專利名稱：斑節(jié)對蝦熱休克蛋白90基因序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學中基因克隆領域，尤其涉及斑節(jié)對蝦熱休克蛋白90的基因的核苷酸及氨基酸序列。
背景技術：
熱休克蛋白90(Hsp90)是一類特異的分子伴侶，在進化中具有高度保守性。早期認為它可協(xié)助變性蛋白從高溫或其它應激環(huán)境中復性，并可促進已產生突變的蛋白質降解。近年來的研究顯示Hsp90具有廣泛的生理功能，它參與調節(jié)多種蛋白質在非應激條件下的生物活性，其中包括調節(jié)DNA的復制、基因轉錄、亞細胞結構的蛋白質轉移、細胞信號轉導、免疫應答、以及生長、發(fā)育、凋亡等。Hsp90還與Ras信號途徑中許多信號分子的折疊與組裝密切相關，主要是Hsp90的結合與解離，介導了這些分子在非活性形式與活性形式間的轉化或在一定條件下，從Hsp90等與之形成的復合物中釋放，才能轉位至胞膜，行使激酶的活性功能。Hsp90還具有使突變蛋白質具備類似野生型構象活性的作用。因此，研究這類進化上非常保守的蛋白的基因表達調控機制和相關的信號轉導是非常重要的。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種斑節(jié)對蝦熱休克蛋白90基因序列，它通過以近源物種熱休克蛋白的基因的CDS序列的保守區(qū)設計的兼并引物，并用PCR法擴增，結合RACE技術克隆到斑節(jié)對蝦熱休克蛋白90基因的全表達序列。
上述目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的解剖斑節(jié)對蝦取出性腺，提取總RNA，使之與反轉錄引物(oligo-dT接頭引物)混合，進行反轉錄，合成第一鏈cDNA。
從GenBank中下載近源物種(如人、牛、斑馬魚、爪蛙等)熱休克蛋白90同源基因CDS序列，利用Clustal W軟件進行多序列比對，確定保守區(qū)，根據(jù)保守區(qū)序列設計兼并引物，擴增片段大小約為680bp。引物設計后采用β-乙睛亞磷酰胺化學法進行DNA合成得到以下引物序列
X90F5’-ATgATTggACAgTTYggTgT-3’X90R5’-TACAgYTTgATITTgTTCTT-3’。
以合成的第一鏈cDNA作為模板，用兼并引物進行PCR擴增，所擴增的PCR產物用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，從凝膠中純化回收目的產物。然后將純化的PCR產物克隆到pMD-18T載體中，轉化大腸桿菌JM-109感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，提取質粒DNA。經(jīng)簡并引物PCR檢測后，將具有插入片段的質粒DNA用M13通用引物進行雙向測序。
本發(fā)明另外再根據(jù)已得到的第一鏈cDNA片段序列設計特異性引物，利用cDNA末端快速擴增技術(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)對目的基因的3′和5′末端進行PCR擴增。
在3′端的快速擴增中，利用半巢式(semi-nested)PCR方法，首先由基因引物和接頭引物進行PCR反應，擴增片段大小約為1500bp。所述的基因引物和接頭引物序列為基因引物5’TCGGGGACTTCGCATACATC 3’接頭引物5’GGCCACGCGACTAGTAC 3’。
經(jīng)3′端的快速擴增后的序列在其5′端進行快速擴增，利用末端轉移酶和dCTP在cDNA末端加上poly(C)尾后，以加尾后的cDNA作為模板，利用外側特異性引物和oligodG進行第一次PCR擴增，所得PCR產物再利用內側引物和oligodG進行第二次PCR擴增。所述引物序列為oligo-dG5’GGGGGGGGGGGGGGGH 3’基因外側引物5’GGCCACGCGACTAGTAC 3’基因內側引物5’GCCGACAAGGTGACCGTAGT 3’。
經(jīng)末端快速擴增技術進行PCR所得到的PCR產物在1.2％的瓊脂糖凝膠電泳上進行分離檢測后，將PCR產物純化后，克隆到pMD-18T載體中，轉化大腸桿菌JM-109感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，用M13引物對質粒DNA進行測序，測序所得序列再與兼并引物擴增所得的序列利用Clustal W軟件進行拼接得到目的基因。
斑節(jié)對蝦熱休克蛋白90基因的分離，對于研究軟體動物體內的熱休克蛋白90對環(huán)境中的污染因素的應激反應，從而探討能否將該分子作為一種生物學指標具有重要的理論意義和實踐意義。而且該基因對性腺發(fā)育具有促進的作用，因此可以通過對基因的克隆獲得純化的蛋白，來進一步檢測該基因是否影響斑節(jié)對蝦的性腺發(fā)育。


圖1是本發(fā)明在取溫度升高前后體內的不同組織器官中的表達；No stimulated環(huán)境溫度未改變?yōu)?8℃；stimulated環(huán)境溫度提高為38℃；RTC未加入模板時PCR反應的結果；liver代表肝臟；ovary代表卵巢；muscle肌肉；brain腦；stomach胃；heart心臟；Hsp90熱休克蛋白90基因。
具體實施例方式
下面通過以下具體實施方式
對本發(fā)明作進一步闡述，但是本發(fā)明的內容完全不局限于此。
1.總RNA的提取取鮮活健康斑節(jié)對蝦(體重約300g)在實驗室內暫養(yǎng)2d后(水溫約24℃，氣泵充氣)，解剖蝦體取出性腺約100mg，放入1mL Trizol(Gibco，Japan)中進行勻漿，按照試劑盒使用說明提取總RNA。
2.cDNA第一鏈的合成取斑節(jié)對蝦總RNA 5μg與反轉錄引物(oligo-dT接頭引物)1μL(10pmol/L)混合，70℃加熱5min后，立即放置冰上，然后加入5×buffer，2.5mmol/L dNTP混合液，RibonucleaseInhibitor，M-MLV反轉錄酶，反應體系為25μL。反應過程為42℃60min，70℃ 15min，最后放入-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.兼并引物設計依據(jù)，引物合成的方法從GenBank中下載近源物種(如人、牛、斑馬魚、爪蛙等)Hsp90同源基因CDS序列，利用Clustal W軟件進行多序列比對，確定保守區(qū)，根據(jù)保守區(qū)序列設計兼并引物，擴增片段大小約為680bp。引物設計后采用β-乙睛亞磷酰胺化學法進行DNA合成。
引物序列X90F5’-ATgATTggACAgTTYggTgT-3’
X90R5’-TACAgYTTgATITTgTTCTT-3’。
4.斑節(jié)對蝦熱休克蛋白90基因cDNA全序列的克隆以近源物種Hsp90基因CDS序列的保守區(qū)設計的兼并引物，擴增片段大小約為680bp。
4.1第一鏈cDNA用兼并引物進行PCR擴增以上述合成的第一鏈cDNA作為模板，用兼并引物進行PCR擴增，反應體系為10x PCR反應緩沖液5μL，25mmol/L MgCl23μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，10nmol/L引物dTF和dTR各2μL，Taq酶1.25U，用PCR水將反應體系補充至50μL。反應條件為1個循環(huán)，94℃變性5min；35個循環(huán)94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s；1個循環(huán)，72℃延伸10min；4℃保溫。所擴增的PCR產物用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，從凝膠中純化回收目的產物。然后將純化的PCR產物克隆到pMD-18T載體中，轉化大腸桿菌JM-109感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，提取質粒DNA。經(jīng)兼并引物PCR檢測后，將具有插入片段的質粒DNA用M13通用引物進行雙向測序。
4.2第一鏈cDNA的快速擴增技術進行PCR擴增根據(jù)已得到的cDNA片段序列設計特異性引物。利用cDNA末端快速擴增技術(Rapid Amplification ofcDNA ends，RACE)對目的基因的3′和5′末端進行PCR擴增。
在3′RACE中，由基因引物和接頭引物進行PCR反應，擴增片段大小約為1500bp。引物序列為接頭引物5’GGCCACGCGACTAGTAC 3’基因引物5’GCCGACAAGGTGACCGTAGT 3’反應體系同兼并引物擴增體系。
反應條件為1個循環(huán)，94℃變性5min； 35個循環(huán)94℃變性45s，59℃退火30s，72℃延伸1min；1個循環(huán)，72℃延伸10min；4℃保溫。
在5′RACE中，利用末端轉移酶和dCTP在cDNA末端加上poly(C)尾后，以加尾后的cDNA作為模板，利用外側特異性引物和oligodG進行第一次PCR擴增，所得PCR產物取1μL作為模板，再利用內側引物和oligodG進行第二次PCR擴增。引物序列為oligo-dG5’GGGGGGGGGGGGGGGH 3’外側基因引物5’TGTTCTTCTGCTTGCGGTTC 3’內側基因引物5’TCCTCCCAGTCGTTGGTCAG 3’反應體系反應體系同兼并引物擴增體系。
反應條件第一次PCR擴增為1個循環(huán)，94℃變性5min；35個循環(huán)94℃變性45s，60℃退火30s，72℃延伸1min；1個循環(huán)，72℃延伸10min；4℃保溫。
第二次PCR擴增為1個循環(huán)，94℃變性5min；35個循環(huán)94℃變性45s，58℃退火30s，72℃延伸1min；1個循環(huán)，72℃延伸10min；4℃保溫。
所得到的PCR產物在1.2％的瓊脂糖凝膠電泳上進行分離檢測后，將PCR產物純化后，克隆到pMD-18T載體中，轉化大腸桿菌JM-109感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，用M13引物對質粒DNA進行測序，測序所得序列再與兼并引物擴增所得的序列利用Clustal W軟件進行拼接即得目的基因。
5.斑節(jié)對蝦熱休克蛋白90基因的測定所得到的PCR產物在1.2％的瓊脂糖凝膠電泳上進行分離檢測后，將PCR產物純化后，克隆到pMD-18T載體中，轉化大腸桿菌JM-109感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，用3730測序儀對質粒DNA進行測序。測序結果用BLAST軟件(http://www.ncbi.nim.nih.gov/)進行同源性測定，來確定為斑節(jié)對蝦熱休克蛋白90基因同源序列。比對結果為ScoreESequences producing significant al ignments (Bits) Valuegi|70997669|gb|AAZ17403.1|90kDa heat shock protein[Bemisia ta9390.0gi|54873686|gb|AAV41061.1|Hsp90beta[Xenopus laevis]>gi|506...9370.0gi|70997651|gb|AAZ17402.1|90kDa heat shock protein[Bemisia ta9340.0gi|4835864|gb|AAD30275.1|heat shock protein hsp90 beta[salmos9220.0gi|42556386|gb|AAS19788.1|hsp-90[Chiromantes haematocheir]6530.0
根據(jù)Iroe1995年的報道，只要兩個序列間用BLAST軟件比對后E-Value值小于0.005，則兩個序列之間具有絕對的同源性，即證明序列為同一種基因序列。從對比結果看斑節(jié)對蝦目的基因序列BLAST比對后，與其他物種的熱休克蛋白90基因的E值絕對小于0.005，所以證明所克隆的目的基因是熱休克蛋白90基因的同源序列。
6.斑節(jié)對蝦熱休克蛋白90基因在不同組織內的表達按照前述RNA提取，cDNA合成的方法，取溫度升高前后體內的不同組織器官來檢測基因在環(huán)境條件改變時，觀察斑節(jié)對蝦熱休克蛋白90基因是否直接發(fā)揮免疫作用。
β-肌動蛋白(β-actin)作為內參照物來調節(jié)各個階段模板即cDNA的量，使其所含的模板數(shù)一致，從而進行PCR反應，然后所得到的PCR產物在1.2％的瓊脂糖凝膠電泳上進行分離檢測基因的表達量的高低。所用的引物序列為β-actinF5’TTGCTACATCGCCCTTGACT 3’R5’TGTGGACGGTTTCCTGAATA 3’基因特異性引物F5’CCACGAGGATTCCACCAACC 3’R5’CCTTCGTCACCGAGACAAGC 3’從圖1中結果可以看出溫度升高后，基因在體內不同組織的表達量明顯增強，尤其在腦、胃及心臟。環(huán)境溫度的變化直接影響基因在斑節(jié)對蝦體內的表達，基因在生物體內發(fā)揮了一定的功能。
序列表<110>中國水產科學研究院南海水產研究所<120>斑節(jié)對蝦熱休克蛋白90基因序列<150>CN200610037558.2<151>2006-9-7<160>2<210>1<211>2514<212>RNA<213>斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)<220>
<221>3’UTP<222>(2227)...(2514)<220>
<221>5’UTP<222>(1)...(63)<220>
<221>CDS<222>(64)...(2226)<220>
<221>PolyA site<222>(2491)...(2514)<220>
<221>PolyA signal
<222> (2471)...(2475)<400>1caacacattccaaagccaacaactttttgttcctttgtcggtcaaagcttcacacattcc 60aaaatg cct gag gag gtc acc acc ggg gag gag gag gtc ttc gcg ttc cag 111Met Phe Glu Glu Val Thr Thr Gly Glu Glu Glu Val Phe Ala Phe Gln 161 7 13gcg gag atc gcg cag ctg atg tcc ctg atc atc aac acc ttc tac agc 159Ala Glu Ile Ala Gln Leu Met Ser Leu Ile Ile Asn Thr Phe Tyr Ser 3217 23 29aac aag gag atc ttc ctg cga gag ctg atc tcg aac tcg tcc gac gcc 207Asn Lys Glu Ile Phe Leu Arg Glu Leu Ile Ser Asn Ser Ser Asp Ala 4833 39 45ctc gac aag atc cgc tac gag tcg ctg acg gac ccg tcc aag ctg gag 255Leu Asp Lys Ile Arg Tyr Glu Ser Leu Thr Asp Pro Ser Lys Leu Glu 6449 55 61agc ggc aag gac ctg ttc atc aag ctg gtg ccc aac aag gac gac cgc 303Ser Gly Lys Asp Leu Phe Ile Lys Leu Val Pro Ash Lys Asp Asp Arg 8065 71 77acg ctc acc atc atc gac agt ggc atc ggc atg acc aag gcc gac ctg 351Thr Leu Thr Ile Ile Asp Ser Gly Ile Gly Met Thr Lys Ala Asp Leu 9681 87 93gtg aac aac ctg ggc acc atc gcc aag tcg ggc aca aag gcc ttc atg 399Val Asn Asn Leu Gly Thr Ile Ala Lys Ser Gly Thr Lys Ala Phe Met 11297 103 109
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<210>2<211>720<212>PRT<213>斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)<400>2Met Phe Glu Glu Val Thr Thr Gly Glu Glu Glu Val Phe Ala Phe Gln 161 7 13Ala Glu Ile Ala Gln Leu Met Ser Leu Ile Ile Asn Thr Phe Tyr Ser 3217 23 29Asn Lys Glu Ile Phe Leu Arg Glu Leu Ile Ser Asn Ser Ser Asp Ala 4833 39 45Leu Asp Lys Ile Arg Tyr Glu Ser Leu Thr Asp Pro Ser Lys Leu Glu 6449 55 61Ser Gly Lys Asp Leu Phe Ile Lys Leu Val Pro Asn Lys Asp Asp Arg 8065 71 77Thr Leu Thr Ile Ile Asp Ser Gly Ile Gly Met Thr Lys Ala Asp Leu 9681 87 93Val Asn Asn Leu Gly Thr Ile Ala Lys Ser Gly Thr Lys Ala Phe Met 11297 103 109Glu Ala Leu Gln Ala Gly Ala Asp Ile Ser Met Ile Gly Gln Phe Gly 128113 119 125Val Gly Phe Tyr Ser Ala Tyr Leu Val Ala Asp Lys Val Thr Val Val 144129 135 141
Ser Arg Asn Asn Asp Asp Glu Gln Tyr Ile Trp Glu Ser Ser Ala Gly 160145 151 157Gly Ser Phe Thr Val Arg His Asp Thr Gly Glu Pro Ile Gly Arg Gly 176161 167 173Thr Lys Ile Thr Leu His Leu Lys Glu Asp Gln Thr Glu Tyr Leu Glu 192177 183 189Glu Arg Arg Val Lys Glu Ile Val Lys Lys His Ser Gln Phe Ile Gly 208193 199 205Tyr Pro Ile Lys Leu Leu Val Glu Lys Glu Arg Asp Lys Glu Val Ser 224209 215 221Asp Asp Glu Glu Glu Glu Lys Glu Glu Lys Glu Glu Glu Ala Glu Glu 240225 231 237Asp Lys Pro Lys Ile Glu Asp Val Gly Glu Asp Glu Glu Ala Asp Lys 256241 247 253Glu Lys Gly Glu Asp Lys Lys Lys Lys Lys Thr Val Lys Glu Lys Tyr 272257 263 269Thr Glu Asp Glu Glu Leu Asn Lys Thr Lys Pro Leu Trp Thr Arg Asn 288273 279 285Pro Asp Asp Ile Ser Lys Glu Glu Tyr Gly Glu Phe Tyr Lys Ser Leu 304289 295 301Thr Asn Asp Trp Glu Asp His Leu Ala Val Lys His Phe Ser Val Glu 320305 311 317Gly Gln Leu Glu Phe Arg Ala Leu Leu Phe Leu Pro Arg Arg Ala Pro 336321 327 333
Phe Asp Leu Phe Glu Asn Arg Lys Gln Lys Asn Lys Ile Lys Leu Tyr 352337 343 349Val Arg Arg Val Phe Ile Met Glu Asn Cys Glu Glu Leu Ile Pro Glu 368353 359 365Tyr Leu Asn Phe Ile Asn Gly Val Val Asp Ser Glu Asp Leu Pro Leu384369 375 381Asn Ile Ser Arg Glu Met Leu Gln Gln Asn Lys Ile Leu Lys Val Ile 400385 391 397Arg Lys Asn Leu Val Lys Lys Thr Leu Glu Leu Phe Glu Glu Ile Val 416401 407 413Asp Asp Lys Glu Ser Tyr Lys Lys Phe Tyr Glu Asn Phe Ser Lys Asn 432417 423 429Leu Lys Leu Gly Ile His Glu Asp Ser Thr Asn Arg Lys Lys Leu Ala 448433 439 445Glu Phe Leu Arg Tyr His Thr Ser Ala Ser Gly Asp Glu Met Ser Ser 464449 455 461Leu Lys Glu Tyr Val Ser Arg Met Lys Glu Asn Gln Lys His Ile Tyr 480465 471 477Phe Ile Thr Gly Glu Thr Arg Glu Gln Val Gln Asn Ser Ala Phe Val 496481 487 493Glu Arg Val Lys Lys Arg Gly Phe Glu Val Ile Tyr Met Thr Glu Pro 512497 503 509Ile Asp Glu Tyr Cys Val Gln Gln Leu Lys Glu Tyr Asp Gly Lys Gln 528513 519 525
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1.一種斑節(jié)對蝦熱休克蛋白90基因，其特征在于它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。
2.根據(jù)權利要求1所述的斑節(jié)對蝦熱休克蛋白90基因，其特征在于它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述。
全文摘要
本發(fā)明從近源物種肌動蛋白的基因的CDS序列的保守區(qū)設計的兼并引物，從斑節(jié)對蝦的性腺中提取總RNA，并用PCR法擴增，克隆到斑節(jié)對蝦熱休克蛋白90基因的表達序列。斑節(jié)對蝦熱休克蛋白90基因的分離，對于研究軟體動物體內的熱休克蛋白90對環(huán)境中的污染因素的應激反應，從而探討能否將該分子作為一種生物學指標具有重要的理論意義和實踐意義。
文檔編號C07K14/435GK101092623SQ20071008997
公開日2007年12月26日 申請日期2007年3月26日 優(yōu)先權日2006年9月7日
發(fā)明者江世貴, 邱麗華, 周發(fā)林, 張漢華 申請人:中國水產科學研究院南海水產研究所