專利名稱：抗傳染性法氏囊病病毒vp4蛋白單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及抗體工程技術(shù)，具體為抗傳染性法氏囊病病毒VP4蛋白 單克隆抗體。
技術(shù)背景傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus, IBDV)是傳染性法氏囊病(IBD)的病 原，主要侵害3-6周齡雛雞的法氏囊中樞免疫器官，破壞表面帶有sIgM的B淋巴細(xì)胞，并引 起脾臟、胸腺及外周血液淋巴細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致以淋巴細(xì)胞衰竭、壞死為主要特征的免疫缺 陷性和免疫抑制性疾病。該病發(fā)病率高，病程短，除疾病自身可造成機(jī)體損傷外，還可導(dǎo)致 多種疫苗免疫失敗，嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。IBDV屬雙RNA病毒科(S!VmmWA^)禽雙 RNA病毒屬04礎(chǔ)/maw'n^),無囊膜，具有單層衣殼，呈20面體立體對稱，病毒基因組由雙 鏈雙節(jié)段RNA組成，大節(jié)段A全長3259個核苷酸，含有兩個部分重疊的開放閱讀框架(ORF)， 大ORF全長共3036個核苷酸，按NH2-VP2-VP4-VP3-COOH的順序編碼分子量為110 kDa 的多聚前體蛋白(VP2/4/3)，并剪切加工成為VP2蛋白前體(pVP2)、 VP3和VP4蛋白，pVP2 進(jìn)一步加工成為成熟的VP2蛋白和4條多肽(pep46、 pep7a、 pep7b和pepll);小ORF全長共 435_447個核苷酸，編碼VP5非結(jié)構(gòu)蛋白。小節(jié)段B全長2827個核苷酸，只有一個ORF編 碼VP1蛋白。VP4由243個氨基酸組成，分子量約為28kDa,屬于絲氨酸蛋白酶，具有水解蛋白活性， 主要作用是對多聚前體蛋白VP2/4/3進(jìn)行自我水解，使之水解成為pVP2、 VP3和VP4三種 病毒蛋白，其中pVP2-VP4VP4-VP3確切剪切位點(diǎn)分別定位于L512A丄A513和 M755AiA756。此外，VP4還能激活VP1的合成，與病毒在感染細(xì)胞后形成的微管狀結(jié)構(gòu)有關(guān)，有可能也參與了病毒組裝，但不誘導(dǎo)凋亡。由于IBDV病毒粒子不存在VP4蛋白，無法 獲得自然狀態(tài)下的VP4病毒蛋白，嚴(yán)重制約VP4蛋白特性和功能的研究，利用VP4重組蛋 白制備特異性單克隆抗體可為VP4研究提供必要的試劑和技術(shù)手段，對探討VP4蛋白在IBDV 病毒粒子形成及其致病方面的作用具有重要意義。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供抗IBDV VP4蛋白單克隆抗體。本發(fā)明的單克隆抗體是用純化的IBDV VP4重組蛋白為抗原，通過雜交瘤細(xì)胞方法獲得
的，能特異識別IBDV感染細(xì)胞病毒蛋白的單克隆抗體。IBDVVP4重組蛋白是將IBDVVP4 基因克隆于原核表達(dá)載體pET-28a，在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，分離包涵體，用8M 尿素溶解，經(jīng)鎳螯合親和層析純化獲得的表達(dá)蛋白。 該單克隆抗體的具體制備方法如下1 、根據(jù)IBDV VP4基因cDNA序列設(shè)計(jì)一對引物，通過PCR擴(kuò)增得到全長VP4基因。 將IBDV VP4基因克隆于原核表達(dá)載體pET-28a，在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)IBDV VP4蛋白；裂解表達(dá)菌體，分離包涵體，用8M尿素溶液溶解表達(dá)蛋白，經(jīng)鎳螯合親和層析 純化，獲得IBDVVP4重組蛋白。2、 用IBDV VP4重組蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞 融合，以HAT培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)后，以VP4重組蛋白和IBDV感染細(xì)胞進(jìn)行雙重ELISA篩 選和有限稀釋法克隆化，獲得分泌抗IBDV VP4蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；將雜交瘤 細(xì)胞注入經(jīng)降殖烷致敏的BALB/c小鼠誘生腹水，對獲得抗IBDV VP4蛋白單克隆抗體特性 進(jìn)行鑒定。3、 以ELISA測定抗IBDV VP4蛋白單克隆抗體的腹水效價，間接免疫熒光鑒定抗IBDV VP4蛋白單克隆抗體與IBDV病毒蛋白的反應(yīng)性和特異性，用單克隆抗體亞型測定試劑盒鑒 定抗IBDV VP4蛋白單克隆抗體的Ig亞類。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是(1)本發(fā)明提供的IBDVVP4重組蛋白制備方法簡單，純度高；(2)本 發(fā)明提供抗IBDVVP4蛋白的單克隆抗體特異性強(qiáng)，制備方法簡單；(3)抗IBDVVP4蛋白單 克隆抗體可用于VP4蛋白的特性和功能研究。


圖1為IBDV VP4重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-VP4的鑒定圖，圖中1是陰性對照，2是質(zhì)粒 pET28a-VP4的PCR產(chǎn)物，3是100 bp DNA ladder。圖2為IBDV VP4表達(dá)蛋白的SDS-PAGE鑒定圖，圖中1是蛋白質(zhì)Marker, 2是 BL21(DE3)/pET-28a誘導(dǎo)表達(dá)菌體，3是BL21(DE3)/pET28a-VP4誘導(dǎo)表達(dá)菌體。圖3為抗VP4蛋白單克隆抗體的IFA鑒定圖，圖中A和B分別是單克隆抗體6A4與IBDV NB株感染及正常雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)的反應(yīng)結(jié)果，C和D分別是單克隆抗體6H8與IBDV NB株感染及正常CEF的反應(yīng)結(jié)果，E和F分別是單克隆抗體4C3與IBDVNB株感染及正常 CEF的反應(yīng)結(jié)果。
具體實(shí)施方式
1、 IBDV VP4重組蛋白的制備根據(jù)IBDV NB株A節(jié)段核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，PCR
擴(kuò)增IBDV VP4基因，將其克隆于原核表達(dá)載體pET-28a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)IBDV VP4蛋白；收集表達(dá)菌體，凍融3次后，離心分離包涵體，用8M尿素溶液 溶解表達(dá)蛋白，經(jīng)鎳螯合親和層析純化，獲得IBDVVP4重組蛋白。2、 抗IBDVVP4蛋白單克隆抗體的制備用等量弗氏佐劑乳化純化的VP4重組蛋白， 免疫6-8周齡BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0在聚乙二醇作用下進(jìn)行細(xì)胞融合， 用HAT培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性培養(yǎng)；以純化的VP4重組蛋白和IBDV感染CEF裂解物為檢測抗 原，用雙重ELISA方法對雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行篩選，陽性雜交瘤經(jīng)連續(xù)5次有限稀釋法 克隆化，獲得穩(wěn)定分泌抗VP4蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；以降殖烷致敏BALB/c小鼠 后，將雜交瘤細(xì)胞注入致敏小鼠腹腔誘生腹水，獲得抗IBDVVP4蛋白單克隆抗體。3、 抗IBDV VP4蛋白單克隆抗體的特性鑒定以純化VP4重組蛋白為檢測抗原用間接 ELISA方法測定抗IBDV VP4蛋白單克隆抗體的腹水效價；以間接免疫熒光鑒定抗IBDV VP4 蛋白單克隆抗體與IBDV病毒蛋白的反應(yīng)性和特異性；用SBA公司ClonotypingTM System/HRP亞型測定試劑盒鑒定抗IBDV VP4蛋白單克隆抗體重鏈和輕鏈的Ig亞型。實(shí)施例1 IBDV VP4重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)IBDV NB株A節(jié)段核苷酸序列(EF517528.1)設(shè)計(jì)合成特異性引物，上游引物 5，-CGTCGTCCATGGCCGACAAGGGGTACGAGGTAGTC-3，(下劃線為iVcoI位點(diǎn))，下游引物 5'-CGTCGTCTCGAGCATGGCAAGGTGGTACTGGCGTCC-3,((下劃線為Jftol位點(diǎn))。以PCR 從IBDV A節(jié)段質(zhì)粒中擴(kuò)增IBDV VP4基因，引入TVcoI/^zoI酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物經(jīng)Wcol/^zol 雙酶酶切消化后，連接到原核表達(dá)載體pET-28a的iVcoI/J^oI位點(diǎn)間，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Topl0, 提取轉(zhuǎn)化細(xì)菌的質(zhì)粒，以PCR鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒(圖1)，經(jīng)序列測定驗(yàn)證，獲得IBDV VP4 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-VP4。實(shí)施例2 IBDV VP4重組蛋白的表達(dá)與純化以氯化鈣法將重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-VP4轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，挑取陽性克隆接種 LB液體培養(yǎng)基(含50昭/mL Kan), 37 °C 250 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，次日按1:100的比例接種 于含lOmL新鮮LB培養(yǎng)基lOOmL錐形瓶中，37 °C 300 r/min振蕩培養(yǎng)，當(dāng)0D6(X)=0.6時， 加入終濃度為lmMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)2h, 4°C 12000 r/min離心30 sec，收集菌體，凍融三次， 4°C 12000 r/min離心10 min， SDS-PAGE分析裂解菌體的上清和沉淀，分析IBDV VP4蛋白 的表達(dá)情況(圖2)。加入5倍體積8M尿素溶解沉淀，振蕩至溶液澄清，4°C 12000 r/min離心 10min，棄沉淀，上清轉(zhuǎn)移至鎳離子親和層析柱中，振蕩lh，使帶有His標(biāo)簽的VP4表達(dá)蛋 白與鎳離子鰲合，先后用2倍柱床體積pH=8.0的8 M尿素溶液，3倍柱床體積pH=6.3的8 M
尿素，3倍柱床體積pH=5.9的8M尿素和5倍柱床體積pH=4.5的8M尿素洗脫柱床，收集洗 脫液lml/管；用SDS-PAGE分析洗脫液，獲得高純度的VP4重組蛋白。 實(shí)施例3小鼠免疫分別將純化的IBDVVP4重組蛋白與弗氏佐劑等比例混合，充分乳化，制備VP4免疫 抗原，免疫6-8周齡BALB/c純系小鼠10只。首免以弗氏完全佐劑免疫抗原，背部皮下、 皮內(nèi)多點(diǎn)注射，每只100pg(0.2mL);間隔20天，用弗氏不完全佐劑免疫抗原進(jìn)行第二次 免疫，腹腔注射，每只100pg(0.2mL);間隔20天，用不加佐劑的VP4免疫抗原進(jìn)行三免， 肌肉注射，每只100pg(0.2mL);免疫15天后，尾靜脈采血，以VP4重組蛋白為檢測抗原， 用間接ELISA方法測定免疫小鼠血清的抗體水平，免疫小鼠抗體滴度達(dá)到1:4000以上，表 明小鼠獲得良好免疫效果。實(shí)施例3雜交瘤細(xì)胞株的建立1、 細(xì)胞融合細(xì)胞融合前3天，進(jìn)行超強(qiáng)免疫，以不加佐劑的VP4重組蛋白尾靜脈注射小鼠，每只 50嗎(0.1mL)。免疫小鼠經(jīng)眼眶放血，收集血清，拉頸致死后，無菌取小鼠脾臟，分離脾 細(xì)胞，經(jīng)臺盼蘭染色計(jì)數(shù)，按5:1的比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞(2xlO》混合，在PEG4000作 用下進(jìn)行細(xì)胞融合；融合細(xì)胞經(jīng)洗滌后，用HAT選擇培養(yǎng)基重懸，置5XC02 37'C進(jìn)行選 擇性培養(yǎng)，5天后半量換液，IO天后改為HT培養(yǎng)基。待細(xì)胞克隆長至1/5-1/2培養(yǎng)孔時， 吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測分泌抗體。2、 雜交瘤細(xì)胞篩選分別用純化的VP4重組蛋白和IBDV感染CEF裂解物作為檢測抗原，對雜交瘤細(xì)胞培 養(yǎng)上清中的分泌抗體進(jìn)行雙重ELISA檢測，篩選陽性雜交瘤細(xì)胞。用0.05M碳酸鹽包被 緩沖液(pH9.6)稀釋純化的VP4重組蛋白或IBDV感染CEF裂解物，加入酶標(biāo)板，100 ^L/ 孔，37。C包被1 h后轉(zhuǎn)入4。C包被過夜；用含0.05%吐溫20的PBS緩沖液(PBST)洗滌3次， 加5%脫脂奶粉37"封閉lh，每孔加入雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清100 ^L， 37。C孵育2h; PBST 洗3次，加入1:5000倍稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體，37。C孵育1 h， PBST洗4次，加入顯色底物OPD-H202，避光反應(yīng)10min后，用2 M H2S04終止反應(yīng)，用 酶標(biāo)儀讀取OD49o值，以與陰性O(shè)D柳值的比值大于2.1判為陽性。VP4重組蛋白和IBDV 感染細(xì)胞兩種抗原檢測均呈陽性的雜交瘤細(xì)胞孔為陽性克隆。3、 有限稀釋法克隆化用HT培養(yǎng)基制備陽性雜交瘤細(xì)胞懸液，取樣進(jìn)行臺盼蘭染色和計(jì)數(shù)；以HT培養(yǎng)基將
雜交瘤細(xì)胞稀釋至20個/mL和10個/mL，將稀釋細(xì)胞懸液分別加入96孔培養(yǎng)板，每孔O.l mL，細(xì)胞含量分別為2個/孔和l個/ L，置5y。C02 37'C培養(yǎng)，5-7天觀察細(xì)胞克隆生長情 況，選取單克隆生長孔細(xì)胞上清，以ELISA檢測分泌抗體；對陽性克隆進(jìn)行連續(xù)5次克隆， 使其抗體分泌陽性率達(dá)95%以上，擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存細(xì)胞，獲得穩(wěn)定分泌抗VP4蛋白單克隆 抗體的雜交瘤細(xì)胞株。其中的3株分別為4C3、 6A4和6H8。 實(shí)施例4抗VP4蛋白單克隆抗體的制備用降植烷腹腔注射成年雌性BALB/c小鼠，0.2mL/只，致敏1周后，腹腔注射雜交瘤細(xì) 胞懸液5xl0Mx107， 7-10天后采集小鼠腹水，12000 g離心3 min，收集上清，-70匸凍存， 獲得單克隆抗體4C3、 6A4和6H8腹水6.5-8 mL。實(shí)施例5抗VP4蛋白單克隆抗體的腹水效價測定用PBS緩沖液1000倍稀釋抗VP4蛋白單克隆抗體腹水，經(jīng)倍比稀釋后，分別加入VP4 重組蛋白(2 ng/mL)包被的酶標(biāo)板，100 pL/孔，37。C孵育2h; PBST洗滌3次，加入1:5000 稀釋的HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體，37。C孵育1 h， PBST洗滌后，加入顯色底物OPD-H202， 避光反應(yīng)10min，用2MH2S04終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀取OD柳值，以與陰性O(shè)D柳值的比 值大于2.1判為陽性，以陽性孔的最大稀釋度為抗VP4蛋白單克隆抗體腹水效價。結(jié)果測得 單克隆抗體4C3、 6A4和6H8腹水的ELISA效價分別為6.4x105、 2.6><106和5.2><106。實(shí)施例6抗VP4蛋白單克隆抗體與IBDV病毒蛋白的反應(yīng)性與特異性鑒定以間接免疫熒光測定抗VP4蛋白單克隆抗體與IBDV病毒蛋白的反應(yīng)性與特異性。雞胚 成纖維細(xì)胞經(jīng)IBDV感染24h， PBS漂洗兩次；加入甲醛丙酮=1 : 1的固定液，100pL/孑L， 固定l h;棄固定液，通風(fēng)干燥；分別加入單克隆抗體4C3、 6A4t和6H8的細(xì)胞培養(yǎng)上清， 100pL/孔，37。C孵育lh; PBS洗滌3次，加入1:100稀釋的FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體， 37。C孵育30min; PBS洗滌后，每孔加入PBS lOOpL，熒光顯微鏡觀察并照相。結(jié)果單克隆 抗體4C3、 6A4和6H8均特異識別IBDV感染CEF的病毒蛋白(圖3)。實(shí)施例7抗VP4蛋白單克隆抗體的Ig亞型測定利用SBA公司ClonotypingTM System/HRP亞型測定試劑盒測定抗IBDV VP4蛋白單克 隆抗體Ig亞型。結(jié)果顯示，單克隆抗體4C3、 6A4和6H8的重鏈均為IgGl，輕鏈為k。
序列表上游引物5'-CGTCGT￡￡^I^CCGACAAGGGGTACGAGGTAGTC-3，(下劃線為TVcoI位點(diǎn))；下游引物5，-CGTCGT￡I￡OASCATGGCAAGGTGGTACTGGCGTCC-3，(下劃線為Wol位點(diǎn))。
權(quán)利要求
1、 一種抗傳染性法氏囊病病毒(IBDV) VP4蛋白單克隆抗體，其特征在于該單克隆抗體 是用純化的IBDV VP4重組蛋白為抗原，通過雜交瘤細(xì)胞方法獲得的，特異識別IBDV 感染細(xì)胞中的VP4病毒蛋白的單克隆抗體。
2、 如權(quán)利要求1所述一種抗傳染性法氏囊病病毒(IBDV) VP4蛋白單克隆抗體，其特征在 于IBDV VP4重組蛋白是將IBDV VP4基因克隆于原核表達(dá)載體pET-28a,在大腸桿菌 BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，分離包涵體，用8M尿素溶解，經(jīng)鎳螯合親和層析純化獲得的表 達(dá)蛋白。
全文摘要
本發(fā)明抗傳染性法氏囊病病毒(IBDV)VP4蛋白單克隆抗體屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及基因工程。將IBDV VP4基因克隆于原核表達(dá)載體pET-28a，在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)；分離包涵體，用8M尿素溶解，經(jīng)鎳螯合親和層析純化獲得VP4重組蛋白。用VP4重組蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合，以HAT培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)后，以VP4重組蛋白和IBDV感染細(xì)胞進(jìn)行雙重ELISA篩選和有限稀釋法克隆化，獲得分泌抗IBDV VP4蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其中4C3、6A4和6H8腹水的ELISA效價分別為6.4×10⁵、2.6×10⁶和5.2×10⁶，均能特異識別IBDV感染細(xì)胞的病毒蛋白，其Ig亞型重鏈為IgG1，輕鏈為κ。
文檔編號C07K16/08GK101121748SQ20071007013
公開日2008年2月13日 申請日期2007年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月20日
發(fā)明者周繼勇, 王永志, 郭軍慶 申請人:浙江大學(xué)