專利名稱：治療結(jié)核桿菌感染的多肽藥物制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種天龍抗菌肽藥物及其制備方法，用于治療多耐藥結(jié)核桿菌的感染，屬于生物醫(yī)學(xué)技 術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
(一) 多耐藥結(jié)核病現(xiàn)狀
結(jié)核病是對人類健康威脅最大的傳染性疾病之一。據(jù)WHO統(tǒng)計，目前全球約有20億人口感染結(jié)核 桿菌，每年新發(fā)病例達800萬左右，死亡人數(shù)約3百萬，占人口死亡率的7%。結(jié)核病發(fā)病率及死亡率上 升的最主要原因之一就是結(jié)合桿菌耐藥株的出現(xiàn)和傳播。據(jù)報道，全球結(jié)核病人中約有36%感染了耐藥 菌，這種現(xiàn)象在發(fā)展中國家及A1DS病人中尤為重要。此外，全球五大洲35個國家和地區(qū)報告的各常用 抗結(jié)核藥原發(fā)耐藥率為異煙肼(7.3%),鏈霉素(7.3%),利福平(1.8%)，乙胺丁醇(1.0%)，而獲 得性耐藥率還原高于此值。因此，研發(fā)一種新型的治療多耐藥結(jié)核桿菌感染的藥物有著十分重要的意義。
(二) 抗菌肽的應(yīng)用
抗菌肽(antimicrobialp印tides)是生物體中經(jīng)誘導(dǎo)而合成的一種內(nèi)源性多肽，在機體抵抗病原微生物 的入侵方面起著重要的作用，更被認為是缺乏特異性免疫功能生物的重要防御成分?？咕牡淖饔脵C理 與常用的抗生素明顯不同，它主要通過在細胞膜表面形成離子通道來殺死細菌，現(xiàn)在有報道廣泛被研究 應(yīng)用于抗菌、抗結(jié)核、抗癌。在目前結(jié)核菌的耐藥性明顯增強，而尋找新的抗生素又極為困難的情況下， 尋找一種新的抗結(jié)核菌多肽藥物具有非常重要意義。 (二)兩棲類動物提取中藥研究現(xiàn)狀
兩棲類動物在中國屬于傳統(tǒng)中藥和民族藥而廣泛應(yīng)用，如中華蟾蜍、大蹼鈴蟾、黑斑蛙、沼蛙和 澤蛙。這些兩棲類動物的皮膚和內(nèi)臟具有廣泛的藥理活性和臨床療效，己報道的有廣譜抗微生物作用、 抗腫瘤、局部麻醉、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、心血管系統(tǒng)作用。
在國外，從兩棲類動物尋求藥理活性單體化合物已是新藥發(fā)明的熱點，國外報道，從爪蟾皮膚分泌 液獲得的抗菌肽Magainin具廣譜抗微生物作用，同時具有抗腫瘤活性，在美國已獲準(zhǔn)作為廣譜抗菌藥物，； Magainin制藥公司宣布，他們生產(chǎn)的爪蟾皮膚抗菌肽Magainin類似物MSI-78用于治療糖尿病患者足部 潰瘍與ofloxacin有同樣的效果，但產(chǎn)生更小的副作用。國外學(xué)者也已報道從東方鈴蟾和花鈴蟾中分離出 若干具廣譜抗微生物活性的多肽類物質(zhì)，如Bombinin和BLP-like多肽。
我國對兩棲類藥物的應(yīng)用有悠久的歷史，但對其活性成分和藥理性質(zhì)的研究主要集中亍生物堿等有 機小分子多肽類物質(zhì)的研究還較少。
天龍屬爬行綱，蜥蝎目，壁虎科，其乂名守宮、壁虎等，現(xiàn)代醫(yī)藥書籍或雜志上收載品種為無蹼壁
虎(Gekko swinhonis Gunther)和多痣壁虎(多疣壁虎Gjaponicus)及其它幾種壁虎的干燥全體。壁虎，咸 寒有小毒，入心、肝經(jīng)，具有補肺腎、養(yǎng)精血、止咳平喘、祛風(fēng)定驚、解毒通絡(luò)散結(jié)等功效。早在1978 年，駱和生等人經(jīng)實驗證明天龍對結(jié)核桿菌有抑制作用，對致病性真菌有抑制作用，此后關(guān)于天龍在臨 床結(jié)核病的應(yīng)用日漸增多，并顯示出很好的療效。主要用于肺結(jié)核、脊柱結(jié)核、胸腰椎結(jié)核、淋巴結(jié)核、 頸淋巴結(jié)核或腫大以及骨與關(guān)節(jié)結(jié)核(骨癆)等。如焦起周等用回生膏外敷加服復(fù)方中藥湯劑治療結(jié)核 病355例；李守信等用攻瘰丹、化離散加消核膏埋入或外貼治療淋巴結(jié)核1239:例，治愈率98.3%總有效 率99.9%。于立君等人的專利申請"治療結(jié)核病的中藥及其制作方法"(專利號03132605.6)報道了天龍 用于治療瘰疬結(jié)核，雖然天龍治療結(jié)核有效，但是關(guān)于天龍抗結(jié)核的藥理活性成分未有相關(guān)的文獻報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種抗多耐藥結(jié)核桿菌的抗菌多肽及其制備方法和在制藥中的應(yīng)用。 本發(fā)明所述抗菌肽用于但不限于結(jié)核分枝桿菌的抑制。 本發(fā)明所述抗菌肽用于但不限于多耐藥結(jié)核菌感染的治療。
本發(fā)明所述天龍抗菌肽全序列結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同多肽。 使用本發(fā)明所述的天龍抗菌肽，對于結(jié)核分支桿菌生長有抑制作用。
本發(fā)明所述的抗菌肽、多耐藥結(jié)核病、結(jié)核分枝桿菌，是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的，現(xiàn)代的醫(yī)學(xué) 書籍中有其準(zhǔn)確的定義。
通過以下實施例對本發(fā)明的天龍抗菌肽的制備和應(yīng)用進行描述。需說明的是，下述實施例只是用來 說明而非限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其他常用制備方法及其他引起結(jié)核病的分支桿菌均在本 發(fā)明的范圍內(nèi)。
實施例一天龍抗菌肽的制備方法
將天龍干藥材粉碎過80目篩，稱取2500g藥粉，用4500ml用蒸餾水混勻泡脹，4度冰箱靜置24hr， 低溫高速離心得上清抑0ml， 0.45um膜過濾即得到天龍抗菌肽粗提液，將粗提液過固相萃取柱ODS ~SPE (C18,封端)，分別用水和甲醇洗脫，凍干得到水溶部分和醇溶部分，經(jīng)HPLC色譜分析(ODSC18柱， SHIMADZU 150L*4.6)，甲醇溶部分經(jīng)凝膠過濾柱層析,透析脫鹽和反相高壓液相色譜分離純化即得多肽。 其中
凝膠過濾柱層析為將收集的天龍凍干粉溶于蒸餾水后上樣于S鄰hadex G-50凝膠過濾柱，凝膠過濾 柱長1000mm,直徑26mm，用0.01MNa2HPO4—NaH2PO4 pH6.5緩沖液洗脫，收集70分鐘以后的峰。
反相髙壓液相色譜為:凝膠過濾柱層析得到的活性成分峰上樣于經(jīng)含0.1%三氟醋酸的超純水平衡的 C18反相柱,柱長250mm直徑lOmm,用含0.1%三氟醋酸的甲醇從10%到100%的梯度洗脫,收集時間為 16.2分鐘處的峰。
然后用髙效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。 在上述制備所得的天然^収抗菌肽的序列、結(jié)構(gòu)夯析的基礎(chǔ)上設(shè)計合成，即得到一種合成抗菌肽，
肽一級全序列結(jié)構(gòu)為纈氨酸-半胱氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-精氨酸-纈氨酸-半胱氨酸-賴氨酸-天冬酰胺-丙氨酸-賴氨酸半胱氨酸-賴氨酸-酪氨酸-精氨酸-天冬氨酸-纈氨酸-半胱氨酸-賴氨
酸-蘇氨酸-酪氨酸-甲硫氨酸-精氨酸-賴氨酸-色氨酸-天冬酰胺-半胱氨酸-精氨酸(NH2-VCTGGNRVCKNAKCKY RDVC KTY MR KWNC R -COOH )。
天然抗菌肽衍生物的制備過程包括首先設(shè)計合成編碼抗菌肽基因，將抗菌肽的編碼基因克隆到
載體pPIC9載體中，然后轉(zhuǎn)化畢氏酵母菌株，甲醇誘導(dǎo)表達蛋白。有關(guān)的DNA分離、純化、PCR擴 增、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌、片段回收、連接等分子克隆操作均按照J.沙穆克魯克等編著的《分子克隆試驗指 南》進行。
實施例二抗菌肽對分支桿菌的抑菌作用研究
1. 培養(yǎng)基
7H9瓊脂半流培養(yǎng)基:M畫ebrook 7H9干粉(SIGMA M0178) 4. 7g，丙三醇4ml，瓊脂粉0. 5g，加 蒸餾水至900ml， 15磅121'C高壓滅菌IO分鐘，冷卻后加入OADC至1000ml,待用。 蘇通半流體培養(yǎng)基稱取谷氨酸鈉4.0 g,枸櫞酸1 g， IGHP(W).25 g,MgS0"7ft0 0.25 g，枸櫞酸 鐵銨0.025 g，甘油15ml,瓊脂粉0.25 g,加入蒸餾水后加熱使其完全溶解，冷卻后以戰(zhàn)NaOH調(diào) pH至7.2,用蒸餾水定容至500ml,分裝，12lr髙壓滅菌20分鐘，待用。
2. 藥物對照藥品為異煙肼；測試藥品為天龍抗菌肽。
3. 菌株:結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株6i(KCo6a"eW咖^/6ercu"s/s IfaRv, ATCC 27294);金色分枝桿菌 汰aw咖，ymri^J^; ， 耐異煙肼結(jié)核桿菌株；多耐藥結(jié)核桿菌株:耐利福平結(jié)核桿菌株
4. 藥效評價標(biāo)準(zhǔn)肉眼觀察各個培養(yǎng)管中分支桿菌的生長，并同麥?zhǔn)媳葷峁躭號、2號、3號、4號比 濁，無分支桿菌生長表示"-"；有分支桿菌生長并同1號比濁管相近表示"+";同2號比濁管相近 表示"++",依次類推,其中+號的多少反映出分支桿菌相對生長的多少。
操作步驟
將藥液倍比稀釋為3個梯度，分別為20ng/ml ,10ng/ml , 5ng/ml， 2.5ng/ml， 1.25嗎/m。 接種菌株取分枝桿菌新鮮分支桿菌，加0. 5%Tween-80生理鹽水磨菌稀釋，與1號麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷?，?成lmg/ml菌液上述新鮮菌落，稀釋成10—3mg/ml菌液，每管培養(yǎng)基接種0. lml。最終接種量為10、g。 37'C溫箱孵育15天觀察結(jié)核菌生長
實驗為雙管平行操作，每次實驗重復(fù)兩次，取平均值，結(jié)果如表一
表一天龍抗菌肽抑制結(jié)核菌生長的作用
最小抑菌濃度(ug/ml)
天龍抗菌肽結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv5.0
金色分枝桿菌^2. 5
耐異煙肼結(jié)核桿菌株5.0
耐利福平結(jié)核桿菌株2.5
多耐藥結(jié)核桿菌株10.0
實施例三
女，41歲，2000年時因咳嗽、咳痰，拍片檢查診斷為肺結(jié)核，用異煙肼、利復(fù)平、吡嗪酰胺、乙胺 丁醇治療后病情無明顯好轉(zhuǎn)，藥敏試驗為多耐藥難治性結(jié)核(耐異煙肼、利復(fù)平)，咳嗽、咳痰，痰菌 陽性，且肺上有空洞?？诜隹咕?0mg， tid,維持3周，空洞閉合，痰菌陰轉(zhuǎn)，臨床癥狀消失，遂 停藥。
實施例四
男，59歲。2001年時因咳嗽、咳痰、乏力不適，拍片檢査發(fā)現(xiàn)患空洞型肺結(jié)核，用異煙肼、利福平、 乙胺丁醇等抗結(jié)核治療，病情無明顯好轉(zhuǎn)，經(jīng)?？人?、咳痰、盜汗、納差，痰菌3(+)，且藥敏試驗為多耐 藥難治性結(jié)核，胸片顯示兩肺繼發(fā)型肺結(jié)核伴空洞。2004年用天龍抗菌肽40mg， tid，治療4周，患者無 不適癥狀，痰菌陰轉(zhuǎn)，空洞閉合，胸片上病灶穩(wěn)定，遂停藥。序列表
〈110〉正鶴堯
〈120〉治療結(jié)核桿菌感染的多肽藥物制備和應(yīng)用
<160> 1
<170〉 Patentln Version 2.1 <400〉 1
VaLCysLysTh.r GiySerArg丁rpArg
AspLeuCysArg AsnPheMetHisArg丁yr
G:l.nSer/Vrg(I) 23
<210> 1 <211> 2 3 <212〉 PRT 〈213〉天龍
權(quán)利要求
1. 一種合成抗菌肽，其特征在于該抗菌肽是依據(jù)天龍中天然分離多肽而衍生合成得到的一種單鏈多肽。
2. 權(quán)利要求1所述多肽全序列結(jié)構(gòu)為纈氮酸-半胱氨酸-蘇氨^"甘氨酸-甘氨酸-天冬 -精氨酸-纈氨酸-半胱氨酸-賴氨酸-天冬酰胺-丙氨酸-賴氨酸半胱氨酸-賴氨酸-酪氨酸-精氨酸-天冬氨酸-纈氨酸-半胱氨酸-賴氨酸-蘇氨酸-酪氨酸-甲硫氨酸-精氨酸-賴氨酸-色氨酸-天冬酰胺-半胱 氨酸-精氨酸(NHr VCTGGNRVCKNAKCKY RDVC KTY MR KWNC R《00H)。
3. 權(quán)利要求1所述的合成抗菌肽在治療包括多耐藥結(jié)核桿菌在內(nèi)的結(jié)核桿菌感染疾病的藥物中的應(yīng)用。
4. 權(quán)利要求1所述的合成抗菌肽在制備治療多耐藥結(jié)核桿菌包括多耐藥結(jié)核桿菌在內(nèi)的結(jié)核桿菌感染 疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，提供一種天龍抗菌肽衍生物制備方法，用于治療結(jié)核桿菌的感染。天龍抗菌肽衍生物，為依據(jù)中國兩棲類動物天龍中分離得到的天然多肽而合成的一種單鏈多肽，多肽一級全序列結(jié)構(gòu)為纈氨酸-半胱氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-精氨酸-纈氨酸-半胱氨酸-賴氨酸-天冬酰胺-丙氨酸-賴氨酸半胱氨酸-賴氨酸-酪氨酸-精氨酸-天冬氨酸-纈氨酸-半胱氨酸-賴氨酸-蘇氨酸-酪氨酸-甲硫氨酸-精氨酸-賴氨酸-色氨酸-天冬酰胺-半胱氨酸-精氨酸(NH₂-VCTGGNRVCKNAKCKYRDVC KTY MRKWNC R-COOH)。天龍抗菌肽衍生物藥物可顯著抑制包括多耐藥結(jié)核桿菌在內(nèi)的結(jié)核桿菌生長，可應(yīng)用于治療包括多耐藥結(jié)核桿菌在內(nèi)的結(jié)核桿菌感染的藥物。
文檔編號C07K14/46GK101381407SQ20071009728
公開日2009年3月11日 申請日期2007年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月29日
發(fā)明者孔繁翠, 王鶴堯, 葵 邱, 鄭文婕, 昊 顧 申請人:王鶴堯;鄭文婕