專利名稱：一步法構建陽離子化載體蛋白與黃曲霉毒素B₁的偶聯(lián)物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及陽離子載體蛋白的制備及黃曲霉毒素B廣陽離子蛋白偶聯(lián)物的一步法構建。將 構建的偶聯(lián)物作為免疫原免疫動物，可提高機體的免疫應答水平，制備高質量的抗黃曲霉毒 素B!抗體。
背景技術：
黃曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)是一類主要由寄生曲霉(^perg/〃^; aras衍a^)和產毒的 黃曲霉(A/7"w^)所產生的有毒次生代謝產物，其中以黃曲霉毒素B！ (aflatoxinB!, AFB,) 的危害最大，是目前已知的毒性最大的致癌物之一。國際癌癥研究機構已將其列為I級致癌 物。由于AFB,污染食品的途徑很多，因此要完全杜絕AFB!的污染是不可能的，完善監(jiān)督措 施和采用科學檢測方法可以在最大程度上減少AFB!對人類健康的危害。目前AFBi的檢測方 法主要有基于理化和免疫的分析方法，前者包括薄層層析法、高效液相色譜、質譜和毛細管 電泳等，薄層層析法作為我國目前檢測AFB,國標方法，雖然操作簡便，成本低廉，但由于 是半定量方法，靈敏度低，已經難以滿足低檢測限的需要；而其他儀器分析方法雖然靈敏度 高、重現(xiàn)性好，但同時存在著耗時、檢測儀器昂貴、操作復雜等缺點，不能滿足現(xiàn)場快速檢 測的需求；而酶聯(lián)免疫吸附反應、免疫微柱以及免疫芯片等免疫學檢測方法由于節(jié)省時間、 成本低、操作簡便，適合批量檢測和現(xiàn)場檢測，正逐步受到我國各質檢相關部門的重視。
AFB,作為半抗原，需將其與載體蛋白偶聯(lián)后，才能具備刺激動物產生抗體的免疫原性。 但由于完全抗原制備過程復雜，AFBi利用率低，因此常常需要使用較大量的AFB!才能制備 得到相應的抗體；然而，"9.11"事件后，AFB,作為一種劇毒的生物試劑被美國等發(fā)達國家嚴 格控制。市場上該毒素標準品不僅價格高而且難以買到，這給研究AFB,的免疫學檢測方法 帶來很大困難，也在一定程度上阻礙了免疫學方法的應用和推廣。
早期研究認為AFB，本身性質不活潑，不具備與載體蛋白連接的活性基團，需將其衍生 后，再與載體蛋白偶聯(lián)，即先將AFB!轉化為AFB廣羧基活化物(AFBrOxime,AFB,-O)，然 后，在碳化二亞胺(l-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide， EDC)等偶聯(lián)劑的催化 下，與載體蛋白發(fā)生縮合反應，形成穩(wěn)定的AFB廣O-載體蛋白偶聯(lián)物。其中，第一步AFB, 的轉化率為70%~80%， AFB廣O的純化得率為80%~90%，而第二步，僅有30%~40%的 AFB!-O偶聯(lián)到載體蛋白上。因此，AFB,的總利用率在20。/。左右，利用率較低。綜合上述原因，研究提高AFB!利用率的偶聯(lián)物制備方法是非常必要的。
本發(fā)明利用了陽離子載體蛋白胺甲基化原理構建了 AFBr陽離子載體蛋白的偶聯(lián)物。在 AFB,的結構中，由于其幾基的a-活潑氫在弱酸條件下，以烯醇式存在，可通過甲醛的偶聯(lián)作 用，與載體蛋白的胺乙基發(fā)生胺甲基化偶聯(lián)。由于陽離子載體蛋白的羧基幾乎全部被胺乙基 取代，因而整個蛋白帶正電，作為完全抗原免疫動物時，較之普通蛋白的偶聯(lián)物，陽離子載 體蛋白更易與機體內帶弱負電的細胞膜表面結合，進而被抗原提呈細胞識別和刺激機體內的 免疫應答，同時，也提高r機體對共價偶聯(lián)在陽離子載體蛋白半抗原(AFB!)的識別和應答 水平，即可刺激抗原提呈細胞對半抗原決定簇的提呈、促進T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖。
本發(fā)明中AFB!的總利用率在50%左右。實驗證明，通過該法制備的偶聯(lián)物具有較好的 免疫原性，能夠刺激機體產生高質量的AFB,抗體。因此，本發(fā)明相對于傳統(tǒng)合成方法，有 操作步驟少、毒素利用率高、抗體效價高等優(yōu)點。
本專利發(fā)明者針對兩歩法存在的諸多問題，發(fā)明了用陽離子載體蛋白一步構建黃曲霉毒 素Br載體蛋白偶聯(lián)物的方法。相關研究國內外尚未見報道。
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發(fā)明內容
(一) 要解決的技術問題
本發(fā)明的目的是提供一種一步構建AFBr載體蛋白偶聯(lián)物的方法。
(二) 技術方案
為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是
烯醇或者含a-活潑氫的羰基化合物，在偶聯(lián)劑甲醛的作用下，能與伯胺或仲胺進行偶聯(lián)。 根據該原理，AFBi上羰基的a-活潑氫就能夠在甲醛的偶聯(lián)作用下與含有胺乙基的陽離子 蛋白反應，得到AFBr陽離子蛋白的偶聯(lián)物。陽離子化蛋白相對于簡單蛋白而言，具有較多 的胺乙基，因而整個蛋白帶正電，作為完全抗原免疫動物時，較之普通蛋白的偶聯(lián)物，陽離 子載體蛋白更易與機體內帶弱負電的細胞膜表面結合，進而被抗原提呈細胞識別和刺激機體 內的免疫應答。 具體步驟
1.陽離子蛋白的制備 .
載體蛋白包括牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)、卵清白蛋白(Ovalbumin, OVA)、辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)、血孔匙蛋白(Keyhole limpet hemocyanin， KLH)和多聚賴氨酸(Ploy-l-lysine， PLL)。
制備步驟
(1) 將乙二胺(ethylenediamine， EDA)加入到冰浴中的2-乙烷磺酸基(2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid， MES)緩沖液中，并用HC1調節(jié)pH至弱酸性；
(2) 將載體蛋白溶于MES后，與上述EDA溶液混勻；
(3) 滴加偶聯(lián)劑EDC于(2)所述溶液中，室溫反應后，用醋酸終止反應；
(4) 將上述反應物用去離子水充分透析；
(5) 將其凍干后，凍干備用。所用EDA體積在20iiL 100nL之間，所用的載體蛋白質量在5mg 100mg之間，EDA與 MES的體積比在1:25 1:5之間，MES緩沖液的pH調節(jié)到4 6。
制備得到陽離子牛血清白蛋白(Cationized bovine serum albumin, cBSA)、陽離子卵清
白蛋白(Cationized ovalbumin, cOVA)、陽離子辣根過氧化物酶(Cationized horseradish
peroxidase, cHRP)、陽離子血孔匙蛋白(Cationized keyhole limpet hemocyanin, cKLH)或陽
離子多聚賴氨酸(Cationizedploy-l-lysine， cPLL)。 2. AFB!-陽離子載體蛋白偶聯(lián)物的制備
AFB,-陽離子載體蛋白偶聯(lián)物包括AFB廣cBSA、 AFB,-cOVA、 AFB廣cHRP、 AFB廣cKLH 和AFB!-cPLL。 制備步驟
(1) 將陽離子載體蛋白和AFB!分別用去離子水和二甲基甲酰胺溶解后，將AFB,溶液 逐滴加入到載體蛋白液中混勻；
(2) 在上述反應液中加入偶聯(lián)劑甲醛，反應后即得到AFB,-陽離子載體蛋白偶聯(lián)物；
(3) 用去離子水充分透析后，凍干備用。
其中，陽離子載體蛋白與AFBi的質量比例在1:1 5:1之間，二甲基甲酰胺和甲醛的體積 比在1:1 5:1之間。 (三)有益效果
本發(fā)明以AFB,為半抗原，利用陽離子蛋白一步法合成AFBi —載體蛋白偶聯(lián)物，該法具 有步驟簡單、AFB利用率高等優(yōu)點，避免了目前所用兩歩法步驟多、利用率低等缺點。


下面結合附圖和實施例對本發(fā)明專利進一步說明。
圖1 AFBi的結構
圖2載體蛋白的陽離子化
圖3 AFBi與陽離子載體蛋白的偶聯(lián)機理
① AFB!在弱酸性緩沖液中的烯醇化；
② 陽離子載體蛋白中亞胺離子的形成；
③ 陽離子載體蛋白中的亞胺離子在甲醛作用下，與烯醇化AFB,偶聯(lián)
具體實施例方式
實施例1 AFB,-cBSA偶聯(lián)物的制備 l.lcBSA的制備
將5(M00nLEDA加入到500 pL冰浴MES緩沖液中，并用HC1將pH調節(jié)到5.5左右， 再將5 100mgBSA溶解于50pL的MES緩沖液，然后，與上述EDA溶液混勻，再在上述混 合液中添加2~50mg的EDC，室溫攪拌l 12h后，用醋酸終止反應，最后用去離子水充分透 析48 72h，凍干備用。
1.2 AFB!-cBSA偶聯(lián)物的制備
將5~100mg的cBSA與2mg AFBi分別用500~10000pL去離子水和50~1000nL 二甲基甲 酰胺溶解后，再將上述AFBi溶液逐滴加入到上述蛋白質溶液中混勻，然后迅速加入 50~1000]iiL甲醛，37'C下輕搖24h，用去離子水充分透析48h后，凍干備用。
實施例2 AFBrcOVA偶聯(lián)物的的制備
2.1 cOVA的制備
將50~100|aL EDA加入到500 冰浴MES緩沖液中，并用HC1將pH調節(jié)到5.5左右， 再將5 100mgOVA溶解于10(^L的上述緩沖液，然后，與上述EDA溶液混勻，再在上述混 合液中添加2 50mg的EDC，室溫攪拌l 12h后，用醋酸終止反應，最后用去離子水充分透 析48 72h，凍干備用。
2.2 AFBi-cOVA偶聯(lián)物的制備
將5~100mg的cOVA與l~50mg AFBt分別用500~10000pL去離子水和50 1000& 二甲 基甲酰胺溶解后，再將上述AFBi溶液逐滴加入到上述蛋白質溶液中混勻，然后迅速加入 5(M00(HiL甲醛，37。C下輕搖24h，用去離子水充分透析48h后，凍干備用。
實施例3 AFBrcHRP偶聯(lián)物的制備
3.1 cHRP的制備
將50~100pL EDA加入到冰浴的500 MES緩沖液中，并用HC1將pH調節(jié)到5.5左右， 再將5 100mgHRP溶解于500pL的上述MES緩沖液，然后，與上述EDA溶液混勻，再在上 述混合液中添加2~50mg的EDC，室溫攪拌l 12h后，用醋酸終止反應，最后用去離子水充 分透析48 72h，凍干備用。
93.2 AFBrcHRP偶聯(lián)物的制備
將5~100mg的cHRP與l~50mg AFB!分別用500~10000nL去離子水和50~1000& 二甲 基甲酰胺溶解后，再將上述AFBi溶液逐滴加入到上述蛋白質溶液中混勻后，迅速加入 50 1000pL甲醛，37'C下輕搖24h，用去離子水充分透析48h后，凍干備用。
實施例4 AFBrcKLH偶聯(lián)物的制備
4.1 cKLH的制備
將50~100|aL EDA加入到冰浴的500 MES緩沖液中，并用HC1將pH調節(jié)到5.5左右， 再將5~100mg KLH溶解于800pL的上述MES緩沖液，然后，與上述EDA溶液混勻，再在 上述混合液中添加2~50mg的EDC，室溫攪拌l 12h后，用醋酸終止反應，最后用去離子水 充分透析48 72h，凍干備用。
4.2 AFBrcKLH偶聯(lián)物的制備
將5~100mg的cKLH與l~50mg AFB!分別用500 10000nL去離子水和50~1000|iL 二甲 基甲酰胺溶解后，再將上述AFBi溶液逐滴加入到上述蛋白質溶液中混勻，然后迅速加入 50 100(^L甲醛，37'C下輕搖24h，用去離子水充分透析48h后，凍干備用。
實施例5 AFB廣cPLL偶聯(lián)物的制備
5.1cPLL的制備
將50 10(HiLEDA加入到冰浴的500 ^LMES緩沖液中，并用HC1將pH調節(jié)到5.5左右， 再將5 100mgPLL溶解于1000pL的上述MES緩沖液，然后，與上述EDA溶液混勻，再在 上述混合液中添加2 50mg的EDC，室溫攪拌l 12h后，用醋酸終止反應，最后用去離子水 充分透析48 72h，凍干備用。
5.2 AFB廣cPLL偶聯(lián)物的制備
將5 100mg的cPLL與l~50mg AFBi分別用500~10000hL去離子水和50~1000nL 二甲基 甲酰胺溶解后，再將上述AFB!溶液逐滴加入到上述蛋白質溶液中混勻，然后迅速加入 50-1000^iL甲醛，37'C下輕搖24h，用去離子水充分透析48h后，凍干備用。
上述所用MES緩沖液濃度均為O.lmol/L， HC1均為lmol/L，醋酸均為4mol/L。
AFBr陽離子蛋白偶聯(lián)物的鑒定
采用紫外分光光度計對陽離子載體蛋白、AFB,標品及偶聯(lián)物進行掃描，根據其特征吸收 峰來確定偶聯(lián)是否成功。結果顯示，AFBi-陽離子載體蛋白偶聯(lián)物在270nm和366nm有兩個主要的吸收峰，前一 個吸收峰是載體蛋白(280nm)和AFB! (266nm)的疊加峰，而后者是AFB!的另一特征吸 收峰G63nm)。根據偶聯(lián)比公式，結合紫外圖譜上吸收峰波長及吸光度，可以計算出AFB, 與陽離子蛋白的偶聯(lián)比。
-366, -366wm
A工、 二 _^ ^
M載體蛋白 (^偶聯(lián)物'278wm — j偶聯(lián)物■ 366"m X f XFSi ■ 278"m / 6^FSi . 366"m)/6"載體蛋白■ 278mw
其中偶聯(lián)物中AFBi的摩爾質量；
M載體蛋A:偶聯(lián)物中載體蛋白的摩爾質量；
j偶聯(lián)物.27S :偶聯(lián)物在278nrn處的吸光度； ^偶聯(lián)物.366 :偶聯(lián)物在366nrn處的吸光度；
. 278 : AFB!在278nm處的摩爾吸光系數(shù)； ^4ral366 m : AFBi在366nm處的摩爾吸光系數(shù)； f載體蛋s.278腦載體蛋白在278nm處的摩爾吸光系數(shù) 經過計算，AFBi與陽離子蛋白的偶聯(lián)比在6.1左右，證明了成功制備AFBr陽離子蛋白 偶聯(lián)物。
權利要求
1.陽離子蛋白，其特征在于結構式其中，載體蛋白的羧基幾乎全部被胺乙基取代，整個蛋白帶正電，因而作為完全抗原免疫動物時，陽離子載體蛋白更易與機體內帶弱負電的細胞膜表面結合，進而被抗原提呈細胞識別和刺激機體內的免疫應答。
2. AFBr陽離子蛋白偶聯(lián)物，其特征在于它的分子結構式為其中，載體蛋白可以是陽離子牛血清白蛋白(Cationized bovine serum albumin ， cBSA)、陽離子卵清白蛋白(Cationized ovalbumin, cOVA)、陽離子辣根過氧化物酶(Cationizedhorseradish peroxidase, cHRP)、陽離子血孑L匙蛋白(Cationized keyhole limpet hemocyanin，cKLH)或陽離子多聚賴氨酸(Cationized ploy-L-lysine， cPLL)，分別與AFB,結合得到AFB,-cBSA、 AFB廣cOVA、 AFB廣cHRP、 AFB廣cKLH和AFB廣cPLL。
3.制備權利要求l所述一種陽離子載體蛋白的方法，其特征在于包括步驟(1) 制備CBSA，步驟如下將20 100(xL乙二胺(ethylenediamine， EDA)加入到冰浴的500nL O.lmol/L 2-乙烷 磺酸(2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid, MES)緩沖液中，并用lmol/L HC1將pH調 節(jié)到4~6，然后，將5 100mg BSA溶解在50nL的上述MES緩沖液后，與上述EDA溶 液混勻，再在上述混合液中添加2~50mg的碳化亞二胺(l-Ethyl-3-[3-dimethylamin叩ropyl] carbodiimide, EDC)，室溫攪拌l 12h，用4mol/L的醋酸終止反應，用去離子水充分透 析48 72h后，將其凍藏備用。(2) 制備cOVA，步驟如下將20 100|aL EDA加入到冰浴的500nL O.lmol/L MES緩沖液中，并用lmol/L HC1 將pH調節(jié)到4 6，然后，將5 100mgOVA溶解在10(^L的上述MES緩沖液后，與上述 EDA溶液混勻，再在上述混合液中添加2~50mg的EDC，室溫攪拌l~12h，用4mol/L的 醋酸終止反應，用去離子水充分透析48 72h后，將其凍藏備用。(3) 制備cHRP，步驟如下將20 100pL EDA加入到冰浴的500pL O.lmol/L MES緩沖液中，并用lmol/L HC1 將pH調節(jié)到4 6，然后，將5 100mgHRP溶解在50(^L的上述MES緩沖液后，與上述 EDA溶液混勻，再在上述混合液中添加2~50mg的EDC，室溫攪拌l~12h，用4mol/L的 醋酸終止反應，用去離子水充分透析48 72h后，凍藏備用。(4) 制備cKLH，步驟如下將20 100nL EDA加入到冰浴的500pL O.lmol/L MES緩沖液中，并用lmol/L HC1 將pH調節(jié)到4~6，再將5~100mg KLH溶解于800pL的上述MES緩沖液后，與上述EDA 溶液混勻，再在上述混合液中添加2 50mg的EDC，室溫攪拌l 12h后，用4mol/L的醋 酸終止反應，用去離子水充分透析48 72h后，凍藏備用。(5) 制備cPLL，步驟如下將20 100nL EDA加入到冰浴的500 pL O.lmol/L MES緩沖液中，并用lmol/L HC1 將pH調節(jié)到4-6，再將5 100mg PLL溶解于lOOOpL的上述MES緩沖液，然后，與上 述EDA溶液混勻，再在上述混合液中添加2~50mg的EDC，室溫攪拌l~12h后，用4mol/L 的醋酸終止反應，最后用去離子水充分透析48 72h，凍藏備用。所用EDA體積在20pL 100pL之間，所用的載體蛋白質量在5mg 100mg之間，EDA 與MES的體積比在1:25 1:5之間，MES緩沖液的pH調節(jié)到4~6。
4. 如權利要求2所述一種AFBr陽離子載體蛋白偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于AFB, 上羰基的a-活潑氫能夠在甲醛的偶聯(lián)作用下與陽離子蛋白的胺乙基反應，得到AFB,-陽離 子載體蛋白的偶聯(lián)物，能夠制備包括免疫抗原、包被抗原和酶標記物在內的AFB,-陽離 子蛋白偶聯(lián)物，得到AFBi完全抗原。
5. 如權利要求2所述一種AFBr陽離子載體蛋白偶聯(lián)物的制備方法，其特征是偶聯(lián)劑甲 醛。
6. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于包括步驟(1) AFB廣cBSA的制備，步驟如f:將5~100mg cBSA與l~50mg AFB!分別用 500~1000(VL去離子水和50~1000pL 二甲基甲酰胺溶解，再將AFB!溶液逐滴加入到上述蛋白質溶液中，混勻后，迅速加入50 1000nL甲醛，37。C下輕搖24h，充分反應后即得 到AFBrcBSA，用去離子水充分透析48h后，凍干備用。(2) AFB廣cOVA的制備，步驟如下將5~100mg的cOVA與l~50mg AFB!分別用 500~10000^iL去離子水和50~1000pL 二甲基甲酰胺溶解，再將AFB,溶液逐滴加入到上述 蛋白質溶液中，混勻后，迅速加入50~1000pL甲醛，37'C下輕搖24h，充分反應后即得 到AFB廣cOVA，接著用去離子水充分透析48h后，凍干備用。(3) AFBl-cHRP的制備，步驟如下將5~100mg的cHRP與l~50mg AFB,分別用 500~10000^iL去離子水和500|iL 二甲基甲酰胺溶解，再將AFB!溶液逐滴加入到上述蛋白 質溶液中，混勻后，迅速加入50 1000nL甲醛，37'C下輕搖24h，充分反應后即得到 AFBrcHRP，接著用去離子水充分透析48h后，凍干備用。(4) AFB廣cKLH的制備，步驟如下將5~100mg的cKLH與l~50mg AFB!分別用 500~10000^iL去離子水和50~100(VL 二甲基甲酰胺溶解，再將AFB,溶液逐滴加入到上述 蛋白質溶液中，混勻后，迅速加入50 100(VL甲醛，37'C下輕搖24h，充分反應后即得 到AFB!-cKLH，接著用去離子水充分透析48h后，凍干備用。(5) AFB廣cPLL的制備，步驟如下將5 100mg的cPLL與l~50mg AFB,分別用 500~10000pL去離子水和50 1000nL 二甲基甲酰胺溶解，再將上述AFB,溶液逐滴加入到 上述蛋白質溶液中，混勻后，迅速加入50~1000nL甲醛，37。C下輕搖24h，充分反應后 即得到AFBi-cPLL，接著用去離子水充分透析48h后，凍干備用。其中，陽離子載體蛋白與AFBi的質量比例在l:l 5:l之間，二甲基甲酰胺和甲醛的體 積比在1:1 5:1之間。
全文摘要
本發(fā)明根據胺甲基化反應反應原理，利用黃曲霉毒素B₁結構中羰基碳的α-活潑氫，以甲醛為偶聯(lián)劑，與陽離子蛋白中的胺乙基發(fā)生縮合反應，一步法構建黃曲霉毒素B₁-陽離子載體蛋白偶聯(lián)物。該法較之目前采用先將黃曲霉毒素B₁衍生轉化為羧基活化物后，再與載體蛋白縮合偶聯(lián)的兩步法，具有步驟少、操作簡單、利用率高的優(yōu)點。
文檔編號C07K1/10GK101293912SQ20071005193
公開日2008年10月29日 申請日期2007年4月23日 優(yōu)先權日2007年4月23日
發(fā)明者偉 余, 吳佳佳, 周有祥, 鶯 徐, 陳福生 申請人:陳福生