專利名稱：一種提取冠菌素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提取冠菌素的方法。
背景技術(shù)：
冠菌素(Coronatine，簡(jiǎn)稱COR)是由植物病原菌丁香假單胞菌的幾個(gè)致病變種產(chǎn)生的一種非寄主?；远舅?。(Bender C L，Alarco..n-Chaidez F and Gross DC.Pseudomonas syringae phytotoxinsmode of action，regulation andbiosynthesis by peptide and polyketide synthetases.Microbiol.Mol.Biol.Rev.1999，63，266-292；Palmer D A，and C L Bender.Effects of environmentaland nutritional factors on production of the polyketide phytotoxin coronatineby Pseudomonas syringae pv.Glycinea.Appl.Environ.Microbiol.1993，59，1619-1626.)冠菌素是茉莉酸甲酯(MeJA)的環(huán)戊烷結(jié)構(gòu)類似物，具有多種生理功能，在抗脅迫方面尤其顯著，可作為一種新型的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。(Uppalapati S R，Ayoubi P，Weng H，Palmer D A，Mitchell R E，Jones W and Bender C L.Thephytotoxin coronatine and methyl jasmonate impact multiple phytohormonepathways in tomato.Plant J.2005，42，201-217；Block A，Schmelz E，JonesJ B，Klee H J.Coronatine and salicylic acidthe battle between Arabidopsisand Pseudomonas for phytohormone control.Mol Plant Pathol，2005，6(1)，79-83；Brooks D M.Bender C L and B N Kunkel.The Pseudomonas syringae phytotoxincoronatine promotes virulence by overcoming salicylic acid-dependentdefences in Arabidopsis thaliana.Mol.Plant.Pathol.2005，6，629-639.)冠菌素是由丁香假單胞菌的不同致病變種發(fā)酵得到的一種次生代謝物，生產(chǎn)冠菌素的丁香假單胞菌的不同致病變種包括以下幾種丁香假單胞菌絳紅致病變種(P.s.pv.atropurpruea)、丁香假單胞菌大豆致病變種(P.s.pv.glycinea)、丁香假單胞菌番茄致病變種(P.s.pv.toma to)、丁香假單胞菌李死致病變種(P.s.pv.morsprunorum)、丁香假單胞菌斑生致病變種(P.s.pv.maculicola)、丁香假單胞菌獼猴桃致病變種(P.s.pv.actinidiae)、野油菜黃單胞菌棲新西蘭麻致病變種(X.c.pv.Phormiicola)(Palmer D A，Bender C L.Effects ofenvironmental and nutritional factors on production of the polyketidephytotoxin coronat ine by Pseudomonas syringae pv.glycinea.Appl.Environ.Microbiol.1993，59，1619-1626.)。冠菌素現(xiàn)有的制備工藝為發(fā)酵液經(jīng)離心后棄去沉淀，用有機(jī)溶劑提取上清液，提取液減壓濃縮得冠菌素粗品，該粗品含有大量脂溶性物質(zhì)，需要精制，進(jìn)一步精制一般將粗品溶解于溶劑中，然后用硫酸銨溶液反萃，再用溶劑提取，然后減壓濃縮直接干燥得到產(chǎn)品(Palmer D A and C L Bender.Effects of environmental and nutritional factors on production of thepolyketide phytotoxin coronatine by Pseudomonas syringae pv.glycinea.Appl.Environ.Microbiol.1993，59，1619-1626.)。上述制備工藝中，存在下列缺點(diǎn)(1)消耗大量有機(jī)溶劑，成本高(2)操作繁瑣(3)易污染環(huán)境，(4)與有效成分溶解性質(zhì)比較相近的雜質(zhì)不易除去等缺點(diǎn)(Uppalapati S R，Ayoubi P，Weng H，Palmer D A，Mitchell R E，Jones W and Bender C L.The phytotoxin coronatineand methyl jasmonate impact multiple phytohormone pathways in tomato.Plant.J.2005，42，201-217.)。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種提取冠菌素的方法。
本發(fā)明提供的提取冠菌素的方法，是將含有冠菌素的微生物發(fā)酵液的上清液過(guò)以大孔吸附樹(shù)脂為吸附劑的吸附柱分離，洗脫得到冠菌素。
所述方法中，所述吸附劑為非極性大孔吸附樹(shù)脂，如HPD100、HPD200或HPD300等。所述洗脫用的洗脫劑為有機(jī)溶劑。所述有機(jī)溶劑可選自乙醇、乙醚、石油醚、正己烷、乙酸乙酯和丙酮中的一種、或者其中任意兩種或者三種的組合。
所述方法中，所述含有冠菌素的微生物發(fā)酵液的上清液，是含有冠菌素的微生物發(fā)酵液經(jīng)過(guò)離心去除菌體得到的上清液。
所述方法中，所述含有冠菌素的微生物發(fā)酵液的上清液的pH值為2.0-3.0；優(yōu)選為pH2.5。
所述方法中，所述含有冠菌素的微生物發(fā)酵液的上清液的上柱吸附速度可為3.0升/小時(shí)-5.5升/小時(shí)；所述洗脫的流速可為3.5升/小時(shí)-7.5升/小時(shí)。
所述方法中，所述含有冠菌素的微生物發(fā)酵液的上清液的上柱量可為3-200ml/g大孔吸附樹(shù)脂。
所述方法還包括將洗脫得到的含有冠菌素的洗脫液進(jìn)行干燥得到冠菌素晶體。
所述干燥步驟可為在30℃-53.5℃，真空度為0.06-0.09Mpa的條件下減壓蒸發(fā)。
本發(fā)明的方法針對(duì)發(fā)酵液中冠菌素組分濃度相對(duì)較低，且組分復(fù)雜的特點(diǎn)，利用非極性大孔樹(shù)脂對(duì)非極性物質(zhì)選擇性吸附的特點(diǎn)，將發(fā)酵液經(jīng)過(guò)柱、洗脫和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，分離提取冠菌素，以取代有機(jī)溶劑萃取法。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的方法具有提取率高，提取的冠菌素純度高的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的方法具有冠菌素提取率高、操作簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低和對(duì)環(huán)境污染低的特點(diǎn)。本發(fā)明的方法采用的大孔吸附樹(shù)脂對(duì)冠菌素的選擇性良好、吸附快、解析也快、吸附容量較大、生產(chǎn)周期短；且大孔樹(shù)脂物理化學(xué)穩(wěn)定性高、機(jī)械強(qiáng)度好、再生容易；工藝簡(jiǎn)單，操作十分簡(jiǎn)便，一步即可達(dá)到分離目的，溶劑皆可回收利用，成本低廉，適用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式
冠菌素提取方法，包括下述步驟(1)收集微生物發(fā)酵液上清液；將該發(fā)酵液上清液的pH值調(diào)至2.0-3.0；(2)將所得pH值為2.0-3.0的上清液以3.0升/小時(shí)-5.5升/小時(shí)的速度流經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂；(3)用大量水沖洗至流出液無(wú)色后，改用洗脫劑(有機(jī)溶劑)洗脫冠菌素，所用的洗脫劑為2-6柱體積，洗脫液流量為3.5升/小時(shí)-7.5升/小時(shí)，所說(shuō)的有機(jī)溶劑是丙酮。
(4)將有機(jī)溶劑洗脫液在30℃-53.5℃，真空度為0.06-0.09Mpa下減壓蒸發(fā)，并回收溶劑，即得冠菌素。
下面以具體的實(shí)施例，說(shuō)明本發(fā)明方法的效果。
下述實(shí)施例中提到的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中提到的百分比，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。
實(shí)施例1、提取冠菌素及其效果驗(yàn)證挑取冷凍保存的丁香假單胞菌大豆致病變種耐高溫突變體MFB141(MFB141菌株已保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC1276，中國(guó)專利號(hào)ZL 200510011466.2)于斜面培養(yǎng)基(含有甘露醇1％，L-谷氨酸鈉0.2％，KH2PO40.05％，NaCl 0.02％，MgSO4·7H2O 0.02％，pH 7.0；固體培養(yǎng)基加入1.3％的瓊脂粉，121℃滅菌30min)上，28℃培養(yǎng)48-60h使其活化，然后挑取一環(huán)活化好的菌體，接入含有10ug/ml的卡那霉素和30ug/ml的鏈霉素的液體培養(yǎng)基(含有甘露醇1％，L-谷氨酸鈉0.2％，KH2PO40.05％，NaCl0.02％，MgSO4·7H2O 0.02％，pH 7.0；121℃滅菌30min)中，28℃培養(yǎng)36-48h，到對(duì)數(shù)期時(shí)，取培養(yǎng)菌液按2％(體積比)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(A液含有氯化銨1.0g，KH2PO44.1g，K2HPO43.6g，MgSO4·7H2O 0.2g，KNO30.3g，2mM FeCl310ml，蒸餾水890ml，pH 6.8；B液含有葡萄糖20g，蒸餾水100ml；A、B液分開(kāi)進(jìn)行115℃滅菌20min，接種前混合)中，在溫度26℃-30℃、轉(zhuǎn)速260rpm/min發(fā)酵7天，即得到成熟發(fā)酵液，經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)冠菌素產(chǎn)量達(dá)到36.0mg/L。
取500ml上述發(fā)酵液離心棄沉淀，得到發(fā)酵液上清液。將5克HPD100大孔吸附樹(shù)脂用乙醇充分浸泡溶脹后，用蒸餾水洗滌至無(wú)乙醇，裝入吸附柱中，用水平衡；用鹽酸將上述收集得到的發(fā)酵液上清液的pH值調(diào)節(jié)至pH2.5，加入到上述裝有大孔吸附樹(shù)脂的吸附柱中，以3.0升/小時(shí)的吸附速率過(guò)柱；吸附完畢后，用蒸餾水沖洗吸附柱至流出液無(wú)色后，再用丙酮洗脫，洗脫速率為3.5升/小時(shí)；將丙酮洗脫液在溫度為45℃，0.06-0.09MPA的條件下減壓濃縮得到浸膏，干燥后得到10.6mg冠菌素產(chǎn)品，收率為58.6％；用高效液相色譜法檢測(cè)該冠菌素產(chǎn)品的純度，結(jié)果表明該冠菌素產(chǎn)品的純度為99％(其中，冠菌素占97％，冠菌酸占3％，可根據(jù)需要將二者分離)。
實(shí)施例2、提取冠菌素及其效果驗(yàn)證挑取冷凍保存的丁香假單胞菌大豆致病變種耐高溫突變體MFB141(MFB141菌株已保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC1276，中國(guó)專利號(hào)ZL 200510011466.2)于斜面培養(yǎng)基(含有甘露醇1％，L-谷氨酸鈉0.2％，KH2PO40.05％，NaCl 0.02％，MgSO4·7H2O 0.02％，pH 7.0；固體培養(yǎng)基加入1.3％的瓊脂粉，121℃滅菌30min)上，28℃培養(yǎng)48-60h使其活化，然后挑取一環(huán)活化好的菌體，接入含有10ug/ml的卡那霉素和30ug/ml的鏈霉素(請(qǐng)?zhí)峁┘尤肟股氐拿Q和濃度)的液體培養(yǎng)基(含有甘露醇1％，L-谷氨酸鈉0.2％，KH2PO40.05％，NaCl 0.02％，MgSO4·7H2O 0.02％，pH 7.0；121℃滅菌30min)中，28℃培養(yǎng)36-48h，到對(duì)數(shù)期時(shí)，取培養(yǎng)菌液按2％(體積比)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(A液含有氯化銨1.0g，KH2PO44.1g，K2HPO43.6g，MgSO4·7H2O 0.2g，KNO30.3g，2mM FeCl310ml，蒸餾水890ml，pH 6.8；B液含有葡萄糖20g，蒸餾水100ml；A、B液分開(kāi)進(jìn)行115℃滅菌20min，接種前混合)中，在溫度26℃-30℃、轉(zhuǎn)速260rpm/min發(fā)酵7天，即得到成熟發(fā)酵液，經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)冠菌素產(chǎn)量達(dá)到39.0mg/L。
取2000ml上述發(fā)酵液離心棄沉淀，得到發(fā)酵液上清液。將30克HPD300大孔吸附樹(shù)脂用乙醇充分浸泡溶脹后，用蒸餾水洗滌至無(wú)乙醇，裝入吸附柱中，用水平衡；用鹽酸將上述收集得到的發(fā)酵液上清液的pH值調(diào)節(jié)至pH3.0，加入到上述裝有大孔吸附樹(shù)脂的吸附柱中，以3.5升/小時(shí)的吸附速率過(guò)柱；吸附完畢后，用蒸餾水沖洗吸附柱至流出液無(wú)色后，再用丙酮洗脫，洗脫速率為4.5升/小時(shí)；將丙酮洗脫液在溫度為45℃，0.06-0.09Mpa Mpa的條件下減壓濃縮得到浸膏，干燥后得到50.2mg冠菌素產(chǎn)品，收率為64.3％；用高效液相色譜法方法檢測(cè)該冠菌素產(chǎn)品的純度，結(jié)果表明該冠菌素產(chǎn)品的純度為99％(其中，冠菌素占96％，冠菌酸占4％，可根據(jù)需要將二者分離)。
實(shí)施例3、提取冠菌素及其效果驗(yàn)證挑取冷凍保存的丁香假單胞菌大豆致病變種低溫高產(chǎn)突變體M-18(M-18菌株已保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC1412，中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?00510085280.1)于斜面培養(yǎng)基(含有甘露醇1％，L-谷氨酸鈉0.2％，KH2PO40.05％，NaCl 0.02％，MgSO4·7H2O 0.02％，pH 7.0；固體培養(yǎng)基加入1.3％的瓊脂粉，121℃滅菌30min)上，28℃培養(yǎng)48-60h使其活化，然后挑取一環(huán)活化好的菌體，接入含有10ug/ml的卡那霉素和30ug/ml的鏈霉素的液體培養(yǎng)基(含有甘露醇1％，L-谷氨酸鈉0.2％，KH2PO40.05％，NaCl0.02％，MgSO4·7H2O 0.02％，pH 7.0；121℃滅菌30min)中，28℃培養(yǎng)36-48h，到對(duì)數(shù)期時(shí)，取培養(yǎng)菌液按2％(體積比)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(A液含有氯化銨1.0g，KH2PO44.1g，K2HPO43.6g，MgSO4·7H2O 0.2g，KNO30.3g，2mM FeCl310ml，蒸餾水890ml，pH 6.8；B液含有葡萄糖20g，蒸餾水100ml；A、B液分開(kāi)進(jìn)行115℃滅菌20min，接種前混合)中，在溫度為26℃-30℃、轉(zhuǎn)速為260rpm/min的條件下發(fā)酵7天，即得到成熟發(fā)酵液，經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)冠菌素產(chǎn)量達(dá)到100mg/L。
取5000ml上述發(fā)酵液離心棄沉淀，得到發(fā)酵液上清液。將300克HPD300大孔吸附樹(shù)脂用乙醇充分浸泡溶脹后，用蒸餾水洗滌至無(wú)乙醇，裝入吸附柱中，用水平衡；用鹽酸將上述收集得到的發(fā)酵液上清液的pH值調(diào)節(jié)至pH20.，加入到上述裝有大孔吸附樹(shù)脂的吸附柱中，以4.0升/小時(shí)的吸附速率過(guò)柱；吸附完畢后，用蒸餾水沖洗吸附柱至流出液無(wú)色后，再用丙酮洗脫，洗脫速率為5.5升/小時(shí)；將丙酮洗脫液在溫度為45℃，0.06-0.09Mpa Mpa的條件下減壓濃縮得到浸膏，干燥后得到502.3mg冠菌素產(chǎn)品，收率為65.1％；用高效液相色譜法檢測(cè)該冠菌素產(chǎn)品的純度，結(jié)果表明該冠菌素產(chǎn)品的純度為99％(其中，冠菌素占97％，冠菌酸占3％，可根據(jù)需要將二者分離)。
實(shí)施例4、提取冠菌素及其效果驗(yàn)證挑取冷凍保存的丁香假單胞菌大豆致病變種低溫高產(chǎn)突變體M-18(M-18菌株已保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC1412，中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?00510085280.1)于斜面培養(yǎng)基(含有甘露醇1％，L-谷氨酸鈉0.2％，KH2PO40.05％，NaCl 0.02％，MgSO4·7H2O 0.02％，pH 7.0；固體培養(yǎng)基加入1.3％的瓊脂粉，121℃滅菌30min)上，在28℃培養(yǎng)48-60h使其活化，然后挑取一環(huán)活化好的菌體，接入含有10ug/ml的卡那霉素和30ug/ml的鏈霉素的液體培養(yǎng)基(含有甘露醇1％，L-谷氨酸鈉0.2％，KH2PO40.05％，NaCl 0.02％，MgSO4·7H2O 0.02％，pH 7.0；121℃滅菌30min)中，28℃培養(yǎng)36-48h，到對(duì)數(shù)期時(shí)，取培養(yǎng)菌液按2％(體積比)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(A液含有氯化銨1.0g，KH2PO44.1g，K2HPO43.6g，MgSO4·7H2O 0.2g，KNO30.3g，2mMFeCl310ml，蒸餾水890ml，pH 6.8；B液含有葡萄糖20g，蒸餾水100ml；A、B液分開(kāi)進(jìn)行115℃滅菌20min，接種前混合)中，在溫度為26℃-30℃、轉(zhuǎn)速為260rpm/min的條件下發(fā)酵7天，即得到成熟發(fā)酵液，經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)冠菌素產(chǎn)量達(dá)到106mg/L。
取5000ml上述發(fā)酵液離心棄菌體沉淀，得到發(fā)酵液上清液。將25克HPD300大孔吸附樹(shù)脂用乙醇充分浸泡溶脹后，用蒸餾水洗滌至無(wú)乙醇，裝入吸附柱中，用水平衡；用鹽酸將上述收集得到的發(fā)酵液上清液的pH值調(diào)節(jié)至pH2.5，加入到上述裝有大孔吸附樹(shù)脂的吸附柱中，以5.5升/小時(shí)的吸附速率過(guò)柱；吸附完畢后，用蒸餾水沖洗吸附柱至流出液無(wú)色后，再用丙酮洗脫，洗脫速率為7.5升/小時(shí)；將丙酮洗脫液在溫度為45℃，0.06-0.09Mpa Mpa的條件下減壓濃縮得到浸膏，干燥后得到500.6mg冠菌素產(chǎn)品，收率為63.5％；用高效液相色譜法方法檢測(cè)該冠菌素產(chǎn)品的純度，結(jié)果表明該冠菌素產(chǎn)品的純度為99％(其中，冠菌素占97％，冠菌酸占3％，可根據(jù)需要將二者分離)。
權(quán)利要求
1.一種提取冠菌素的方法，是將含有冠菌素的微生物發(fā)酵液的上清液過(guò)以大孔吸附樹(shù)脂為吸附劑的吸附柱分離，洗脫得到冠菌素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述吸附劑為非極性大孔吸附樹(shù)脂；所述洗脫用的洗脫劑為有機(jī)溶劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述有機(jī)溶劑選自乙醇、乙醚、石油醚、正己烷、乙酸乙酯和丙酮中的一種、或者其中任意兩種或者三種的組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法中，還包括將含有冠菌素的微生物發(fā)酵液的上清液在過(guò)吸附柱前調(diào)節(jié)pH值至2.0-3.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述方法中，所述過(guò)吸附柱前將含有冠菌素的微生物發(fā)酵液的上清液的pH值調(diào)節(jié)至pH2.5。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述含有冠菌素的微生物發(fā)酵液的上清液的上柱吸附速度為3.0升/小時(shí)-5.5升/小時(shí)；所述洗脫的流速為3.5升/小時(shí)-7.5升/小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述含有冠菌素的微生物發(fā)酵液的上清液的上柱量為3-200ml/g大孔吸附樹(shù)脂。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述非極性大孔吸附樹(shù)脂為HPD100、HPD200或HPD300。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述方法還包括將洗脫得到的含有冠菌素的洗脫液進(jìn)行干燥得到冠菌素晶體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述干燥步驟是在30℃-53.5℃，真空度為0.06-0.09Mpa的條件下減壓蒸發(fā)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種提取冠菌素的方法。該方法，是將含有冠菌素的微生物發(fā)酵液的上清液過(guò)以大孔吸附樹(shù)脂為吸附劑的吸附柱分離，洗脫得到冠菌素。本發(fā)明的方法具有冠菌素提取率高、操作簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低和對(duì)環(huán)境污染低的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07C231/24GK101054350SQ20071009903
公開(kāi)日2007年10月17日 申請(qǐng)日期2007年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月9日
發(fā)明者李召虎, 章家長(zhǎng), 段留生, 張明才, 吳慧玲, 焦睿 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)