專利名稱：高純度甘草查爾酮a的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)用藥物、化工領(lǐng)域，特別涉及一種從甘草(Glycyrrhiza) 中提取分離純化獲得高純度(〉90%)甘草査爾酮A (Licochalcone A)的方法。
背景技術(shù)：
甘草査爾酮A (Licochalcone A)是甘草中的一種査爾酮，其結(jié)構(gòu)為:近年來隨著對甘草査爾酮A的不斷深入研究，發(fā)現(xiàn)其除了具有抗氧 化、清除自由基的活性外，還具有抗利什曼原蟲病(尤指黑熱病)、抗炎、 抗HIV、抗腫瘤、抗菌、免疫促進等功能，在食品和醫(yī)藥工業(yè)中有廣泛的 用途。文獻Biochemical and Biophysical Research Communications 2004 322 263-270報道甘草査爾酮A能抑制激素非依賴性PC-3前列腺癌細胞的增 殖，提示甘草查爾酮A有望開發(fā)成為一種新的治療前列腺癌藥物。文獻 Journal of Antimicrobial Chemotherapy 1999 43 793-803報道甘草査爾酮A 對寄生性疾病瘧疾和利什曼原蟲病(尤指黑熱病)有很好的療效。文獻 Antimicrobial Agents and Chemotheraphy 2002 46 1226-1230報道甘草査爾 酮A對芽孢型食品感染菌如genera Bacillus and Clostridium有較好的抑制 效果，可以作為食品添加劑延長食品保藏時間。
隨著對甘草査爾酮A藥理作用的研究，它的應(yīng)用受到了人們的廣泛關(guān) 注。然而由于甘草査爾酮A在甘草中的含量較低，因此要取得高純度的甘草査爾酮A工藝極為繁復(fù)，成本昂貴，目前市場上所使用的甘草査爾酮A 只是含量不一的甘草査爾酮A粗品。目前國內(nèi)有關(guān)的文獻報道制取甘草査 爾酮A純品的方法成本都非常昂貴，《甘草查爾酮分離純化工藝的研究》 (寧夏工程技術(shù)，4 (4)， 2005， 363-365) —文報道了提取分離甘草查爾 酮的操作，此法用乙醇浸泡，石灰水除雜，大孔樹脂粗分離后，Na2C03 溶液和乙酸乙酯反復(fù)萃取，采用聚酰胺柱層析，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫， 此后再采用硅膠柱層析，使用甲苯-氯仿-丙酮作為洗脫劑，最后結(jié)晶得到 査爾酮，該操作工藝繁雜，硅膠的使用量較大，還消耗了大量不能回收 的混合溶劑?！陡咚倌媪魃V法分離純化甘草査爾酮甲和脹果香豆素甲》(現(xiàn)代中 藥研究與實踐，18， 2004， 53-56) —文報道了從甘草中精制高純度甘 草查爾酮A的方法，此法用95%乙醇超聲提取，2。/。NaOH除雜，2%鹽酸 沉淀得甘草査爾酮A粗品，然后采用高速逆流色譜法分離純化甘草查爾 酮A，該法分離效果較好，但對樣品的處理量有限，且對設(shè)備和溶劑系 統(tǒng)要求較高，也消耗了大量不能回收的混合溶劑，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。以上方法都消耗了大量的吸附劑及毒性極大的有機溶劑，操作也異 常繁復(fù)，成本的昂貴限制了它們進入商品市場。從發(fā)展趨勢來看，必須 開發(fā)出能規(guī)?；a(chǎn)高純度、低成本甘草查爾酮A的制備工藝。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種高純度甘草查爾酮A的制備方法。目的是克服現(xiàn)有 方法操作繁復(fù)，成本昂貴的缺陷，以適合低成本的工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的高純度甘草查爾酮A的制備方法，順序包括(6) 提取步驟，將甘草干燥粉碎，以冷滲法、溫浸法或回流法
中的一種方法，將甘草粉以溶劑提取1 3次，合并提取液；所述的提取 溶劑為下述溶劑中的一種A.甲醇與水的混合物，混合物中甲醇的含量占0 — 100wt。/。;B，乙醇與水的混合物，混合物中乙醇的含量占0 — 100wtQ/o; C.丙酮與水的混合物，混合物中丙酮的含量占0 — 100wt。/。；(7) 濃縮步驟，將提取液減壓濃縮，回收提取液中的有機溶劑， 將提取液濃縮至20。C時的比重為1.05 1. 15，得提取物濃縮液；(8) 萃取步驟，以有機溶劑分批萃取或采用連續(xù)流萃取提取物 濃縮液，獲得有機溶劑萃取相和萃余相；所述有機溶劑為正丁醇、乙酸 乙酯、正己烷、氯仿或異戊醇中的一種；(9) 分離步驟，將有機溶劑萃取相進行減壓濃縮，回收其中的 有機溶劑，得到濃縮物，濃縮物采用柱層析分離，洗脫劑由乙醇水溶液 或甲醇水溶液或丙酮水溶液組成，其中水占的比例為100—0wt。/。，進行等 度或梯度洗脫，用薄層層析檢測法或高效液相色譜法檢査流出液，收集 含甘草査爾酮A的流出液，并減壓濃縮此流出液，得甘草查爾酮A濃縮物；(10) 結(jié)晶步驟，將甘草査爾酮A濃縮物用有機溶劑結(jié)晶即得甘 草査爾酮A純品，經(jīng)檢測其純度不低于90%;所述的結(jié)晶有機溶劑是丙酮、 乙醇、甲醇、異丙醚、氯仿或它們的混合溶劑。所述的高純度甘草査爾酮A的制備方法，其特征在于，所述提取步 驟中(1)所述的冷滲法為在室溫下以5 20倍質(zhì)量比的溶劑浸泡甘草 粉，然后以滲漉的方法進行提取；(2)所述的溫浸法為在40 5(TC溫度 下以5 20倍質(zhì)量比的溶劑浸泡甘草粉、攪拌并保溫3 6小時；(3)所 述的回流法是以5 20倍質(zhì)量比的溶劑浸泡甘草粉，加熱使溶劑回流并 保持回流狀態(tài)1 5小時。
所述的高純度甘草查爾酮A的制備方法，其特征在于，所述提取步 驟中，所述的提取溶劑為下述溶劑中的一種(1)甲醇與水的混合物， 混合物中甲醇的含量占40 —80wt%; (2)乙醇與水的混合物，混合物中乙醇的含量占40—80wt。/。； (3)丙酮與水的混合物，混合物中丙酮的含 量占40—80wt%。所述的高純度甘草查爾酮A的制備方法，其特征在于(1)所述濃縮步驟為真空減壓濃縮，真空度為0.01 0. 1Mpa，溫度40 80。C，濃縮 液2(TC時比重為1.05 1.15; (2)所述萃取步驟，是指以1 3倍體積 比的有機溶劑萃取，萃取方式可以為攪拌萃取，室溫或4 1(TC低溫靜置 分層，萃取次數(shù)1 3次；或采用有機溶劑連續(xù)流萃取分離機進行萃取， 萃取次數(shù)1 3次；(3)所述分離步驟中，將有機溶劑萃取液減壓濃縮為 真空減壓方式，真空度為0.01 0. 1Mpa，溫度40 80。C;所使用的柱層 析填料為大孔徑樹脂、聚酰胺或葡聚糖凝膠。本發(fā)明采用優(yōu)化的提取和純化工藝，利用可重復(fù)使用的柱層析填料， 以水、醇、丙酮等無毒或低毒可回收溶劑，進行淋洗，再經(jīng)一次簡便無 需低溫的常規(guī)結(jié)晶就能獲得高純度甘草查爾酮A;工藝簡單，成本低廉、 適合工業(yè)化生產(chǎn)，為進一步研究甘草査爾酮A單體的藥理作用提供了依 據(jù)，所得產(chǎn)品為橘黃色針狀晶體，其中甘草査爾酮A純度高于90X。


圖1是本發(fā)明方法制備的甘草査爾酮A高效液相譜圖。
具體實施方式
下面的實施案例是對本發(fā)明的進一步詳細描述，但其不意味著對本
發(fā)明的任何限制。
實施例1
'稱取干燥粉碎的甘草粉lKg，以20倍量的80%乙醇在室溫下浸泡2h， 然后以冷滲法提取，滲漉速度為10mL/min，滲漉液減壓濃縮，濃縮至比 重為1.08 (2CTC)時，用水飽和的正丁醇按l:l比例攪拌萃取3次，合 并萃取液并減壓濃縮回收正丁醇，所得濃縮物以500g大孔D101樹脂吸 附，乙醇水梯度洗脫，其中水占乙醇水的比例由100wt%，間隔20wt°/o， 梯度遞減至Owt%，用薄層層析檢測法檢査流出液，收集含甘草查爾酮A的 流出液，減壓濃縮得甘草査爾酮A濃縮物，再經(jīng)異丙醚-丙酮結(jié)晶，得2. 82 克純度92. 21 %的甘草查爾酮A純品。
實施例2
稱取干燥粉碎的甘草粉1Kg，以無水乙醇按質(zhì)量比1:3和1:2回流提 取2次，每次1小時，過濾，合并濾液，減壓回收乙醇，濃縮近干后加 水至比重l. 10 (2(TC)，用乙酸乙酯按l:l比例攪拌萃取3次，合并萃取 液，減壓回收乙酸乙酯，所得濃縮物以500g聚酰胺吸附，乙醇水梯度洗 脫，其中水占乙醇水的比例由100wt%，間隔15wt%，梯度遞減至Owt%, 用薄層層析檢測法檢查流出液，收集含甘草查爾酮A的流出液，減壓濃 縮得甘草查爾酮A濃縮物，再經(jīng)乙醇-異丙醚結(jié)晶，得2.07克純度91.82 X的甘草査爾酮A純品。
實施例3
稱取干燥粉碎的甘草粉1Kg，分別用10倍、5倍、5倍量的80°/。丙酮 水回流提取3次，第一次提取3h，第二次提取lh，第三次提取lh過濾， 合并提取液，4(TC減壓回收丙酮，濃縮至比重1.05 (2(TC)，用乙酸乙酯 按1:3比例連續(xù)流萃取，濃縮萃取液，所得濃縮物以500g大孔D101樹 脂吸附，乙醇水梯度洗脫，其中水占乙醇水的比例由100wt%，間隔20wt%， 梯度遞減至Owt%,用薄層層析檢測法檢查流出液，收集含甘草查爾酮A的
流出液，減壓濃縮得甘草査爾酮A濃縮物，再經(jīng)異丙醚-丙酮結(jié)晶，得2. 73克純度91. 77%的甘草査爾酮A純品。 實施例4稱取干燥粉碎的甘草粉1Kg，以10倍量無水甲醇在室溫下進行滲漉， 滲漉速度為5ml/min，滲漉液減壓濃縮近干后加水至比重1. 10 (20°C)， 用正己烷按1:1比例采用連續(xù)流萃取分離機萃取2次，合并萃取液并減 壓濃縮，所得濃縮物以500g大孔AB-8樹脂吸附，丙酮水梯度洗脫，其 中水占丙酮水的比例由100wt%，間隔10機％，梯度遞減至0被％，用薄層層 析檢測法檢查流出液，收集含甘草查爾酮A的流出液，減壓濃縮得甘草 査爾酮A濃縮物，再經(jīng)丙酮結(jié)晶，得1.80克純度93.70%的甘草查爾酮 A純品。實施例5稱取干燥粉碎的甘草粉1Kg，分別加入質(zhì)量比1:4， 1:3和1:3的水 回流提取3次，第一次保持回流狀態(tài)2小時，第二、第三次分別為1.5 小時，過濾，合并濾液，減壓濃縮至比重l. 15 (2CTC)，用異戊醇按l:l 比例攪拌萃取3次，合并濃縮萃取液，所得濃縮物以500g大孔XAD-7樹 脂吸附，乙醇水梯度洗脫，其中水占乙醇水的比例由100wt%，間隔20wt%， 梯度遞減至Owt%，用薄層層析檢測法檢査流出液，收集含甘草査爾酮A的 流出液，減壓濃縮得甘草查爾酮A濃縮物，再經(jīng)甲醇結(jié)晶，得1.17克純 度90. 13%的甘草査爾酮A純品。實施例6稱取干燥粉碎的甘草粉1Kg，以無水丙酮按質(zhì)量比1:5， 1:4和1:4 回流，保持回流狀態(tài)2小時，過濾，提取3次，合并濾液，減壓回收丙 酮，濃縮近干后加水至比重1. 15 (20°C)，用異戊醇按1:1比例攪拌萃取 3次，合并濃縮萃取液，所得濃縮物以500g聚酰胺樹脂吸附，乙醇水梯 度洗脫，其中水占乙醇水的比例由100wt%，間隔20wt%，梯度遞減至Owt%，
用薄層層析檢測法檢查流出液，收集含甘草査爾酮A的流出液，減壓濃縮得甘草查爾酮A濃縮物，再經(jīng)異丙醚-丙酮結(jié)晶，得2.58克純度91.52 ^的甘草査爾酮A純品。 實施例7稱取干燥粉碎的甘草粉1Kg，以20倍量50 X丙酮于50'C溫浸提取 3小時，提取液60。C減壓濃縮至比重1.08 (20°C)，用正丁醇按1:3比例 攪拌萃取2次，合并濃縮萃取液，所得濃縮物以500g大孔D101樹脂吸 附，乙醇水梯度洗脫，其中水占乙醇水的比例由100wt%，間隔10wt%， 梯度遞減至Owt%，用薄層層析檢測法檢査流出液，收集含甘草査爾酮A的 流出液，減壓濃縮得甘草查爾酮A濃縮物，再經(jīng)氯仿結(jié)晶，得2.96克純 度90. 76%的甘草查爾酮A純品。實施例8稱取干燥粉碎的甘草粉1Kg，以50 %甲醇按質(zhì)量比1:8， 1:6和1:6 回流提取3次，合并提取液，減壓回收甲醇，濃縮至比重1.12 (20°C)， 用異戊醇按1:1比例攪拌萃取3次，合并濃縮萃取液，所得濃縮物以500g 大孔AB-8樹脂吸附，乙醇水梯度洗脫，其中水占乙醇水的比例由100wt%， 間隔15wt呢，梯度遞減至Owt。/Q，用薄層層析檢測法檢查流出液，收集含甘 草査爾酮A的流出液，減壓濃縮得甘草查爾酮A濃縮物，再經(jīng)異丙醚-丙 酮結(jié)晶，得2.64克純度93. 10X的甘草查爾酮A純品。實施例9稱取干燥粉碎的甘草粉1Kg，以5倍量40%乙醇于5(TC溫浸提取6小 時，過濾，濾液減壓回收乙醇，濃縮至比重l. 10 (2CTC)，用乙酸乙酯按 1:1比例攪拌萃取3次，合并萃取液，減壓回收乙酸乙酯，所得濃縮物以 500g聚酰胺吸附，乙醇水梯度洗脫，其中水占乙醇水的比例由100wt%， 間隔10wty。，梯度遞減至0wt9&，用薄層層析檢測法檢査流出液，收集含甘 草查爾酮A的流出液，減壓濃縮得甘草査爾酮A濃縮物，再經(jīng)氯仿結(jié)晶， 得2. 12克純度90. 17%的甘草査爾酮A純品。 實施例10稱取干燥粉碎的甘草粉1Kg，以80%甲醇按質(zhì)量比1:8， 1:6和1:4 回流提取3次，每次2小時，過濾，合并濾液，減壓回收甲醇，濃縮至 比重L10(2(TC)，用正丁醇按l:l比例攪拌萃取3次，合并萃取液，減 壓回收正丁醇，所得濃縮物以500g聚酰胺吸附，乙醇水梯度洗脫，其中 水占乙醇水的比例由100wt%，間隔20wt。/。，梯度遞減至Owt96,用薄層層析 檢測法檢査流出液，收集含甘草查爾酮A的流出液，減壓濃縮得甘草査 爾酮A濃縮物，再經(jīng)乙醇-異丙醚結(jié)晶，得2.02克純度92. 12%的甘草査 爾酮A純品。實施例11稱取干燥粉碎的甘草粉1Kg，以40%丙酮按質(zhì)量比1:8， 1:6和1:6 回流提取3次，每次2小時，過濾，合并濾液，減壓回收丙酮，濃縮至 比重I.IO (20°C)，用乙酸乙酯按l:l比例攪拌萃取3次，合并萃取液， 減壓回收乙酸乙酯，所得濃縮物以500g大孔XAD-7樹脂吸附，乙醇水梯 度洗脫，其中水占乙醇水的比例由100wt。/。，間隔15機％，梯度遞減至(kt%， 用薄層層析檢測法檢查流出液，收集含甘草查爾酮A的流出液，減壓濃 縮得甘草査爾酮A濃縮物，再經(jīng)甲醇-氯仿結(jié)晶，得2.21克純度90.84 X的甘草査爾酮A純品。實施例12稱取干燥粉碎的甘草粉1Kg，以8倍量40 %甲醇在45"C下溫浸3小 時，過濾，重復(fù)1次，合并濾液，濾液減壓濃縮至比重1.08 (20°C)，用 氯仿按1:1比例攪拌萃取3次，濃縮萃取液，所得濃縮物以500g S印hadex LH-20分離，60%甲醇水溶液洗脫，用薄層層析檢測法檢查流出液，收集 含甘草査爾酮A的流出液，減壓濃縮得甘草查爾酮A濃縮物，再經(jīng)異丙 醚-丙酮精制，得2.52克純度92.52X的甘草査爾酮A純品。經(jīng)高效液相
色譜(HPLC)測得譜圖如圖1所示。 HPLC條件固定相HypersilC-18柱流動相甲醇2%乙酸二6: 4檢測波長282 nm 流速1.0 ml/min 進樣量10 (ll tR= 14.022 min 含量=92.521870%。
權(quán)利要求
1.高純度甘草查爾酮A的制備方法，順序包括(1)提取步驟，將甘草干燥粉碎，以冷滲法、溫浸法或回流法中的一種方法，將甘草粉以溶劑提取1～3次，合并提取液；所述的提取溶劑為下述溶劑中的一種A.甲醇與水的混合物，混合物中甲醇的含量占0-100wt％；B.乙醇與水的混合物，混合物中乙醇的含量占0-100wt％；C.丙酮與水的混合物，混合物中丙酮的含量占0-100wt％；(2)濃縮步驟，將提取液減壓濃縮，回收提取液中的有機溶劑，將提取液濃縮至20℃時的比重為1.05～1.15，得提取物濃縮液；(3)萃取步驟，以有機溶劑分批萃取或采用連續(xù)流萃取提取物濃縮液，獲得有機溶劑萃取相和萃余相；所述有機溶劑為正丁醇、乙酸乙酯、正己烷、氯仿或異戊醇中的一種；(4)分離步驟，將有機溶劑萃取相進行減壓濃縮，回收其中的有機溶劑，得到濃縮物，濃縮物采用柱層析分離，洗脫劑由乙醇水溶液或甲醇水溶液或丙酮水溶液組成，其中水占的比例為100-0wt％，進行等度或梯度洗脫，用薄層層析檢測法或高效液相色譜法檢查流出液，收集含甘草查爾酮A的流出液，并減壓濃縮此流出液，得甘草查爾酮A濃縮物；(5)結(jié)晶步驟，將甘草查爾酮A濃縮物用有機溶劑結(jié)晶即得甘草查爾酮A純品，經(jīng)檢測其純度不低于90％；所述的結(jié)晶有機溶劑是丙酮、乙醇、甲醇、異丙醚、氯仿或它們的混合溶劑。
2. 如權(quán)利要求1所述的高純度甘草查爾酮A的制備方法，其特征在 于，所述提取步驟中(1)所述的冷滲法為在室溫下以5 20倍質(zhì)量比 的溶劑浸泡甘草粉，然后以滲漉的方法進行提?。?2)所述的溫浸法為 在40 5(TC溫度下以5 20倍質(zhì)量比的溶劑浸泡甘草粉、攪拌并保溫3 6小時；(3)所述的回流法是以5 20倍質(zhì)量比的溶劑浸泡甘草粉，加熱 使溶劑回流并保持回流狀態(tài)1 5小時。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的高純度甘草査爾酮A的制備方法，其特征在于，所述提取步驟中，所述的提取溶劑為下述溶劑中的一種(1)甲醇與水的混合物，混合物中甲醇的含量占40_80wt%; (2)乙醇與水的 混合物，混合物中乙醇的含量占40 — 80wt。/。； (3)丙酮與水的混合物， 混合物中丙酮的含量占40—80wt%。
4. 如權(quán)利要求1或2所述的高純度甘草查爾酮A的制備方法，其特 征在于(1)所述濃縮步驟為真空減壓濃縮，真空度為0.01 0. 1Mpa， 溫度40 80。C，濃縮液2(TC時比重為1.05 1. 15; (2)所述萃取步驟， 是指以1 3倍體積比的有機溶劑萃取，萃取方式可以為攪拌萃取，室溫 或4 10。C低溫靜置分層，萃取次數(shù)1 3次；或采用有機溶劑連續(xù)流萃 取分離機進行萃取，萃取次數(shù)1 3次；(3)所述分離步驟中，將有機溶 劑萃取液減壓濃縮為真空減壓方式，真空度為0. 01 0. lMpa，溫度40 8CTC;所使用的柱層析填料為大孔徑樹脂、聚酰胺或葡聚糖凝膠。
5. 如權(quán)利要求3所述的高純度甘草査爾酮A的制備方法，其特征在 于(1)所述濃縮步驟為真空減壓濃縮，真空度為0.01 0. 1Mpa，溫度 40 80°C，濃縮液2CTC時比重為1.05 1. 15; (2)所述萃取步驟，是指 以1 3倍體積比的有機溶劑萃取，萃取方式可以為攪拌萃取，室溫或4 l(TC低溫靜置分層，萃取次數(shù)1 3次；或采用有機溶劑連續(xù)流萃取分離 機進行萃取，萃取次數(shù)1 3次；(3)所述分離步驟中，將有機溶劑萃取 液減壓濃縮為真空減壓方式，真空度為0.01 0. 1Mpa，溫度40 8(TC; 所使用的柱層析填料為大孔徑樹脂、聚酰胺或葡聚糖凝膠。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高純度甘草查爾酮A的制備方法，其工藝步驟為首先，將甘草粉碎，以冷滲、溫浸或回流提取法，將甘草粉以溶劑提取1～3次；合并提取液，減壓濃縮；然后用有機溶劑萃取，減壓濃縮萃取液并回收有機溶劑，所得濃縮物采用柱層析分離，用水、乙醇、甲醇、丙酮或它們的混合溶液洗脫，收集含甘草查爾酮A的流出液，此流出液經(jīng)濃縮及有機溶劑結(jié)晶即可獲得高純度甘草查爾酮A。本發(fā)明工藝路線簡單，步驟少，所使用的溶劑、柱填料和洗脫液都能循環(huán)使用，是一種低成本、高純度、易于放大、循環(huán)型的制備工藝，所得產(chǎn)品甘草查爾酮A為桔黃色針狀晶體，其純度不低于90％。
文檔編號C07C45/00GK101117311SQ20071005252
公開日2008年2月6日 申請日期2007年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月20日
發(fā)明者余龍江, 葉玉平, 崔永明, 敖明章, 梁曉榮 申請人:華中科技大學(xué);新疆昆侖神農(nóng)有限公司