專利名稱：：一種五環(huán)三萜皂苷類化合物及制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，確切地說涉及一種五環(huán)三萜皂苷類化合物及制備方法及用途。
背景技術(shù)：
：朱砂根為紫金?？谱辖鹋僦参镏焐案?4wfo/flcrwatoSims)的根。性味苦、辛、涼，具有清熱解毒、散瘀止痛的作用。用于治療上呼吸道感染、扁桃體炎、白喉、丹毒、淋巴結(jié)炎、勞傷吐血、心胃氣痛、風(fēng)濕骨痛、跌打損傷等癥。百兩金皂苷A和B(ardisiacrispinA和ardisiacrispinB)是從中藥朱砂根中分離得到的主要三萜皂苷類活性成分之一。藥理學(xué)研究表明，對人的五種腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒活性(MCF-7:IC5o4.72pM;NCI-H460:IC5023.58jaM;SF-268:IC5()2.36nM;HepG2:IC5()6.60nM)，近來研究發(fā)現(xiàn)其對HL-60(人早幼粒細(xì)胞)細(xì)胞增殖有抑制作用。同時又測定了其對正常的人胚腎293細(xì)胞的生長的影響(293:IC50>24pM)，結(jié)果顯示對正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性很小。百兩金皂苷A和B的組合物進(jìn)行HPLC檢測，百兩金皂苷A和B的總含量為99%。其性狀為白色粉末(MeOH)，可溶于甲醇、乙醇。微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)就是利用微生物代謝過程中某個或一組酶對底物進(jìn)行催化的反應(yīng)。具有高度立體選擇性，不僅對結(jié)構(gòu)有化學(xué)選擇性和非對映異構(gòu)體選擇性，并且有嚴(yán)格的區(qū)域選擇性。而且反應(yīng)條件溫和，公害少，成本低廉。對中藥成分生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行研究，其主要目的就是通過對中藥有效成分在微生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的研究來尋找新藥源，以及對新活性成分的發(fā)現(xiàn)，新前體物質(zhì)的制備，都有著極其重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種與百兩金皂苷B相比，具有更好的水溶性，更適合藥物制劑的一種五環(huán)三萜皂苷類化合物。本發(fā)明的第二個目的是提供一種五環(huán)三萜皂苷類化合物的制備方法。本發(fā)明的第三個目的是提供一種五環(huán)三萜皂苷類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種五環(huán)三萜皂苷類化合物，其特征是具有下述結(jié)構(gòu)化學(xué)名為西克拉明皂苷元A-3(3-(Ha-L-鼠李吡喃糖基-(l42)-P-D-葡萄吡喃糖基-(1~>4)-[(3-0-葡萄吡喃糖基-(1—2)]-[a-D-半乳吡喃糖基-(1—3)]卜a-L-阿拉伯吡喃糖苷。一種五環(huán)三萜皂苷類化合物的制備方法，是由下述步驟組成(1)微生物的培養(yǎng)將燕麥曲霉(AA3.4454)從固體培養(yǎng)基接種至預(yù)先配制好的液體土豆培養(yǎng)基中，所述液體土豆培養(yǎng)基100ml中含葡萄糖1-5克；置于恒溫振蕩器中，在120-180rpm，24-28。C培養(yǎng)36-72小時；(2)將百兩金皂苷B溶于甲醇或體積百分比濃度為50%-100%的乙醇水溶液或體積百分濃度為50%的丙酮水溶液中，配成10-100mg/ml，加入步驟(1)制成的發(fā)酵液中，在120-180rpm，24-28°C，培養(yǎng)2-6日；(3)發(fā)酵液的處理發(fā)酵液抽濾后收集濾液，減壓濃縮至原體積的1/10-1/20，用等體積正丁醇萃取2-4遍，萃取液合并濃縮至干，獲得粗浸膏；(4)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離純化將步驟(3)得到的粗浸膏用大孔樹脂柱層析分離，以體積比為100:0-0:100的水-乙醇或水-甲醇梯度洗脫得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物富集物，利用制備高效液相制備，Rpl8色譜柱，流動相為體積百分比為35%-60%的甲醇水溶液或25%-60%的乙腈水溶液，獲得化學(xué)名為西克拉明皂苷元A-3p-0-(a-L-鼠李吡喃糖基-(l—2)-p-D-葡萄吡喃糖基-(1—4)-[^0-葡萄吡喃糖基-(1~2)]-[a-D-半乳吡喃糖基-(l—3)]卜a-L-阿拉伯吡喃糖苷。所述大孔樹脂優(yōu)選HP20型大孔樹脂、D101型大孔樹脂、AB-8型大孔樹脂、YWD-01型大孔樹脂。一種五環(huán)三萜皂苷類化合物，化學(xué)名為西克拉明皂苷元A-3f3-0-(a-L-鼠李吡喃糖基-(l—2)-p-D-葡萄吡喃糖基-(l44)-[(3-D-葡萄吡喃糖基-(l—2)]-[a-D-半乳吡喃糖基-(1—3)])-a-L-阿拉伯吡喃糖苷在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的化學(xué)名為西克拉明皂苷元A-3(3-CMa-L-鼠李吡喃糖基-(l—2)-p-D-葡萄吡喃糖基-(144)-[卩-0-葡萄吡喃糖基-(1—2)]-[a-D-半乳吡喃糖基-(l—3)]卜a-L-阿拉伯吡喃糖苷與百兩金皂苷B相比，水溶性有所增加，抗癌活性與底物相當(dāng)。本發(fā)明的制備方法反應(yīng)條件溫和，公害少，成本低廉。本發(fā)明對中藥有效成分在微生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的研究來尋找新藥源，以及對新活性成分的發(fā)現(xiàn)，新前體物質(zhì)的制備，都有著極其重要的意義。圖1為本發(fā)明化合物的制備HLPC色譜圖。具體實施方式-下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實施例1'西克拉明皂苷元A-3p-0-(oc-L-鼠李吡喃糖基-(l42)-P-D-葡萄吡喃糖基-(1—4)-[P-D-葡萄吡喃糖基-(1—2)]-[a-D-半乳吡喃糖基-(l—3)]卜a-L-阿拉伯吡喃糖苷的制備(1)微生物的培養(yǎng)將燕麥曲霉(AA3.4454)(在中國科學(xué)院微生物研究所購買)從固體培養(yǎng)基接種至預(yù)先配制好的液體土豆培養(yǎng)基中，所述液體土豆培養(yǎng)基100ml含葡萄糖2g，置于恒溫振蕩器中，在180rpm，28'C條件下培養(yǎng)48小時；(2)將百兩金皂苷B溶于甲醇中，配成50mg/ml，加入步驟(1)制成的發(fā)酵液中，在180rpm，28°C，培養(yǎng)4日；G)發(fā)酵液的處理發(fā)酵液抽濾收集濾液，減壓濃縮至原體積的1/15，用等體積正丁醇萃取3遍，萃取液合并濃縮至干，獲得粗浸膏；(4)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離純化將步驟(3)得到的粗浸膏用HP20型大孔樹脂分離，先用五倍柱體積的水清洗色譜柱，再用甲醇濃度逐慚增加的水-甲醇溶液梯度洗脫，在30%甲醇水溶液到50%甲醇水溶液洗脫部分得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物富集物，利用制備高效液相制備，示差檢測器檢測，Rp-18色譜柱10x250cm，流速為5ml/min，流動相為體積百分濃度為60%甲醇水溶液，獲得西克拉明皂苷元A-3p-CHa-L-鼠李吡喃糖基-(l—2)-P-D-葡萄吡喃糖基-(1—4)-[卩-0-葡萄吡喃糖基-(142)]-[a-D-半乳吡喃糖基-(l—3)]卜a-L-阿拉伯吡喃糖苷?；衔镂骺死髟碥赵狝-3p-0-{a-L-鼠李吡喃糖基-(l—2)-(3-D-葡萄吡喃糖基-(1^4)-[(3-0-葡萄吡喃糖基-(1—2)]-[a-D-半乳吡喃糖基-(l—3)]卜a-L-阿拉伯吡喃糖苷白色粉末(甲醇)，[c^2+25.8°(MeOH,c=0.3)。Libermann—Burchard和Molish反應(yīng)陽性；分子式C59H96027(positiveHRESI-MS1259.5853[M+Na〗+，calcd.forC58H940271259.6031);IR中v^cm":3426，2925，1716，1630，1387，1044;ESI-MS(positive)m/z:1259[M+Na]+，iH-NMR(600MHz,inpyridine-4),13C-NMR(150MHz,inpyridine-^):見表1。5表l本發(fā)明化合物的碳譜、氫譜數(shù)據(jù)(氘代吡啶中測定)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*在BrukerAV600(600MHzfor'H,150MHzfor13C)核磁共振儀中測定a"(O)"代表信號交蓋。b偶合常數(shù)J值用Hz表示碳?xì)湫盘柕臍w屬通過HMBC、HSQC和TOCSY譜共同解析。本發(fā)明化合物的HLPC檢測圖譜見圖1，圖中4號峰為本發(fā)明化合物的色譜峰。百兩金皂苷B水溶性不好，只是微溶于熱水中，即lmg溶解在100ral8(TC度熱水中，易溶于有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇中。本發(fā)明的化合物易溶于熱水中，10mg能夠溶解在50ml80°(5熱水中。同時也易溶于甲醇中。由于產(chǎn)品的水溶性的增加對于將來以單體化合物直接開發(fā)成注射劑或者凍干粉針是非常有利的?？梢酝ㄟ^對腫瘤進(jìn)行局部注射給藥，提高藥物的療效，因此，將本發(fā)明的化合物開發(fā)成局部用藥的注射劑具有很好的前景。實施例2本發(fā)明的化合物的制備(1)微生物的培養(yǎng):將燕麥曲霉(AA3.4454)從固體培養(yǎng)基接種至預(yù)先配制好的液體土豆培養(yǎng)基中，所述液體土豆培養(yǎng)基100ml含葡萄糖3g，置于恒溫振蕩器中，在160rpm，25。C條件下培養(yǎng)48小時；(2)將百兩金皂苷B溶于體積百分比濃度為50。/。的乙醇水溶液中，配成50mg/ml，加入步驟(1)制成的發(fā)酵液中，在160rpm，25°C，培養(yǎng)5日；(3)發(fā)酵液的處理發(fā)酵液抽濾收集濾液，減壓濃縮至原體積的1/10，用等體積正丁醇萃取2遍，萃取液合并濃縮至干，獲得粗浸膏；(4)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離純化將步驟(3)得到的粗浸膏用D101型大孔樹脂分離，先用五倍柱體積的水清洗色譜柱，再用乙醇濃度逐慚增加的水-乙醇溶液梯度洗脫，在50%乙醇水溶液洗脫部分得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物富集物，利用制備高效液相制備，蒸發(fā)光檢測器檢測，Rp-18色譜柱20x250cm，流速為10ml/min，流動相為體積百分濃度為35%甲醇水溶液，獲得西克拉明皂苷元A-3p-0-(oc-L-鼠李吡喃糖基-(l42)-(3-D-葡萄吡喃糖基-(1^4)-[(3-D-葡萄吡喃糖基-(l42)]-[a-D-半乳吡喃糖基-(l43)]卜cc-L-阿拉伯吡喃糖苷。實施例3本發(fā)明的化合物的制備(1)微生物的培養(yǎng)將燕麥曲霉(AA3.4454)從固體培養(yǎng)基接種至預(yù)先配制好的液體土豆培養(yǎng)基中，所述液體土豆培養(yǎng)基100ml含葡萄糖4g，置于恒溫振蕩器中，在120rpm，28i:條件下培養(yǎng)48小時；(2)將百兩金皂苷B溶于體積百分比濃度為50%的丙酮水溶液中，配成100mg/ml，加入步驟(1)制成的發(fā)酵液中，在120rpm，28°C，培養(yǎng)3日；(3)發(fā)酵液的處理發(fā)酵液抽濾收集濾液，減壓濃縮至原體積的1/20，用等體積正丁醇萃取4遍，萃取液合并濃縮至干，獲得粗浸膏；(4)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離純化將步驟(3)得到的粗浸膏用AB-8型大孔樹脂分離，先用五倍柱體積的水清洗色譜柱，再用乙醇濃度逐慚增加的水-乙醇溶液梯度洗脫，在70%乙醇水溶液洗脫部分得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物富集物，利用制備高效液相制備，示差檢測器檢測，Rp-18色譜柱10x250cm，流速為4ml/min，流動相為體積百分濃度為40%乙腈水溶液，獲得西克拉明皂苷元A-3p-CHcc-L-鼠李吡喃糖基-(l42)-(3-D-葡萄吡喃糖基-(l44HP-D-葡萄吡喃糖基-(1—2)]-[a-D-半乳吡喃糖基-(l—3)])-a-L-阿拉伯吡喃糖苷。實施例4本發(fā)明的化合物的制備'(1)微生物的培養(yǎng)將燕麥曲霉(AA3.4454)從固體培養(yǎng)基接種至預(yù)先配制好的液體土豆培養(yǎng)基中，所述液體土豆培養(yǎng)基100ml含葡萄糖lg,置于恒溫振蕩器中，在160rpm,28'C條件下培養(yǎng)72小時；(2)將百兩金皂苷B溶于體積百分比濃度為100%的乙醇中，配成100mg/ml，加入步驟(1)制成的發(fā)酵液中，在160rpm，28°C，培養(yǎng)2日；(3)發(fā)酵液的處理發(fā)酵液抽濾收集濾液，減壓濃縮至原體積的1/15，用等體積正丁醇萃取3遍，萃取液合并濃縮至干，獲得粗浸膏；(4)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離純化將步驟(3)得到的粗浸膏用YWD-01型大孔樹脂分離，先用五倍柱體積的水清洗色譜柱，再用乙醇濃度逐慚增加的水-乙醇溶液梯度洗脫，在50%乙醇水溶液洗脫部分得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物富集物，利用制備高效液相制備，示差檢測器檢測，Rp-18色譜柱20x250cm，流速為10ml/min,流動相為體積百分濃度為35%乙腈水溶液，獲得西克拉明皂苷元A-3p-(Ha-L-鼠李吡喃糖基-(1—2)-p-D-葡萄吡喃糖基-(l—4)-[(3-D-葡萄吡喃糖基-(1—2)]-[a-D-半乳吡喃糖基-(l—3)]卜a-L-阿拉伯吡喃糖苷。實施例5本發(fā)明化合物的制備(1)微生物的培養(yǎng)將燕麥曲霉(AA3.4454)從固體培養(yǎng)基接種至預(yù)先配制好的液體土豆培養(yǎng)基中，所述液體土豆培養(yǎng)基100ml含葡萄糖5g，置于恒溫振蕩器中，在160rpm，24'C條件下培養(yǎng)36小時；(2)將百兩金皂苷B溶于體積百分比濃度為90o/。的乙醇水溶液中，配成10mg/ml，加入步驟(1)制成的發(fā)酵液中，在120rpm，24°C，培養(yǎng)6日；(3)發(fā)酵液的處理發(fā)酵液抽濾收集濾液，減壓濃縮至原體積的1/15，用等體積正丁醇萃取3遍，萃取液合并濃縮至干，獲得粗浸膏；(4)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離純化將步驟(3)得到的粗浸膏用HP20型大孔樹脂分離，先用五倍柱體積的水清洗色譜柱，再用乙醇濃度逐慚增加的水-乙醇溶液梯度洗脫，在50%乙醇水溶液洗脫部分得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物富集物，利用制備高效液相制備，示差檢測器檢測，Rp-18色譜柱20x250cm，流速為10ml/min，流動相為體積百分濃度為60%乙腈水溶液，獲得西克拉明皂苷元A-3p-(Ha-L-鼠李吡喃糖基-(l42)-p-D-葡萄吡喃糖基-(1—4)-[p-D-葡萄吡喃糖基-(1—2)]-[a-D-半乳吡喃糖基-(l—3)]卜oc-L-阿拉伯吡喃糖苷。實施例6本發(fā)明化合物的制備(1)微生物的培養(yǎng)將燕麥曲霉(AA3.4454)從固體培養(yǎng)基接種至預(yù)先配制好的液體土豆培養(yǎng)基中，所述液體土豆培養(yǎng)基100ml含葡萄糖5g，置于恒溫振蕩器中，在160rpm，24'C條件下培養(yǎng)36小時；(2)將百兩金皂苷.B溶于體積百分比濃度為90%的乙醇水溶液中，配成10mg/ml，加入步驟(1)制成的發(fā)酵液中，在120rpm，24°C，培養(yǎng)6日；(3)發(fā)酵液的處理發(fā)酵液抽濾收集濾液，減壓濃縮至原體積的1/15，用等體積正丁醇萃取3遍，萃取液合并濃縮至干，獲得粗浸膏；(4)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離純化將步驟(3)得到的粗浸膏用YWD-01型大孔樹脂分離，先用五倍柱體積的水清洗色譜柱，再用純乙醇溶液洗脫部分得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物富集物，利用制備高效液相制備，示差檢測器檢測，Rp-18色譜柱20x250cm，流速為10ml/min，流動相為體積百分濃度為25%乙腈水溶液，獲得西克拉明皂苷元A-3p-0-(oc-L-鼠李吡喃糖基-(l—2)-(3-D-葡萄吡喃糖基-(l—4)-[(3-D-葡萄吡喃糖基-(1—2)]-[a-D-半乳吡喃糖基-(1—3)]}-0^丄-阿拉伯吡喃糖苷。實施例7本發(fā)明化合物的制備(1)微生物的培養(yǎng)將燕麥曲霉(AA3.4454)從固體培養(yǎng)基接種至預(yù)先配制好的液體土豆培養(yǎng)基中，所述液體土豆培養(yǎng)基100ml含葡萄糖5g，置于恒溫振蕩器中，在160rpm，24'C條件下培養(yǎng)36小時；(2)將百兩金皂苷B溶于體積百分比濃度為卯°/。的乙醇水溶液中，配成10mg/ml，加入步驟(1)制成的發(fā)酵液中，在120rpm，24°C，培養(yǎng)6日；(3)發(fā)酵液的處理發(fā)酵液抽濾收集濾液，減壓濃縮至原體積的1/15，用等體積正丁醇萃取3遍，萃取液合并濃縮至干，獲得粗浸膏；(4)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離純化將步驟(3)得到的粗浸膏用YWD-01型大孔樹脂分離，先用五倍柱體積的水清洗色譜柱，再用純甲醇溶液洗脫部分得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物富集物，利用制備高效液相制備，示差檢測器檢測，Rp-18色譜柱20x250cm，流速為10ml/min，流動相為體積百分濃度為25%乙腈水溶液，獲得西克拉明皂苷元A-3p-0-(a-L-鼠李吡喃糖基-(1—2)-(3-D-葡萄吡喃糖基-(1—4HP-D-葡萄吡喃糖基-(1~>2)]-[a-D-半乳吡喃糖基-(1—3)]}-01七-阿拉伯吡喃糖苷。實施例8體外抗腫瘤活性測試實驗以體外培養(yǎng)的MCF-7(人乳腺癌)和Hela(宮頸癌)為模型，以紫杉醇為陽性藥，利用MTT法測定了本發(fā)明的化合物(實施例l制備)體外抗腫瘤的活性，結(jié)果見表2。表2本發(fā)明化合物體外抑制腫瘤細(xì)胞生長試驗結(jié)果,入_對兩種腫瘤細(xì)胞生長抑制作用'始t/---------------'—--------------------------------------—'--------------^-----------^------------------------'—MCF-7(IC5omol/L)Hela(IC50mol/L)本發(fā)明的化合物2.34xl0—42.08x10—權(quán)利要求1.一種五環(huán)三萜皂苷類化合物，其特征是具有下述結(jié)構(gòu)化學(xué)名為西克拉明皂苷元A-3β-O-{α-L-鼠李吡喃糖基-(1→2)-β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-[β-D-葡萄吡喃糖基-(1→2)]-[α-D-半乳吡喃糖基-(1→3)]}-α-L-阿拉伯吡喃糖苷。2.—種五環(huán)三蔽皂苷類化合物的制備方法，其特征是由下述步驟組成(1)微生物的培養(yǎng)將燕麥曲霉(AA3.4454)從固體培養(yǎng)基接種至預(yù)先配制好的液體土豆培養(yǎng)基中，所述液體土豆培養(yǎng)基100ml中含葡萄糖1-5克；置于恒溫振蕩器中，在120-180rpm，24-28。C培養(yǎng)36-72小時；(2)將百兩金皂苷B溶于甲醇或體積百分比濃度為50%-100%的乙醇水溶液或體積百分濃度為50%的丙酮水溶液中，配成10-100mg/ml，加入步驟(1)制成的發(fā)酵液中，在120-180rpm，24-28°C，培養(yǎng)2-6日；G)發(fā)酵液的處理發(fā)酵液抽濾后收集濾液，減壓濃縮至原體積的1/10-1/20，用等體積正丁醇萃取2-4遍，萃取液合并濃縮至干，獲得粗浸膏；(4)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離純化將步驟(3)得到的粗浸膏用大孔樹脂柱層析分離，以體積比為100:0-0:100的水-乙醇或水-甲醇梯度洗脫得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物富集物，利用制備高效液相制備，Rpl8色譜柱，流動相為體積百分比為35%-60%的甲醇水溶液或25%-60%的乙腈水溶液，獲得化學(xué)名為西克拉明皂苷元A-3p-(Ha-L-鼠李吡喃糖基-(l42)-P-D-葡萄吡喃糖基-(1—4)-[3-0-葡萄吡喃糖基-(142)]-[a-D-半乳吡喃糖基-(1—3)]卜oc-L-阿拉伯吡喃糖苷。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種五環(huán)三萜皂苷類化合物的制備方法，其特征是所述大孔樹脂為HP20型大孔樹脂、D101型大孔樹脂、AB-8型大孔樹脂、YWD-01型大孔樹脂。4.權(quán)利要求l所述一種五環(huán)三萜皂苷類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種五環(huán)三萜皂苷類化合物及制備方法及用途，該化合物具有下述結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的化合物與百兩金皂苷B相比，水溶性有所增加，抗癌活性與底物相當(dāng)。制備方法中反應(yīng)條件溫和，公害少，成本低廉。文檔編號C07J71/00GK101381395SQ200710059519公開日2009年3月11日申請日期2007年9月6日優(yōu)先權(quán)日2007年9月6日發(fā)明者劉岱琳,白淑芳,虹陳,隋玉輝申請人:中國人民武裝警察部隊醫(yī)學(xué)院