專利名稱：海洋雙rna病毒mabv重組蛋白的制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其是含有海洋雙RNA病毒外殼蛋白基因VP2或VP3基因的融合蛋白及制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水生雙RNA病毒屬(Aquabirnavirus)隸屬雙RNA病毒科(Birnaviridae)，此科的一個明顯特征是病毒基因組是由雙節(jié)段的雙鏈RNA組成。Aquabirnavirus屬的代表種是能引起鮭魚急性傳染性病的傳染性胰壞死病病毒(IPNV)。Sorimachi M、Hara T.1985年首次從一種鰤(Seriolaquinqueradiana)分離到海洋雙RNA病毒(Sorimachi M，Hara T.“Characteristics and pathogenicity of a virus isolated from yellowtailfingerlings showing ascites[J]”《Fish Pathol》1985，19231-238.)，魳感病的典型癥狀為貧血性腮壞死，肝臟出血，腹水等。其后從褐牙鲆、香魚(徊游性)、琥珀魚、紅稽東方鲀、海蛸、珍珠貝和其他的海洋魚類和十幾種貝類病體中都分離到各種MABV病毒。最近甚至在浮游動物中也發(fā)現(xiàn)了這種病毒Hosono H，Suzuki S，Kusuda R.在“Genogrouping of birnavirusesisolated from marine fisha comparison of VP2/NS junction regions ongenome segment A[J]”(《J Fish Dis》1996，19295-306)中的研究發(fā)現(xiàn)這些從海洋生物分離的雙RNA病毒在血清型和基因組型上與IPNV不同，并把這些從海洋生物分離到的水生雙RNA病毒暫命名為海洋雙RNA病毒(MABV)。組成雙RNA病毒基因組的兩條片段是3.1kb的A片段和2.8kb的B片段。B片段編碼一個分子量為90kDa的依賴RNA的RNA聚合酶；而A片段編碼一個分子量106kDa的聚蛋白，編碼的蛋白順序?yàn)镹H2-VP2-NS-VP3-COOH。其中VP2和VP3為病毒的結(jié)構(gòu)蛋白(Zhang，CX，Suzuki，S(2004)Aquabirnaviruses isolated from marine organisms form adistinct genogroup from other aquabimaviruses[J].(《J Fish Dis》2004，27633-643)。
由于海洋雙RNA病毒其寄主廣泛，對多種魚苗生產(chǎn)造成了很大的危害，在許多未發(fā)病成魚體內(nèi)也檢測到較高比例的MABV病毒攜帶者，從而造成病毒的傳播。除魚貝病害診斷需要外，親魚引進(jìn)和繁育中也迫切需要有對病毒攜帶的親魚進(jìn)行靈敏檢測的手段。到目前為止，已報道用來檢測該病毒方法，包括間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence)、蛋白免疫印記法(immunodot blot)及RT-PCR法等，相關(guān)檢測技術(shù)可詳見Rodriguez Saint-Jean S，Borrego JJ，Perez-Prieto SI.在“Comparativeevaluation of five serological methods and RT-PCR assay for the detection ofIPNV in fish”(《J Virol Methods》2001 Sep；97(1-2)23-31)中的研究。但至今還未見利用基因工程方法制備病毒外殼蛋白，作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白、作為免疫疫苗，以及作為抗原制備抗體的專利和報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種海洋雙RNA病毒MABV蛋白的其制備方法和應(yīng)用。
一種含有海洋雙RNA病毒MABV基因的GST/VP2融合蛋白的生產(chǎn)方法，包括提取病毒MABV的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，設(shè)計引物VP2正向引物(5’-ggatccatgtccctcaccacg-3’)VP2反向引物(5’-ctcgagttaggccaccagggtg-3’)經(jīng)PCR擴(kuò)增后，得到的DNA片段克隆入pGEM-T-easy載體后用BamH I和Xho I雙酶切，克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pGEX-4t-2中，并轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)條件為細(xì)菌OD600＝1.0，IPTG終濃度為0.8mM，37℃，搖6h，采用包涵體分離結(jié)合割膠回收的方法純化得到GST/VP2融合蛋白。
一種含有海洋雙RNA病毒MABV基因VP2蛋白的生產(chǎn)方法，包括將所述的GST/VP2融合蛋白經(jīng)凝血酶處理后，用GST親和柱吸附除去GST，回收得到的VP2蛋白。
一種含有海洋雙RNA病毒MABV基因的GST/VP3融合蛋白的生產(chǎn)方法，包括提取病毒MABV的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，設(shè)計引物vp3正向引物(5’-ggatcetcagggatggatgaagag-3’)vp3反向引物(5’-ctcgagttacacttctccgttatctcc-3’)經(jīng)PCR擴(kuò)增后，得到的DNA片段首先克隆入pGEM-T-easy載體；將重組pGEM-T-easy載體用BamH I和Xho I雙酶切，將vp3進(jìn)一步克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pGEX-4t-2中，并轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。GST/VP3表達(dá)條件為細(xì)菌OD600＝0.8，IPTG終濃度＝0.8mM，30℃搖8h，通過谷胱甘肽親和柱直接分離純化得到GST/VP3融合蛋白。
一種含有海洋雙RNA病毒MABV基因VP3蛋白的生產(chǎn)方法，包括將所述的GST/VP3融合蛋白經(jīng)凝血酶處理后，用GST親和柱吸附除去GST，回收得到的VP3蛋白。
本發(fā)明還提供了所述蛋白或融合蛋白，即VP2蛋白、VP3蛋白、GST/VP2融合蛋白或GST/VP3融合蛋白作為疫苗在誘導(dǎo)魚產(chǎn)生免疫反應(yīng)中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了所述蛋白或融合蛋白，即VP2蛋白、VP3蛋白、GST/VP2融合蛋白或GST/VP3融合蛋白制備的多克隆抗體。所述的多克隆抗體可以為抗VP2或VP3蛋白或抗VP2或VP3蛋白序列中各抗原蔟的各種多克隆抗體。
本發(fā)明還提供了所述的多克隆抗體在檢測海洋雙RNA病毒MABV中的應(yīng)用。采用ELISA檢測方法或Western blot檢測方法檢測海洋雙RNA病毒MABV。
ELISA檢測方法，檢測的條件為用包被液包被感染海洋雙RNA病毒MABV動物的腎臟(血液或其它組織)提取液，一抗為抗VP2或VP3融合蛋白多克隆抗體，二抗為過氧辣根偶聯(lián)的羊抗兔血清，以O(shè)PD為底物進(jìn)行顯色。這里“二抗”可以為任何抗兔的抗體，顯色也可以為任何可以檢測的ELISA顯色方法。
Western blot檢測方法，檢測的條件為將感染海洋雙RNA病毒MABV動物的腎臟(血液或其它組織)提取液經(jīng)變性凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜進(jìn)行雜交，一抗為抗VP3融合蛋白多克隆抗體，二抗為過氧辣根偶聯(lián)的羊抗兔血清，以DAB為底物進(jìn)行顯色。這里“二抗”可以為任何抗兔的抗體，顯色也可以為任何可以檢測的Western blot顯色方法。
在本發(fā)明中，術(shù)語“基因”指編碼具有海洋雙RNA病毒(或多肽)的核苷酸序列。該術(shù)語還包括能編碼具有與海洋雙RNA病毒外殼蛋白相同功能的蛋白的序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個核苷酸的缺失、插入和或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個核苷酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語“海洋雙RNA病毒外殼蛋白”指具有海洋雙RNA病毒外殼蛋白活性的多肽。該術(shù)語還包括具有與海洋雙RNA病毒外殼蛋白相同功能的序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體，誘導(dǎo)突變體，在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下能與海洋雙RNA病毒DNA雜交的DNA所編碼的蛋白，以及利用抗海洋雙RNA病毒外殼蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。
本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。所用的宿主細(xì)胞是指原核細(xì)胞?？捎玫脑怂拗骷?xì)胞如大腸桿菌，枯草桿菌等。本發(fā)明的抗體制備可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的技術(shù)進(jìn)行制備。
本發(fā)明所提供的海洋雙RNA病毒MABV的檢測方法同時利用外殼蛋白VP2和VP3抗體進(jìn)行雙重檢測，增加了檢測的可信度；利用ELISA和western blot進(jìn)行檢測海洋雙RNA病毒MABV，比其它方法(RT-PCR、原位雜交等)簡單易行；利用制備VP2和VP3融合蛋白作為疫苗，比減毒疫苗更經(jīng)濟(jì)更安全。


圖1 vp2基因片段在大腸桿菌中表達(dá)。泳道1，蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量；泳道2，在誘導(dǎo)條件OD600＝1.0、IPTG＝0.8mM、溫度37℃下的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物；泳道3，表達(dá)產(chǎn)物的沉淀不可溶蛋白；泳道4，表達(dá)產(chǎn)物的上清可溶性蛋白；泳道5，載體pGEX4t-2的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物；泳道6，大腸桿菌E.coliBL21(DE3)的裂解液；泳道7，表達(dá)產(chǎn)物的Western blot驗(yàn)證。
圖2 vp3基因片段在大腸桿菌中表達(dá)。泳道1，蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量；泳道2，在誘導(dǎo)條件OD600＝0.8、IPTG＝0.8mM、溫度37℃下的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物；泳道3，表達(dá)產(chǎn)物的沉淀不可溶蛋白；泳道4，表達(dá)產(chǎn)物的上清可溶性蛋白；泳道5，載體pGEX4t-2的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物；泳道6，大腸桿菌E.coliBL21(DE3)的裂解液；泳道7，回收純化的VP3融合蛋白；泳道8，表達(dá)產(chǎn)物的Western blot驗(yàn)證。
圖3在MABV感染的CHSE-214細(xì)胞中通過免疫印跡來檢測MABVVP2(VP2前體)和VP3蛋白。
泳道1標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量；A.泳道2和3用GST/VP3抗血清檢測VP3蛋白(約27 kDa)；泳道4未感染病毒的細(xì)胞作為陰性對照。
B.泳道5和6用GST/VP2抗血清檢測VP2前體(約56 kDa)以及成熟的VP2蛋白(約54 kDa)；泳道7未感染病毒的細(xì)胞作為陰性對照。
圖4A魚病毒的ELISA檢測，利用抗VP2抗體進(jìn)行ELISA檢測，灰柱為GST/VP2或GST/VP3抗血清與不同滴度病毒的反應(yīng)；黑柱(control 1)為免疫前兔血清與不同滴度病毒的反應(yīng)；白柱(control 2)為只有二抗與不同滴度病毒的反應(yīng)。每個柱體為三個重復(fù)的平均值。
圖4B魚病毒的ELISA檢測，利用抗VP3抗體進(jìn)行ELISA檢測，灰柱為GST/VP2或GST/VP3抗血清與不同滴度病毒的反應(yīng)；黑柱(control 1)為免疫前兔血清與不同滴度病毒的反應(yīng)；白柱(control 2)為只有二抗與不同滴度病毒的反應(yīng)。每個柱體為三個重復(fù)的平均值。
圖5AB用GST/VP2抗血清進(jìn)行MABV在香魚ayu(Plecoglossusaltivelis)中的ELISA分析。
黒柱感染后不同天數(shù)的魚腎樣品。白柱(control 1)為無病毒的魚腎?；抑?control 2)為感染病毒的魚腎與免疫前兔血清反應(yīng)。每個柱體為三個重復(fù)的平均值。
圖5B用GST/VP3抗血清進(jìn)行MABV在香魚ayu(Plecoglossus altivelis)中的ELISA分析。
黒柱感染后不同天數(shù)的魚腎樣品。白柱(control 1)為無病毒的魚腎?；抑?control 2)為感染病毒的魚腎與免疫前兔血清反應(yīng)。每個柱體為三個重復(fù)的平均值。
圖6魚病毒的Western blot檢測。用GST/VP3抗血清對香魚體中的MABV病毒進(jìn)行免疫分析。用MABV-Y6病毒感染魚后取感染后不同天數(shù)的魚腎樣品作分析，未感染病毒的魚腎作為對照。
具體實(shí)施例方式
MABV病毒的分離、VP2和VP3基因克隆將從感病香魚(Plecoglossus altivelis)中分離到的MABV在鮭魚細(xì)胞系CHSE-214(Chinook salmon embryo cell line)中于20℃中培養(yǎng)，繁殖病毒，并進(jìn)一步提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
以MABV Y-6病毒感染的魚細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，設(shè)計引物。其中正向引物含有BamHI酶切位點(diǎn)(下劃線堿基)，反向引物含有XhoI酶切位點(diǎn)(下劃線堿基)。
vp2正向引物(5’-ggatccatgtccctcaccacg-3’)vp2反向引物(5’-ctcgagttaggccaccagggtg-3)vp3正向引物(5’-ggatcctcagggatggatgaagag-3’)vp3反向引物(5’-ctcgagttacacttctccgttatctcc-3’)PCR擴(kuò)增條件94℃1min，54℃40s，72℃1min，30個循環(huán)。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，得到的DNA片段首先克隆入pGEM-T-easy載體。并經(jīng)測序確定了已克隆到病毒外殼蛋白Vp2和核心蛋白VP3基因。其中，Vp2基因的編碼區(qū)的核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列對應(yīng)GenBank登錄號AY283781。vp3基因的編碼區(qū)的核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列對應(yīng)GenBank登錄號AY283781。
VP2和VP3在大腸桿菌中與GST融合高效表達(dá)將重組pGEM-T-easy載體用BamH I和Xho I雙酶切，分別將vp2和vp3進(jìn)一步克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pGEX-4t-2中，并轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。GST/VP2最適合表達(dá)條件為細(xì)菌OD600＝1.0，IPTG終濃度為0.8mM，37℃，搖6h。而GST/VP3最適合表達(dá)條件為細(xì)菌OD600＝0.8，IPTG終濃度＝0.8mM，30℃搖8h。薄層掃描顯示在最適合表達(dá)條件下，GST/VP2最高表達(dá)水平占細(xì)菌總蛋白的23.6％，而GST/VP3最高表達(dá)水平達(dá)可達(dá)到細(xì)菌總蛋白的42.7％。SDS-PAGE和用抗GST抗體進(jìn)行的Western blot結(jié)果顯示表達(dá)的GST/VP2大小約46 kDa，而GST/VP3為53 kDa與預(yù)計的分子量相符合。SDS-PAGE分析還顯示GST/VP2表達(dá)產(chǎn)物幾乎全是不可溶性的包涵體，而GST/VP3除不可溶性的包涵體外，還有部分是可溶性蛋白。
其中VP2融合蛋白具有序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列，VP3融合蛋白具有序列表中SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列。
在SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列及SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列中第664～678位置編碼的氨基酸序列為凝血酶(thrombin)切割位點(diǎn)，能將融合蛋白的GST和VP2(或VP3)切開，后面為VP2或VP3序列。
大腸桿菌表達(dá)的重組VP2和VP3蛋白的純化由于大腸桿菌表達(dá)的是N端融合了谷胱甘肽的VP3，而且部分是可溶性的，因此可以通過谷胱甘肽親和柱直接分離純化GST/VP3。將細(xì)菌用溶菌酶lysozyme和超聲波處理后，通過親和柱分離回收了產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和western blot分析，結(jié)果顯示(見圖2)GST/VP3已經(jīng)成功被純化回收。由于大腸桿菌表達(dá)的GST/VP2是以不可溶的包涵體形式存在，我們采用了包涵體分離結(jié)合割膠回收的方法純化GST/VP2。包涵體分離使用Novagen公司的Protein Refolding Kit，用lysozyme(溶菌酶)將含GST/VP2的表達(dá)細(xì)菌裂解在冷的1×PBS的溶液中，并經(jīng)超聲波處理后，通過離心和1×包涵體洗液處理3次，回收包涵體。再用1×包涵體溶解液溶解包涵體，通過SDS-PAGE，將含目的條帶的PAGE膠割下后透析，回收GST/VP2蛋白。將凝血酶加入溶解在1×PBS的溶液的GST/VP2和GST/VP3溶液中，在20℃酶切12hr，然后將酶切好的混合物通過親和層析柱，吸附除去GST，回收得到VP2和VP3蛋白。
VP2和VP3多克隆抗體制備用純化的重組VP2和VP3蛋白免疫14-16周齡的健康新西蘭大白兔，每次注射500μl含80μg左右純化的GST/VP3和GST/VP2。第一次加500μl福氏完全佐劑溶液乳化，皮下多點(diǎn)注射免疫；3周后，同劑量GST/VP3和GST/VP2加福氏不完全佐劑溶液乳化，腿部肌肉多點(diǎn)注射免疫；2周后，直接用GST/VP3和GST/VP2溶于1ml生理鹽水免疫；1周后，再次用抗原加強(qiáng)免疫。1周后，收集兔抗血清，-70℃保存?zhèn)溆?。制備的多克隆抗體的效價測定結(jié)果表明，抗Vp2多克隆抗體和抗VP3多克隆抗體的效價結(jié)果均為1∶512000，達(dá)到高效價水平，可以用于進(jìn)一步檢測應(yīng)用。GST-VP2融合蛋白和GST-VP3融合蛋白作為疫苗誘導(dǎo)香魚產(chǎn)生抗體將純化的GST-VP2融合蛋白和GST-VP3融合蛋白溶于PBS，配制成1μg/1μl的溶液，每100μl溶液加上適量5μlGen+抗生素，作為免疫抗原，免疫香魚。分別制備魚抗GST-VP2融合蛋白的血清和魚抗GST-VP3融合蛋白的血清。結(jié)合ELISA方法評價了這兩種血清對感染病毒的細(xì)胞的保護(hù)作用，中和抗體的效價分別為1∶3,200和1∶800。VP2融合蛋白免疫魚的血清對感染病毒的細(xì)胞的保護(hù)作用比VP3融合蛋白免疫魚的血清對病毒感染細(xì)胞的保護(hù)作用更強(qiáng)，為抗病毒疫苗的篩選提供了依據(jù)。
用多克隆抗體檢測MABV病毒用感染指數(shù)(MOI)為0.1的MABV感染CHSE-214細(xì)胞，當(dāng)90％細(xì)胞出現(xiàn)病理癥狀時，收獲細(xì)胞，進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析，以確定多克隆抗體的特異性和檢測有效性。當(dāng)用兔抗GST/VP3抗血清進(jìn)行蛋白印跡檢測時，可以清楚地檢測到1條27 kDa的特異性蛋白條帶(圖3中泳道2和3)，其與預(yù)測的VP3分子量一致。當(dāng)用兔抗GST/VP2抗血清檢測時，可以檢測到3條蛋白質(zhì)條帶，大小分別為56、54和35 kDa((圖3中泳道5和6)，其中56 kDa蛋白與VP2前體蛋白proVP2大小一致，54 kDa蛋白則與VP2蛋白大小一致，35 kDa則是未知蛋白，有可能是VP2的降解形式。在沒有病毒感染的細(xì)胞中，VP2和VP3的都沒有檢測到陽性條帶。結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)制備的兔抗VP2和兔抗VP3抗血清可以用于該病毒的特異性檢測。
為了確定兩種多克隆抗體的檢測MABV靈敏度，對不同稀釋濃度的病毒粒子進(jìn)行了ELISA檢測。結(jié)果表明，當(dāng)MABV病毒滴度從9.76×107TCID50/ml稀釋到1.00×104TCID50/ml時，無論是兔抗GST/VP2抗血清還是兔抗GST/VP3抗血清，均可以檢測到。這說明兩種多克隆抗體檢測MABV都達(dá)到了相當(dāng)高的靈敏度。
用多克隆抗體檢測感病香魚體內(nèi)MABV病毒將體長10cm香魚分為2組，每組22條。1組腹膜下每條注射0.01mlMABV(107TCID50)，另1組每條注射0.01ml PBS作為對照。感染后不同天數(shù)取魚腎臟，進(jìn)行ELISA和western blot檢測。
ELISA檢測的具體操作步驟如下腎臟勻漿上清液溶在Tris溶液中使最終濃度(50mM Tris.Cl pH6.8，100mM DTT，2％SDS)，沸水浴變性后樣品用包被液(15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，pH9.6)包被在96孔的ELISA板上；再用封閉液PBS-T(PBS pH7.4，0.5％Tween-20)加3％脫脂奶粉封閉30分鐘；抗VP2抗體和抗VP3抗體以1∶2000分別稀釋在3％脫脂奶粉的PBS-T溶液中37℃溫浴1小時；用PBS-T洗滌3次，每次5分鐘；用HRP偶聯(lián)的羊抗兔抗體作為二抗37℃反應(yīng)1小時；用PBS-T洗滌3次，每次5分鐘；最后，加入100μl OPD檸檬酸溶液(0.4mg/ml，pH5.0)顯示，以50ul 50mM H2SO4終止反應(yīng)，在492nm處測定吸光值。
Western blot的操作方法如Towbin等(1979)(Towbin H，Staehelin T，Gordon J.Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamidae gels tonitrocellulose sheetsProcedure and some applications.Proc Natl Acad SciUSA，1979，764350-4354)所述。
ELISA檢測結(jié)果表明，在MABV感染后第4天GST/VP3抗血清就可以明顯地檢測到香魚體內(nèi)MABV病毒(圖5B)，而用GST/VP2抗血清則在第8天才能很明顯地檢測到香魚體內(nèi)病毒(圖5A).結(jié)果提示使用ELISA檢測方法時，VP3抗血清比VP2抗血清能更靈敏地檢測病魚體內(nèi)的MABV病毒。
進(jìn)一步用GST/VP3抗血清對感染后不同天數(shù)魚腎進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果也顯示在MABV感染后第4天可以明顯地檢測特異性條帶(圖6)，這進(jìn)一步確定了ELISA檢測的結(jié)果。
從以上檢測方法得到了如下檢測結(jié)果(1)利用VP3抗體，在病毒感染后4天就能用ELISA方法檢測到病毒，而用VP2抗體則需6天；(2)利用VP3抗體，在病毒感染后6天就能用Western blot方法檢測到病毒。(3)VP3抗體的靈敏性高于VP2抗體。
SEQUENCE LISTING<110>浙江大學(xué)<120>海洋雙RNA病毒MABV重組蛋白的制備方法與應(yīng)用<130>
<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1320<212>DNA<213>GST/VP2<400>1atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt60ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa120tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat180ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac240atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg300gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt360gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa420acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat480gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa540aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca600tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat660ctggttccgc gtggatccat gtccctcacc acgaaccccc aggacaaagt gaacaaccag720ctagtcacca aaggagtgac agtcctaaac ctaccaacag ggttcgacaa gccatacgtc780
cgcctggagg acgagacccc acaagggccc cagtcaatga acggcgcccg gatgaggtgc840acagctgcaa ttgcaccacg aaggtacgaa atcgacctcc catccgcacg cctccccaca900gtaccagcga ctgggaccct cacaacaatc tatgaaggga acgccgacat tgtgaactca960accacagtga ccggcgacat cagcttcaga ctggaacaag accccccgaa tgacacgaag1020tacgacttcc agctcgactt cctcggctta gacaacaacg tccccgtcgt gtcaataacc1080agctctacgc tggccacaac cgacaactac aggggggtct cagtcaaatt cacacagtca1140atcccaacag agacaatcac aaaacccatc accagggtca agctgtccta caaaatcaac1200cagcagacag ctatcggcaa tgcagcaacg cttggacccc tggggccctc atccgtctca1260ttctcatcag gaaacggcaa cgtacctgga gtgctcaggc caatcaccct ggtggcctaa1320<210>2<211>1395<212>DNA<213>GST/VP3<400>2atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt60ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa120tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat180ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac240atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg300gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt360gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa420acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat480gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa540aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca600tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat660ctggttccgc gtggatcctc agggatggat gaagagctgc agaagctgct gcacgccacc720atggccagag caaaagaggt gaaagacgcc gaagtcttca aacttctcaa gctgatgtcc780tggaccagga agaacgggct caccgaccac atgtatgaat ggtcaaaaga ggaccctgaa840gcagtcaaat ttggcaaact catcagcaca ccaccaaaac accaagagaa gccaaaagga900
cccgaccagc acacggcaca ggaggcaaaa gccgtccgga tctcactaga tgcagtgaaa960gcaggagcag actttgcctc cccagactgg atcgcggaga atggataccg cggtccatca1020ccaggccagt tcaagtacta cgtcatcaca gggcgcgtcc cagacccacg agacgagtac1080gaggactacg tgcgaaaacc aataacaaga cccacggaca tggacaaaat cagacgccta1140gccaacagtg tctacggact tccccaccaa gaacctgcac cagaggaatt ctaccaagcg1200gtagtcgaga tcttcgcaga aaatggagga cgaggaccag atcaagacca gatgcaagac1260ctgagggact tggcccggca gatgaaacga cgaccccgac cagctgagac acgcaggcaa1320aaccgagctc caccacgggc ggcacccagt ggaagctcac gttttacccc ctccggagat1380aacggagaag tgtaa 1395<210>3<211>439<212>PRT<213>GST/VP2<400>3Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro1 5 10 15Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu20 25 30Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu35 40 45Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys50 55 60Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn65 70 75 80Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu85 90 95Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser100 105 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu115 120 125Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn130 135 140Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp145 150 155 160Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu165 170 175Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr180 185 190Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala195 200 205Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg210 215 220Gly Ser Met Ser Leu Thr Thr Asn Pro Gln Asp Lys Val Asn Asn Gln225 230 235 240Leu Val Thr Lys Gly Val Thr Val Leu Asn Leu Pro Thr Gly Phe Asp245 250 255Lys Pro Tyr Val Arg Leu Glu Asp Glu Thr Pro Gln Gly Pro Gln Ser260 265 270Met Asn Gly Ala Arg Met Arg Cys Thr Ala Ala Ile Ala Pro Arg Arg275 280 285Tyr Glu Ile Asp Leu Pro Ser Ala Arg Leu Pro Thr Val Pro Ala Thr290 295 300Gly Thr Leu Thr Thr Ile Tyr Glu Gly Asn Ala Asp Ile Val Asn Ser305 310 315 320Thr Thr Val Thr Gly Asp Ile Ser Phe Arg Leu Glu Gln Asp Pro Pro325 330 335Asn Asp Thr Lys Tyr Asp Phe Gln Leu Asp Phe Leu Gly Leu Asp Asn340 345 350Asn Val Pro Val Val Ser Ile Thr Ser Ser Thr Leu Ala Thr Thr Asp
355 360 365Asn Tyr Arg Gly Val Ser Val Lys Phe Thr Gln Ser Ile Pro Thr Glu370 375 380Thr Ile Thr Lys Pro Ile Thr Arg Val Lys Leu Ser Tyr Lys Ile Asn385 390 395 400Gln Gln Thr Ala Ile Gly Asn Ala Ala Thr Leu Gly Pro Leu Gly Pro405 410 415Ser Ser Val Ser Phe Ser Ser Gly Asn Gly Asn Val Pro Gly Val Leu420 425 430Arg Pro Ile Thr Leu Val Ala435<210>4<211>464<212>PRT<213>GST/VP3<400>4Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro1 5 10 15Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu20 25 30Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu35 40 45Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys50 55 60Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn65 70 75 80Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu85 90 95
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser100 105 110Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu115 120 125Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn130 135 140Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp145 150 155 160Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu165 170 175Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr180 185 190Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala195 200 205Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg210 215 220Gly Ser Ser Gly Met Asp Glu Glu Leu Gln Lys Leu Leu His Ala Thr225 230 235 240Met Ala Arg Ala Lys Glu Val Lys Asp Ala Glu Val Phe Lys Leu Leu245 250 255Lys Leu Met Ser Trp Thr Arg Lys Asn Gly Leu Thr Asp His Met Tyr260 265 270Glu Trp Ser Lys Glu Asp Pro Glu Ala Val Lys Phe Gly Lys Leu Ile275 280 285Ser Thr Pro Pro Lys His Gln Glu Lys Pro Lys Gly Pro Asp Gln His290 295 300Thr Ala Gln Glu Ala Lys Ala Val Arg Ile Ser Leu Asp Ala Val Lys305 310 315 320Ala Gly Ala Asp Phe Ala Ser Pro Asp Trp Ile Ala Glu Asn Gly Tyr325 330 335Arg Gly Pro Ser Pro Gly Gln Phe Lys Tyr Tyr Val Ile Thr Gly Arg
340 345 350Val Pro Asp Pro Arg Asp Glu Tyr Glu Asp Tyr Val Arg Lys Pro Ile355 360 365Thr Arg Pro Thr Asp Met Asp Lys Ile Arg Arg Leu Ala Asn Ser Val370 375 380Tyr Gly Leu Pro His Gln Glu Pro Ala Pro Glu Glu Phe Tyr Gln Ala385 390 395 400Val Val Glu Ile Phe Ala Glu Asn Gly Gly Arg Gly Pro Asp Gln Asp405 410 415Gln Met Gln Asp Leu Arg Asp Leu Ala Arg Gln Met Lys Arg Arg Pro420 425 430Arg Pro Ala Glu Thr Arg Arg Gln Asn Arg Ala Pro Pro Arg Ala Ala435 440 445Pro Ser Gly Ser Ser Arg Phe Thr Pro Ser Gly Asp Asn Gly Glu Val450 455 460
權(quán)利要求
1.一種含有海洋雙RNA病毒MABV基因的GST/VP2融合蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于提取病毒MABV的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，設(shè)計引物VP2正向引物(5’-ggatccatgtccctcaccacg-3’)VP2反向引物(5’-ctcgagttaggccaccagggtg-3’)經(jīng)PCR擴(kuò)增后，得到的DNA片段克隆入pGEM-T-easy載體后用BamH I和Xho I雙酶切，克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pGEX-4t-2中，并轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)條件為細(xì)菌OD600＝1.0，IPTG終濃度為0.8mM，37℃，搖6h，采用包涵體分離結(jié)合割膠回收的方法純化得到GST/VP2融合蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的方法而得到的GST/VP2融合蛋白。
3.一種含有海洋雙RNA病毒MABV基因VP2蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于將權(quán)利要求2所述的GST/VP2溶解在1×PBS的溶液中，將凝血酶thrombin加入溶液中，在20℃酶切12hr，然后將酶切好的混合物通過親和層析柱，吸附除去GST，回收得到VP2蛋白。
4.一種含有海洋雙RNA病毒MABV基因的GST/VP3融合蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于提取病毒MABV的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，設(shè)計引物vp3正向引物(5’-ggatcctcagggatggatgaagag-3’)vp3反向引物(5’-ctcgagttacacttctccgttatctcc-3’)經(jīng)PCR擴(kuò)增后，得到的DNA片段首先克隆入pGEM-T-easy載體；將重組pGEM-T-easy載體用BamH I和Xho I雙酶切，將vp3進(jìn)一步克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pGEX-4t-2中，并轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。GST/VP3表達(dá)條件為細(xì)菌OD600＝0.8，IPTG終濃度＝0.8mM，30℃搖8h，通過谷胱甘肽親和柱直接分離純化得到GST/VP3融合蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述的方法而得到的GST/VP3融合蛋白。
6.一種含有海洋雙RNA病毒MABV基因VP3蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于將權(quán)利要求5所述的GST/VP3融合蛋白溶解在1×PBS的溶液中，將凝血酶thrombin加入溶液中，在20℃酶切12hr，然后將酶切好的混合物通過親和層析柱，吸附除去GST，回收得到VP3蛋白。
7.如權(quán)利要求2或5所述的融合蛋白作為疫苗在誘導(dǎo)魚產(chǎn)生免疫反應(yīng)中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求3或6所述的蛋白作為疫苗在誘導(dǎo)魚產(chǎn)生免疫反應(yīng)中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求2或5所述的融合蛋白制備的多克隆抗體。
10.如權(quán)利要求9所述的多克隆抗體在檢測海洋雙RNA病毒MABV中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含有海洋雙RNA病毒MABV結(jié)構(gòu)蛋白基因的重組蛋白制備方法和應(yīng)用，所述的重組蛋白包括VP2融合蛋白或VP3融合蛋白以及VP2或VP3蛋白，其中VP2融合蛋白編碼序列具有序列表中SEQID NO.1所述的核苷酸序列，VP3融合蛋白編碼序列具有序列表中SEQID NO.2所述的核苷酸序列。本發(fā)明用重組蛋白制備的多克隆抗體在檢測海洋雙RNA病毒MABV中增加了檢測的可信度；利用ELISA和westernblot進(jìn)行檢測，比其它方法(RT－PCR、原位雜交等)簡單易行。利用制備VP2和VP3重組蛋白作為疫苗，比減毒疫苗更經(jīng)濟(jì)更安全。
文檔編號C07K16/18GK101016547SQ20071006690
公開日2007年8月15日 申請日期2007年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月25日
發(fā)明者張傳溪, 徐海君, 楊章女, 林建國 申請人:浙江大學(xué)