專利名稱：用離子液體結(jié)晶蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種蛋白質(zhì)結(jié)晶的新方法，特別是涉及一種將離子液體用于蛋白質(zhì)結(jié)晶的新方法。
背景技術(shù)：
近年來，由于生物活性物質(zhì)在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)、農(nóng)業(yè)和工業(yè)方面的廣泛應(yīng)用，因此通過X射線晶體學(xué)揭示生物大分子結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系而顯得尤為重要。以晶體形式存在的生物大分子是比較穩(wěn)定的，而X射線衍射是確定晶體分子三維空間結(jié)構(gòu)最可靠的方法。具體了解生物大分子結(jié)構(gòu)對于新藥設(shè)計、蛋白質(zhì)工程以及改變分子結(jié)構(gòu)或構(gòu)象等方面都具有十分重要的意義。但是從總體方面來說，生物大分子的晶體培養(yǎng)仍然是摸索性和經(jīng)驗性的，在某種程度上還要靠機(jī)遇。晶體培養(yǎng)已成為當(dāng)前阻礙提高晶體結(jié)構(gòu)分析速度的關(guān)鍵性問題。
專利申請?zhí)枮?7192855.X的專利申請文件中公開了一種從蛋白質(zhì)溶液結(jié)晶蛋白質(zhì)的方法，該方法包括(a)用包含硫原子的鹽處理蛋白質(zhì)溶液，所說的硫原子具有低于6的氧化態(tài)；(b)以結(jié)晶形式回收蛋白質(zhì)。本發(fā)明的特點在于將離子液體用于蛋白質(zhì)的結(jié)晶。近年來，離子液體已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物領(lǐng)域。例如由于其電化學(xué)穩(wěn)定性高，具有較高的電導(dǎo)率和較寬的電化學(xué)窗口，人們已成功的利用離子液體來分離純化蛋白質(zhì)。并且有研究表明，某些蛋白質(zhì)在離子液體中的活性和穩(wěn)定性大大提高。一些蛋白質(zhì)在水中的溶解度較小，很難得到符合X射線的晶體，而離子液體對很多無機(jī)和有機(jī)物質(zhì)都表現(xiàn)出良好的溶解能力，這就為這類蛋白質(zhì)的結(jié)晶提供了可能。此外，離子液體的結(jié)構(gòu)具有更大的可設(shè)計性，即可通過修飾或調(diào)變陰陽離子的結(jié)構(gòu)或種類來調(diào)控離子液體的物理化學(xué)性質(zhì)，以滿足特定的應(yīng)用需求。由于離子液體的低揮發(fā)性，使蛋白質(zhì)分子緩慢的從溶液中析出而結(jié)晶，避免了多晶的生成。而且所培養(yǎng)的蛋白質(zhì)晶體與不加離子液體比較衍射強(qiáng)度高，重復(fù)性好。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種將離子液體用于蛋白質(zhì)結(jié)晶并使其處于一種可控狀態(tài)的用離子液體結(jié)晶蛋白質(zhì)的方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的用離子液體-水混合溶液從蛋白質(zhì)溶液中結(jié)晶蛋白質(zhì)，所述的離子液體-水混合溶液是由重量比為離子液體1～85％與沉淀劑1～25％加緩沖溶液配制而成的pH值為4.0～11.0的混合液。
所述的離子液體為咪唑類離子液體、硝基乙胺類離子液體、胍類離子液體、季銨類離子液體、季鏻類離子液體或吡啶類離子液體中的一種，其重量比含量優(yōu)選5～50％。
所述的沉淀劑是氯化鈉、氯化鎂、硫酸鈉、醋酸銨、檸檬酸銨、硝酸銨、硫酸銨、硫酸鈣、硫酸鎂、硝酸鉀、硼酸鉀、磷酸鉀、酒石酸鉀、酒石酸鉀鈉、檸檬酸鈉、碘化鈉、硝酸鈉、磷酸鈉、氯化鋰或硫酸鋰中的一種，其重量比濃度優(yōu)選3～6％。
所述緩沖溶液pH值優(yōu)選4.4～10.5。
采用本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)晶新方法，將濃度為10～300mg/mL的蛋白質(zhì)溶液添加至離子液體-水混合溶液中，進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)晶。
采用本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)晶新方法進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)晶，可以在0℃～50℃條件下獲得蛋白質(zhì)晶體。
采用本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)晶新方法進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)晶，可以使工藝條件變得寬泛，而且在不同條件下可獲得不同形貌的蛋白質(zhì)單晶，所培養(yǎng)的蛋白質(zhì)晶體衍射強(qiáng)度高，重復(fù)性好，提高了結(jié)晶過程的可操作性。
采用本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)晶新方法，可以獲得動物蛋白質(zhì)晶體，如蛋清溶菌酶；也可以獲得植物蛋白質(zhì)晶體，如索馬甜蛋白。
采用本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)晶新方法，既可以從配制的蛋白質(zhì)溶液中獲得蛋白質(zhì)單晶，也可以直接從蛋白質(zhì)粗原料中結(jié)晶蛋白質(zhì)。


圖1為比較例中不加離子液體時，以氯化鈉為沉淀劑，濃度4％(重量)，采用懸滴結(jié)晶法，醋酸-醋酸鈉緩沖體系下，pH值4.5時所得蛋清溶菌酶晶體圖。
圖2為本發(fā)明中以氯化鈉為沉淀劑，濃度3％(重量)，采用懸滴結(jié)晶法，醋酸-醋酸鈉緩沖體系下，pH值4.4，四氟硼酸丁基甲基咪唑與緩沖溶液體積比為1∶6時所得蛋清溶菌酶晶體圖。
圖3為本發(fā)明中以氯化鈉為沉淀劑，濃度3％(重量)，采用懸滴結(jié)晶法，醋酸-醋酸鈉緩沖體系下，pH值4.6，四氟硼酸丁基甲基咪唑與緩沖溶液體積比為1∶6時所得蛋清溶菌酶晶體圖。
圖4為本發(fā)明中以氯化鈉為沉淀劑，濃度3％(重量)，采用懸滴結(jié)晶法，醋酸-醋酸鈉緩沖體系下，pH值4.6，四氟硼酸丁基甲基咪唑與緩沖溶液體積比為5∶9時所得蛋清溶菌酶晶體圖。
圖5為本發(fā)明中以硫酸鈉為沉淀劑，濃度4％(重量)，采用懸滴結(jié)晶法，醋酸-醋酸鈉緩沖體系下，pH值4.5，四氟硼酸丁基甲基咪唑與緩沖溶液體積比為5∶9時所得蛋清溶菌酶晶體圖。
圖6為本發(fā)明中以氯化鎂為沉淀劑，濃度6％(重量)，采用懸滴結(jié)晶法，醋酸-醋酸鈉緩沖體系下，pH值4.5，四氟硼酸丁基甲基咪唑與緩沖溶液體積比為5∶9時所得蛋清溶菌酶晶體圖。
圖7、8為本發(fā)明中以氯化鈉為沉淀劑，濃度5％(重量)，采用批量結(jié)晶法，氫氧化鈉緩沖體系下，pH值9.0～10.5，加入1～50μl四氟硼酸丁基甲基咪唑時所得蛋清溶菌酶晶體圖。
圖9、10為本發(fā)明中以氯化鈉為沉淀劑，濃度5％(重量)，采用批量結(jié)晶法，氫氧化鈉緩沖體系下，pH值9.0～10.5，加入5～100mg氯丁基甲基咪唑時所得蛋清溶菌酶晶體圖。
圖11為本發(fā)明中以雞蛋清為原料，以氯化鈉為沉淀劑，濃度5％(重量)，采用批量結(jié)晶法，氫氧化鈉緩沖體系下，pH值9.0～10.5，加入四氟硼酸丁基甲基咪唑所得蛋清溶菌酶晶體圖。
圖12為本發(fā)明中以酒石酸鉀鈉為沉淀劑，濃度8％(重量)，采用懸滴結(jié)晶法，N-(2-乙酰氨基)-亞氨二乙基緩沖體系下，pH值6.5～7.0，加入四氟硼酸丁基甲基咪唑所得索馬甜蛋白質(zhì)晶體圖。
具體實施方式
下面舉例對本發(fā)明做更詳細(xì)地描述比較例1為了更清楚地反映本發(fā)明的效果，先進(jìn)行一個比較例1，在不加離子液體的情況下，酸性體系中，通常得到多晶或?qū)\晶；在堿性條件下，我們很難獲得可以用于X射線衍射的單晶體。按常規(guī)方法，在pH值4.5，氯化鈉濃度4％(重量)，室溫的條件下，培養(yǎng)出溶菌酶球晶如圖1所示。
實施例1配制濃度為10～50mg/mL的溶菌酶溶液，調(diào)節(jié)醋酸-醋酸鈉緩沖體系pH值至4.4。以氯化鈉為沉淀劑，濃度為3％(重量)。采用懸滴結(jié)晶法，懸滴中包括5μl溶菌酶溶液，2μl四氟硼酸丁基甲基咪唑和12μl緩沖溶液。池液中四氟硼酸丁基甲基咪唑與緩沖溶液比例與懸滴一致，氯化鈉濃度為15％(重量)，于室溫下培育，得塊狀晶體如圖2所示。
實施例2除了將實施例1中醋酸-醋酸鈉緩沖體系pH值變更為4.6外，其它均按相同步驟配制懸滴與池液，在相同條件下培育，所得晶體與圖1相比為長塊狀晶體如圖3所示。
實施例3除了將實施例2中懸滴所包含四氟硼酸丁基甲基咪唑和緩沖溶液體積分別變更為5μl和9μl外，其它均按相同步驟配制懸滴與池液，在相同條件下培育，實驗所得棒狀晶體如圖4所示。
實施例4除了將實施例3中沉淀劑變更為硫酸鈉，濃度變?yōu)?％(重量)，pH值調(diào)至4.5外，其它均按相同步驟配制懸滴與池液，在相同條件下培育，得塊狀晶體如圖5所示。
實施例5除將了實施例4中沉淀劑變更為氯化鎂，濃度變?yōu)?％(重量)外，其它均按相同步驟配制懸滴與池液，在相同條件下培育，得小塊晶體如圖6所示。
實施例6配制濃度為10～50mg/mL的溶菌酶溶液，調(diào)節(jié)氫氧化鈉緩沖體系pH值至9.0～10.5。以氯化鈉為沉淀劑，濃度為5％(重量)。采用批量結(jié)晶法，加入四氟硼酸丁基甲基咪唑1～50μl，于4℃下培育12h，在溶菌酶溶液中析出溶菌酶結(jié)晶。而且3天后結(jié)晶生成通過肉眼和實體顯微鏡都可確認(rèn)并可進(jìn)行X射線衍射分析。得十二面晶體，晶體尺寸為100～500μm，如圖7、8所示。
實施例7除了將實施例6中加入小瓶中的四氟硼酸丁基甲基咪唑替換為5～100mg氯丁基甲基咪唑以外，其它都按照同樣的步驟制備溶菌酶結(jié)晶溶液。將其密封并于4℃下培育24h，在溶菌酶溶液中析出溶菌酶結(jié)晶。而且5天后結(jié)晶生成通過肉眼和實體顯微鏡都可確認(rèn)并可進(jìn)行X射線衍射分析。得雙錐體和塊狀晶體，晶體尺寸為30～200μm其晶體形貌如圖9、10所示。
實施例8取一定量蛋清，用2體積水將其溶解，用1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系pH值至9.0～10.5。以氯化鈉為沉淀劑，濃度5％(重量)。采用批量結(jié)晶法，加入四氟硼酸丁基甲基咪唑1～30μl，于4℃下溫育24h，在蛋清溶液中析出溶菌酶結(jié)晶。得大量微晶，晶體尺寸為5～100μm，如圖11所示。
實施例9配制濃度為20～30mg/mL的索馬甜蛋白溶液，調(diào)節(jié)N-(2-乙酰氨基)-亞氨二乙基體系下緩沖體系pH值至6.5～7.0。以酒石酸鉀鈉為沉淀劑，濃度為8％(重量)。采用懸滴結(jié)晶法，懸滴中包括5μl索馬甜蛋白溶液，1～6μl四氟硼酸丁基甲基咪唑和適量緩沖溶液。池液中四氟硼酸丁基甲基咪唑與緩沖溶液比例與懸滴一致，酒石酸鉀鈉濃度為20％(重量)，于室溫下培育，得八面雙錐晶體如圖12所示。
權(quán)利要求
1.一種用離子液體結(jié)晶蛋白質(zhì)的方法，其特征是用離子液體一水混合溶液從蛋白質(zhì)溶液中結(jié)晶蛋白質(zhì)，所述的離子液體一水混合溶液是由重量比為離子液體1～85％與沉淀劑1～25％加緩沖溶液配制而成的pH值為4.0～11.0的混合液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用離子液體結(jié)晶蛋白質(zhì)的方法，其特征是所述的離子液體為咪唑類離子液體、硝基乙胺類離子液體、胍類離子液體、季銨類離子液體、季鏻類離子液體或吡啶類離子液體中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2用離子液體結(jié)晶蛋白質(zhì)的方法，其特征是所述的離子液體的重量比含量優(yōu)選5～50％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用離子液體結(jié)晶蛋白質(zhì)的方法，其特征是所述的沉淀劑是氯化鈉、氯化鎂、硫酸鈉、醋酸銨、檸檬酸銨、硝酸銨、硫酸銨、硫酸鈣、硫酸鎂、硝酸鉀、硼酸鉀、磷酸鉀、酒石酸鉀、酒石酸鉀鈉、檸檬酸鈉、碘化鈉、硝酸鈉、磷酸鈉、氯化鋰或硫酸鋰中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用離子液體結(jié)晶蛋白質(zhì)的方法，其特征是所述的沉淀劑的重量比濃度優(yōu)選3～6％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用離子液體結(jié)晶蛋白質(zhì)的方法，其特征是pH值優(yōu)選4.4～10.5。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用離子液體結(jié)晶蛋白質(zhì)的方法，其特征是所述的蛋白質(zhì)溶液是配制的蛋白質(zhì)溶液或者是蛋白質(zhì)的粗原料。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用離子液體結(jié)晶蛋白質(zhì)的方法，其特征是所用蛋白質(zhì)是植物蛋白或者是動物蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任何一項所述的用離子液體結(jié)晶蛋白質(zhì)的方法，其特征是將濃度為10～300mg/mL的蛋白質(zhì)溶液添加至離子液體一水混合溶液中。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-8任何一項所述的用離子液體結(jié)晶蛋白質(zhì)的方法，其特征是結(jié)晶溫度為0℃～50℃。
全文摘要
本發(fā)明提供的一種用離子液體結(jié)晶蛋白質(zhì)的方法。用離子液體－水混合溶液從蛋白質(zhì)溶液中結(jié)晶蛋白質(zhì)，所述的離子液體－水混合溶液是由重量比為離子液體1～85％與沉淀劑1～25％加緩沖溶液配制而成的pH值為4.0～11.0的混合液。采用本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)晶方法進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)晶，可以使工藝條件變得寬泛，而且在不同條件下可獲得不同形貌的蛋白質(zhì)單晶，所培養(yǎng)的蛋白質(zhì)晶體衍射強(qiáng)度高，重復(fù)性好，提高了結(jié)晶過程的可操作性。
文檔編號C07K1/14GK101092445SQ20071007235
公開日2007年12月26日 申請日期2007年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者張密林, 徐曉冬, 李欣欣, 丹媛媛, 景曉燕 申請人:哈爾濱工程大學(xué)