、高劑量組可顯著抑制大鼠血小板聚集性，并降低血小板黏附性，與模型對(duì)照組比較差異有非常顯著性(P＜0.01、P＜0.05)，說(shuō)明本發(fā)明提取物具有明顯的活血化淤的作用，見(jiàn)表13。
表11本發(fā)明提取物對(duì)大鼠血液黏度的影響(x±s，n＝10)

注與高血脂模型組比較，*P＜0.05，#P＜0.01(表12、13同)表12本發(fā)明提取物對(duì)大鼠紅細(xì)胞聚集性和變形性的影響(x±s，n＝10)

表13本發(fā)明提取物對(duì)血小板黏附性和聚集性的影響((x±s，n＝10)



圖1是標(biāo)準(zhǔn)品溶液的高效液相色譜圖，其中R6為5，2’-二羥基-7，8-二甲氧基黃酮。
圖2是實(shí)施例1所得提取物的高效液相色譜圖，其中R6為5，2’-二羥基-7，8-二甲氧基黃酮。
圖3是標(biāo)準(zhǔn)品溶液的高效液相色譜圖，其中R1為7-O-甲基漢黃芩素，R3為穿心蓮黃酮，R4為5-羥基-7，8，2’3’-四甲氧基黃酮，R6為5，2’-二羥基-7，8-二甲氧基黃酮。
圖4是實(shí)施例1所得提取物的高效液相色譜指紋圖譜，其中R1為7-O-甲基漢黃芩素，R3為穿心蓮黃酮，R4為5-羥基-7，8，2’3’-四甲氧基黃酮，R6為5，2’-二羥基-7，8-二甲氧基黃酮。
具體實(shí)施例方式
制備例例1取干燥的穿心蓮根2000g，粉碎成粗粉。
取穿心蓮根粗粉，加40％乙醇30倍浸泡12小時(shí)，在常壓下加熱提取1.5小時(shí)，趁熱過(guò)濾，藥渣再加40％乙醇20倍，加熱提取1小時(shí)，趁熱過(guò)濾，合并兩次乙醇提取液。將乙醇提取液減壓濃縮至無(wú)醇味，在5～20℃下以3000rpm離心，取上清液加于已處理好的AB-8型大孔吸附樹(shù)脂(天津南開(kāi)大學(xué)化工廠生產(chǎn))，以2BV/h(倍柱體積每小時(shí))的流速上大孔吸附樹(shù)脂柱，待吸附飽和后，先用水以1.5BV/h的流速洗脫樹(shù)脂柱，至水洗液無(wú)色后，再依次以20％、60％、90％乙醇以1BV/h的流速洗脫，各乙醇梯度間的遞增以上一梯度洗脫液至無(wú)色為依據(jù)，收集濃度為60％和90％的乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮，噴霧干燥。
精密稱取本發(fā)明所述提取物樣品1mg，加甲醇溶解并定容至10mL。精密吸取上述溶液2mL至25mL容量瓶中，加1.0mL的0.1mol/L AlCl31.0mL，以60％乙醇稀釋至刻度，放置30min后，于282nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液所得的回歸方程計(jì)算總黃酮部位中黃酮的平均含量為68.53％。
精密稱取本實(shí)施例所述提取物樣品1mg，加甲醇溶解并定容至10mL。進(jìn)樣前以0.20μm微孔濾膜過(guò)濾。精密吸取5μL，依選定的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液所得的回歸方程計(jì)算本發(fā)明提取物中5，2’-二羥基-7，8-二甲氧基黃酮的含量11.38％，色譜圖見(jiàn)圖2，本實(shí)施例提取物的高效液相指紋圖譜見(jiàn)圖4。
例2取新鮮干燥的穿心蓮根1000g，粉碎成粗粉。
取穿心蓮根粗粉，加50％乙醇30倍浸泡12小時(shí)，在常壓下加熱回流提取1.0小時(shí)，趁熱過(guò)濾，藥渣再加50％乙醇20倍，加熱回流提取1小時(shí)，趁熱過(guò)濾，合并兩次乙醇提取液。將乙醇提取液減壓濃縮至無(wú)醇味，在5～20℃下以2000rpm離心，取上清液加于已處理好的AB-8型大孔吸附樹(shù)脂(天津南開(kāi)大學(xué)化工廠生產(chǎn))，以2BV/h(倍柱體積每小時(shí))的流速上大孔吸附樹(shù)脂柱，待吸附飽和后，先用水以1.5BV/h的流速洗脫樹(shù)脂柱，至水洗液無(wú)色后，再依次以20％、60％、90％乙醇以1BV/h的流速洗脫，各乙醇梯度間的遞增以上一梯度洗脫液至無(wú)色為依據(jù)，收集濃度為60％和90％的乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮，噴霧干燥。所得提取物中總黃酮含量為65.62％，5，2’-二羥基-7，8-二甲氧基黃酮的含量10.16％。
例3取新鮮干燥的穿心蓮根1000g，粉碎成粗粉。
取穿心蓮根粗粉，加70％乙醇20倍浸泡12小時(shí)，在常壓下加熱回流提取1.5小時(shí)，趁熱過(guò)濾，藥渣再加50％乙醇15倍，加熱回流提取1小時(shí)，趁熱過(guò)濾，合并兩次乙醇提取液。將乙醇提取液減壓濃縮至無(wú)醇味，在5～20℃下以2000rpm離心，取上清液加于已處理好的AB-8型大孔吸附樹(shù)脂(天津南開(kāi)大學(xué)化工廠生產(chǎn))，以2BV/h(倍柱體積每小時(shí))的流速上大孔吸附樹(shù)脂柱，待吸附飽和后，先用水以1BV/h的流速洗脫樹(shù)脂柱，至水洗液無(wú)色后，再依次以20％、60％、90％乙醇以1BV/h的流速洗脫，各乙醇梯度間的遞增以上一梯度洗脫液至無(wú)色為依據(jù)，收集濃度為60％和90％的乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮，噴霧干燥。所得提取物中總黃酮含量為53.28％，5，2’-二羥基-7，8-二甲氧基黃酮的含量6.85％。
應(yīng)用例例1將制備例1所得提取物48.3g用適量乙醇稀釋后，按照等量遞加法分別賦型劑HPMC和微粉硅膠按1∶1.5∶0.5的比例混合均勻，過(guò)6號(hào)篩制成顆粒，于60℃溫度下干燥3小時(shí)。取1#空腸溶膠囊，分別填充以上干燥顆粒，每1粒膠囊0.3g，于囊口處涂一層阿拉伯膠漿，套封膠囊，用干燥紗布擦拭膠囊后，裝于密閉棕色瓶?jī)?nèi)，即得。該制劑的用量為每天兩次，每次2粒，口服。
例2將制備例1所得提取物42.2g與100g花生油混合，加入10g蜂蠟及1g吐溫-80，再用旋轉(zhuǎn)式扎囊機(jī)壓制成500粒軟膠囊(0.3g/粒)。該制劑的用量為每天兩次，每次2粒，口服。
例3將制備例2所得提取物41.3g與大豆油50g混合，加入5.0g蜂蠟及0.8g吐溫-80，再用旋轉(zhuǎn)式扎囊機(jī)壓制成300粒軟膠囊(0.3g/粒)。該制劑的用量為每天兩次，每次4粒，口服。
例4將制備例3所得提取物43.6g用適量乙醇稀釋后再與淀粉200g混勻，過(guò)120目篩，于60℃下烘干3小時(shí)，裝膠囊(0.3g/粒)。該制劑的用量為每天兩次，每次3粒，口服。
例5
將制備例1提取物88.1g與40g PEG4000及200g PEG6000混合，熔融，滴入冷卻劑甲基硅油中即得滴丸(50mg/粒)。該制劑的用量為每天兩次，每次2.0g，口服。
例6將制備例3提取物與1.5倍量的β-環(huán)糊精包合，加入60g淀粉，混合，再過(guò)80目篩2次，置攪拌機(jī)中，加入蒸餾水適量，攪拌10分鐘，制軟材，過(guò)16目篩制粒，濕粒于60℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥，干粒過(guò)16目篩整粒。加入羧甲基淀粉鈉10g及硬脂酸鎂2g，混合均勻，壓片，包薄膜衣，得片劑。該制劑的用量為每天三次，每次2片，口服。
例9將制備例1提取物46.5g用2倍量的β-環(huán)糊精包合，再加入60g淀粉，混合，再過(guò)80目篩2次，置攪拌機(jī)中，加入蒸餾水適量，攪拌10分鐘，制軟材，過(guò)16目篩制粒，濕粒于60℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥，干粒過(guò)16目篩整粒，分包裝，即得顆粒劑。該制劑的用量為每天3次，每次1袋(2g)，溫水沖服。
例10將制備例2提取物40.3g與HPMC、乳糖及淀粉按1∶0.9∶0.9∶1.2的比例混合均勻，用95％乙醇20目制粒，50℃以下干燥1小時(shí)、16目篩整粒，再加入1％硬脂酸鎂混合均勻，壓制成片重為0.32g的片劑。即得分散片。該制劑的用量為每天2次，每次3片，溫水沖服。
權(quán)利要求
1.一種穿心蓮根提取物，該提取物是將穿心蓮根用乙醇回流提取后經(jīng)大孔樹(shù)脂純化得到，其中含有質(zhì)量百分比為53.28～68.53％的下列總黃酮
7-0-甲基漢黃芩素、穿心蓮黃酮、5-羥基-7，8，2’3’-四甲氧基黃酮、5-羥基-3，7，8，2’-四甲氧基黃酮和5，2’-二羥基-7，8-二甲氧基黃酮。
2.權(quán)利要求1所述的一種穿心蓮根提取物，其特征在于所述的總黃酮中5，2’-二羥基-7，8-二甲氧基黃酮的質(zhì)量百分比含量為穿心蓮根提取物的6.85～11.38％。
3.權(quán)利要求1或2所述穿心蓮根提取物的制備方法，該方法由以下步驟組成(1)取穿心蓮根粗粉，每次加40～70％乙醇10～30倍，在常壓下加熱回流提取1.0～1.5小時(shí)，重復(fù)提取2～3次，過(guò)濾，合并提取液；(2)將乙醇提取液減壓濃縮至無(wú)醇味，然后在5～20℃下，1000～3000rpm高速離心，取上清液，以0.5～2BV/h的流速上大孔吸附樹(shù)脂柱，待吸附飽和后，先用5～10BV水以0.5～2BV/h的流速洗脫，分別用20％，60％，90％乙醇進(jìn)行梯度洗脫，收集60％和90％乙醇的洗脫液，濃縮，噴霧干燥即得。
4.權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述的提取所用的乙醇濃度是40％。
5.權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述的乙醇回流提取次數(shù)為2次，提取時(shí)間分別為1.5和1.0小時(shí)。
6.權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述的離心速度是2000rpm。
7.權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述的上柱流速是1.5BV/h。
8.權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述的洗脫流速是1BV/h。
9.權(quán)利要求1或2所述的穿心蓮根提取物在制備治療抗血栓的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種穿心蓮根提取物，其特征在于含有53.28～68.53％總黃酮(其中5，2’－二羥基－7，8－二甲氧基黃酮6.85～11.38％)。該提取物是將穿心蓮根粗粉浸泡乙醇中，常壓加熱回流提取，然后將乙醇提取物通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂，用乙醇洗脫，收集乙醇濃度為60～90％的洗脫液，最后減壓濃縮，噴霧干燥得到，盡可能地保留了原料藥中的黃酮類(lèi)成分7－O－甲基漢黃芩素、穿心蓮黃酮、5－羥基－7，8，2’3’－四甲氧基黃酮、5－羥基－3，7，8，2′－四甲氧基黃酮、5，2’－二羥基－7，8－二甲氧基黃酮，很好地保持穿心蓮根的天然特征。
文檔編號(hào)C07D311/00GK101040883SQ20071002762
公開(kāi)日2007年9月26日 申請(qǐng)日期2007年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月20日
發(fā)明者祝晨蔯, 林朝展 申請(qǐng)人:廣州中醫(yī)藥大學(xué)