專利名稱：精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸細胞粘附三肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種活性肽類物質(zhì)精氨酸-甘氨酸-天冬氨 酸細胞粘附三肽的制備方法。
背景技術(shù)：
細胞外基質(zhì)及基底膜中的纖維連接蛋白(Fn)、玻璃體連接蛋白(VN)、 膠原蛋白(Collagen)、血管性假血友病因子(vWF)等均含有一高度保守的 氨基酸序列一精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列。美國癌癥研究中心的 Pierschbacherherhe和Puoslahti于1984年首次發(fā)現(xiàn)并鑒定了此三肽的細胞粘附作用。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列是整聯(lián)蛋白的主要識別位點，而整聯(lián)蛋 白又是一類在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用的細胞粘著因子，所以此三肽序列 可以模擬細胞外基質(zhì)成分被整聯(lián)蛋白所識別從而對細胞進行調(diào)節(jié)。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列在生物體內(nèi)的功能很多。層粘連蛋白出現(xiàn) 于早期胚中，對于保持細胞間粘連，細胞的極性及細胞的分化都有重要意義。層 粘連蛋白也與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)。而層粘連蛋白正是通過此三肽序列與細胞膜 上的整聯(lián)蛋白結(jié)合，從而在胚胎發(fā)育及組織分化中發(fā)揮重要作用。在細胞外基質(zhì)中的纖連蛋白中，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列是其被細 胞識別的最小結(jié)構(gòu)單位。其受體也為整聯(lián)蛋白家族成員之一。纖連蛋白的功能主 要是介導(dǎo)細胞粘著。通過粘著，纖連蛋白可以通過細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細胞的 形狀和細胞骨架的組織促進細胞鋪展。在胚胎發(fā)育過程中，纖連蛋白對于許多類 型的細胞遷移和分化是必需的。在創(chuàng)傷修復(fù)中，纖連蛋白促進巨噬細胞和其他免 疫細胞遷移到受損部位。在血凝塊形成過程中，纖連蛋白促進血小板附著于血管 受損部位。顯微注射纖連蛋白受體的抗體或含此三肽序列的短肽可以阻斷細胞的 遷移。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列與腫瘤細胞及其新生內(nèi)皮血管表面的整 聯(lián)蛋白受體結(jié)合，參與腫瘤細胞的浸潤過程。粘附是癌細胞侵襲的始動步驟。腫 瘤細胞通過膜表面受體粘附于基底膜及細胞外基質(zhì)成分。腫瘤細胞與細胞外基質(zhì) 的多種成分(如層粘連蛋白、纖維粘連蛋白等)的相互粘著，是腫瘤轉(zhuǎn)移過程的 重要環(huán)節(jié)，此類肽限制了腫瘤細胞向細胞外基質(zhì)的粘附及轉(zhuǎn)移。人工合成此肽類 的氨基酸序列，競爭性地與腫瘤細胞表面的整聯(lián)蛋白受體結(jié)合，抑制細胞與基質(zhì) 之間的粘附，達到抑制腫瘤細胞浸潤、轉(zhuǎn)移的目的。近年來，還發(fā)現(xiàn)此三肽在傷 口愈合、神經(jīng)再生、皮膚修復(fù)等方面具有良好的作用。綜上所述，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列是多種生物細胞外基質(zhì)和血漿 蛋白結(jié)構(gòu)中常見的基本成分，也是廣泛存在于細胞間識別系統(tǒng)的基本單位，能與 細胞表面整聯(lián)蛋白特異性結(jié)合，從而介導(dǎo)許多重要的生命活動。外源性精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽能與體內(nèi)含此三肽序列的物質(zhì)競爭結(jié)合整聯(lián)蛋白，從而具 有一系列生物學(xué)功能。對于精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽的合成已經(jīng)分別有了酶法合成、化學(xué)法合 成、化學(xué)法與酶法相結(jié)合的方法來合成。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種工藝簡化、成本降低、工時減少、操作安全的精氨 酸-甘氨酸-天冬氨酸細胞粘附三肽產(chǎn)品的制備方法。我們選擇了液相化學(xué)法合成精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽。所用的化學(xué)法并 不是經(jīng)典的用帶保護基的氨基酸進行的肽合成，而是利用廉價的不帶有保護基的 氨基酸或只用芐氧羰基保護的氨基酸來合成精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽。我們 之所以選擇這種方法是因為這種方法與其他方法相比較費用較低、反應(yīng)簡單、效 率也是很高的。本發(fā)明是一種液相化學(xué)合成法，過程主要有二肽合成、三肽合成等步驟，生 產(chǎn)中不需要脫除保護基。是以天冬氨酸為原料，通過氯乙酰氯與天冬氨酸的反應(yīng) 得到氯乙?；於彼?，氯乙?；於彼岚苯獾玫礁拾彼?天冬氨酸二肽；芐 氧羰基精氨酸(Z-Arg-OH)與三溴化磷反應(yīng)得到氮羧基內(nèi)酸酐精氨酸 (NCA-Arg);氮羧基內(nèi)酸酐精氨酸(NCA-Arg)與甘氨酸-天冬氨酸二肽反應(yīng)得 到精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽。應(yīng)用本專利所述方法，還可以合成其它的二肽、 三肽或多肽產(chǎn)品。具體工藝步驟如下(1 )取25克~35克L-天冬氨酸懸浮于40~60毫升、質(zhì)量濃度為17%~27% 濃度氫氧化鈉水溶液中使其完全溶解，用該濃度氫氧化鈉水溶液調(diào)pH值8~12 之間，然后加入30~60毫升乙酸乙酯；在0'O1(TC的條件下，以0.10 ~0.20ml/min的速度分別滴加15~30毫升10~13mol/l氯乙酰氯和15~40毫升 170/0~27%氫氧化鈉水溶液到上述溶液中，邊滴加邊攪拌，滴加過程中控制氫氧 化鈉水溶液滴加速度保持溶液的pH在8~12范圍內(nèi)，滴加完畢，繼續(xù)攪拌20~50
分鐘；結(jié)束反應(yīng)時用濃鹽酸調(diào)PH至3以下，然后將此反應(yīng)液用乙酸乙酯抽提三 次，合并提取液，加無水硫酸鈉干燥，減壓除去乙酸乙酯，即得到氯乙?；於?氨酸白色粉末；(2) 在0'O1(TC低溫條件下，將所得到的氯乙酰化天冬氨酸按照1.0g: 5~10^11的比例加入質(zhì)量濃度為25%~28%的濃氨水，攪拌24 48小時，然后減 壓除去多余氨氣，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到微黃粘稠狀物質(zhì)，加入乙醇振搖并倒掉，再加入 乙醇攪拌至成粉末，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)即得甘氨酸-天冬氨酸二肽白色粉末；(3) 于20m卜200ml四氫呋喃溶液中懸浮1g 10g的芐氧羰基精氨酸 (Z-Arg-OH)，于室溫加入5m卜50ml含有三溴化磷的四氫呋喃溶液(V三溴化磷/V四氫呋喃"4)，室溫攪拌3~5小時后，將反應(yīng)液上層的四氫呋喃傾注下 去，下層為沉淀下來的比重較大的油狀物，將此油狀物反復(fù)用200 400ml的四 氫呋喃洗滌，真空干躁得淡黃色的焦油狀物，即得氮羧基內(nèi)酸酐精氨酸；(4) 在帶有溫度計、pH電極、外冷卻裝置和攪拌裝置的容器中，將甘氨酸 -天冬氨酸二肽溶于pH 8 12的0.1 0.3mol/L的硼酸-硼酸鉀緩沖體系中，體系 中甘氨酸-天冬氨酸二肽的含量是0.5mol/卜0.8mol/L用KOH調(diào)pH 8~12，加入 0.01~0.03毫升辛醇，在激烈攪拌下按氮羧基內(nèi)酸酐精氨酸物質(zhì)的量甘氨酸-天冬氨酸二肽物質(zhì)的量為1~1.5: 1的比例， 一次加入氮羧基內(nèi)酸酐精氨酸(NCA-Arg)，并不斷加入1~2mol/l的KOH溶液保持pH為8~12， 2~8分種內(nèi) 堿消耗結(jié)束，加入濃硫酸調(diào)pH到3以下終止反應(yīng)；將上述反應(yīng)液凍干，用少量 水溶解，用醇沉淀，抽濾得沉淀，用S印hadexG-10柱層析分離產(chǎn)物，得到本 專利所述的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽產(chǎn)品。氯乙?；诤铣芍杏腥齻€作用1.是對氨基進行了保護；2.是對天冬氨 酸的羧基有活化作用；3.是氯乙?；诎苯夂罂芍苯愚D(zhuǎn)化為所需的與天冬氨酸氨基成肽鍵的甘氨酸殘基，省去了一步接氨基酸的步驟。


圖1:本專利制備的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽的質(zhì)譜圖。通過圖譜可知，峰值為347.2272與精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽的分子量 Mw346相對應(yīng)，確認為其質(zhì)譜峰，證明產(chǎn)物為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽。具體的實施方式
實施例1:氯乙酰化天冬氨酸的合成取25克L-天冬氨酸懸浮于40毫升、27。/。濃度氫氧化鈉的水溶液中使其完 全溶解，然后用該濃度氫氧化鈉水溶液調(diào)phN10，然后加入30毫升乙酸乙酯； 在0。C的條件下，以0.16ml/min的速度分別滴加15毫升12.54mol/l氯乙酰氯和 15毫升27%氫氧化鈉到上述溶液中，邊滴加邊攪拌，滴加過程中控制氫氧化鈉 水溶液滴加速度保持溶液的pH在9.5，滴加完畢，繼續(xù)攪拌30分鐘；結(jié)束反應(yīng) 時用濃鹽酸(濃度為37%)調(diào)PH至2.5，然后將此反應(yīng)液用200ml乙酸乙酯抽 提三次，合并提取液，加2克無水硫酸鈉干燥，減壓除去乙酸乙酯，即得到氯乙 ?；於彼岚咨勰┘s30克。實施例2:甘氨酸-天冬氨酸二肽的合成在2'C下，將前面所得的氯乙?；於彼岚凑?.0g: 6ml的比例加入濃氨 水(27%)，此溶液攪拌24小時，然后減壓除去多余氨氣，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到微黃 粘稠狀物質(zhì)，加入10ml乙醇振搖并倒掉(除去醇溶物質(zhì))，再加入10ml乙醇攪 拌至成粉末，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)即得甘氨酸-天冬氨酸二肽白色粉末約0.9克。實施例3:氮羧基內(nèi)酸酐精氨酸(NCA-Arg)的合成于20ml四氫呋喃溶液中懸浮1g的芐氧羰基精氨酸(Z-Arg-OH)，于室溫 加入5ml含有三溴化磷的四氫呋喃溶液(V三溴化磷/V四氫呋喃-1: 4)，室溫 攪拌3小時后，將反應(yīng)液上層的四氫呋喃傾注下去，下層為沉淀下來的比重較大 的油狀物，將此油狀物反復(fù)用200ml的四氫呋喃洗滌6 8次，真空干躁得淡黃 色的焦油狀物0.5克左右，即氮羧基內(nèi)酸酐精氨酸。實施例4:精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽的合成將1g甘氨酸-天冬氨酸二肽溶于pH 9的0.2mol/L硼酸-硼酸鉀緩沖體系中， 體系中甘氨酸-天冬氨酸二肽的含量是0.6mo1/1。在帶有溫度計、pH電極、外冷 卻裝置和攪拌裝置的容器中，用KOH調(diào)pH-10，加入一滴辛醇(0.01毫升)， 一次加入氮羧基內(nèi)酸酐精氨酸(NCA-Arg)(氮羧基內(nèi)酸酐精氨酸物質(zhì)的量:甘氨 酸-天冬氨酸二肽物質(zhì)的量=1.05)，并不斷加入1mo1/1的KOH溶液保持pH為9， 5分鐘內(nèi)堿消耗結(jié)束。隨后加入濃硫酸調(diào)pH到3終止反應(yīng)。反應(yīng)液凍干，用5ml 水溶解，用10ml乙醇沉淀此液，抽濾得沉淀，用S印hadexG-10柱層析分離產(chǎn) 物，得到本專利所述的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽產(chǎn)品約0.2克。
權(quán)利要求
1、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸細胞粘附三肽的制備方法，其包括如下步驟(1)氯乙酰氯與天冬氨酸的反應(yīng)得到氯乙?；於彼?；(2)氯乙?；於彼岚苯獾玫礁拾彼?天冬氨酸二肽；(3)芐氧羰基精氨酸與三溴化磷反應(yīng)得到氮羧基內(nèi)酸酐精氨酸；(4)氮羧基內(nèi)酸酐精氨酸與甘氨酸-天冬氨酸二肽反應(yīng)得到精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽。
2、 如權(quán)利要求1所述的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸細胞粘附三肽的制備方法，其特征在于取25克~35克L-天冬氨酸懸浮于40~60毫升、質(zhì)量濃度為 17%~27%濃度氫氧化鈉水溶液中使其完全溶解，調(diào)pH值8 12之間，然后 加入30 60毫升乙酸乙酯；在0。C 1(TC的條件下，以0.10 ~0.20ml/min的 速度分別滴加15~30毫升10~13mol/L氯乙酰氯和15~40毫升17°/。~27%氫氧化鈉到上述溶液中，邊滴加邊攪拌，保持溶液的pH在8 12范圍內(nèi)，滴加 完畢，繼續(xù)攪拌20~50分鐘；結(jié)束反應(yīng)時用濃鹽酸調(diào)PH至3以下，然后將 此反應(yīng)液用乙酸乙酯抽提三次，合并提取液，加無水硫酸鈉干燥，減壓除去 乙酸乙酯，即得到氯乙酰化天冬氨酸白色粉末。
3、 如權(quán)利要求1所述的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸細胞粘附三肽的制備方法，其 特征在于在0X: 10'C低溫條件下，將所得到的氯乙?；於彼岚凑?1.0g: 5~10ml的比例加入質(zhì)量濃度為25%~28%的濃氨水，攪拌24~48小時，然后減壓除去多余氨氣，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到微黃粘稠狀物質(zhì)，加入乙醇振搖 并倒掉，再加入乙醇攪拌至成粉末，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)即得甘氨酸-天冬氨酸二肽白色 粉末。
4、 如權(quán)利要求1所述的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸細胞粘附三肽的制備方法，其 特征在于于20m卜200ml四氫呋喃溶液中懸浮1g~10g的芐氧羰基精氨酸， 于室溫加入5m卜50ml含有三溴化磷的四氫呋喃溶液，兩者體積比為1: 4， 室溫攪拌3 5小時后，將反應(yīng)液上層的四氫呋喃傾注下去，下層為沉淀下來 的比重較大的油狀物，將此油狀物反復(fù)用200~400 ml的四氫呋喃洗滌，真 空干躁得淡黃色的焦油狀物，即得氮羧基內(nèi)酸酐精氨酸。
5、如權(quán)利要求1所述的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸細胞粘附三肽的制備方法，其特征在于將甘氨酸-天冬氨酸二肽溶于pH 8~12的0.1~0.3mol/L的硼酸-硼酸鉀緩沖體系中，體系中甘氨酸-天冬氨酸二肽的含量是0.5mol/卜0.8mo1/1, 用KOH調(diào)pH 8~12，加入0.01~0.03毫升辛醇，在激烈攪拌下， 一次性加 入與甘氨酸-天冬氨酸二肽摩爾比為1~1.5: 1的氮羧基內(nèi)酸酐精氨酸，保持 pH為8~12， 2~8分種內(nèi)堿消耗結(jié)束，加入濃硫酸調(diào)pH到3以下終止反應(yīng)； 將上述反應(yīng)液凍干，少量水溶解，加醇沉淀，抽濾得沉淀，用SephadexG-10 柱層析分離產(chǎn)物，得到精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明屬生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種活性肽類物質(zhì)精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸細胞粘附三肽的制備方法。過程主要有二肽合成、三肽合成等步驟，生產(chǎn)中不需要脫除保護基。是以天冬氨酸為原料，包括氯乙酰氯與天冬氨酸的反應(yīng)得到氯乙?；於彼?、氯乙酰化天冬氨酸氨解得到甘氨酸-天冬氨酸二肽、芐氧羰基精氨酸(Z-Arg-OH)與三溴化磷反應(yīng)得到氮羧基內(nèi)酸酐精氨酸(NCA-Arg)、氮羧基內(nèi)酸酐精氨酸(NCA-Arg)與甘氨酸-天冬氨酸二肽反應(yīng)得到精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽等步驟。本發(fā)明所述方法具有簡化工藝、降低成本、減少工時、安全操作的優(yōu)良效果，能夠制備高純度、高活性的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽產(chǎn)品。
文檔編號C07K5/09GK101161672SQ200710056360
公開日2008年4月16日 申請日期2007年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月28日
發(fā)明者侯瑞珍, 張學(xué)忠, 力 徐, 森 楊, 華 王, 黃宜兵 申請人:吉林大學(xué)