專利名稱：：明膠多重改性衍生物及其交聯(lián)材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及化合物明膠，尤其涉及明膠多重改性衍生物此外，本發(fā)明還涉及該明膠多重改性衍生物的交聯(lián)材料。
背景技術(shù)：
：明膠是膠原的變性衍生物，是一種含有18種人體不可缺少的氨基酸的蛋白質(zhì)a天然明膠通常通過(guò)酸法或堿法對(duì)動(dòng)物皮、骨、腱與韌帶等結(jié)締組織中的膠原進(jìn)行水解后分離提取制備。通常它可以分為A型和B型兩種通過(guò)酸法水解制備的明膠被稱為A型，具有較少的側(cè)鏈羧酸殘基和較高的等電點(diǎn)通過(guò)堿法水解制備的明膠被稱為B型，側(cè)鏈的大部分谷氨酰胺和天冬酰胺殘基都轉(zhuǎn)化為谷氨酸和天冬氨酸，因而側(cè)鏈具有較多的羧酸殘基，等電點(diǎn)較低。無(wú)論是酸法或堿法制備的天然明膠，通常都是一個(gè)復(fù)雜的混合物，含有多種不同分子量的多肽，其性質(zhì)因生產(chǎn)批次的不同而有一定的差異。明膠還可以通過(guò)基因重組工程來(lái)制備?；蛑亟M明膠具有精確的分子量、等電點(diǎn)、以及可以根據(jù)特定的應(yīng)用來(lái)設(shè)計(jì)明膠的分子結(jié)構(gòu)(Olsen等，AdvancedJkugDeliveryReviews,55,1547,2003)。明膠具有生物相容、生物降解、低免疫原性等許多優(yōu)異性能，因而在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的用途如明膠止血海綿、藥用明膠膠囊、明膠海綿傷口敷料以及新型藥物緩釋制劑和組織再生修復(fù)支架等等。然而明膠在體溫條件下可溶于水，因而對(duì)明膠進(jìn)行物理交聯(lián)和化學(xué)交聯(lián)以提高明膠的熱和機(jī)械穩(wěn)定性對(duì)于明膠的絕大多數(shù)生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用是必不可少的。脫氫熱處理和紫外線輻射是明膠物理交聯(lián)的常用方式，但是交聯(lián)效率較低且不可控?；瘜W(xué)交聯(lián)具有相對(duì)較高的效率。常見(jiàn)的明膠化學(xué)交聯(lián)劑包括甲醛、戊二醛、多官能團(tuán)環(huán)氧交聯(lián)劑、多官能團(tuán)異氰酸酯交聯(lián)劑、酰基疊氮化合物、碳化.:二亞胺等等(Kuijpers等,JournalofBio腿teria〗sScience:PolymerEdition,11,225,2000)。但是這些化學(xué)交聯(lián)劑通常具有較強(qiáng)的毒副作用，即使微量的化學(xué)交聯(lián)劑和交聯(lián)官能團(tuán)的殘留也可能導(dǎo)致嚴(yán)重的炎性反應(yīng)。因此當(dāng)前可供選擇的化學(xué)交聯(lián)方式在很大程度上制約了明膠在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。明膠的化學(xué)改性是提高明膠在生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用的一個(gè)重要途徑。這種途徑不僅可以使明膠具有一些重要的物理化學(xué)性能，同時(shí)還可能減少或者不使用有毒副作用的化學(xué)交聯(lián)劑制備明膠交聯(lián)材料。例如，Ma等人在JouraalofBio腿terialsScience:PoiymerEdition,13,67，2002中公開(kāi)了具有兩親性能的聚乳酸疏水改性明膠衍生物；VanDenBiilcke等人在Bioniacromolecuies,1,31,2000中公開(kāi)了甲基丙烯酰氨改性明膠衍生物，這些衍生物可以通過(guò)相對(duì)溫和的光引發(fā)自由基聚合制備出明膠交聯(lián)材料sMorikawa和ltetsuda等人在Jour腿iofBiomaterialsScience:Poiy姐erEdition,13,167,2002中公開(kāi)的N-異丙基丙烯酰氨接枝明膠衍生物具有溫度響應(yīng)凝膠化性能；Shu等人在Bio腿terials,24,3825,2003公開(kāi)的巰基化改性明膠衍生物可以通過(guò)溫和的二硫鍵方式或親核加成方式制備原位交聯(lián)材料。到目前為止，這些方法在制備明膠交聯(lián)材料時(shí)仍具有很多局限性。其中一個(gè)重要原因是明膠可供化學(xué)改性和交聯(lián)的主要官能團(tuán)(側(cè)鏈氨基或羧基)數(shù)量相當(dāng)有限。例如B型明膠的側(cè)鏈氨基和羧基分別約為28和118個(gè)/1000氨基酸殘基；A型明膠具有與B型明膠相近的側(cè)鏈氨基含量，但側(cè)鏈羧基的含量則要低得多(54個(gè)/1000氨基酸殘基)。因此很有必要進(jìn)--歩開(kāi)發(fā)新型化學(xué)改性和交聯(lián)的方法以進(jìn)一歩擴(kuò)展明膠在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的多種應(yīng)用前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)闥題之一是提供一類新穎的明膠多重改性衍生物。本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是提供--類新顆的明膠多重改性衍生物的交聯(lián)材料。本發(fā)明以明膠為原料，通過(guò)對(duì)明膠側(cè)鏈氨基的酰氨鍵疏水化改性、氨基的酰氨鍵羧基化改性以及羧基的巰基化改性制備了新穎的明膠多重改性衍生物。與明膠單一改性衍生物相比，本發(fā)明明膠多重改性衍生物具有許多優(yōu)異的性能，如可調(diào)節(jié)的側(cè)鏈分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)性能等等，將在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有許多重要的應(yīng)用。本發(fā)明明膠多重改性衍生物同時(shí)具有下述通式(！)結(jié)構(gòu)和至少下述通式(n)、aii)和(iv)中的一種結(jié)構(gòu)。其中G是指明膠殘基，包括A型明膠殘基、B型明膠殘基、基因重組明膠殘基等:R,是亞烷基或含有一個(gè)酰氨鍵的連接基團(tuán)fe是指烷基或芳香基；Ra是亞烷基或取代亞烷基R4是羧基或羧基鹽。其中R'和R"是亞嫁基、取代亞烷基、芳香基或聚醚基；上述的亞烷基是指-(CH丄-(n是i~15的整數(shù))。優(yōu)選n是1*8的整數(shù)。上述取代亞烷基是指至少一個(gè)氫原子被烷基、羥基、氨基、烷氧基、苯基、酯基等基團(tuán)取代的亞烷基。上述芳香基是指芳香族的苯基、萘基等。優(yōu)選苯基。上述聚醚基是指-[(C冊(cè)),0],-，其中R是烷基，n是l10的整數(shù)，m是"500的整數(shù)。優(yōu)選R為氫原子，fi分別等于2、3和4。上述烷基是指具有1~15個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的烷基。例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、新戊基、己基、庚基、辛基等等。優(yōu)選具有110個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的烷基，特別優(yōu)選甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、,基o上述烷氧基是指具有1~6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的烷氧基。例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、戊氧基、新戊氧基、己氧基等。優(yōu)選具有H個(gè)碳原子的支鏈或直鏈的烷氧基，特別優(yōu)選甲氧基和乙氧基o上述酯基是指-C(0)OR,其中R是上述低級(jí)烷基。優(yōu)選甲酯基、乙酯基、丙酯基和丁酯基。上述羧基是指-C00H;羧基鹽是指上述羧基被堿中和后的基團(tuán)，即-C00—A+，其中A'包括鈉離子、鉀離子、鋰離子、氨根離子等。優(yōu)選羧基、羧基鈉鹽或羧基鉀鹽。本發(fā)明明膠多重改性衍生物具有下列幾種代表性化學(xué)結(jié)構(gòu)通式上述含有一個(gè)酰氨鍵的連接基團(tuán)是指""R"N1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中G、R,、R"R3和R4的定義同前述。本發(fā)明明膠多重改性衍生物中R,、fe、R，和仏的優(yōu)選化學(xué)結(jié)構(gòu)如下-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>在上述通式(V)到(XI)的明膠多重改性衍生物都含有至少--個(gè)巰基。通式(v)、(VI)和(ni)為本發(fā)明明膠雙重改性衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式通式(VIII)、(IX)和(X)為本發(fā)明明膠三重改性衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式；通式(XI)為本發(fā)明明膠四重改性衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。本發(fā)明明膠多重改性衍生物的化學(xué)改性包括以下四種方式(A)明膠側(cè)鏈氨基的酰氨鍵疏水化改性；(B)明膠側(cè)鏈氨基的酰氨鍵羧基化改性；(C)明膠側(cè)鏈羧基的巰基化改性；(D)明膠側(cè)鏈氨基的酰氨鍵羧基化改性后的巰基化改性?；瘜W(xué)改性方式(A)，明膠側(cè)鏈氨基的酰氨鍵疏水化改性常用的方法如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中G和仏的定義同上述。具體的常用制備過(guò)程是將明膠溶于溫水配成水溶液(通常約為30攝氏度)，然后調(diào)節(jié)溶液的pH值為弱堿性(通常為8^10);此后加入酸酐，攪拌反應(yīng)一定時(shí)間，同時(shí)不斷加入適量的堿溶液(如氫氧化鈉)以保持反應(yīng)溶液為弱堿性；最后反應(yīng)溶液透析純化、冷凍干燥即可得到產(chǎn)物。所采用的酸酐包括醋酸酐、丙酸酐、丁酸酑、戊酸酐、己酸酐、庚酸酸酐、辛酸酑等等?；瘜W(xué)改性方式(B)，明膠側(cè)鏈氨基的酰氨鍵羧基化改性常用的方法如下所示-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中G和l3的定義同上述。具體的常用制備過(guò)程是將明膠溶于溫水配成水溶液(通常約為30攝氏度)，然后調(diào)節(jié)溶液的pH值為弱堿性(通常為8~10):此后加入二酸酸酐，攪拌反應(yīng)一定時(shí)間，同時(shí)不斷加入適量的堿溶液(如氫氧化鈉)以保持反應(yīng)溶液為弱堿性；最后反應(yīng)溶液透析純化、冷凍干燥即可得到產(chǎn)物。所采用的二酸酸酐包舌丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐、馬來(lái)酸酐、庚二酸酐、辛二酸酐等等。化學(xué)改性方式(C)和(D),對(duì)明膠側(cè)鏈羧基的巰基化改性(包括明膠側(cè)鏈氨基的酰氨鍵羧基化引入的羧基巰基化改性)采用酰肼/碳二亞胺的偶合化學(xué)方法(Shu等，Bio腿cromoiecules,3,1304,2002)。其基本原理是明膠的側(cè)鏈羧基(或明膠側(cè)鏈氨基的酰氨鍵羧基化引入的羧基)在碳二亞胺的活化"f生成活性中w體，然后二硫代二酰肼的截肼氨基親核進(jìn)攻活性中間體生成加成物，最后加成物的二硫鍵被還原成自由巰基，純化即可得到產(chǎn)物。其常用的方法如下所示-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中G和R,的定義同上述。具體的常用制備過(guò)程是將明膠或明膠酰氨鍵羧基化改性衍生物溶于溫水配成水溶液(通常約為30攝氏度)，然后調(diào)節(jié)溶液的pH值為弱酸性(通常為4.75);此后加入定量的二硫代二酰肼，攪拌溶解后再加入定量的卜乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，同時(shí)不斷加入適量的酸溶液(如鹽酸)以保持反應(yīng)溶液pH值為475;最后在弱堿性條件下(通常沐值為8~10)加入羥基硫醇、二硫蘇糖醇或硼氫化鈉等還原劑將二硫鍵還原成自由巰基，在酸性條件下透析純化除去雜質(zhì)、冷凍干燥即可得到產(chǎn)物?；瘜W(xué)改性方式(C)和(D),對(duì)明膠側(cè)鏈羧基(或明膠側(cè)鏈氨基的酰氨鍵羧基化引入的羧基)的巰基化改性，所采用的常見(jiàn)代表性二硫代二酰肼包括Shu等人在Biofflacrotnoiecuies，3,1304,2002中公開(kāi)的二硫代二丙酸二酰肼(簡(jiǎn)稱DTP朋)和二硫代二丁酸二酰肼(簡(jiǎn)稱DTBDH),以及本申請(qǐng)人在發(fā)明專利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)?200610118715.2,發(fā)明名稱二酰胼化合物及其制備方法和用途)中公開(kāi)的新型二酰肼化合物包括二硫代二丙酸雙酰甘氨酸二酰肼(簡(jiǎn)稱DGDTPDH)、二硫代二丙酸雙酰丙氨酸二酰肼(簡(jiǎn)稱DADTP啦、二硫代二丙酸雙酰(羥基)氨基乙酸二酰肼(簡(jiǎn)稱DHADTPDH)、二硫代二丙酸雙酰氨基丙酸二酰肼(簡(jiǎn)稱DPDTPM)、二硫代二丙酸雙酰氨基丁酸二酰肼(簡(jiǎn)稱郎DTPDH)、雙丙二酸雙截胱胺二酰肼(簡(jiǎn)稱DPCDH)、雙琥珀酸雙酰胱胺二酰肼(簡(jiǎn)稱DSCDH)、雙(甲基)丁二酸雙酰胱胺二酰肼(簡(jiǎn)稱DMPC朋)、雙戊二酸雙酰胱胺二酰肼(簡(jiǎn)稱DGC冊(cè))、雙己二酸雙酰胱胺二酰肼(簡(jiǎn)稱DACDH)等等。這些代表性二硫代二酰肼的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下所示-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>雙琥銷酸雙st^t膚二絲WW*t閎稱依CBHJ雙《甲基1丁二酸雙tt胱w鵬n膚二ft^(兩稱wffcwi;雙成二酸SUSMMS二贈(zèng)(簡(jiǎn)^DGC朋)雙&二酸雙iytsf二NHNH],(閎稱DAC加)甜述通式(V)代表的明膠多重改性衍生物包括化學(xué)改性方式u)明膠鑭鏈氨基的酰氨鍵疏水化改性和化學(xué)改性方式(c)明膠側(cè)鏈羧基的巰基化改性兩個(gè)過(guò)程。所采用的一般制備方法分為兩個(gè)歩驟U)將明膠溶于溫水配成水溶液(通常約為30攝氏度)，然后調(diào)節(jié)溶液的沐值為弱堿性(通常為8~40):此后加入酸酐，攪拌反應(yīng)--定時(shí)間，同時(shí)不斷加入適量的堿溶液(如氫氧化鈉》以保持反應(yīng)溶液為弱堿性；最后反應(yīng)溶液透析純化、冷凍千燥即可得到中間產(chǎn)物(2)將中間產(chǎn)物溶于溫水配成水溶液或直接采用未純化的中間產(chǎn)物溶液(通常約為30攝氏度)，調(diào)節(jié)溶液的沐值為弱酸性(通常為4.75);此后加入定量的二硫代二酰肼，攪拌溶解后再加入定量的1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，同時(shí)不斷加入適量的酸溶液(如鹽酸)以保持反應(yīng)溶液pH值為4.75;最后在弱堿性條件下(通常沐值為8~10)加入羥基硫醇、二硫蘇糖醇或硼氫化鈉等還原劑將二硫鍵還原成自由巰基，在酸性條件下透析純化除去雜質(zhì)、冷凍干燥即可得到本發(fā)明通式(V)代表的明膠多重改性衍生物。所采用的酸酐包括醋酸酐、丙酸酐、丁酸酐、戊酸酐、己酸酐、庚酸酐、辛酸酐等等，所采用的二硫代二酰肼如前所述。前述通式(VI)代表的明膠多重改性衍生物包括化學(xué)改性方式(B)明膠側(cè)鏈氨基的酰氨鍵羧基化改性和化學(xué)改性方式(C)明膠側(cè)鏈羧基的巰基化改性兩個(gè)過(guò)程。所采用的一般制備方法分為兩個(gè)歩驟(i)將明膠溶于溫水配成水溶液(通常約為30攝氏度)，調(diào)節(jié)溶液的01!值為弱酸性(通常為4.75):此后加入定量的二硫代二酰肼,攪拌溶解后再加入定量的1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，同時(shí)不斷加入適量的酸溶液(如鹽酸)以保持反應(yīng)溶液。11值為4.75;最后在弱堿性條件下(通常pH值為卜10)加入羥基硫醇、二硫蘇糖醇或硼氫化鈉等還原劑將二硫鍵還原成自由巰基，在酸性條件下透析純化除去雜質(zhì)、冷凍干燥即可得到中間產(chǎn)物；(2)在惰性氣體(如氮?dú)獾?保護(hù)下將中間產(chǎn)物溶于溫水配成水溶液然(通常約為30攝氏度)，調(diào)節(jié)溶液的pH值為弱堿性(通常為8~i0〉；此后加入二酸酸酐，攪拌反應(yīng)一定時(shí)間，同時(shí)不斷加入適量的堿溶液(如氫氧化鈉)以保持反應(yīng)溶液為弱堿性最后反應(yīng)溶液在酸性條件下透析純化、冷凍干燥即可得到本發(fā)明通式(VI)代表的明膠多重改性衍生物中間產(chǎn)物。所釆用的二酸酸酐包括丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐等等，所采用的二硫代二酰肼如前所述。甜述通式(VII)和(X)代表的明膠多重改性衍生物包括化學(xué)改性方式(B)明膠側(cè)鏈氨基的酰氨鍵羧基化改性、化學(xué)改性方式(C)明膠側(cè)鏈羧基的巰基化改性和化學(xué)改性方式(D)明膠側(cè)鏈氨基的酰氨鍵羧基化改性后的巰基化改性三個(gè)過(guò)程。所采用的—般制備方法基本相同，可分為兩個(gè)歩驟U)將明膠溶于溫水配成水溶液(通常約為30攝氏度)，調(diào)節(jié)溶液的pH值為弱堿性(通常為8~10);此后加入二酸酸酐，攪拌反應(yīng)一定時(shí)間，阿時(shí)不斷加入適量的堿溶液(如氫氧化鈉)以保持反應(yīng)溶液為弱堿性最后反應(yīng)溶液透析純化、冷凍干燥即可得到中間產(chǎn)物；(2)將中間產(chǎn)物溶于溫水配成水溶液或直接采用未純化的中間產(chǎn)物溶液(通常約為30攝氏度)，調(diào)節(jié)溶液的沖值為弱酸性(通常為4.75):此后加入定量的二硫代二酰肼，攪拌溶解后再加入定量的1-乙基_3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，同時(shí)不斷加入適量的酸溶液(如鹽酸)以保持反應(yīng)溶液沐值為4.75;最后在弱堿性條件下(通常pH值為810)加入羥基硫醇、二硫蘇糖醇或硼氫化鈉等還原劑將二硫鍵還原成自由巰基，在酸性條件下透析純化除去雜質(zhì)、冷凍干燥即可得到產(chǎn)物。如果反應(yīng)中1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽過(guò)量，全部羧基都被改性為巰基，產(chǎn)物即為本發(fā)明通式(VII)代表的明膠多重改性衍生物；如果反應(yīng)中1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽的使用量較少，部分羧基被改性為巰基，產(chǎn)物即為本發(fā)明通式(X)代表的明膠多重改性衍生物。所采用的二酸酸酐包括丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐等等，所采用的二硫代二酰肼如前所述。稱述通式(WII)代表的明膠多重改性衍生物的制備方法與上述通式(VI)代表的明膠多重改性衍生物的制備方法基本相同，只要在上述通式(VI)代表的明膠多重改性衍生物的制備歩驟(2)中同時(shí)加入酸酐和二酸酸酐即可。前述通式(IX)和(XI)代表的明膠多重改性衍生物的制備方法與上述通式(VII)和(x)代表的明膠多重改性衍生物的制備方法基本相同，只要在上述通式(vn)和(X)代表的明膠多重改性衍生物的制備歩驟(2)中同時(shí)加入酸酐和二酸酸酐即可。如果反應(yīng)中卜乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽過(guò)量，全部羧基都被改性為巰基，產(chǎn)物即為本發(fā)明通式(IX)代表的明膠多重改性衍生物;如果反應(yīng)中1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽的使用量較少，部分羧基被改性為巰基，產(chǎn)物即為本發(fā)明通式(5Q)代表的明膠多重改性衍生物。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明公開(kāi)的明膠多重改性衍生物具有靈活多變的化學(xué)結(jié)構(gòu)和多種性能。在本發(fā)明通式(v)、(vru)、(IX)和(Xi)代表的明膠多重改性衍生物中通過(guò)對(duì)明膠側(cè)鏈氨基的改性，引入了疏水基團(tuán)，提高了本發(fā)明明膠多重改性衍生物的疏水性能，改變了水溶液的性質(zhì)、促進(jìn)了疏水膠束的形成，提高了對(duì)疏水物質(zhì)(如藥物等)的增溶作用；同時(shí)通過(guò)對(duì)明膠側(cè)鏈羧基的巰基化改性，提供了活性的巰基，可以作為進(jìn)-歩化學(xué)改性的具有高度反應(yīng)活性的活性點(diǎn)(如可以和高度生物相容的交聯(lián)劑制備交聯(lián)材料等)。在本發(fā)明通式(V1)、(VII)、(VUI)、(IX)、(X)和(XI)代表的明膠多重改性衍生物中通過(guò)對(duì)明膠側(cè)鏈氨基的改性引入了額外的羧基，改變了水溶液的性質(zhì)、提高了本發(fā)明明膠多重改性衍生物的親水性能同時(shí)更為重要的是通過(guò)把氨基轉(zhuǎn)化為羧基，大大提高了可供進(jìn)一歩化學(xué)改性的羧基的含量(例如B型明膠的側(cè)鏈羧基含量可以增加多達(dá)24%,而A型明膠的側(cè)鏈羧基含量可以增加多達(dá)50%);此外這些羧基和明膠本身具有的羧基都可以進(jìn)行巰基化改性，提供了活性的巰基，可以作為進(jìn)-歩化學(xué)改性的具有高度反應(yīng)活性的活性點(diǎn)(如可以和高度生物相容的交聯(lián)劑制備交聯(lián)材料等)。本發(fā)明的新穎明膠多重改性衍生物至少具有一個(gè)側(cè)鏈自由巰基，可以在合適的條件下重新氧化形成二硫鍵。氧氣、低濃度過(guò)氧化氫、碘、鐵三價(jià)離子等中強(qiáng)度氧化劑均可使自由巰基形成二硫鍵，從而制備出明膠交聯(lián)材料。其一般制備方法是將本發(fā)明的明膠多重改性衍生物的水溶液在中性或弱堿性條件下用空氣氧化制備二硫鍵交聯(lián)材料或者在弱酸性或酸性條件下，用低濃度過(guò)氧化氫、鐵三價(jià)離子等更強(qiáng)的氧化劑氧化制備二硫鍵交聯(lián)材料。本發(fā)明明膠多重改性衍生物的交聯(lián)材料還可以通過(guò)本發(fā)明的明膠多重改性衍生物和巰基反應(yīng)活性交聯(lián)劑交聯(lián)制備。本發(fā)明采用的巰基反應(yīng)活性官能團(tuán)包括馬來(lái)酰亞胺、乙烯砜、a,e不飽和丙烯酸酯、a,&不飽和甲基丙烯酸酯、鹵代丙酸酯、鹵代丙酰胺、二硫代吡啶、N-羥基丁二酰亞胺活化酯等等。其中馬來(lái)酰亞胺、乙烯砜、碘代丙酸酷、碘代丙酰胺、二硫代吡啶等官能團(tuán)具有很高巰基反應(yīng)活性。這些反應(yīng)可以分為三類(1)琉基和活化不飽和雙鍵的加成反應(yīng)，屬于這類反應(yīng)的官能團(tuán)包括馬來(lái)酰亞胺、乙烯砜、a,0不飽和丙烯酸酯、a,0不飽和甲基丙烯酸酯等；(2)巰基和活化鹵代垸的取代反應(yīng)，屬于這類反應(yīng)的官能團(tuán)包括碘代丙酸酯、溴代丙酸酯、氯代丙酸酯、碘代丙酰胺、溴代丙酰胺、氯代丙酰胺、二硫代吡啶等；(3)最后一類是硫酯化反應(yīng)，這類反應(yīng)的官能團(tuán)包括各種羧酸的活化酯，如羥基丁二酰亞胺活化酯等等。以本發(fā)明通式(V)代表的明膠多重改性衍生物為例，巰基和這些官能團(tuán)的反應(yīng)方程式如下-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>N-輕基T-it亞梭法化敏IV5I1本發(fā)明采用的巰基反應(yīng)活性交聯(lián)劑至少含有兩個(gè)上述反應(yīng)官能團(tuán)的聚乙二醇(簡(jiǎn)稱PEG)的衍生物，如雙臂、三臂、四臂、A臂或更多臂的聚乙二醇衍生物，它們具有如下典型的化學(xué)結(jié)構(gòu)-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>■o—旭—&啦F廣PEG—0^ls^O—reG-F4。、'o、A"J三臂聚乙-醉疋聯(lián)刺W臂聚C^游充聯(lián)附F，F(xiàn)2、\\\啦PEG鵬鵬PEG歷OOO、艦一八臂聚乙Ji8l交聯(lián)射其中&、F2、F:，、F.i、Fs、FB、F7和&為前述巰基反應(yīng)活性官能團(tuán)如馬來(lái)酰亞胺、乙烯砜、(i，0不飽和丙烯酸酯、a,p不飽和甲基丙烯酸酯、鹵代丙酸酯、鹵代丙酰胺、二硫代吡啶或N-羥基丁二酰亞胺等等，它們可以具有全部相同、部分相同或全部不相同的化學(xué)結(jié)構(gòu);PEG是指分子量為100到1000000的具有CH3C貼重復(fù)單元的鏈段。以雙臂的聚乙二醇為例，本發(fā)明采用的常見(jiàn)交聯(lián)劑包括聚乙二醇二馬來(lái)酰亞胺、聚乙二醇二乙烯砜、聚乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇二(甲基)丙烯酰胺、聚乙二醇二鹵代丙酸酯、聚乙二醇二鹵代丙酰胺、聚乙二醇二二硫代妣啶、聚乙二醇二N-羥基丁二酰亞胺等?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)式如下所示聚2^醉二馬4USUE接■N~PEG~N'H聚&二酵二&雄弒聚&二醇二(甲基)丙蜂酸曲RM或,聚乙二醇二(甲4p丙埤SUfe艦.聚6二醉二通代丙酸肇M聚&-醇二由代丙《*\，/"-"-^&j聚&二醇J1^代必定聚Z^II二N-輕基T-敞亞梭本發(fā)明采用琉基反應(yīng)活性交聯(lián)劑交聯(lián)的新穎明膠多重改性衍生物的交聯(lián)材料的一般制備方法是將本發(fā)明的明膠多重改性衍生物制成水溶液或混合水溶液，調(diào)節(jié)溶液的PH值為中性，然后加入上述巰基反應(yīng)活性交聯(lián)劑的水溶液，混合均勻后室溫靜置片刻即形成凝膠，得到交聯(lián)材料。以上述雙臂聚乙二醇衍生物交聯(lián)劑和本發(fā)明通式(V)代表的明膠多重改性衍生物為例，所制備的交聯(lián)材料具有如下化學(xué)結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>與本發(fā)明通式(V)代表的明膠多重改性衍生物相似，本發(fā)明通式(VI)、(VII)、(VIII)、(DO、(X)和(XI)代表的明膠多重改性衍生物也至少含有一個(gè)巰基，也可以采用上述相同的交聯(lián)方式制備交聯(lián)材料。此外也可采用一種多臂聚乙二醇衍生物交聯(lián)劑共同交聯(lián)制備本發(fā)明明膠多重改性衍生物的交聯(lián)材料。另外也可以采用兩種或兩種以上聚乙二醇衍生物交聯(lián)劑(如雙臂聚乙二醇衍生物、三臂聚乙二醇衍生物交聯(lián)劑、四臂聚乙二醇衍生物交聯(lián)劑、八臂聚乙二醇衍生物交聯(lián)劑等等)來(lái)制備本發(fā)明明膠多重改性衍生物的交聯(lián)材料。也可以采用上述制備方法，同時(shí)采用兩種或兩種以上本發(fā)明明膠多重改性衍生物來(lái)制備明膠交聯(lián)材料本發(fā)明的有益效果是可以方便地制備出具有高度生物相容的明膠交聯(lián)材料，這些明膠交聯(lián)材料可以制成薄膜、海綿、凝膠等各種形態(tài)，可以用作細(xì)胞生長(zhǎng)基質(zhì)等等。附圖是本發(fā)明實(shí)施例l中乙酰化和巰基化明膠多重改性衍生物的氫原子核磁共振譜圖和重要化學(xué)位移峰的歸屬(W)為溶劑)。具體實(shí)施方式下面的實(shí)施例可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1乙酰化和巰基化明膠多重改性衍生物(本發(fā)明通式(V)代表的明膠多重改性衍生物，其中R,="C恥Hf,R2--CH3)的合成和表征U)明膠的乙?；男悦髂z(B型，來(lái)自牛皮，Sigma,突國(guó))i克溶解于100毫升蒸餾水中(約30攝氏度)，得到澄清透明溶液。用1.0摩爾/升的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值為約9.5,然后在電磁攪拌下加入(K05克醋酸酐(分析純)，不斷加入適量1.0摩爾/升的氫氧化鈉溶液，保持溶液的沐值在弱堿性(通常8.0~從5)。在約30攝氏度下攪拌反應(yīng)1小時(shí)。此后上述溶液裝入透析管(截除分子量3500，F(xiàn)isher,美國(guó))，用蒸餾水透析，每8小時(shí)換--次透析液；直至凝膠液相色譜(GPC)檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外210納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰。最后收集透析管內(nèi)的溶液，冷凍千燥得到白色絮狀蹈體(.乙?；髂z)約0.8克。(2)乙?；髂z的巰基化改性取上述乙?；髂z0.5克溶解于50毫升蒸餾水中(約30攝氏度)。在上述溶液中加入0.3克二硫代二丙酰肼(按照Shu等人在Bio腿cromolecules,3,1304,2002中公開(kāi)的方法制備)，攪拌溶解。然后溶液的胡值用0.1摩爾/升鹽酸調(diào)節(jié)至4.75，加入0.25克I-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(Aldrich,美節(jié)，電磁攪拌。在上述溶液中不斷加入適量0.1摩爾/升鹽酸，使溶液的pH值保持在4.75。電磁攪拌反應(yīng)2小時(shí)后，加入2.5克二硫蘇糖醇(DiagnosticChemicalLimited,類國(guó))和0.1摩爾/升的氫氧化鈉溶液，攪拌，調(diào)節(jié)溶液的pH值為8.5。此后室溫電磁攪拌反應(yīng)24小時(shí)后，在上述溶液中加入6摩爾/升的鹽酸直至pH值為約3.0。將上述溶液裝入透析管(截除分子量3500,Sig腿，美國(guó))，用10升0.001摩爾/升的鹽酸和0.3摩爾/升的氯化鈉溶液透析5天，每8小時(shí)換-*次透析液然后再用10升0.001摩爾/升的鹽酸溶液透析3天，每8小時(shí)換透析液，直至GPC檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外210納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰。最后收集透析管內(nèi)的溶液，冷凍干燥得到百色絮狀固體約0.35克。(3)乙?；蛶€基化明膠多重改性衍生物的表征乙酰化和巰基化明膠多重改性衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示(;rc檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外2io納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰，表明合成的乙酰化和巰基化明膠多重改性衍生物為高度純化，雜質(zhì)低于儀器檢測(cè)水平。來(lái)用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)試劑測(cè)定乙?；髂z的側(cè)鏈氨基，約37%的氨基被甲?；男?。采用Shu等人在8io腿cromolecules,3,1304,2002中報(bào)道的改進(jìn)Ell腿n方法檢測(cè)乙酰化和巰基化明膠多重改性衍生物的活性巰基含量0.5毫摩爾巰基/克。氫譜核磁共振檢測(cè)(H-湖R)(W)為溶劑)見(jiàn)閣1。實(shí)施例2己娥化和巰基化明膠多重改性衍生物(本發(fā)明通式(V)代表的明膠多重改性衍生物，其中R產(chǎn)"CftCHf,-CftCftCftCIWi,)的合成和表征(1)明膠的己?；男悦髂z(A型，來(lái)自豬皮，Sig腿，美國(guó))1克溶解于100毫升蒸餾水中(約30攝氏度>,得到澄清透明溶液。用1.0摩爾/升的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的PH值為約9.5,然后在電磁攪拌下加入0.1克戊酸酐(分析純)，不斷加入適量l.0摩爾/升的氫氧化鈉溶液，保持溶液的PH值在弱堿性(通常8.(Ka5)。在約30攝氏度下攪拌反應(yīng)1小時(shí)。此后上述溶液裝入透析管(截除分子量3500,Fisher，美國(guó))，用蒸餾水透析，每8小時(shí)換一次透析液；直至凝膠液相色譜(GPC)檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外210納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰。最后收集透析管內(nèi)的溶液，冷凍干燥得到白色絮狀圃體(己?；髂z)約O.S克。(2)己?；髂z的巰基化改性取上述己載化明膠0.5克溶解于50毫升蒸餾水中(約30攝氏度)。在上述溶液中加入0.3克二硫代二丙酰肼(按照Shu等人在Bio腿croraolecules,3，1304,2002中公開(kāi)的方法制備)，攪拌溶解。然后溶液的？1{值用0.1摩爾/升鹽酸調(diào)節(jié)至4.75,加入0.25克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(Aldrich,美節(jié)，電磁攪拌。在上述溶液中不斷加入適量0.1摩爾/升鹽酸，使溶液的pH值保持在4.75。電磁攪拌反應(yīng)2小時(shí)后，加入2.5克二硫蘇糖醇(DiagnosticCh棚icaiLiiUecl,美國(guó))和0.i摩爾/升的氨氧化鈉溶液，攪拌，調(diào)節(jié)溶液的pH值為8.5。此后室溫電磁攪拌反應(yīng)24小時(shí)后，在上述溶液中加入6摩爾/升的鹽酸直至pH值為約3.0。將上述溶液裝入透析管(截除分子量3500,Sig腿，美國(guó))，用10升0.001摩爾/升的鹽酸和0.3摩爾/升的氯化鈉溶液透析5天，每8小時(shí)換一次透析液；然后再用10升0.001摩爾/升的鹽酸溶液透析3天，每8小時(shí)換透析液，直至GPC檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外210納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰。最后收集透析管內(nèi)的溶液，冷凍干燥得到百色絮狀固體約0.37克。(3)己?；蛶€基化明膠多重改性衍生物的表征己?；蛶€基化明膠多重改性衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示-GPC檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外210納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰，表明合成的己酰化和巰基化明膠多重改性衍生物為高度純化，雜質(zhì)低于儀器檢測(cè)水甲采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TOBS)試劑測(cè)定己截化明膠的側(cè)鏈氨基，約33%的氨基被己酰化改性。采用Shu等人在Bio腿cromolecules,3,1304,2002中報(bào)道的改進(jìn)Ell腿n方法檢測(cè)甲?；蛶€基化明膠多重改性衍生物的活性巰基含量0.24毫摩爾巰基/克。氫譜核磁共振檢測(cè)CH-N朧)(W)為溶劑)結(jié)果如下-<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實(shí)施例3丁酰化和巰基化明膠多重改性衍生物(本發(fā)明通式(V)代表的明膠多重改性衍生物，其中R產(chǎn)一a^c^c^NHa^c^",R2=—c恥恥ft)的合成和表征(i)明膠的丁?；男悦髂z(B型，來(lái)自牛皮，Sig腿，美國(guó))1克溶解于100毫升蒸餾水中(約30攝氏度),得到澄清透明溶液。用1.0摩爾/升的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值為約9.5，然后在電磁攪拌下加入o.os克丁酸酐(分析純)，不斷加入適量1.0摩爾/升的氨氧化鈉溶液，保持溶液的pH值在弱堿性(通常8.5)。在約30攝氏度下攪拌反應(yīng)1小時(shí)。此后上述溶液裝入透析管(截除分子量3500,Fisher,美國(guó))，用蒸餾水透析，每8小時(shí)換一次透析液；直至凝膠液相色譜(GPC)檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外210納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰。最后收集透析管內(nèi)的溶液，冷凍千燥得到白色絮狀固體(丁酰化明膠)約0.75克。(2)丁酰化明膠的巰基化改性取上述丁?；髂z0.5克溶解于50毫升蒸餾水中(約30攝氏度)。在上述溶液中加入0.4克雙琥珀酸雙酰胱胺二酰肼(按照本申請(qǐng)人申請(qǐng)的發(fā)明專利(二酰肼化合物及其制備方法和用途，申請(qǐng)?zhí)?00610118715.2)中公開(kāi)的方法制備)，攪拌溶解。然后溶液的pH值用0.1摩爾/升鹽酸調(diào)節(jié)至4.75,加入0.25克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(Aidrich,美國(guó))，電磁攪拌。在上述溶液中不斷加入適量0.1摩爾/升鹽酸，使溶液的pH值保持在4.75。電磁攪拌反應(yīng)2小時(shí)后，加入3.0克二硫蘇糖醇(DiagnosticChemicalLimited,類國(guó))和0.1摩爾/升的氫氧化鈉溶液，攪拌，調(diào)節(jié)溶液的pH值為8.5。此后室溫電磁攪拌反應(yīng)24小時(shí)后，在上述溶液中加入6摩爾/升的鹽酸直至8值為約3.0。將上述溶液裝入透析管(截除分子量3500,31,,突國(guó))，用10升0.0(H摩爾/升的鹽酸和0.3摩爾/升的氯化鈉溶液透析5天，每8小時(shí)換—次透析液；然后再用10升0.001摩爾/升的鹽酸溶液透析3天，每8小時(shí)換透析液，直至GPC檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外210納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰。最后收集透析管內(nèi)的溶液，冷凍干燥得到百色絮狀固體約0.31克。(3)丁?；蛶€基化明膠多重改性衍生物的表征]'?；蛶€基化明膠多重改性衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>GPC檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外210納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰，表明合成的丁?；蛶€基化明膠多重改性衍生物為高度純化，雜質(zhì)低于儀器檢測(cè)水平。采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)試劑測(cè)定丁?；髂z的側(cè)鏈氨基，約3機(jī)的氨基被己?；男?。采用Shu等人在Bioraacromolecules,3,1304,2002中報(bào)道的改進(jìn)Ellman方法檢測(cè)丁酰化和巰基化明膠多重改性衍生物的活性巰基含量0.47毫摩爾巰基/克。氫譜核磁共振檢測(cè)('H-NMR)(W)為溶劑)的結(jié)果如下.-氫abcdefgS(ppn)~~2.552.553.382.552.11~~1.520.81實(shí)施例4乙酰化和巰基化明膠多重改性衍生物(本發(fā)明通式(V)代表的明膠多OII重改性衍生物，其中R產(chǎn)—C^WIKHCI^CH:r"，R產(chǎn)—CH3)的合成和表征(1)明膠的乙?；男悦髂z(A型，來(lái)自豬皮，Sigma,美國(guó))1克溶解于100毫升蒸餾水中(約30攝氏度),得到澄清透明溶液。用1.0摩爾/升的氧氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值為約9.5，然后在電磁攪拌下加入0.08克醋酸酐(分析純)，不斷加入適量1.0摩爾/升的氫氧化鈉溶液，保持溶液的pH值在弱堿性(通常8.0~9.5)。在約30攝氏度下攪拌反應(yīng)i小時(shí)。此后上述溶液裝入透析管(截除分子量3500，F(xiàn)isher,美國(guó))，用蒸餾水透析，每8小時(shí)換一次透析液；直至凝膠液相色譜(GPC)檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外210納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰。最后收集透析管內(nèi)的溶液，冷凍干燥得到白色絮狀固體(乙酰化明膠)約0.8克。(2)乙?；髂z的巰基化改性取上述乙?；髂z0.5克溶解于50毫升蒸餾水中(約30攝氏度)。在上述溶液中加入0.5克二硫代二丙酸雙酰甘氨酸二iW(按照本申請(qǐng)人申請(qǐng)的發(fā)明專利(二酰肼化合物及其制備方法和用途，申請(qǐng)?zhí)?00610U8715.2)中公開(kāi)的方法制備)，攪拌溶解。然后溶液的pH值用(U摩爾/升鹽酸調(diào)節(jié)至4.75,加入0.3克卜乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(AlcMch,類恥，電磁攪拌。在上述溶液中不斷加入適量(U摩爾/升鹽酸，使溶液的沐值保持在4.75。電磁攪拌反應(yīng)2小時(shí)后，加入3.0克二硫蘇糖醇(DiagnosticChemicaiUndted，美國(guó))和0.1摩爾/升的氫氧化鈉溶液，攪拌，調(diào)節(jié)溶液的pH值為8.5。此后室溫電磁攪拌反應(yīng)24小時(shí)后，在上述溶液中加入6摩爾/升的鹽酸直至pH值為約3.0。將上述溶液裝入透析管(截除分子量3500，Sig腿，突國(guó))，用10升0.001摩爾/升的鹽酸和0.3摩爾/升的氯化鈉溶液透析5天,每8小時(shí)換一次透析液:然后再用10升0.001摩爾/升的鹽酸溶液透析3天，每8小時(shí)換透析液，直至GPC檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外210納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰。最后收集透析管內(nèi)的溶液，冷凍干燥得到百色絮狀固體約0.3克'(3)乙酰化和巰基化明膠多重改性衍生物的表征乙?；蛶€基化明膠多重改性衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示:oGPC檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外210納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰，表明合成的乙?；蛶€基化明膠多重改性衍生物為高度純化，雜質(zhì)低于儀器檢測(cè)水平。采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)試劑測(cè)定乙?；髂z的側(cè)鏈氨基，約52%的氨基被乙?；男?。采用Shu等人在Bio腿cro鵬lecules,3,1304,2002中報(bào)道的改進(jìn)Eli腿n方法檢測(cè)甲酰化和巰基化明膠多重改性衍生物的活性巰基含量0.32毫摩爾巰基/克。氫譜核磁共振檢測(cè)('H-NMR)(IW)為溶劑)的結(jié)果如下-氫8bd2.573.892.68L84實(shí)施例5丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物(本發(fā)明通式(VI)代表的明膠多重改性衍生物，其中R產(chǎn)-C恥Hf,fe=-CftCH廠，R產(chǎn)-COOH)的合成和表征(1)明膠的巰基化改性明膠(B型，來(lái)自牛皮，Sig腿，美國(guó))2克溶解于200毫升蒸餾水中(約30攝氏度)。在上述溶液中加入1.2克二硫代二丙酸肼(按照Shu等人在Biomacromolecules,3,1304，2002中公開(kāi)的方法制備)，攪拌溶解。然后溶液的pH值用0.1摩爾/升鹽酸調(diào)節(jié)至4.75,加入0.5克卜乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(Aldrich,美國(guó))，電磁攪拌。在上述溶液中不斷加入適量0.1摩爾/升鹽酸，使溶液的pH值保持在4.75。電磁攪拌反應(yīng)2小時(shí)后,加入6克二硫蘇糖醇(DiagnosticChemicalLimited,類國(guó))和0.1摩爾/升的氫氧化鈉溶液，攪拌，調(diào)節(jié)溶液的pH值為8.5。此后室溫電磁攪拌反應(yīng)24小時(shí)后，在上述溶液中加入6摩爾/升的鹽酸直至pH值為約3.0。將上述溶液裝入透析管(截除分子量3500,Sigma,類國(guó))，用10升0.001摩爾/升的鹽酸和0.3摩爾/升的氯化鈉溶液透析5天，每8小時(shí)換一次透析液;然后再用10升0.001摩爾/升的鹽酸溶液透析3天，每8小時(shí)換透析液，直至GPC檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外210納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰。最后收集透析管內(nèi)的溶液，冷凍干燥得到百色絮狀固體(巰基化改性明膠)約1.3克。(2)巰基化改性明膠的丁二酰羧基化改性上述巰基化改性明膠在惰性氣體(氮?dú)?保護(hù)下1克溶解于IOO毫升蒸餾水中(約30攝氏度)，得到澄清透明溶液。用1.0摩爾/升的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值為約9.Q,然后在電磁攪拌下加入O.S克丁二酸酐(分析純)，不斷加入適量1.0摩爾/升的氫氧化鈉溶液，保持溶液的pH值在弱堿性(通常8.0^.5)。在約30攝氏度下攪拌反應(yīng)20分鐘。加入6摩爾/升的鹽酸，調(diào)節(jié)上述溶液的pH值為約3.0。將上述溶液裝入透析管(截除分子量3500,Sigma,類國(guó))，用10升0.001摩爾/升的鹽酸和0.3摩爾/升的氯化鈉溶液透析5天，每8小時(shí)換一次透析液；然后再用10升0.001摩爾/升的鹽酸溶液透析3天，每8小時(shí)換透析液，直至GPC檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外210納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰。最后收集透析管內(nèi)的溶液，冷凍干燥得到百色絮狀固體(丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物)約0.7克。(3)丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物的表征T二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示-(JPC檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外210納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰,表明合成的丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物為高度純化，雜質(zhì)低于儀器檢測(cè)水平。采用Shu等人在Bioraacromolecules,3，1304,2002中報(bào)道的改進(jìn)Ell蹈an方法檢測(cè)丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物的活性巰基含量0.31毫摩爾巰基/克。氫譜核磁共振檢測(cè)('H-N鼴)(D20為溶劑)的結(jié)果如下氫abcd6(,)"""2.562.692.452.51實(shí)施例6丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物(本發(fā)明通式(VID代表的明膠多重改性衍生物，其中R產(chǎn)-CH2CH2-,的合成和表征U)明膠的丁二酰羧基化改性明膠(B型，來(lái)自豬皮，Sig腿，美國(guó))l克溶解于WO毫升蒸餾水中(約30攝氏度),得到澄清透明溶液。用1.0摩爾/升的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值為約9.5,然后在電磁攪拌'F加入0.05克丁二酸酐(分析純)，不斷加入適量1.0摩爾/升的氫氧化鈉溶液，保持溶液的pH值在弱堿性(通常8.5)。在約30攝氏度下攪拌反應(yīng)1小時(shí)。此后上述溶液裝入透析管(截除分子量3500,Fisher,突國(guó))，用蒸餾水透析，每8小時(shí)換一次透析液直至凝膠液相色譜((:;PC)檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外2i0納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰。最后收集透析管內(nèi)的溶液，冷凍千燥得到白色絮狀固體(丁二酰羧基化明膠)約0.7克。(2)丁二酰羧基化明膠的巰基化改性取上述丁二酰羧基化明膠0.5克溶解于50毫升蒸餾水中(約30攝氏度)。在上述溶液中加入i.2克二硫代二丙酰肼(按照Shu等人在Bio腿CTO隨lecules,3,1304,2002中公開(kāi)的方法制備),攪拌溶解。然后溶液的pH值用(3.1摩爾/升鹽酸調(diào)節(jié)至4.75,加入0.75克]-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(Aldrich,美國(guó))，電磁攪拌。在上述溶液中不斷加入適量0.1摩爾/升鹽酸，使溶液的pH值保持在4.75。電磁攪拌反應(yīng)2小時(shí)后，加入5克二硫蘇糖醇(DiagnosticCh棚icalUmited,美國(guó))和O.1摩爾/升的氫氧化鈉溶液，攪拌，調(diào)節(jié)溶液的PH值為8.5。此后室溫電磁攪拌反應(yīng)24小時(shí)后，在上述溶液中加入6摩爾/升的鹽酸直至pH值為約3.0。將上述溶液裝入透析管(截除分子量3500,Si柳a,類國(guó))，用10升0.001摩爾/升的鹽酸和0.3摩爾/升的氯化鈉溶液透析5天，每8小時(shí)換一次透析液然后再用10升0.001摩爾/升的鹽酸溶液透析3天，每8小時(shí)換透析液，直至GPC檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外210納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰。最后收集透析管內(nèi)的溶液，冷凍干燥得到百色絮狀固體約0.33克。(3)丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物的表征丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示GPC檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外210納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰，表明合成的丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物為高度純化，雜質(zhì)低于儀器檢測(cè)水平。采用2,4,6-三硝基苯磺酸(T陋S)試劑測(cè)定丁二酰羧基化明膠的側(cè)鏈氨基，約45%的氨基被丁二酰羧基化改性。采用Shu等人在Biomacroraolecules,3,1304,2002中報(bào)道的改進(jìn)Eli腿n方法檢測(cè)丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物的活性巰基含量0.87毫摩爾巰基/克氫譜核磁共振檢測(cè)('H-NMR)(W)為溶劑)的結(jié)果如下:_氧abcdefS(,)"""2.382.39~~i71i~"2.692.562.69實(shí)施例7乙?；⒍《ｔ然蛶€基化明膠多重改性衍生物(本發(fā)明通式(VUi)代表的明膠多重改性衍生物，其中R產(chǎn)-CftCHf,R2=-R:,=-Otfft-,Ri》C00H)的合成和表征(1)明膠的巰基化改性明膠(B型，來(lái)自牛皮，Sigma,美國(guó))2克溶解于200毫升蒸餾水中(約30攝氏度)。在上述溶液中加入1.2克二硫代二丙酰肼(按照Ski等人在Bio腿cro啦lecules,3,1304,2002中公開(kāi)的方法制備)，攪拌溶解。然后溶液的沐值用0.1摩爾/升鹽酸調(diào)節(jié)至4.75，加入0.5克i-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(Aldrich,美國(guó))，電磁攪拌。在上述溶液中不斷加入適量0.1摩爾/升鹽酸，使溶液的pH值保持在4.75。電磁攪拌反應(yīng)2小時(shí)后,加入6克二硫蘇糖斷WagnosticChemicalLimited,類國(guó))和0.i摩爾/升的氫氧化鈉溶液，攪拌，調(diào)節(jié)溶液的pH值為8.5。此后室溫電磁攪拌反應(yīng)24小時(shí)后，在上述溶液中加入6摩爾/升的鹽酸直至pH值為約3.0。將上述溶液裝入透析管(截除分子量3500,Sigma,熒國(guó))，用10升0.001摩爾/升的鹽酸和0.3摩爾/升的氯化鈉溶液透析5天,每8小時(shí)換一次透析液:然后再用10升0.001摩爾/升的鹽酸溶液透析3天，每8小時(shí)換透析液，直至GPC檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外210納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰。最后收集透析管內(nèi)的溶液，冷凍干燥得到百色絮狀畫體(巰基化改性明膠)約1.3克。(2)巰基化改性明膠的乙?；投《ｔ然男詉:述巰基化改性明膠在惰性氣體(氮?dú)?保護(hù)下l克溶解于ioo毫升蒸餾水中(約30攝氏度)，得到澄清透明溶液。用1.0摩爾/升的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值為約9.(J,然后在電磁攪拌下加入0.5克丁二酸酐和0.15克醋酸酐(分析純)，不斷加入適量1.0摩爾/升的氨氧化鈉溶液，保持溶液的pH值在弱堿性(通常8.M.5)。在約30攝氏度F攪拌反應(yīng)20分鐘。加入6摩爾/升的鹽酸，調(diào)節(jié)上述溶液的pH值為約3.0。將上述溶液裝入透析管(截除分子量3500,Sigma,類閨)，用10升0.001摩爾/升的鹽酸和0.3摩爾/升的氯化鈉溶液透析5天，每8小時(shí)換一次透析液；然后再用10升0.OOi摩爾/升的鹽酸溶液透析3天,每8小時(shí)換透析液,直至GPC檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外210納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰。最后收集透析管內(nèi)的溶液，冷凍干燥得到百色絮狀固體(乙?；?、r二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物)約0.7克。(3)乙酰化、丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物的表征乙?；?、]'二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示-GPC檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外210納米吸收檢測(cè)〉均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰，表明合成的丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物為高度純化，雜質(zhì)低于儀器檢測(cè)水平。采用Shu等人在Bio鵬cromolecules，3,1304，2002中報(bào)道的改進(jìn)Ell腿n方法檢測(cè)丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物的活性巰基含量0.47毫摩爾巰基/古沈o氫譜核磁共振檢測(cè)('H-剛R)(D》為溶劑)的結(jié)果如下氫abcde3(p卿)2.562.692.452.511.83實(shí)施例8乙酰化、丁二酸羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物(本發(fā)明通式(IX)代表的明膠多重改性衍生物，其中R產(chǎn)-CH2Cft-,R產(chǎn)-CH:,,"CH2￡%-)的合成和表征U)明膠的乙?；男悦髂z(B型，來(lái)自豬皮，Sigma,類閨)2克溶解于100毫升蒸餾水中(約30攝氏度),得到澄清透明溶液。用1.0摩爾/升的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值為約9.5,然后在電磁攪拌下加入0.02克醋酸酐(分析純)，不斷加入適量1.0摩爾/升的氫氧化鈉溶液，保持溶液的pH值在弱堿性(通常8.0^.5)。在約30攝氏度下攪拌反應(yīng)1小時(shí)。此后上述溶液裝入透析管(截除分子量3500,Fisher,類國(guó))，用蒸餾水透析，每8小時(shí)換一次透析液；直至凝膠液相色譜(GPC)檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外210納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰。最后收集透析管內(nèi)的溶液，冷凍干燥得到白色絮狀畫體(乙?；髂z)約1,6克。(2)乙?；髂z的丁二截羧基化改性取上述乙?；髂z1克溶解于100毫升蒸餾水中(約30攝氏度)，得到澄清透明溶液。用1.0摩爾/升的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值為約9.5,然后在電磁攪拌下加入0.02克丁二酸酐(分析純)，不斷加入適量1.0摩爾/升的氫氧化鈉溶液，保持溶液的pH值在弱堿性(通常8.5)。在約30攝氏度下攪拌反應(yīng)i小時(shí)。此后上述溶液裝入透析管(截除分子量3500,Fisher，美國(guó))，用蒸餾水透析，每8小時(shí)換--次透析液；直至凝膠液相色譜(GPC)檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外2i0納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰。最后收集透析管內(nèi)的溶液，冷凍干燥得到白色絮狀國(guó)體(丁二酰羧基化乙酰化明膠)釣0.7克。(3)丁二酰羧基化和乙?；髂z的巰基化改性取上述丁二酰羧基化和乙?；髂z0.5克溶解于50毫升蒸餾水中(約30攝氏度〉。在七述溶液中加入1.2克二硫代二丙酰胼(按照Shu等人在Bi咖acro啦iecules,3,1304,2002中公開(kāi)的方法制備)，攪拌溶解。然后溶液的pH值用0.1摩爾/升鹽酸調(diào)節(jié)至4.75,加入0.75克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(Aldrich，美國(guó))，電磁攪拌。在上述溶液中不斷加入適量0.1摩爾/升鹽酸,使溶液的pH值保持在4.75。電磁攪拌反應(yīng)2小時(shí)后，加入5克二硫蘇糖醇(Diag恥sUeChemicalLkiiteti，類閨)和O.i摩爾/升的氣氧化鈉溶液，攪拌，調(diào)節(jié)溶液的沐值為8,5。此后室溫電磁攪拌反應(yīng)24小時(shí)后，在上述溶液中加入6摩爾/升的鹽酸直至pH值為約3.0。將上述溶液裝入透析管(截除分子量3500,Sigma,類閨)，用10升0.001摩爾/升的鹽酸和0.3摩爾/升的氯化鈉溶液透析5天，每8小時(shí)換一次透析液；然后再用10升0.001摩爾/升的鹽酸溶液透析3天，每8小時(shí)換透析液，直至GPC檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外2W納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰。最后收集透析管內(nèi)的溶液，冷凍千燥得到百色絮狀國(guó)體約0.33克。(4〉乙?；?、丁二酰羧基化、和巰基化明膠多重改性衍生物的表征乙?；?、T二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示，GPC檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外210納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰，表明合成的乙?；?、丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物為高度純化，雜質(zhì)低于儀器檢測(cè)水平。采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)試劑測(cè)定明膠的側(cè)鏈氨基約2線乙酰化、28%丁二酰羧基化。采用Shu等人在Bio腿cromoiecules,3，1304,2002中報(bào)道的改進(jìn)Eil腿n方法檢測(cè)乙?；⒍《ｔ然蛶€基化明膠多重改性衍生物的活性巰基含量0.64毫摩爾巰基/克。氫譜核磁共振檢測(cè)('H-剛R)(ftO為溶劑)的結(jié)果如下:_氣abcdefg5(ppra)"~~2.382.392.562.692.562.691.84實(shí)施例9丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物(本發(fā)明通式(X)代表的明膠多重改性衍生物，其中R產(chǎn)-CH2CH2-,R3=-C恥Hf)的合成和表征(1)明膠的丁二酰羧基化改性明膠(B型，來(lái)自豬皮，Sig腿，美國(guó))1克溶解于100毫升蒸餾水中(約30攝氏度),得到澄清透明溶液。用i.0摩爾/升的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值為約9.5，然后在電磁攪拌下加入0.05克丁二酸酐(分析純)，不斷加入適量1.0摩爾/升的氫氧化鈉溶液，保持溶液的pH值在弱堿性(通常8.04.5)。在約30攝氏度下攪拌反應(yīng)1小時(shí)。此后上述溶液裝入透析管(截除分子量3500,Pisher,突國(guó))，用蒸餾水透析，每8小時(shí)換—次透析液；直至凝膠液相色譜(GPC)檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外210納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰。最后收集透析管內(nèi)的溶液，冷凍千燥得到白色絮狀蹈體(丁二酰羧基化明膠)約0,7克。(2)丁二酰羧基化明膠的巰基化改性取上述丁二酰羧基化明膠0.5克溶解于50毫升蒸餾水中(約30攝氏度)。在上述溶液中加入0.3克二硫代二丙娥肼(按照Shu等人在Biomacromolecules,3,1304,2002中公開(kāi)的方法制備),攪拌溶解。然后溶液的pH值用0.1摩爾/升鹽酸調(diào)節(jié)至4.75,加入0.25克卜￡基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(Aldrich,爽國(guó))，電磁攪拌。在上述溶液中不斷加入適量0.1摩爾/升鹽酸，使溶液的pH值保持在4.75。電磁攪拌反應(yīng)2小時(shí)后，加入2.5克二硫蘇糖醇(DiagnosticChemicalLimited,美國(guó))和0.1摩爾/升的氫氧化鈉溶液，攪拌，調(diào)節(jié)溶液的pH值為8.5。此后室溫電磁攪拌反應(yīng)24小時(shí)后，在上述溶液中加入6摩爾/升的鹽酸直至pH值為約3.0。將上述溶液裝入透析管(截除分子量3500，Sigma,類國(guó))，用i0升0.OOi摩爾/升的鹽酸和0.3摩爾/升的氯化鈉溶液透析5天，每8小時(shí)換一次透析液然后再用10升0.001摩爾/升的鹽酸溶液透析3夭，每8小時(shí)換透析液，直至GPC檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外210納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰。最后收集透析管內(nèi)的溶液，冷凍干燥得到百色絮狀固體約0.33克。(3)丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物的表征丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示-GPC檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外210納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰，表明合成的丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物為高度純化，雜貭低于儀器檢測(cè)水平。采用2,4,6-三硝基苯磺酸(T腿S)試劑測(cè)定丁二酰羧基化明膠的側(cè)鏈氨基，約45%的氨基被丁二酰羧基化改性。采用Shu等人在Bio腿cro0ioiecules,3,1304，2002中報(bào)道的改進(jìn)Eli鵬n方法檢測(cè)丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物的活性巰基含量0.64毫摩爾巰基/克。煞譜核磁共振檢測(cè)('H-N腿)(ft0為溶劑)的結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>實(shí)施例W丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物(本發(fā)明通式(X)代表的明膠多重改性衍生物，其中R產(chǎn)—ca2CH2cHNHa^ca2—，cw^-)的合成和表征(1)明膠的丁二酰羧基化改性明膠(B型，來(lái)自豬皮，Sig腿，美國(guó))1克溶解于100毫升蒸餾水中(約30攝氏度),得到澄清透明溶液。用1.0摩爾/升的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值為約9.5,然后在電磁攪拌下加入0.05克丁二酸酐(分析純)，不斷加入適量LO摩爾/升的氫氧化鈉溶液，保持溶液的pH值在弱堿性(通常8.5)。在約30攝氏度下攪拌反應(yīng)1小時(shí)。此后上述溶液裝入透析管(截除分子量3500,Fister,美國(guó))，用蒸餾水透析，每8小時(shí)換—-次透析液；直至凝膠液相色譜(GPC)檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外210納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰。最后收集透析管內(nèi)的溶液，冷凍千燥得到白色絮狀畫體(丁二酰羧基化明膠)約0.7克。(2)丁二酰羧基化明膠的巰基化改性取上述丁二酰羧基化明膠0.5克溶解于50毫升蒸餾水中(約30攝氏度)。在上述溶液中加入0.5克雙琥珀酸雙酰胱胺二酰肼(按照本申請(qǐng)人申請(qǐng)的發(fā)明專利二酰肼化合物及其制備方法和用途(申請(qǐng)?zhí)?006H)U8715.2)中公開(kāi)的方法制備)，攪拌溶解。然后溶液的PH值用0.1摩爾/升鹽酸調(diào)節(jié)至4.75,加入0.25克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(Aldrich,類國(guó))，電磁攪拌。在上述溶液中不斷加入適量0.1摩爾/升鹽酸，使溶液的pH值保持在4.75。電磁攪拌反應(yīng)2小時(shí)后，加入3.0克二硫蘇糖醇(DiagnosticChendcaiLimited,美恥和0.1摩爾/升的氫氧化鈉溶液，攪拌，調(diào)節(jié)溶液的pH值為8.5。此后室溫電磁攪拌反應(yīng)24小時(shí)后，在上述溶液中加入6摩爾/升的鹽酸直至？11值為約3.()。將上述溶液裝入透析管(截除分子量3500,Sigma,類國(guó))，用10升0.腿摩爾/升的鹽酸和0.3摩爾/升的氣化鈉溶液透析5天,每8小時(shí)換一次透析液；然后再用10升0.0W摩爾/升的鹽酸溶液透析3天，每8小時(shí)換透析液，直至GPC檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外2i0納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰。最后收集透析管內(nèi)的溶液，冷凍干燥得到百色絮狀固體約0.33克。(3)丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物的表征T二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示:GPC檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外210納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰，表明合成的丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物為高度純化，雜虜?shù)陀趦x器檢測(cè)水平。采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TOBS)試劑測(cè)定丁二酰羧基化明膠的側(cè)鏈氨基，約45%的氨基被丁二酰羧基化改性。采用Shu等人在Bio腿cr咖olecules,3,1304,2002中報(bào)道的改進(jìn)Ell腿n方法檢測(cè)丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物的活性巰基含量-0.61毫摩爾巰基/克。氧譜核磁共振檢測(cè)('H-鵬)(WJ為溶劑)的結(jié)果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>實(shí)施例11丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物(本發(fā)明通式(XI)代表的明膠多重改性衍生物，其中R產(chǎn)-CHaCtir，R2="Cft,-CftCft-)的合成和表征(1)明膠的乙?；男悦髂z(B型，來(lái)自豬皮，Sig腿，美國(guó))2克溶解于100毫升蒸餾水中(約30攝氏度)，得到澄清透明溶液。用1.0摩爾/升的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值為約9.5,然后在電磁攪拌下加入0.02克醋酸酐(分析純)，不斷加入適量1.0摩爾/升的氳氧化鈉溶液，保持溶液的pH值在弱堿性(通常8.0~仏5)。在約30攝氏度下攪拌反應(yīng)1小時(shí)。此后上述溶液裝入透析管(截除分子量3500,Fisher,美國(guó))，用蒸餾水透析，每8小時(shí)換一次透析液直至凝膠液相色譜(GPC)檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外2W納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰。最后收集透析管內(nèi)的溶液，冷凍干燥得到白色絮狀固體(乙?；髂z)約L6克。(2)乙酰化明膠的丁二截羧基化改性取上述乙?；髂z1克溶解于IOO毫升蒸餾水中(約30攝氏度)，得到澄清透明溶液。用1.0摩爾/升的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值為約9.5，然后在電磁攪拌下加入0.02克丁二酸酐(分析純)，不斷加入適量1.0摩爾/升的氫氧化鈉溶液，保持溶液的PH值在弱堿性(通常8.0~9.5)。在約30攝氏度下攪拌反應(yīng)1小時(shí)。此后上述溶液裝入透析管(截除分子量3500,Fisher,美國(guó))，用蒸餾水透析，每8小時(shí)換—次透析液；直至凝膠液相色譜(GPC)檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外210納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰。最后收集透析管內(nèi)的溶液，冷凍干燥得到白色絮狀固體(丁二酰羧基化乙?；髂z)約0.7克。(3)丁二酰羧基化和乙?；髂z的巰基化改性取上述丁二酰羧基化和乙?；髂z0.5克溶解于50毫升蒸餾水中(約30攝氏度)。在上述溶液中加入0.3克二硫代二丙酰肼(按照Shu等人在Biomaer咖olecules，3，1304,2002中公開(kāi)的方法制備)，攪拌溶解。然后溶液的pH值用0.1摩爾/升鹽酸調(diào)節(jié)至4.75,加入0.25克1-￡基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(Aldrich,美國(guó))，電磁攪拌。在上述溶液中不斷加入適量0.1摩爾/升鹽酸,使溶液的PH值保持在4.75。電磁攪拌反應(yīng)2小時(shí)后，加入2,5克二硫蘇糖醇(DiagnosticCh柳icalLimited,類國(guó))和0.1摩爾/升的氫氧化鈉溶液，攪拌，調(diào)節(jié)溶液的pH值為8.5。此后室溫電磁攪拌反應(yīng)24小時(shí)后，在上述溶液中加入6摩爾/升的鹽酸直至pH值為約3.0。將上述溶液裝入透析管(截除分子量3500,Sigma,美國(guó))，用10升0.001摩爾/升的鹽酸和0.3摩爾/升的氯化鈉溶液透析5天，每8小時(shí)換一次透析液；然后再用10升0.001摩爾/升的鹽酸溶液透析3天，每8小時(shí)換透析液，直至GPC檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外210納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰。最后收集透析管內(nèi)的溶液，冷凍干燥得到百色絮狀固體約0.33克。(4)丁二截羧基化、乙?；蛶€基化明膠多重改性衍生物的表丁二酰羧基化、乙?；蛶€基化明膠多重改性衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示:GPC檢測(cè)(純水為流動(dòng)相，紫外210納米吸收檢測(cè))均未發(fā)現(xiàn)小分子雜質(zhì)流出峰，表明合成的丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物為高度純化，雜質(zhì)低于儀器檢測(cè)水平。采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TOBS)試劑測(cè)定明膠的側(cè)鏈氨基約21%乙?；?、28%丁二酰羧基化。采用Shu等人在Bio腿cromolecules,3，i304，2002中報(bào)道的改進(jìn)Eli腿n方法檢測(cè)丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物的活性巰基含量0.54毫摩爾巰基/克。氫譜核磁共振檢測(cè)('H-NMR)(W)為溶劑)的結(jié)果如下:氫8bcdefghiS(ppn)2.382.392.562.692.452.512.562.691.84實(shí)施例12明膠多重改性衍生物交聯(lián)水凝膠的制備1、聚乙二醇二乙烯砜交聯(lián)本發(fā)明明膠多重改性衍生物水凝膠的制備實(shí)施例1制備的乙酰化和巰基化明膠多重改性衍生物0.3克溶解于10毫升(J.1摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(沐7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入適量0.1摩爾/升的氫氧化鈉直至pH為？.4。聚乙二醇二乙烯砜(分子量3400,NektarTherapeutics,類國(guó))0.1克溶解于2.5毫升0.1摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)得到澄清透明溶液。然后將上述2.5毫升聚乙二醇二乙烯砜溶液加入到10毫升乙?；蛶€基化明膠多重改性衍生物溶液，立即電磁攪拌30秒，室溫靜置30分鐘。溶液黏度逐漸增加并形成凝膠。2、聚乙二醇二丙烯酸酯交聯(lián)本發(fā)明明膠多重改性衍生物水凝膠的制備實(shí)施例3制備的丁酰化和巰基化明膠多重改性衍生物0.25克溶解于10毫升0.1摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(PH7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入適量0.1摩爾/升的氫氧化鈉直至pH為7.4。聚乙二醇二乙烯砜(分子量340(J,NektarTherapeutics,類國(guó))0.1克溶解于2.5毫升0.1摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)得到澄清透明溶液。然后將上述2.5毫升聚乙二醇二乙烯砜溶液加入到1(1毫升丁酰化和巰基化明膠多重改性衍生物溶液，立即電磁攬拌30秒，室溫靜置30分鐘。溶液黏度逐漸增加并形成凝膠。3、聚乙二醇二乙烯砜交聯(lián)本發(fā)明明膠多重改性衍生物水凝膠的制備實(shí)施例5制備的丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物0.2克溶解于10毫升0.1摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入適量0.1摩爾/升的氫氧化鈉直至pH為7,4。聚乙二醇二乙烯砜(分子量3幼0,NektarTherapeutics,美國(guó))0.1克溶解于2.5毫升0.1摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)得到澄清透明溶液。然后將上述2.5毫升聚乙二醇二乙烯砜溶液加入到10毫升丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物溶液，立即電磁攪拌30秒，室溫靜置30分鐘。溶液黏度逐漸增加并形成凝膠。4、聚乙二醇二乙烯砜交聯(lián)本發(fā)明明膠多重改性衍生物水凝膠的制備實(shí)施例6制備的丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物0.3克溶解于10毫升0.1摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入適量0.1摩爾/升的氫氧化鈉直至pH為7.4。聚乙二醇二乙烯砜(分子量3400,Mekt紅Therapeutics,類國(guó))(3.i克溶解于2.5毫升0.1摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)得到澄清透明溶液。然后將上述2.5毫升聚乙二醇二乙烯砜溶液加入到10毫升丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物溶液，立即電磁攪拌30秒，室溫靜置30分鐘。溶液黏度逐漸增加并形成凝膠。5、聚乙二醇二乙烯砜交聯(lián)本發(fā)明明膠多重改性衍生物水凝膠的制備實(shí)施例8制備的乙?；⒍《ｔ然蛶€基化明膠多重改性衍生物0.3克溶解于10毫升0.1摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入適量0.1摩爾/升的氫氧化鈉直至pH為7.4。聚乙二醇二乙烯砜(分子量3400,fektarTherapeutics,美國(guó))0.1克溶解于2.5毫升0.i摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)得到澄清透明溶液。然后將上述2.5毫升聚乙二醇二乙烯砜溶液加入到10毫升乙?；?、丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物溶液，立即電磁撹拌30秒，室溫靜置30分鐘，溶液黏度逐漸增加并形成凝膠。6、聚乙二醇二乙烯砜交聯(lián)本發(fā)明明膠多重改性衍生物水凝膠的制備實(shí)施例9制備的丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物0.3克溶解于10毫升0.1摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入適量0.1摩爾/升的氣氧化鈉直至pH為7.4。聚乙二醇二乙烯砜(分子量3400,MektarTherapeutics,美國(guó))0.1克溶解于2.5毫升0.i摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)得到澄清透明溶液。然后將上述2.5毫升聚乙二醇二乙烯砜溶液加入到10毫升丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物溶液，立即電磁攪拌30秒，室溫靜置30分鐘。溶液黏度逐漸增加并形成凝膠。7、聚乙二醇二乙烯砜和聚乙二醇二丙烯酸酯交聯(lián)本發(fā)明明膠多重改性衍生物水凝膠的制備:實(shí)施例1制備的乙酰化和巰基化明膠多重改性衍生物O.15克和實(shí)施例9制備的丁二酰羧基化和巰基化明膠多重改性衍生物0.15克同時(shí)溶解于10毫升0.1摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入適量0.1摩爾/升的氫氧化鈉直至PH為7.4。聚乙二醇二乙烯砜(分子量3400,NektarTherapeutics,類國(guó))0.05克和聚乙二醇二丙烯酸酯(分子量3400,NektarTherapeutics,類國(guó))0.05克同時(shí)溶解于2.5毫升0.1摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)得到澄清透明溶液。然后將上述2.5毫升聚乙二醇二乙烯砜/聚乙二醇二丙烯酸酯溶液加入到10毫升明膠多重改性衍生物溶液，立,電磁攪拌30秒，室溫靜置30分鐘。溶液黏度逐漸增加并形成凝膠。實(shí)施例i3明膠多重改性衍生物交聯(lián)水凝膠作為細(xì)胞粘附生長(zhǎng)的基質(zhì)按照實(shí)施例12在24孔標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)制備6種明膠多重改性衍生物交聯(lián)水凝膠，每孔為0.4毫升。12小時(shí)后整塊細(xì)胞培養(yǎng)板浸泡在75%的酒精溶液消毒2小時(shí)。此后細(xì)胞培養(yǎng)板用無(wú)菌生理鹽水浸洗三次。每孔加入1毫升細(xì)胞培養(yǎng)液(湖腿，1牛血清)和2力'個(gè)NIH3T3成纖細(xì)胞。3攝氏度、二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在聚乙二醇二丙烯酸酯交聯(lián)透明質(zhì)酸-明膠雙組分水凝膠表面的黏附鋪展與空白細(xì)胞培養(yǎng)板相似，細(xì)胞呈紡錘形。這個(gè)結(jié)果表明二硫鍵交聯(lián)透明質(zhì)酸-明膠二組份水凝膠是細(xì)胞粘附生長(zhǎng)的良好基質(zhì)。權(quán)利要求1.同時(shí)具有下述通式(I)結(jié)構(gòu)和至少下述通式(II)、(III)和(IV)中一種結(jié)構(gòu)的明膠多重改性衍生物id="icf0001"file="A2007100362760002C1.gif"wi="127"he="50"top="43"left="28"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>其中G是明膠殘基，包括A型明膠殘基、B型明膠殘基、基因重組明膠殘基；R1是亞烷基或含有一個(gè)酰氨鍵的連接基團(tuán)；R2是烷基或芳香基；R3是亞烷基；R4是羧基或羧基鹽。2、按照權(quán)利要求1所述的明膠多重改性衍生物，其中R,和&是亞烷基，&是烷基，R,是羧基、羧基鈉鹽或羧基鉀鹽。3、按照權(quán)利要求2所述的明膠多重改性衍生物，其中R，和R:,都是碳原子數(shù)1到15的亞烷基。4、按照權(quán)利要求2所述的明膠多重改性衍生物，其中R2是碳原子數(shù)1到15的烷基。5、按照權(quán)利要求1所述的明膠多重改性衍生物，其中R,是含有--個(gè)截氨鍵的連接基團(tuán)，fe是亞烷基，&是烷基。6、按照權(quán)利要求5所述的明膠多重改性衍生物，其中R,是含有一個(gè)酰氨鍵的連接基團(tuán)，！^是碳原子數(shù)l到15的亞烷基，R,是碳原子數(shù)l到15的烷基。7、按照權(quán)利要求1或5或6所述的明膠多重改性衍生物，其特征在于，所述的含有一個(gè)酰氨鍵的連接基團(tuán)為"IHH"C"R^或一"R^C"NH-R^",其中R'和R"是亞烷基、取代亞烷基、芳香基或聚醚基。8、一種或一種以上如權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的明膠多重改性衍生物通過(guò)與至少含有兩個(gè)相同或不相同的巰基反應(yīng)活性官能團(tuán)交聯(lián)劑交聯(lián)生成的明膠交聯(lián)材料。9、按照權(quán)利要求8所述的明膠交聯(lián)材料，其特征在于，所述的巰基反應(yīng)活性官能團(tuán)交聯(lián)劑包括巰基反應(yīng)活性官能團(tuán)的雙臂、三臂或更多臂的聚乙二醇衍生物，所述的聚乙二醉衍生物的分子量為100到1000000。10、按照權(quán)利要求9所述的明膠交聯(lián)材料，其特征在于，所述的巰基反應(yīng)活性官能團(tuán)包括馬來(lái)酰亞胺、乙烯砜、a,e不飽和丙烯酸酯、a,e不飽和甲基丙烯酸酯、碘代丙酸酯、溴代丙酸酯、碘代丙酰胺、溴代丙酰胺、二硫代吡啶、N-羥基丁二酰亞胺活化酯。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一類明膠多重改性衍生物，不僅具有通式(I)結(jié)構(gòu)，至少還同時(shí)具有通式(II)、(III)和(IV)中的一種結(jié)構(gòu)，其中G是明膠殘基，包括A型明膠殘基、B型明膠殘基、基因重組明膠殘基；R₁是亞烷基或含有一個(gè)酰氨鍵的連接基團(tuán)；R₂是烷基或芳香基；R₃是亞烷基；R₁是羧基或羧基鹽。明膠的多重改性包括明膠側(cè)鏈氨基的酰氨鍵疏水化改性、明膠側(cè)鏈氨基的酰氨鍵羧基化改性、明膠側(cè)鏈羧基的巰基化改性及明膠側(cè)鏈氨基的酰氨鍵羧基化改性后的巰基化改性。此外，本發(fā)明還公開(kāi)了該明膠多重改性衍生物的交聯(lián)材料。本發(fā)明明膠多重改性衍生物具有靈活多變的化學(xué)結(jié)構(gòu)和多種性能，其交聯(lián)材料可用作細(xì)胞生長(zhǎng)基質(zhì)等。文檔編號(hào)C07K14/435GK101220090SQ20071003627公開(kāi)日2008年7月16日申請(qǐng)日期2007年1月9日優(yōu)先權(quán)日2007年1月9日發(fā)明者嬋宋申請(qǐng)人:上海百瑞吉生物醫(yī)藥有限公司