專利名稱：一種海南斑等蝎抗菌肽及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明涉及一種海南斑等蝎毒抗菌肽，還涉及該抗菌肽基因的制備方法，同時(shí)還涉及該基因的用途，高活性抗菌肽的分子設(shè)計(jì)和抗菌功能鑒定。具體地說，本發(fā)明涉及一種海南斑等蝎抗菌肽基因的分離鑒定；涉及一種蝎抗菌肽的抗菌譜鑒定采用化學(xué)合成手段生產(chǎn)的海南斑等蝎毒抗菌肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有廣譜抗性，而革蘭氏陰性菌無作用；涉及蝎抗菌肽對(duì)臨床分離的耐藥溶血性葡萄球菌有效；還涉及一種蝎抗菌肽的高活性分子設(shè)計(jì)和抗菌功能鑒定分子設(shè)計(jì)的蝎抗菌肽不但提高了對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌效果，而且對(duì)革蘭氏陰性菌也有了抗性，具有潛在抗菌藥物開發(fā)的價(jià)值。
背景技術(shù)：
抗生素耐藥性問題已成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。中國(guó)是世界上濫用抗生素較為嚴(yán)重的國(guó)家，耐藥菌引起的醫(yī)院感染人數(shù)，已占到住院感染患者總?cè)藬?shù)的百分之三十左右。耐藥菌另一個(gè)危害是可以在不同地區(qū)、國(guó)家之間的人群之間傳播。肺炎鏈球菌是引起細(xì)菌性肺炎的常見病源菌，近年來肺炎鏈球菌對(duì)抗生素耐藥性呈上升趨勢(shì)，并已出現(xiàn)多重耐藥菌株，是臨床感染控制中棘手的難題。
大量研究表明，在感染病菌或可能導(dǎo)致病菌感染(注射細(xì)菌或真菌，體壁損傷等)的情況下，昆蟲能快速合成大量抗菌肽，迅速殺滅已侵入的病菌，并阻止病菌的繼續(xù)侵染。到目前為止，在昆蟲中已發(fā)現(xiàn)了大量的抗細(xì)菌肽，抗真菌肽，以及既抗真菌又抗細(xì)菌的抗菌肽。這些抗菌肽不僅對(duì)細(xì)菌、真菌有廣譜抗菌能力，對(duì)病毒、原蟲及癌細(xì)胞也有作用。此外，還有作用機(jī)制獨(dú)特，對(duì)高等動(dòng)物正常細(xì)胞無害等特點(diǎn)，在面臨抗藥性和篩選新的抗生素極端困難的情況下，昆蟲抗菌肽可能成為抗生素的新來源。
蝎子是我國(guó)的一種傳統(tǒng)名貴中藥，2000多年前就記載了蝎子的藥用史。明朝《本草綱目》更詳細(xì)記載蝎主治“諸風(fēng)癮疹、中風(fēng)、半身不遂、口眼歪斜、語澀、手足抽摯，小兒驚癇風(fēng)搐”等多種疾病，具有抗腫瘤，殺蟲，抑菌和抗菌功效，其作用主要來源于蝎尾毒腺分泌的毒液。毒液的主要成分是一類由10-100個(gè)氨基酸組成的具有多種生物活性的小分子多肽，它們可以選擇性、特異性的與細(xì)胞膜上的膜蛋白相互作用，從而改變細(xì)胞對(duì)離子的通透能力，調(diào)節(jié)細(xì)胞體積、pH、膜電位、興奮性等多種細(xì)胞代謝過程和細(xì)胞分泌、激素作用和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生理過程。據(jù)估計(jì)，約有100000種不同生物活性肽存在于各種蝎毒腺中。因此，蝎毒素具有重要的理論研究意義和應(yīng)用開發(fā)價(jià)值。
對(duì)東亞鉗蝎有實(shí)驗(yàn)研究表明，全蝎乙醇提取物在體外對(duì)8種表淺致病真菌均有抑制作用，尤其對(duì)裴氏著色菌、中克氏孢子絲菌、石膏樣毛癬菌、絮狀表皮癬菌較為敏感，其抗真菌作用優(yōu)于大蒜浸出液。曾憲春等從我國(guó)東亞鉗蝎毒腺中分離到了一個(gè)抗菌肽基因BmKn2，發(fā)現(xiàn)該蝎毒肽具有抗大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的功能(Zeng X C，Wang S X，Zhu Y，Zhu S Y，Li W X.Identification andfunctional characterization of novel scorpion venom peptides with nodisulfide bridge from Buthus martensii Karsch.Peptides，2004，25143-150.)，本發(fā)明獲得的ImAMP1是從海南斑等蝎毒腺中分離的一新基因。同時(shí)，目前涉及海南斑等蝎毒素基因的專利還沒有，而涉及東亞鉗蝎毒腺毒素基因的專利僅有7項(xiàng)①東亞鉗蝎毒素BmKAS在制藥中的應(yīng)用，該發(fā)明涉及東亞鉗蝎毒素BmKAS在制備抗外周傷害藥中的應(yīng)用，以及東亞鉗蝎毒素BmKAS在制備抗痛覺過敏藥中的應(yīng)用；②一種含有雙價(jià)抗蟲基因的重組桿狀病毒，該發(fā)明涉及東亞鉗蝎昆蟲特異性神經(jīng)毒素基因BmKIT與一種昆蟲幾丁質(zhì)酶基因(Chi)，獲得含雙價(jià)抗蟲基因的重組桿狀病毒AcNPV-BmKIT-Chi；③蝎抗心律失常肽重組大腸桿菌及其構(gòu)建方法，該發(fā)明涉及了一種蝎抗心律失常肽BmKIM基因重組大腸桿菌，用于大量生產(chǎn)可溶、具有抗心律失?；钚缘闹亟M肽；④蝎抗心律失常肽及其制備方法和應(yīng)用，該發(fā)明公開了一種蝎抗心律失常肽BmKIM及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明所得到的重組BmKIM多肽具有高效抗心律失?；钚?，且可溶性好，產(chǎn)量高；⑤一種人工合成的蝎氯離子通道神經(jīng)毒素基因-rBmKCTa，該專利涉及到氯離子通道神經(jīng)毒素BmKCT基因，采用基因工程所得的改良的重組蝎氯離子通道神經(jīng)毒素對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞具有抑制作用，可用于制備通過抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可以治療的疾病的藥物；⑥一種過渡型蝎毒素BmKabT的用途，本發(fā)明公開了的過渡型蝎毒素BmKabT的用途，它可以作為一個(gè)獨(dú)特的鈉通道調(diào)制劑，研究鈉通道組成、結(jié)構(gòu)和功能的探針，可調(diào)節(jié)和治療鈉通道相關(guān)疾病的調(diào)制劑和藥品，可制備調(diào)節(jié)或治療高血鉀性麻痹、先天性肌強(qiáng)直及其它骨骼肌疾病、第三類長(zhǎng)QT間隔癥(LQT3)、原發(fā)性心室纖顫及其他心臟疾病的調(diào)制劑或藥品；⑦一種重組蝎昆蟲毒素及其可溶性表達(dá)和純化方法，該發(fā)明涉及一種重組蝎昆蟲毒素rBmKIT及其可溶性表達(dá)和純化方法。
盡管①②③④⑤⑥⑦專利都是關(guān)于東亞鉗蝎毒素的內(nèi)容，而本發(fā)明中所使用的蝎子為海南斑等蝎，專利涉及的蝎毒素基因BmKAS、BmKIT、BmKIM、BmKCT、BmKabT與本發(fā)明獲得的ImKAMP1基因是完全不同的毒素基因，并且①②③④⑤⑥⑦專利發(fā)明都沒有涉及到蝎毒素的抗菌功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供一種海南斑等蝎抗菌肽基因，具有抗菌功能。
本發(fā)明的另一個(gè)目的還在于提供一種海南斑等蝎蝎毒抗菌肽，抗菌效果佳。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是在于提供一種制備的海南斑等蝎抗菌肽的方法，方法易行，操作簡(jiǎn)單，制備的突變體提高了抗菌效果。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是在于提供一種海南斑等蝎抗菌肽在制備治療或預(yù)防革蘭氏細(xì)菌的藥物中的應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施①構(gòu)建了一個(gè)高質(zhì)量海南斑等蝎毒腺組織cDNA文庫(kù)，首先取海南斑等蝎的毒腺；其次是提取總RNA，并純化mRNA；第三是反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA；第四是雙鏈cDNA與載體pSPORT1的連接(采用T4DNA連接酶)；第五是重組分子的電轉(zhuǎn)化；第六是獲得毒腺細(xì)胞cDNA文庫(kù)；②以第一步毒腺組織cDNA文庫(kù)為基礎(chǔ)，通過PCR的方法篩選到了一個(gè)克隆子A165(編號(hào))，序列分析為一種抗菌肽基因，命名為ImAMP1，該菌保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，保藏日期2007年4月3日，保藏編號(hào)CCTCC NOM207034，分類命名大腸桿菌DH5α/ImAMP1(Escherichia coli DH5α/ImAMP1)；③采用化學(xué)合成的方法(由上?？齐纳锟萍加邢薰竞铣?，獲得了蝎毒抗菌肽ImAMP1，抗菌試驗(yàn)結(jié)果表明，ImAMP1對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌蘇云金芽孢桿菌(最小抑菌濃度MIC為25μg/ml)、枯草芽孢桿菌(MIC為50μg/ml)、金黃色葡萄球菌(MIC為25μg/ml)具有不同濃度的抑制作用，而對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌(100μg/ml無作用)和銅綠假單胞菌(100μg/ml無作用)無效。該蝎毒抗菌肽ImAMP1對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌具有特異性；④分子設(shè)計(jì)了ImAMP1的突變體ImAMP1-M，抗菌試驗(yàn)表明，該蝎毒抗菌肽的突變體ImAMP1-M提高了對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌(對(duì)枯草芽孢桿菌MIC為25μg/ml和對(duì)金黃色葡萄球菌MIC為5μg/ml)和對(duì)革蘭氏陰性菌的抗性(對(duì)大腸桿菌MIC為12.5μg/ml和對(duì)銅綠假單胞菌MIC為100μg/ml)；⑤ImAMP1和ImAMP1-M都可以對(duì)湖北省婦幼保健醫(yī)院分離的耐藥溶血性葡萄球菌具有抗性作用(ImAMP1的MIC為25μg/ml，而ImAMP1-M的MIC為5μg/ml)。因此蝎毒抗菌肽ImAMP1具有潛在抗菌藥物開發(fā)的價(jià)值。
本發(fā)明的目的是在于提供一種構(gòu)建高質(zhì)量海南斑等蝎毒腺組織cDNA文庫(kù)的方法，毒素基因覆蓋率達(dá)到95％以上。構(gòu)建高質(zhì)量海南斑等蝎毒腺組織cDNA文庫(kù)的技術(shù)路線如圖1。包括購(gòu)買海南斑等蝎經(jīng)電擊取毒后48h，其毒腺用于總RNA的分離(圖2)；取500mg的蝎尾腺在液氮中研成細(xì)粉末，通過Trizol方法制備的蝎毒腺總RNA；制備的蝎毒腺總RNA采用甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量(圖3)。
通過上述方法制備的蝎毒腺總RNA量為2mg，采用PolyA Tract mRNA分離系統(tǒng)(購(gòu)自美國(guó)Promega)分離和純化mRNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)定其獲得的蝎毒腺mRNA量約10μg。用5μgmRNA作為起始量，進(jìn)行cDNA的第一鏈和第二鏈合成，繼續(xù)雙鏈cDNA與SalI銜接頭的連接，NotI消化雙鏈cDNA，去除雙鏈cDNA分子中的過量SalI銜接頭和酶切小片段，雙鏈cDNA與pSPORT1載體(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen)的連接和轉(zhuǎn)化，結(jié)果獲得了一個(gè)豐度為1.0*107個(gè)克隆子/μgcDNA。構(gòu)建的蝎毒腺cDNA文庫(kù)陽(yáng)性插入率達(dá)到95％以上(圖417/17)，海南斑等蝎的毒素基因覆蓋率達(dá)到95％以上。
本發(fā)明的另一個(gè)目的還在于提供一種從海南斑等蝎毒腺cDNA文庫(kù)中篩選獲得抗菌肽基因。根據(jù)BmKb1設(shè)計(jì)一特定引物5’-gatcattgccaagcatt-3’，結(jié)合下游通用引物采用PCR策略從cDNA文庫(kù)中篩選目的毒素基因。其策略見圖5。將5ng cDNA和25ng pSPORT1載體連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的菌液800μl均勻涂布于10個(gè)LB/Ap+平板(每板80μl菌液)，37℃培養(yǎng)過夜，每個(gè)平板大約含有500個(gè)左右的菌落(克隆子)，將其逐一用牙簽接種至含有950μl的LB/Ap+平板培養(yǎng)基的1.5ml Ep管(并按順序編號(hào))，37℃280rpm振搖過夜，次日從每管取出100μl用作制備PCR模板，然后將每管加入150μl甘油，-20℃或-70℃保存。同時(shí)在每個(gè)平板中加入800μl LB/Ap+液體培養(yǎng)基(每升含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH值至7.4，青霉素100μg/ml)，用無菌接種環(huán)將菌落刮下，分裝入1.5ml Ep管，37℃培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后，用煮沸法制備質(zhì)粒，-20℃保存用作PCR模板。文庫(kù)篩選分三個(gè)輪次，首輪次用從10個(gè)平板制備的混合質(zhì)粒作模板，進(jìn)行10管PCR，電泳檢測(cè)后將陽(yáng)性管對(duì)應(yīng)的500個(gè)克隆分成的10管(每管50個(gè)克隆)進(jìn)行10管PCR。第三輪篩選就可以通過50管PCR獲得所需要的目的克隆。將陽(yáng)性克隆子送公司測(cè)序。結(jié)果表明A165克隆子為一個(gè)新的海南斑等蝎抗菌肽基因，命名為ImAMP1。一種分離的基因，其序列為SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一個(gè)目的還在于提供一種海南斑等蝎蝎毒抗菌肽。ImAMP1的前體組織形式編碼74個(gè)氨基酸殘基，由三個(gè)部分組成，即信號(hào)肽(22個(gè)殘基)、成熟肽(17個(gè)殘基)和前體肽(35個(gè)殘基)，見圖6?；谛舅厍绑wC末端殘基的加工規(guī)則，ImAMP1末端最后的殘基Lys被特異性羧肽酶(Carboxypeptidase)切除，且被酰氨化。因此，本發(fā)明提供一個(gè)海南斑等蝎蝎毒抗菌肽，一種分離或合成的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種特異性作用于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的蝎抗菌肽，可作為抗菌藥物開發(fā)。通過化學(xué)合成的辦法，得到了純度達(dá)95％以上，且與天然抗菌肽ImAMP1氨基酸序列一致的合成多肽(質(zhì)譜分析分子量和HPLC分析純度)(圖7)?？咕Y(jié)果表明對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌(圖8)、金黃色葡萄球菌(圖9)具有不同濃度的抑制作用，而對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌(圖10)和銅綠假單胞菌(圖11)無效，請(qǐng)見下表1。該蝎毒抗菌肽ImAMP1藥物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌具有特異性，與氨芐青霉素具有類似的抗菌效果。而且ImAMP1藥物可以對(duì)耐藥溶血性葡萄球菌(湖北省婦幼保健院檢驗(yàn)科急性分離的一株溶血性葡萄球菌，經(jīng)鑒定為頭孢類抗生素耐受MRCNS，編號(hào)1538)具有抗性作用(圖12)。
表1蝎毒抗菌肽ImAMP1藥物的抑菌效果

ImAMP1藥物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌蘇云金芽孢桿菌的最小抑菌濃度MIC為25μg/ml、對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC為50μg/ml、對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為25μg/ml。且ImAMP1藥物對(duì)湖北省婦幼保健醫(yī)院分離的耐藥溶血性葡萄球菌(耐受紅霉素)的MIC為25μg/ml。但I(xiàn)mAMP1藥物濃度達(dá)到100μg/ml時(shí)，對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌和銅綠假單胞菌仍然無效。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種突變型蝎毒抗菌肽。根據(jù)ImAMP1的成熟肽序列(SEQ ID NO2)，并利用軟件AHTHEPROT 2000(ftp://ftp.ibcp.fr/pub/antheprot/windows/anthe_5_0.exe)顯示其二級(jí)結(jié)構(gòu)圖像。結(jié)果表明，ImAMP1具有典型的兩親性(amphiphilic)α-Helix結(jié)構(gòu)，含有大量的疏水性殘基(Phe和Pro等)(圖13)。ImAMP1等電點(diǎn)(pHi)計(jì)算結(jié)果為8.75，符合多價(jià)陽(yáng)離子抗菌肽的這一特征。基于ImAMP1成熟肽氨基酸序列(SEQ ID NO2)的α-Helix結(jié)構(gòu)，兩親性和等電點(diǎn)，采用點(diǎn)突變將ImAMP1成熟肽氨基酸序列(SEQ ID NO2)的第3位Gly變?yōu)锳rg，第6位Pro變?yōu)長(zhǎng)ys，第10位Gly變?yōu)長(zhǎng)ys和第11位Gly變?yōu)锳rg。其突變型蝎毒抗菌肽ImAMP1-M的氨基酸，一種分離或合成的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID NO3所示的氨基酸序列?？咕囼?yàn)結(jié)果表明，化學(xué)合成的突變體ImAMP1-M不但提高了對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌效果，而且對(duì)革蘭氏陰性菌也有了抗性，請(qǐng)見下表2，擴(kuò)大了抗菌譜。另外，ImAMP1-M藥物仍然對(duì)耐藥溶血性葡萄球菌有抗性(圖14)。
表2突變體ImAMP1-M藥物的抑菌效果

突變型蝎毒抗菌肽ImAMP1-M對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌蘇云金芽孢桿菌的最小抑菌濃度MIC為25μg/ml、對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC為25μg/ml、對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為5μg/ml。ImAMP1-M對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌的MIC為12.5μg/ml、對(duì)銅綠假單胞菌的MIC為100μg/ml。突變型ImAMP1-M與野生型ImAMP1相比，其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭氏陰性菌的抗性大大增強(qiáng)。而且ImAMP1-M藥物對(duì)湖北省婦幼保健醫(yī)院分離的耐藥溶血性葡萄球菌(耐受紅霉素)的MIC為5μg/ml，比其野生型ImAMP1的MIC25μg/ml提高了5倍。
本發(fā)明獲得的蝎毒抗菌肽基因ImAMP1是從海南斑等蝎毒腺中分離的首個(gè)蝎毒液肽基因，同時(shí)也是從海南斑等蝎毒腺鑒定的第一個(gè)抗菌肽基因。并且，合成的野生型ImAMP1和突變型ImAMP1-M對(duì)醫(yī)院分離的耐藥溶血性葡萄球菌有效。


圖1海南斑等蝎毒腺細(xì)胞cDNA文庫(kù)構(gòu)建示意圖。
①取海南斑等蝎的毒腺；②提取總RNA，并純化mRNA；③反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA；④雙鏈cDNA與載體pSPORT1的連接；⑤重組分子的電轉(zhuǎn)化；⑥獲得毒腺細(xì)胞cDNA文庫(kù)。
圖2取自海南的斑等蝎及其毒腺。
圖3海南斑等蝎毒腺總RNA的甲醛變性電泳。
1蝎毒腺總RNA。
圖4PCR檢測(cè)文庫(kù)質(zhì)量電泳圖。
M標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量Mark；1-16從文庫(kù)中隨機(jī)挑選的16個(gè)不同克隆子。
圖5PCR篩選cDNA文庫(kù)的策略。
圖6海南斑等蝎蝎毒抗菌肽ImAMP1基因及其氨基酸。
cDNA序列下方為推斷的對(duì)應(yīng)氨基序列；信號(hào)肽氨基酸以單下劃線標(biāo)記；成熟肽氨基酸以黑體標(biāo)記；方框部分氨基酸為羧肽酶識(shí)別位點(diǎn)；陰影部分氨基酸為C端前體肽；雙劃線部分為PolyA加尾信號(hào)圖7化學(xué)合成海南斑等蝎抗菌肽ImAMP1和其突變體ImAMP1-M的HPLC純度和質(zhì)譜分子量鑒定圖。
AImAMP1野生型HPLC純度鑒定圖；BImAMP1野生型質(zhì)譜分子量鑒定圖；CImAMP1突變體HPLC純度鑒定圖；DImAMP1突變體質(zhì)譜分子量鑒定圖。
圖8ImAMP1藥物對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用。
陰性對(duì)照為1％BSA；陽(yáng)性對(duì)照為50μg/ml氨芐青霉素；抗菌肽ImAMP1藥物濃度為10μg/ml和100μg/ml。
圖9ImAMP1藥物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用。
陰性對(duì)照為1％BSA；陽(yáng)性對(duì)照為50μg/ml氨芐青霉素；抗菌肽ImAMP1藥物濃度為10μg/ml和100μg/ml。
圖10ImAMP1藥物對(duì)大腸桿菌的抑制作用。
陰性對(duì)照為1％BSA；陽(yáng)性對(duì)照為20μg/ml卡那霉素；抗菌肽ImAMP1藥物濃度為10μg/ml和100μg/ml。
圖11ImAMP1藥物對(duì)銅綠假單胞菌的抑制作用。
陰性對(duì)照為1％BSA；陽(yáng)性對(duì)照為20μg/ml卡那霉素；抗菌肽ImAMP1藥物濃度為10μg/ml和100μg/ml。
圖12海南斑等蝎抗菌肽ImAMP1及其突變體ImAMP1-M的螺旋輪圖和等電點(diǎn)預(yù)測(cè)。
AImAMP1野生型的螺旋輪圖；B ImAMP1-M突變體的螺旋輪圖。
圖13野生型ImAMP1藥物對(duì)耐藥溶血性葡萄球菌的抗性作用。
陽(yáng)性對(duì)照為30μg萬古霉素；耐藥抗生素為15μg紅霉素；野生型抗菌肽ImAMP1藥物為50μg；陰性對(duì)照為1％BSA。
圖14突變型ImAMP1-M藥物對(duì)耐藥溶血性葡萄球菌的抗性作用。
陽(yáng)性對(duì)照為30μg萬古霉素；耐藥抗生素為15μg紅霉素；突變型抗菌肽ImAMP1-M藥物為50μg；陰性對(duì)照為1％BSA。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1蝎毒腺總RNA的提取(Trizol LS一步法)①取500mg的蝎尾腺在液氮中研成細(xì)粉末，加入10ml TRIZOL reagent(購(gòu)自美Invitrogen)混勻，室溫(20-25℃，以下相同)放置5分鐘；②然后加入2ml氯仿混合15秒，室溫放置2-3分鐘，4℃下12000g離心15分鐘；③取水相加1倍體積異丙醇，室溫放置10分鐘，4℃下12000g離心10分鐘得RNA沉淀；④沉淀用5ml 75％乙醇洗滌，7500g離心5分鐘；⑤RNA沉淀干燥后溶于DEPC-treatedwater，55-60℃保溫10分鐘以徹底溶解RNA。整個(gè)過程參照TR1ZOL(Total RNAIsolation)Reagent Kit推薦方法進(jìn)行。制備的蝎毒腺總RNA采用甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量。
實(shí)施例2mRNA的分離純化采用PolyA Tract mRNA分離系統(tǒng)(Promega，USA)分離和純化mRNA，其工作原理是基于Oligo(dT)與mRNA 3’端poly(A)尾的互補(bǔ)配對(duì)特性，用生物素標(biāo)記Oligo(dT)，通過它與mRNA 3’端poly(A)的退火形成雜交體，然后用標(biāo)有親合素的磁珠和磁性分離架捕獲并洗滌生物素Oligo(dT)/mRNA雜交體，最后用無RNA酶的ddH2O將之洗脫下來，達(dá)到從總RNA中分離mRNA的目的。①樣品的制備將RNA加入到含有32μl β-巰基乙醇的800μl的GTC中。②探針的退火取250pM濃度Oligo(dT)5μl，加蒸餾水至50μl；加入1.6ml預(yù)熱的dilution buffer(dilution buffer已加入32μl β-巰基乙醇)，與RNA混勻，70℃溫育5分鐘。③磁珠的活化取1.2ml的磁珠SA-PMPS(購(gòu)自美Promega)于1.5ml的離心管中；用0.5×SSC重懸SA-PMPS，以磁架吸附磁珠，原體積0.5×SSC洗滌SA-PMPS3次。④mRNA的獲取將70℃溫育的RNA與SA-PMPS混合，室溫放置5分鐘放磁架上吸附磁珠，棄上清液；2ml的0.5XSSC懸浮磁珠，洗滌重復(fù)2次，最后一次盡量去除SSC；加入無RNA酶的ddH2O至磁珠中，輕輕混勻，然后離心(12000g×3分鐘)或磁架吸附磁珠；取上清，獲得mRNA。通過電泳和紫外測(cè)定mRNA的濃度和純度。⑤mRNA的沉淀將④獲得的mRNA中加入糖原和2.5倍體積的無水乙醇，沉淀過夜，mRNA將用于cDNA的合成。
實(shí)施例3第一鏈cDNA合成①在1.5ml Ep管中加入2μl Not I Primer-adapter和6μl mRNA(含3μg mRNA)，70℃溫育10min，迅速放于冰上，簡(jiǎn)單離心后，加入下列成分4μl 5X first strand buffer；2μl 0.1M DTT；1μl 10mM dNTPs；1μl DEPC·H2O。輕輕混勻后簡(jiǎn)單離心，37℃放至2min；②加入5μl逆轉(zhuǎn)錄酶，混勻后取2μl，加1μl[α-32P]dCTP(4μCi)(示蹤管)。與上述反應(yīng)組分(樣品管)同時(shí)37℃溫育1h，然后放入冰上終止反應(yīng)；③對(duì)于示蹤管，依次加入43μl 20mM EDTA和5μl酵母tRNA，混勻后，分別取兩份10μl點(diǎn)于兩張濾膜上，1份用10％TCA洗3次，每次5min，95％乙醇洗1次，空氣干燥后，放入1.5ml閃爍液中(為1#樣品)；另1份空氣干燥后，放入1.5ml閃爍液(為2#樣品)。另30μl示蹤液，加1.5μl 7.5M NH4OAc和90μl無水乙醇(-20℃)，混勻后立即14,000rpm離心20min，棄上清，加入0.5ml 70％無水乙醇(-20℃)，14,000rpm離心2min，棄上清，37℃干燥10min讓乙醇揮發(fā)，溶于10μl TEN溶液，加入10μl 2X加樣緩沖液，取10μl用于堿性凝膠電泳。用[α-32P]dCTP標(biāo)記λDNA HindIII片段作分子量標(biāo)記；④混勻后室溫下放置15min，加入2μl 0.2M EDTA終止反應(yīng)。取6μl反應(yīng)液和6ml 2X堿性電泳緩沖液混勻，電泳5h后，用7％TCA浸泡20min，直至溴酚蘭變黃。然后用衛(wèi)生紙吸干(8h左右)，進(jìn)行放射自顯影；⑤對(duì)于樣品管，用于第二鏈的合成。
Hind III 10X buffer 2μldGTP0.2mMdATP0.2mM[α-32P]dCTP 2μCi
Hind III markers 1μgKlenow DNA polymerase 2unitAdd ddH2O to final volume of 20μl實(shí)施例4第二鏈cDNA合成①冰上在樣品管中依次按下表加入下列成分；②輕輕混勻后，16℃溫育2h；③加入2μl(10units)T4DNA聚合酶，繼續(xù)16℃反應(yīng)5min；④轉(zhuǎn)入冰上，加入10μl 0.5M EDTA；⑤加入等體積(150μl)酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)，徹底渦旋后，室溫下14,000rpm離心5min。將水相(140μl)轉(zhuǎn)入另一1.5ml Ep管；⑥加入1/2體積(70μl)7.5M NH4OAc和0.5ML無水乙醇(-20℃)，渦旋后，室溫下14,000rpm離心20min；⑦棄上清，加入0.5ml 70％乙醇(-20℃)，同上離心2min。棄上清，37℃干燥10min。
DEPC-treated water 92μl5X second strand buffer 30μl10mM dNTP mix3μlE.coli DNA ligase(10units/μl) 1μlE.coli DNA polymerase(10units/μl) 4μlE.coli RNase H(2units/μl) 1μlFinal Volume 150μl實(shí)施例5雙鏈cDNA與Sal I銜接頭的連接①用25μl_DEPC處理的ddH2O溶解實(shí)施例4的cDNA樣品，然后按下表依次加入；②輕輕混勻，16℃反應(yīng)過夜(約20h)。③用酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)抽提和NH4Oac/乙醇沉淀后，37℃干燥10min。
5X T4DNA ligase buffer 10μlSal I adapters 10μlT4DNA ligase5μlFinal Volume 50μl
實(shí)施例6Not I消化雙鏈cDNA①將實(shí)施例5的樣品溶于41μl，然后按下表依次加入；②混勻后，37℃溫育2h；③用酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)抽提一次，然后用7.5M NH4Oac/乙醇沉淀，37℃干燥10min。④溶于70μl TEN，取1μl用于定量，其余-20℃保存?zhèn)溆谩?br> REACT 3 buffer 5μlNot I 4μlFinal Volume50μl實(shí)施例7去除雙鏈cDNA分子中的過量Sal I銜接頭和酶切小片段用nucleon extraction and purification kit(Amersham，USA)去除過量Sal I銜接頭和酶切小片段。①室溫下懸浮樹脂，然后取600μl加于離心柱中，2000rpm離心10s，去掉液體。在樹脂中央加入40μl上述cDNA溶液。同上離心；②收集洗脫液用于連接反應(yīng)。
實(shí)施例8雙鏈cDNA與pSPORT1載體的連接和轉(zhuǎn)化①在1.5ml Ep管中依次按下表加入成分；②室溫下反應(yīng)16h；③在上述實(shí)施例7中依次加入下列成分5.0μl yeast tRNA，12.5μl 7.5M NH4Oac，70μl無水乙醇(-20℃)。渦旋混勻后立即14000離心20min；④沉淀用70％乙醇(-20℃)洗滌，37℃干燥后溶于4μl；⑤取2μl電擊轉(zhuǎn)化50μl E.coli K12MC1061。
5X T4DNA ligase buffer4μlpSPORT1，NotI-SalI-Cut(50ng/μl) 1μlcDNA(3ng/μl) 4μlT4DNA ligase 1μlAdd ddH2O to final volume 20μl
實(shí)施例9毒腺細(xì)胞cDNA文庫(kù)的初步鑒定用PCR方法鑒定文庫(kù)的質(zhì)量，正向引物5′-TCGACCCACGCGTCCG-3′(按SalI銜接頭序列設(shè)計(jì))；反向引物5′-GAGCGGCCGCCT15-3′(按NotI引物-銜接頭的序列設(shè)計(jì))。
實(shí)施例10PCR引物的設(shè)計(jì)基于蝎毒素BmKb1的前體核苷酸序列agaatattcgaaactcggccaagatggaaataaagtatcttcttaccgtcttcttagtcctgctaatagtgtcc tctgttttctctaataccatcagccatcagcgggctcatcagcgcttttaaaggaagaaggaaaagagatttgaatggctatatagaccacttcaagaattttagaaaacgtgatgccgaattggaagaattactttctaaactaccaatttattaacttctttacgtactacagtcgttagtctctcttccggtcgtttcctaatataaattaaaaattataaactgttggtgaaattaataaatattttttcttaaatataaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa。設(shè)計(jì)特定正向引物FP15′-GATCATTGCCAAGCATT-3′。反向引物RP15′-GAGCGGCCGCCT15-3′，根據(jù)建庫(kù)試劑盒提供的合成第一鏈cDNA引物的序列設(shè)計(jì)。
實(shí)施例11PCR策略篩選cDNA文庫(kù)采用PCR的方法對(duì)實(shí)施例8中構(gòu)建的海南斑等蝎毒腺細(xì)胞cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，其篩選策略見圖5和具體操作步驟如下①取cDNA蝎毒庫(kù)800μl均勻涂布于10個(gè)LB/AP+平板，37℃培養(yǎng)過夜；②每個(gè)平板大約含有500個(gè)左右的單菌落，將其逐一用牙簽接種至600μl的LB/AP+液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜；③取50μl煮沸1分鐘，以制備PCR模板；④其余菌溶液中加入300μl60％無菌甘油-20℃保存；⑤同時(shí)，在每個(gè)平板中加入500μlLB/AP+溶液，用無菌接種環(huán)將菌落刮下，分裝入1.5mlEp管，37℃培養(yǎng)6小時(shí)后，取100μl煮沸1分鐘，制備成為PCR模板；⑥首先用每個(gè)平板的混合菌溶液作為PCR模板，用PCR引物FP1和RP1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性1分鐘，50℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，最后72℃延伸5分鐘，循環(huán)35次。對(duì)經(jīng)PCR反應(yīng)能擴(kuò)出約200bp帶的平板進(jìn)行再篩選，即取此平板中的每個(gè)單菌落的菌溶液10μl，每50管混合后再進(jìn)行PCR反應(yīng)，對(duì)有陽(yáng)性信號(hào)的管所對(duì)應(yīng)的50個(gè)菌再進(jìn)行PCR反應(yīng)。將有約200bpPCR擴(kuò)增帶的單克隆菌溶液送交公司測(cè)序。結(jié)果表明A165克隆子為一個(gè)新的抗菌肽基因，命名為ImAMP1。一種分離的多肽基因，其序列為SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
實(shí)施例12DNA測(cè)序和計(jì)算機(jī)分析通過PCR篩選初步鑒定為陽(yáng)性的克隆用ABI PRISMTMDNA自動(dòng)測(cè)序儀(北京華大基因公司)進(jìn)行測(cè)序。同源性比較和信號(hào)肽切割位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件分別為CLUSTAL X 1.8(Thompson et al.，1997)和PC/GENE(Intelligenetics Inc.，Switzerland)。
實(shí)施例13化學(xué)合成蝎毒抗菌肽ImAMP1ImAMP1的前體組織形式編碼74個(gè)氨基酸殘基，由三個(gè)部分組成，即信號(hào)肽(22個(gè)殘基)、成熟肽(17個(gè)殘基)和前體肽(35個(gè)殘基)，如圖6所示?；谛舅厍绑wC末端殘基的加工規(guī)則，ImAMP1末端最后的殘基Lys被特異性羧肽酶(Carboxypeptidase)切除，且被酰氨化。因此，采用化學(xué)合成的辦法獲得高純度的蝎毒抗菌肽一種合成的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
實(shí)施例14蝎毒肽ImAMP1藥物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的抑制試驗(yàn)革蘭氏陽(yáng)性菌蘇云金芽孢桿菌(CCTCCAB92037)、枯草芽孢桿菌(CCTCCAB91021)、金黃色葡萄球菌(CCTCCAB94004)和革蘭氏陰性菌大腸桿菌(CCTCCAB94012)、銅綠假單胞菌(CCTCCAB93066)均購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。
96孔板培養(yǎng)法①分別將革蘭氏陽(yáng)性菌蘇云金芽孢桿菌(CCTCCAB92037)、枯草芽孢桿菌(CCTCCAB91021)、金黃色葡萄球菌(CCTCCAB94004)和革蘭氏陰性菌大腸桿菌(CCTCCAB94012)、銅綠假單胞菌(CCTCCAB93066)培養(yǎng)到OD600＝0.8時(shí)，稀釋400倍后取80μl加入到96孔板中，然后分別向多孔加入20μl經(jīng)等比稀釋的ImAMP1，達(dá)到終濃度為100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照孔分別加入20μl 1％BSA和20μl的卡那霉素(革蘭氏陰性菌終濃度為20μg/ml)或青霉素(革蘭氏陽(yáng)性菌終濃度為50μg/ml)；②37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，用酶標(biāo)儀測(cè)96孔板中各孔的在600nM波長(zhǎng)處的吸光值；③確定藥物ImAMP1的10倍稀釋的最低抑制濃度后，將最低抑制濃度進(jìn)行2倍等比稀釋，重復(fù)試驗(yàn)的前①②步驟。最終確定蝎毒抗菌肽ImAMP1對(duì)細(xì)菌的最低抑制濃度。野生型蝎毒抗菌肽ImAMP1對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌蘇云金芽孢桿菌的最小抑菌濃度MIC為25μg/ml、枯草芽孢桿菌的MIC為50μg/ml、對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為25μg/ml；而ImAMP1藥物濃度達(dá)到100μg/ml時(shí)，對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌和銅綠假單胞菌無抑制作用。
涂平板法(1)分別將革蘭氏陽(yáng)性菌蘇云金芽孢桿菌(CCTCCAB92037)、枯草芽孢桿菌(CCTCCAB91021)和革蘭氏陰性菌大腸桿菌(CCTCCAB94012)、銅綠假單胞菌(CCTCCAB93066)培養(yǎng)到OD600＝0.8時(shí)，稀釋400倍后取800μl加入到滅菌試管中，然后分別向試管加入200μl經(jīng)等比稀釋的ImAMP1，達(dá)到終濃度為100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照孔分別加入200μl 1％BSA和200μl的卡那霉素(革蘭氏陰性菌終濃度為20μg/ml)或青霉素(革蘭氏陽(yáng)性菌終濃度為50μg/ml)；(2)從37℃，250轉(zhuǎn)培養(yǎng)6小時(shí)后的各試管菌液做適當(dāng)?shù)南♂尯?，?0μl涂布平板，以確保陰性對(duì)照菌形成的菌落數(shù)為50-300個(gè)，以便進(jìn)行計(jì)數(shù)；(3)第一輪確定藥物ImAMP1的10倍稀釋的最低抑制濃度后，將最低抑制濃度進(jìn)行2倍等比稀釋，重復(fù)試驗(yàn)的前(1)(2)步驟。最終確定蝎毒抗菌肽ImAMP1的抑菌效果。野生型蝎毒抗菌肽ImAMP1對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌蘇云金芽孢桿菌的有效抑菌濃度為75μg/ml、對(duì)枯草芽孢桿菌的有效抑菌濃度為75μg/ml、對(duì)金黃色葡萄球菌的有效抑菌濃度為20μg/ml；而ImAMP1藥物濃度達(dá)到100μg/ml時(shí)，對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌和銅綠假單胞菌無抑制作用。
實(shí)施例15突變體ImAMP1-M藥物對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制試驗(yàn)革蘭氏陽(yáng)性菌蘇云金芽孢桿菌(CCTCCAB92037)、枯草芽孢桿菌(CCTCCAB91021)、金黃色葡萄球菌(CCTCCAB94004)和革蘭氏陰性菌大腸桿菌(CCTCCAB94012)、銅綠假單胞菌(CCTCCAB93066)均購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。
96孔板培養(yǎng)法①分別將大腸桿菌、銅綠假單胞菌(革蘭氏陰性菌)和金蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、黃色葡萄球菌(革蘭氏陽(yáng)性菌)培養(yǎng)到OD600＝0.8時(shí)，稀釋400倍后取80μl加入到96孔板中，然后分別向多孔加入20μl經(jīng)等比稀釋的ImAMP1-M，達(dá)到終濃度為100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照孔分別加入20μl 1％BSA和20μl的卡那霉素(革蘭氏陰性菌終濃度為20μg/ml)或青霉素(革蘭氏陽(yáng)性菌終濃度為50μg/ml)；②37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，用酶標(biāo)儀測(cè)96孔板中各孔的在600nM波長(zhǎng)處的吸光值；③確定藥物ImAMP1-M的10倍稀釋的最低抑制濃度后，將最低抑制濃度進(jìn)行2倍等比稀釋，重復(fù)試驗(yàn)的前①②步驟。最終確定蝎毒抗菌肽ImAMP1-M對(duì)細(xì)菌的最低抑制濃度。突變型蝎毒抗菌肽ImAMP1-M對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌對(duì)蘇云金芽孢桿菌的最小抑菌濃度MIC為25μg/ml、對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC為25μg/ml、對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為5μg/ml，而ImAMP1-M對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌的MIC為12.5μg/ml、對(duì)銅綠假單胞菌的MIC為100μg/ml。突變型ImAMP1-M與野生型ImAMP1相比，不但增強(qiáng)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的作用，而且其對(duì)革蘭氏陰性菌的抗性大大增強(qiáng)。
實(shí)施例16蝎毒抗菌肽ImAMP1-M突變體的分子設(shè)計(jì)將ImAMP1的成熟肽序列(SEQ ID NO2)，利用軟件ANTHEPROT2000(ftp://ftp.ibcp.fr/pub/antheprot/windows/anthe_5_0.exe)顯示其二級(jí)結(jié)構(gòu)圖像。結(jié)果表明，ImAMP1具有典型的兩親性(amphiphilic)α-Helix結(jié)構(gòu)，第4位的亮氨酸、第15位的丙氨酸、第8位的亮氨酸、第1位的亮氨酸、第12位的亮氨酸、第5位的異亮氨酸、第16位的苯丙氨酸、第9位的異亮氨酸、第2位的苯丙氨酸和第13位的頡氨酸形成一個(gè)疏水面，而第11位的甘氨酸、第7位的絲氨酸、第14位的絲氨酸、第3位的甘氨酸、第10位的甘氨酸、第17位的賴氨酸和第6位的脯氨酸形成一個(gè)親水面(圖13)。ImAMP1等電點(diǎn)(pHi)計(jì)算結(jié)果為8.75，符合多價(jià)陽(yáng)離子抗菌肽的這一特征?；贗mAMP1成熟肽氨基酸序列的α-Helix結(jié)構(gòu)，兩親性和等電點(diǎn)，采用點(diǎn)突變將ImAMP1成熟肽氨基酸序列的第3位甘氨酸變?yōu)榫彼?，?位脯氨酸變?yōu)橘嚢彼?，?0位甘氨酸變?yōu)橘嚢彼岷偷?1位甘氨酸變?yōu)榫彼帷?duì)其突變體ImAMP1-M氨基酸進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，并利用軟件AHTHEPROT 2000顯示其突變體ImAMP1-M二級(jí)結(jié)構(gòu)圖像。結(jié)果表明，與野生型ImAMP1相比，突變體ImAMP1-M具有更典型的兩親性。其突變型蝎毒抗菌肽ImAMP1-M的氨基酸序列為一種合成的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。
實(shí)施例17ImAMP1和ImAMP1-M藥物對(duì)耐藥溶血性葡萄球菌的抑制試驗(yàn)?zāi)退幦苎云咸亚蚓旰笔D幼保健院檢驗(yàn)科急性分離的一株溶血性葡萄球菌，經(jīng)鑒定為MRCNS(頭孢類抗生素耐受)，編號(hào)“1538”。
96孔板培養(yǎng)法①將耐藥溶血性葡萄球菌培養(yǎng)到OD600＝0.8時(shí)，稀釋400倍后取80μl加入到96孔板中，然后分別向多孔加入20μl經(jīng)等比稀釋的ImAMP1或ImAMP1-M，達(dá)到終濃度為100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照孔分別加入20μl 1％BSA和20μl的氨芐青霉素(終濃度為50μg/ml)；②37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，用酶標(biāo)儀測(cè)96孔板中各孔的在600nM波長(zhǎng)處的吸光值；③確定藥物ImAMP1或ImAMP1-M的10倍稀釋的最低抑制濃度后，將最低抑制濃度進(jìn)行2倍等比稀釋，重復(fù)試驗(yàn)的前①②步驟。最終確定蝎毒抗菌肽ImAMP1和ImAMP1-M對(duì)耐藥溶血性葡萄球菌的最低抑制濃度分別為5μg/ml和2.5μg/ml。
抑菌斑實(shí)驗(yàn)法新鮮接種的耐藥溶血性葡萄球菌斑培養(yǎng)過夜，用無菌的醫(yī)用棉簽挑取菌落，并用無菌的生理鹽水稀釋到0.5麥?zhǔn)蠞舛龋缓笥脽o菌棉簽將上述菌懸液均勻涂布到9cm平板；向已經(jīng)滅菌好的直徑為5mm的濾紙片上加20μl多肽溶液，使紙片上最終含50μg的ImAMP1或ImAMP1-M多肽，然后將此紙片貼到平板上。陰性對(duì)照為20μl 1％BSA，陽(yáng)性對(duì)照為英國(guó)Oxoid公司生產(chǎn)的含有抗生素的濾紙片，分別為紅霉素(15μg)和萬古霉素(30μg)；待紙片貼好后，將平板倒置培養(yǎng)過夜，觀察抑菌斑大小。其結(jié)果是紅霉素樣品和1％BSA都沒有出現(xiàn)抑菌圈，而萬古霉素樣品有20mm的抑菌圈，蝎毒抗菌肽ImAMP1和ImAMP1-M藥物的抑菌圈大小分別為10mm和12mm。
SEQUENCE LISTING<110>武漢大學(xué)<120>一種海南斑等蝎抗菌肽及制備方法和應(yīng)用<130>一種海南斑等蝎抗菌肽及制備方法和應(yīng)用<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>442<212>DNA<213>Isometrus maculates<400>1atcaatttca ctactaggaa aatgaaagtt aaattccttc tcgctgtctt cttgatcgtt60ttggttgtta ctgatcattg tcatgcattg ttcggactta tcccttcgtt gatcggaggg120ctggtatcag cattcaaggg ccgaaggaaa cgccagatgg aagctcgatt cgaaccccaa180aataggaatt acaggaaacg cgagctcgac cttgaaaagt tattcgcaaa tatgcctgat240tactgatctc aattactctt tcagtttcat cgcttagcat aagtttttca agttactgcc300gctactattg catcatgatg tgaattggtt actttctaat ataataaaaa aactatactt360aatcataaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa420aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 442<210>2<211>17<212>PRT<213>Isometrus maculates<400>2
Leu Phe Gly Leu Ile Pro Ser Leu Ile Gly Gly Leu Val Ser Ala Phe1 5 10 15Lys<210>3<211>17<212>PRT<213>Isometrus maculates<400>3Leu Phe Arg Leu Ile Lys Ser Leu Ile Lys Arg Leu Val Ser Ala Phe1 5 10 15Lys
權(quán)利要求
1.一種海南斑等蝎抗菌肽重組大腸桿菌，其特征在于蝎毒抗菌肽重組大腸桿菌Escherichia coli DH5a/ImAMP1，CCTCC NOM207034。
2.一種分離的抗菌肽基因，其序列為SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
3.一種分離的抗菌肽蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
4.一種分離的抗菌肽蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求1所述的一種海南斑等蝎抗菌肽重組大腸桿菌的制備方法，它包括下列步驟A、構(gòu)建了海南斑等蝎毒腺細(xì)胞cDNA文庫(kù)；B、以步驟A毒腺細(xì)胞cDNA文庫(kù)為基礎(chǔ)，通過PCR篩選獲得了一個(gè)陽(yáng)性克隆子A165，為一種抗菌肽基因；C、采用化學(xué)合成的方法，獲得了蝎毒抗菌肽ImAMP1和ImAMP1-M。
6.一種海南斑等蝎抗菌肽在制備治療或預(yù)防革蘭氏細(xì)菌的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種海南斑等蝎抗菌肽及制備方法和應(yīng)用，其特征是蝎毒抗菌肽重組大腸桿菌Escherichia coli DH5a/ImAMP
文檔編號(hào)C07K14/435GK101063103SQ20071005196
公開日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2007年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月26日
發(fā)明者曹志賤, 李文鑫, 吳英亮, 馬一保, 戴潮 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)