專利名稱：一種新的信號(hào)芋螺毒素序列、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中國南海信號(hào)芋螺毒素基因Ltl5.1及其編碼的多肽序列 ltl5a和該多肽的制備技術(shù)，以及該毒素在神經(jīng)生物學(xué)研究和離子通道藥物開發(fā) 中的應(yīng)用。
技術(shù)背景芋螺屬于軟體動(dòng)物門，腹足綱，芋螺科(Conidae)，多數(shù)棲息在熱帶海洋的 淺海水域，因外形呈圓錐形或芋頭狀而得名，表面常有各色花紋，殼口窄長。芋 螺是比較年輕的生物，化石記錄證明芋螺屬最早出現(xiàn)于始新世(Eocene)，中生 代(mesozoic)時(shí)期海洋捕食性軟體動(dòng)物菊石的消失客觀上促進(jìn)了芋螺的第一次 大規(guī)模的物種形成。芋螺的第二次大規(guī)模的輻射始于中新世(Miocene)，基本上 持續(xù)到現(xiàn)在(Teriau and Olivera， 2004)。芋螺具有強(qiáng)大的自然進(jìn)化能力，全球有約700種芋螺，芋螺是海洋無脊椎動(dòng) 物中進(jìn)化最成功的生物之一。芋螺雖然種類很多，但他們都是食肉動(dòng)物，靠毒液 來捕食，根據(jù)其捕食習(xí)性可分為食魚芋螺(piscivorous)、食螺芋螺 (molluscivorous)、食蟲芋螺(vermivorous)。食蟲性芋螺種類最多，占全部芋 螺種類的70%左右。三種芋螺中食魚芋螺毒液的毒性最高，食蟲芋螺的毒性最低。芋螺毒液是芋螺捕食與防御的主要武器，它是由許多單一毒肽組成的雞尾酒 樣的混合毒素，稱為芋螺毒素(Conotoxin)。芋螺毒素通常為由7 41個(gè)氨基酸 殘基組成的小分子多肽。大多富含半胱氨酸，具有高度保守的二硫鍵骨架。與蜘 蛛、蝎、蛇、?？仍S多動(dòng)物的毒素比較(40 80個(gè)氨基酸左右)，芋螺毒素的 肽鏈短得多，富含二硫鍵，分子結(jié)構(gòu)更為緊密，生物活性更高。大多數(shù)芋螺毒素 均由單一的mRNA編碼，原始的翻譯產(chǎn)物是一種特定的多肽前體，約為70-100個(gè) 氨基酸殘基，經(jīng)蛋白酶水解后得到成熟肽。這些成熟肽分別選擇性的作用于鈣、 鈉、鉀離子通道，或者乙酰膽堿、NMDA、 5-羥色胺等受體，許多已經(jīng)成為神經(jīng)生 理學(xué)研究的工具藥。但是，目前已知的芋螺毒素大多是從食魚芋螺中分離得到， 食蟲芋螺的毒液研究的相對較少。
二十世紀(jì)八十年代初，美國猶它大學(xué)01ivera BM學(xué)者實(shí)驗(yàn)室最早開展了芋 螺毒素全面系統(tǒng)研究工作。芋螺毒素按照其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(前體肽中N端高度保守的 信號(hào)肽區(qū)和C端的二硫鍵骨架)，可分為不同的超家族。至今己經(jīng)得到分離的芋 螺毒素有近千種，數(shù)十種芋螺毒素己申請美國專利。它們在鎮(zhèn)痛、局部缺血性保 護(hù)、癲癇治療、某些疾病診斷和受體研究中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，有的已進(jìn)入臨 床研究或已被FDA正式批準(zhǔn)為治療新藥，用作特異診斷試劑和鎮(zhèn)痛藥。目前， 由Elan公司進(jìn)行開發(fā)的co-CTXMWA (SNXm，商品名Ziconotide)，因其直 接作用分布于神經(jīng)組織的N-型鈣離子通道，無需第二信使或蛋白，不成癮，已 成為治療難治性神經(jīng)疼痛的新一代藥物，已通過了ni期臨床試驗(yàn)，正式被FDA 批準(zhǔn)上市。而另一個(gè)衍生于(o-CTX C VID的化合物AM336作用類似于 Ziconotide，因其對N-鈣通道的選擇性更強(qiáng)，副作用更低，已經(jīng)批準(zhǔn)作為對抗嚴(yán) 重抗嗎啡作用慢性疼痛的治療藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。此外，Conantokin-G作為 NMDA受體高度選擇性的拮抗劑，對難以治療的癲癇有效，也已完成I期臨床 試驗(yàn)。另一方面，芋螺毒素作為研究離子通道和膜受體的極好探針或工具，已經(jīng)成 為電壓門控型鈣離子通道(VSCCs)和N型乙酰膽堿受體(nAChRs)等通道、 受體鑒定和診斷的標(biāo)準(zhǔn)工具，在神經(jīng)藥理學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。芋螺在我國南海海域有廣泛分布，已查明的芋螺約有80余種，主要分布在 臺(tái)灣、廣東、廣西、海南諸省以及西沙和南沙群島等。近年來國內(nèi)也開展了芋螺 毒素的生物化學(xué)、分子生物學(xué)以及藥理作用等方面的研究工作。陳冀勝等人自桶 形芋螺(C. 6em/i'mw)、獨(dú)特芋螺(C. cflra"eW幼7ews)、菖蒲芋螺(C. ve;cz7/wm)、 地紋芋螺等類芋螺中分離鑒定了十余種新序列的芋螺毒素。盧柏松、黃培堂以及 戴秋云等從我國的線紋芋螺、織錦芋螺中也發(fā)現(xiàn)了一些新的毒素成分和基因序 列。熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)彭世清、羅素蘭等己從菖蒲芋螺基因組中克隆到兩個(gè)新芋螺毒 素基因；同時(shí)還從海南產(chǎn)的大理石芋螺(C. wflnwow^)、幻芋螺(C./wagw)、 等共12個(gè)種中分別發(fā)現(xiàn)了具有藥用功能的35種O-超家族芋螺毒素及其基因。 雖然我國有著豐富的芋螺資源，但目前對于芋螺毒素的研究尚處于初期階段，有 著廣闊的研究空間和開發(fā)前景。由于芋螺毒素在其基因序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能方面差異較大，具有種類繁
多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜和高度遺傳多樣性特征。構(gòu)建信號(hào)芋螺毒管cDNA文庫可以系統(tǒng)地 研究食蟲芋螺的毒素組成、表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)新的食蟲芋螺特有的毒素序列。迄今為 止，國外己構(gòu)建了多種芋螺的cDNA文庫，中國南海信號(hào)芋螺是一種食蟲性芋 螺，世界上尚沒有關(guān)于它的毒素研究的報(bào)道。另外，目前有關(guān)芋螺毒素的生化結(jié)構(gòu)及其神經(jīng)藥理活性的研究都是基于天然 提取毒素的分子結(jié)構(gòu)，用人工合成的毒素來研究的。雖然已克隆到很多芋螺毒素 基因，但目前鮮有芋螺毒素基因體外表達(dá)的報(bào)道。重組芋螺毒素將以其質(zhì)優(yōu)、價(jià) 廉的優(yōu)勢，代替產(chǎn)率低、成本昂貴的人工合成毒素。開展芋螺毒素體外表達(dá)技術(shù) 的研究，將具有非常重要的理論研究價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種具有新的半胱氨酸骨架的中國南海信號(hào)芋螺毒 素基因Ltl5.1及其編碼的多肽片段ltl5a。本發(fā)明的另一目的在于提供該多肽的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供了用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)考察了該多肽對大鼠 DRG細(xì)胞鈉電流的抑制作用，從而為制備神經(jīng)生物學(xué)研究的工具藥和治療心律失 常、頑痛、癲癇以及中風(fēng)等疾病藥物提供數(shù)據(jù)。通過cDNA文庫的構(gòu)建和測序的方法，從中國南海信號(hào)芋螺毒管中分離得 到具有新的半胱氨酸骨架的芋螺毒素Ltl5.1基因，其DNA序列如序列表中〈4001序列所示。上述本發(fā)明基因所編碼的多肽M5a，其氨基酸序列如序列表中<400> 2序列 所示；其成熟肽的分子量為4，266.8道爾頓，其理論等電點(diǎn)為6.79。該蛋白通過原核細(xì)胞融合表達(dá)載體pTRX在大腸桿菌中以胞內(nèi)可溶的形式 表達(dá)。所述表達(dá)載體pTRX (我實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建并申請專利，專利名稱為 一種高 效原核表達(dá)載體，專利申請?zhí)朲L00 1 24832.4)是以硫氧還蛋白為融合伴體， 中間插入His的親和標(biāo)記位點(diǎn)及蛋白酶3C識(shí)別位點(diǎn)的高效表達(dá)載體。該重組信號(hào)芋螺毒素ltl5a能增加鈉通道電流的開放時(shí)間，同時(shí)降低鈉電流 峰值。本發(fā)明所選擇的信號(hào)芋螺采自海南省三亞市。信號(hào)芋螺毒管cDNA文庫的構(gòu)建取活螺體，使用喉閘破碎螺殼，暴露出
螺肉，冰上小心并快速分離毒管組織，提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄為一鏈cDNA后合 成雙鏈cDNA，雙鏈cDNA與pMD18T載體連接后轉(zhuǎn)化五co//,并保存每個(gè)重組 克隆。本發(fā)明通過對文庫重組克隆大規(guī)模序列測定，從中得到了 1個(gè)新的編碼芋螺毒素的克隆，命名為Ltl5.1 (其DNA序列如序列表中〈40Ol序列所示)。新基因編碼86個(gè)氨基酸殘基，包括有23個(gè)氨基酸的信號(hào)肽、26個(gè)氨基酸的前導(dǎo)肽和37個(gè)氨基酸的成熟肽。其信號(hào)肽序列和成熟肽的半胱氨酸排布與O-超家族芋螺毒素其它成員具有較高的保守性。前導(dǎo)肽和成熟肽的氨基酸與S-家族芋螺毒素成員相似性更高。成熟肽段分子量為4,266.8道爾頓，其理論等電點(diǎn)為6.79。 本發(fā)明通過設(shè)計(jì)了一對引物，將編碼新毒素ltl5a的成熟肽基因克隆到原核融合表達(dá)載體pTRX上(本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建)，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。此表達(dá)載體(pTRX-lt15.1)以T7為啟動(dòng)子，TRX為分子融合伴體，幫助重組蛋白正確折疊，以可溶的形式表達(dá)，TRX的C端有柔鏈區(qū)和6XHis結(jié)構(gòu)，便于利用固定化金屬配體親和層析進(jìn)行純化。所設(shè)計(jì)的上游引物含有蛋白酶3C位點(diǎn)，利于外源蛋白單體的獲得。通過對培養(yǎng)時(shí)間，誘導(dǎo)時(shí)間，溫度等條件的摸索和優(yōu)化，TRX-ltl5.1融合蛋白的表達(dá)量較高，絕大部分處于可溶狀態(tài)。電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，重組線紋芋螺毒素1U5a能增加鈉通道電流的開放時(shí)間，同時(shí)降低鈉電流峰值，可作為探針用于離子通道類型及亞型的分類鑒定或者用于工具藥的研究開發(fā)，用于制備神經(jīng)生物學(xué)研究的工具藥和治療心律失常、頑痛、癲癇以及中風(fēng)等疾病的藥物。本發(fā)明的表達(dá)質(zhì)粒復(fù)制方法參照Sambrook(Sambrook, et al.1989, Molecularcloing. Cold Spring Harbor Labroratory Press. USA)方法，用CaCl2的方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.co//. DH5邙或BL21 (DE3)菌株，用含氨節(jié)青霉素U00、g/mL)的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)化菌株，堿法提取質(zhì)粒。
圖1為信號(hào)芋螺毒素Itl5a與MEKL家族的序列比對 圖2為信號(hào)芋螺毒素ltl5a與桶形芋螺和瘦弱芋螺毒管Btl5a和Ecl5a的前 體肽序列比對圖3為PCR擴(kuò)增U15.1基因2%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。1:擴(kuò)增到的Ltl5.1基因；2:擴(kuò)增的Btl5.1; 3:擴(kuò)增的Ecl5.1; 4: DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖4為融合表達(dá)質(zhì)粒pTRX-Lt15.1的構(gòu)建流程示意圖。 圖5為以T7啟動(dòng)子為引物對pTRX-Lt15.1重組表達(dá)載體進(jìn)行序列測定 圖6為融和蛋白pTRX-lt15.1鎳金屬離子親和層析各組分的SDS-PAGE分析 1: TRX-ltl5a全蛋白；2: TRX-ltl5a可溶上清；3: Ni2+親和層析穿透峰；4: 20mM咪唑洗脫峰；5: 50mM咪唑洗脫峰；6: 100mM咪唑洗脫峰；7:150mM咪挫洗脫峰圖7為重組蛋白ltl5a Sephadex G50分子篩層析圖譜1:峰l未切割的融合蛋白；2:峰2TRX;3:峰3重組芋螺毒素ltl5a; 4:峰4DTT和酶切緩沖液等成分圖8為重組蛋白1U5a Sephadex G50分子篩各組分Tricine SDS-PAGE電泳結(jié)果1: G50的峰2組分(TRX); 2: G50的峰3組分(ltl5a) 3: G50的峰4組分 (DTT和酶切緩沖液)4: 3C酶切融合蛋白TRX-ltl5a結(jié)果；5: G50的峰3組分 (ltl5a); 6:分子量標(biāo)準(zhǔn)圖9為重組蛋白ltl5a電噴霧質(zhì)譜鑒定結(jié)果 圖10為重組蛋白ltl5a對DRG細(xì)胞鈉峰值電流-電壓關(guān)系的影響 用藥前，用藥5min， 10min， 15min四個(gè)時(shí)間的I/V曲線疊加比較 圖11芋螺毒素ltl5a作用前后鈉離子通道最大開放曲線單指數(shù)參數(shù)和繪制的 擬合曲線具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何 形式限制本發(fā)明。實(shí)施例1:信號(hào)芋螺毒管CDNA文庫的構(gòu)建和鑒定總RNA的提取和cDNA合成分離中國南海信號(hào)芋螺毒管，參照Gibco BRL 公司的TRIZOL LS試劑說明書進(jìn)行毒管總RNA提取。取1 p g信號(hào)芋螺毒管總RNA 以 SMART IIIolignuclotide(5， -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3') 和 CDSIII/3' PCR引物(5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)3。N—iN-3')進(jìn)行逆 轉(zhuǎn)錄合成第一鏈，得到10ul cDNA第一鏈產(chǎn)物。信號(hào)芋螺毒管cDNA文庫的構(gòu)建和鑒定取cDNA 1. 5、1用于連接反應(yīng)，轉(zhuǎn) 化后涂板。從平板中挑取單克隆保種并隨機(jī)挑取一定數(shù)目的單克隆進(jìn)行測序和生 物信息學(xué)分析。實(shí)施例2:信號(hào)芋螺毒素Ltl5.1基因的序列分析南海信號(hào)芋螺神經(jīng)毒素基因Ltl5.1的質(zhì)粒和序列來自中國南海信號(hào)芋螺毒 管cDNA文庫中所克隆到EST序列，編碼Ltl5.1的EST序列共5條，占總EST 序列(576)的0.8%,在文庫中出現(xiàn)的頻率很低，估計(jì)對應(yīng)的天然蛋白含量相對 較低。Ltl5.1編碼一個(gè)86個(gè)氨基酸的前體肽(包括23aa的信號(hào)肽，26aa的前導(dǎo) 肽和37aa的成熟肽)，SignalP預(yù)測的信號(hào)肽部分與O超家族中MEKL家族具 有很高的同源性，伹是成熟肽部分與MEKL家族采用的-C-C-CC-C-C-半胱氨酸 骨架完全不同，(見圖1)是一種全新的尚未從其他芋螺毒素中發(fā)現(xiàn)的骨架 -C-C-CC-C-C-C-C-。我們將這個(gè)新半胱氨酸骨架命名為XV類骨架。把信號(hào)芋螺 毒素Ltl5.1與從桶形芋螺和瘦弱芋螺毒管克隆到的毒素Btl5a和Ecl5a的前體 肽序列比對，發(fā)現(xiàn)屬于同一種XV類骨架，具有高度同源性。(見圖2)實(shí)施例3:重組信號(hào)芋螺毒素Ltl5.1表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)Ltl5.1基因編碼成熟蛋白的氨基酸序列和大腸桿菌的密碼子偏好性，設(shè) 計(jì)并合成PCR反應(yīng)的模板，并結(jié)合pTRX質(zhì)粒(我實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建并申請專利， 專利名稱為 一種高效原核表達(dá)載體，專利申請?zhí)朲L00 1 24832.4)的多克隆 位點(diǎn)，設(shè)計(jì)Ltl5.1基因片段的擴(kuò)增引物，如下所示。在上游引物中引入/^"I酶 切位點(diǎn)以及ProScissionProtease切割位點(diǎn)，下游引物中引入AWI酶切位點(diǎn)及雙 終止密碼子。PCR產(chǎn)物經(jīng)A:/7"I和iVWl酶切與pTRX載體相連后，TRX基因、6個(gè) 組氨酸序列、蛋白酶PreScissionProtease識(shí)別位點(diǎn)序列、Ltl5.1基因編碼成熟蛋白的核苷酸序列和終止子TTATAA融合在一起，并構(gòu)成一個(gè)完整的讀碼框。TRX-Ltl5.1(3C) upper primers'〇00^014￡￡￡!^^11￡1211￡￡^202￡￡￡ ^錢誕1 ^飄鵬 11疆￡' 3'I Precision Protease site Ltl5.1 TRX-Ltl5.1(3C) lower primer:5'ATTT GCGGCCGC TTA TTA繊tgTTAg蟲ltfmT嵐CfiA艦CTO 3， 胸I stopcodon Ltl5.1
以文庫中含Ltl5.1的pcDNA3質(zhì)粒為DNA模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增出的片段(含限 制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)和蛋白酶PreScission Protease識(shí)別序列)約為150bp，與預(yù)期 PCR產(chǎn)物大小一致。(見圖3)擴(kuò)增產(chǎn)物用A:;mI和iVwI酶切后，克隆進(jìn)線性載體 pTRX，構(gòu)建融合表達(dá)質(zhì)粒pTRX-Lt15.1。(構(gòu)建過程見圖4)。對重組質(zhì)粒進(jìn)行 雙向測序，其序列與合成的模板序列結(jié)果完全一致，說明合成的引物與PCR擴(kuò)增 的Ltl5.1基因無誤，插入表達(dá)載體的Ltl5.1基因的讀碼框正確。(見圖5)實(shí)施例4:重組信號(hào)芋螺毒素Ltl5.1的表達(dá)將pTRX-Ltl5.1轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.co".BL21 (DE3)。用CaCl2法制各大腸桿 菌E.co/z'.BL21(DE3)的感受態(tài)，在40ul大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中加入lul提取的 pTRX- Ltl5. 1質(zhì)粒DNA，混勻冰浴1小時(shí)，42。C熱擊卯秒，加入lml SOC溶 液復(fù)蘇后涂到含有100ug/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37i:培養(yǎng)12小時(shí)， 當(dāng)長出菌落后挑取單菌，進(jìn)行檢測。構(gòu)建好的基因工程菌超聲裂解上清液經(jīng) SDS-PAGE電泳分析表明，菌體經(jīng)0.1mmol/L IPTG， 19。C低溫誘導(dǎo)后有明顯的 特異表達(dá)產(chǎn)物帶，分子量與軟件預(yù)測的理論值18kD相符(見圖6)。實(shí)施例5:重組信號(hào)芋螺毒素TRX-Ltl5.1的純化將誘導(dǎo)表達(dá)后的培養(yǎng)菌液在4°C ， 6,000rpm/min離心5分鐘，菌體先用TE 緩沖液(pH8.0)重懸，離心，再用預(yù)冷的50mmol/LTris-HCl(pH8.0), 50Ommol/L NaCl溶液洗滌菌體，超聲處理后，裂解上清液經(jīng)Ni2+Chelating Sepharose親和色 譜層析一步純化。收集穿流峰，分別用不同濃度咪唑(20mmol/L 、 50mmol/L 、 150mmol/L)的50mM Tris (pH8.0) ， 500mmol/L NaCl緩沖液洗脫至平臺(tái)期， 分別收集洗脫峰進(jìn)行Tricine SDS-PAGE檢測。結(jié)果表明，重組TRX-Ltl5.1蛋 白主要集中于50-100mmol/L的咪唑洗脫峰中，在10Ommol/L咪唑洗脫峰中融 合蛋白的含量達(dá)70%以上(見圖6)。實(shí)施例6:重組信號(hào)芋螺毒素Ltl5.1酶切后純化通過N嚴(yán)Chelating Sepharose Fast Flow親和層析所得到的純化的融合蛋白， 進(jìn)行3C酶酶切。酶切條件為50mmol/L Tris-HCl， 150mmol/L NaCl， lmmol/L EDTA， lmmol/L DTT (pH8.0)酶切緩沖液中20'C酶切作用3hr。 融合蛋白酶切后ltl5a分子量為4.4KD左右，而伴體蛋白TRX的分子量為 13.8KD,沒有切開的融和蛋白的分子量為18KD左右，三種蛋白的分子量差別較 大，因此可采用分子篩效應(yīng)根據(jù)蛋白分子量的大小將蛋白分開，得到純化的目的 蛋白。SepharoseG50分子篩的分離范圍為1.5kD-30kD， 因此我們采用Sepharose G50純化酶切后的目的蛋白。Sepharose G50分子篩用50mM NH4CC^平衡，融合蛋白酶切后直接上樣到G50， 5cmxl00cm的XK50柱上樣50毫升，流速2.5ml/min。設(shè)定自動(dòng)收集程序， 收集各蛋白紫外吸收峰，取樣進(jìn)行18XSDS-PAGE電泳檢測。G50分子篩層析圖 譜見圖7， Tricine SDS—PAGE電泳結(jié)果見圖8。電泳結(jié)果顯示G50分子篩層析的 第二個(gè)峰是酶切下來的TRX伴體，第三個(gè)峰為目的蛋白ltl5a實(shí)施例7:電噴霧質(zhì)譜重組rltl5a分子量和純度質(zhì)譜圖見圖9根據(jù)公式Ml-(M+n)/n M2=(M+n+l)/(n+l)(其中M1， M2為相鄰兩個(gè)質(zhì)譜峰的荷質(zhì)比值)取前兩個(gè)峰和后兩個(gè)峰分別得到的分子量為4412.4和4412.7，與重組蛋白 rltl5a的計(jì)算分子量4413.0相一致，說明純化到的蛋白確實(shí)是ritl5a。荷質(zhì)比為883.7， 1104.1， 1471.9的三個(gè)峰是分別帶5 + ， 4+， 3+價(jià)的完整蛋白分子離子，說明純 化得到的重組rltl5a純度很高，不含其他雜質(zhì)分子。實(shí)施例8:重組信號(hào)芋螺毒素ltl5a對鈉離子通道的作用選用細(xì)胞表面光滑的大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞電流膜片鉗實(shí) 驗(yàn)。對照組和實(shí)驗(yàn)組分別記錄的是使用4pM毒素前后在梯度去極化條件下的全 細(xì)胞鈉電流。細(xì)胞鉗制電壓為一70mV，刺激電壓為一80mV到+ 30mV，步階為 10mV，刺激電壓脈沖寬度為150mS。由I/V曲線可見(見圖10)，在3個(gè)時(shí)間點(diǎn) 記錄的電流電壓關(guān)系與用藥前相比1)電流的激活電壓都是一40mV沒變，但 是最大電流的電壓發(fā)生了變化，對照和用藥5分鐘均在一20mV達(dá)到最大值，而 用藥IO、 15分鐘最大電流在一10mV才達(dá)到；2)在一20mV的電壓下，峰值電 流隨時(shí)間的延長減少，由最初的2460pA減少到688pA。 3)電流的翻轉(zhuǎn)電位發(fā) 生了改變，對照組與用藥5分鐘在30mV的電壓下還沒有翻轉(zhuǎn)過來，用藥10分 鐘翻轉(zhuǎn)電位為25mV,用藥15分鐘變?yōu)榱?15mV，翻轉(zhuǎn)電位的變化趨勢是變小。 擬合曲線如圖ll。結(jié)果顯示ltl5a能增加鈉通電流的開放時(shí)間，同時(shí)降低鈉峰值電流。
序歹U表<110>中山大學(xué)<120>—種新的信號(hào)芋螺毒素序列、制備方法及其應(yīng)用<160>3<210>1<211>258<212>DNA<213>中國南信號(hào)芋螺(Conus /故eraras)<400>1atg gag aaa ctt aca atc ctg att ctt gtt gcc act gtc ctg ttg 45 Met Glu Lys Leu Thr lie Leu lie Leu Val Ala Thr Val Leu Leu 15 10 15gcg atc cag gtc ctg gtt caa agt gac gga gaa aac cct gtg aag 90 Ala lie Gin Val Leu Val Gin Ser Asp Gly Glu Asn Pro Val Lys20 25 30ggg agg gtc aaa cac tat gca gcg aaa cgt ttc teg gca etc ttc 135 Gly Arg Val Lys His Tyr Ala Ala Lys Arg Phe Ser Ala Leu Phe35 40 45aga ggg cca cgc gaa tgc aca act aag cat egg cgt tgt gaa aag 180 Arg Gly Pro Arg Glu Cys Thr Thr Lys His Arg Arg Cys Glu Lys50 55 60gat gag gaa tgt tgc cca aat ctt gag tgt aaa tgc tta acc agt 225 Asp Glu Glu Cys Cys Pro Asn Leu Glu Cys Lys Cys Leu Thr Ser65 70 75cct gat tgc cag tct ggt tat aaa tgt aaa cct 258 Pro Asp Cys Gin Ser Gly Tyr Lys Cys Lys Pro80 85<210>2<211>86<212>PRT<213>中國南海信號(hào)芋螺(Conus toferafws)<220><221>precursor peptide<222>(1)".(86) <400>2Met Glu Lys Leu Thr lie Leu lie Leu Val Ala Thr Val Leu Leu 15 10 15Ala lie Gin Val Leu Val Gin Ser Asp Gly Glu Asn Pro Val Lys20 25 30Gly Arg Val Lys His Tyr Ala Ala Lys Arg Phe Ser Ala Leu Phe35 40 45Arg Gly Pro Arg Glu Cys Thr Thr Lys His Arg Arg Cys Glu Lys50 55 60Asp Glu Glu Cys Cys Pro Asn Leu Glu Cys Lys Cys Leu Thr Ser65 70 75Pro Asp Cys Gin Ser Gly Tyr Lys Cys Lys Pro80 85<210>3<211>37<212>PRT<213>中國南海信號(hào)芋螺(Conus /故eraftw) <220><221>成熟肽 <222>(1)...(37)<400>3Glu Cys Thr Thr Lys His Arg Arg Cys Glu Lys Asp Glu Glu Cys 15 10 15Cys Pro Asn Leu Glu Cys Lys Cys Leu Thr Ser Pro Asp'Cys Gin20 25 30Ser Gly Tyr Lys Cys Lys Pro3權(quán)利要求
1、從中國南海信號(hào)芋螺毒管中分離得到的核苷酸序列，其核苷酸序列如序列表中<400>1序列所示。
2、 一種多肽，其含有權(quán)利要求1所述基因編碼的氨基酸序列、或其保守性變異 多肽序列或其活性衍生物。
3、 按權(quán)利要求2所述的多肽，其特征在于該多肽的氨基酸序列如序列表400<2> 所示。
4、 權(quán)利要求3所述的多肽的成熟肽片段，其氨基酸序列如序列表4WK3〉所示。
5、 權(quán)利要求4所述的多肽的生產(chǎn)方法，按照以下步驟進(jìn)行-(1) 將編碼權(quán)利要求4所述的成熟肽基因克隆到原核融合表達(dá)載體pTRX 上，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3);(2) 培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌BL21(DE3);(3) 對大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行超聲裂解，將表達(dá)產(chǎn)物的裂解液經(jīng)Ni2+ Chelating Sepharose親和色譜層析，得到融合蛋白；(4) 融合蛋白經(jīng)3C蛋白酶切割、離子交換層析和反相高效液相層析，得 到重組Ltl5.1多肽的成熟肽。
6、 權(quán)利要求2、 3、或4所述多肽用于離子通道類型的檢測和神經(jīng)生物學(xué)工具藥 物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的信號(hào)芋螺毒素序列、制備方法及其應(yīng)用。從中國南海信號(hào)
文檔編號(hào)C07K14/435GK101130775SQ20071002885
公開日2008年2月27日 申請日期2007年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月27日
發(fā)明者任政華, 劉君梁, 周茂軍, 孫丹丹, 徐安龍, 曾夏蕓, 磊 王, 蔣秀華 申請人:中山大學(xué)