專利名稱：一種N端特異的人Eme1多肽及其抗體制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以抗體為特征的體外試驗用的生物制品，具體是一種N端 特異的人Eme1多肽及其抗體制備方法，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
Eme1 (essential meiotic endonuclease 1 homolog 1)蛋白與IV!us81
復(fù)合在一起即構(gòu)成了能切割有分支DNA結(jié)構(gòu)的外切核酸酶。研究表明，敲除 了 Eme1基因的胚胎干細胞對絲裂霉素C等DNA交聯(lián)劑高度敏感，對離子 輻射、UV輻射以及羥基脲處理敏感性稍弱。此外，研究結(jié)果還顯示Eme1 在哺乳動物基因組完整性的維持和DNA修復(fù)過程中發(fā)揮了非常關(guān)鍵的作用， 其缺陷可導(dǎo)致自發(fā)的基因組不穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為解決通過免疫實驗特異性檢測Eme1的表達與天然存在， 并建立相應(yīng)體外免疫分析所需基本生物制品的問題，而提供的一種能特異 性針對Eme1的N端合成多肽抗體及其制備方法。本發(fā)明還可同時解決目前使用的類似抗體價格高，親和力低，抗體結(jié)合蛋白的位置不特異且抗原
性較差等問題。本發(fā)明所述的抗Eme1合成多肽抗體，按照以下歩驟制備:
抗原表位分析與拮抗位置確定利用多種表位預(yù)測軟件，如DNAstar， OMIGA， UWGCG等進行綜合分析，主要考量指標包括親水性結(jié)構(gòu)、抗 原指數(shù)、表面可及性等，再結(jié)合我們已有實際制備抗體的驗證經(jīng)驗，最終 確定第26到第40位為該抗體的靶標，其氨基酸序列為 LKKEPSSTKRRQPER。
多肽的合成靶標多肽采用全自動多通道多肽合成儀合成，柱層析純
化，然后通過HPLC，用每分鐘1。/。的標準乙晴梯度來檢測純度。
多肽與載體蛋白交聯(lián)由于本合成多肽分子量太小，在動物體內(nèi)不能 誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，因此將多肽與載體蛋白交聯(lián)后才能進行免疫，選擇鑰 孔嘁血藍素進行交聯(lián)，能顯著增加抗原的大小和免疫原性，從而制備出人 工免疫原。
免疫動物所述的制備方法，其抗原肽-交聯(lián)載體蛋白做為免疫原，免 疫家兔制備抗體。選取適齡免疫用新西蘭兔，經(jīng)過適應(yīng)性飼養(yǎng)后進行多點 注射免疫。反復(fù)加強免疫，至取血測抗體效價達到標準時停止免疫。
抗體純化達到要求的免疫動物放血，標準方法收集抗血清，依次使 用辛酸-硫酸銨方法和親和層析過柱純化方法，進行抗血清純化，通過
SDS-PAGE和HPLC驗證純度，得到目標抗體。
本發(fā)明制備的高質(zhì)量多肽抗體效價高、親和力強，可與天然Eme1分 子發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。用多肽制備抗體的成本較常規(guī)的重組抗原制備抗體方法低，抗體特異性好，經(jīng)親和層析純化后可以用于各種酶免檢測和
WB試驗要求，可用于建立體外免疫分析。該合成肽抗體的制備，為Eme1 分子的研究及其相關(guān)疾病的研究(如診斷策略的制定，流行病學(xué)調(diào)査、預(yù) 防和控制)提供了一個重要的工具，以及在生物醫(yī)學(xué)研究中對相應(yīng)靶蛋白 的特性、含量測定、分布情況的分析和蛋白的確證等方面都具有重要作用。


圖1是液相色譜鑒定合成多肽純度結(jié)果圖。 圖2是質(zhì)譜鑒定合成多肽分子量結(jié)果圖。
圖3是通過間接ELISA方法鑒定純化抗體相對親和常數(shù)結(jié)果圖。
圖1表明經(jīng)過HPLC對合成的多肽進行純化后，液相色譜鑒定純度 為89.0%。
圖2表明多肽分子量理論值為1942.3，質(zhì)譜鑒定實測值M+H+為 1943.36。
圖3中EUSA檢測制備的多抗和多肽抗原親和常數(shù)為106-107L/mol。
具體實施例方式
實施例1: Eme1抗原肽的合成。用DNAstar， OMIGA， UWGCG等蛋白分析軟件，對Eme1氨基酸 序列進行親水性結(jié)構(gòu)(hydrophilicity)、抗原指數(shù)(antigenicity)、表面可及性 (surface probability)等分析以及同源性分析(homology)，再結(jié)合我們巳有 實際制備抗體的驗證經(jīng)驗，最終確定第26到第40位為靶標，其氨基酸序 列為LKKEPSSTKRRQPER。在全自動多肽合成儀上由固定羧基向氨基 端遞減合成后獲得粗品。經(jīng)30%乙睛溶解后，進行高壓液相色譜(HPLC) 分析，計算主峰面積并收集，經(jīng)冷凍真空抽干后純化合成肽，質(zhì)譜鑒定。
實施例2:合成多肽與載體的偶聯(lián)。
載體蛋白選擇KLH (Keyhole limpet hemocyanin)，用雙功能試劑 順丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯(MBS)連接法將KLH與合成肽進行偶聯(lián) 取KLH5mg (0.11|jmol，含賴氨酸2.2|jmol)，溶于0.75mL偶聯(lián)緩沖液 1 (50mmol/L硼酸鹽緩沖液，pH8.5) ; 3mg MBS (11,)溶于75|jL 二甲酰胺(DMF)。將MBS溶液分3次加入KLH溶液，旋轉(zhuǎn)混勻，室溫 作用30分鐘。迅速離心后，將反應(yīng)混合物(約0.8mL)加入預(yù)先用偶聯(lián) 緩沖液2(0.1mol/L磷酸鹽，0.15mol/LNaCL， 0.01mol/LNa2EDTA， pH7.0) 平衡的PD-10柱。用偶聯(lián)緩沖液2洗脫，收集洗脫液(即MBS-KLH溶 液)。溶解1.5mg合成多肽于0.15mL偶聯(lián)緩沖液2，加入MBS-KLH緩 沖液0.56，室溫下旋轉(zhuǎn)混合，作用2小時后置4。C過夜，將反應(yīng)混合物 (約0.7mL)加入預(yù)先用磷酸緩沖液平衡的PD-10柱，磷酸緩沖液洗脫， 收集流出液。將KLH、 MBS-KLH和偶聯(lián)物進行SDS-KLH和偶聯(lián)物進行 SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝膠電泳)鑒定偶聯(lián)效率。
實施例3:抗多肽抗體的制備。取偶聯(lián)的KLH-多肽500iJg，溶于500|jL磷酸緩沖液，加等體積完全 福氏佐劑。免疫選取適齡免疫用新西蘭兔(體重標準為2-2.5公斤)，經(jīng) 過適應(yīng)性詞養(yǎng)后，背部皮內(nèi)不少于15點注射。2周后抗原量減半(250ijg)，
加等體積的不完全福氏佐劑，第一次加強免疫。2周后進行第二次加強免 疫，方法同前。再2周后耳緣靜脈少量采血，用合成多肽(1|jg/mL)包 被酶標板，間接ELISA法檢測免疫血清效價。反復(fù)加強免疫，至取血測抗 體效價達到1: 16萬時停止免疫，采用頸動脈放血收集抗體。
實施例4:親和層析純化抗多肽抗體。
① Eme1合成多肽親和層析柱的制備稱取1.5g CNBr活化 S印harose4B，用1mmol/L鹽酸充分浸洗膨脹凝膠后，再用偶聯(lián)緩沖液 洗2次，迅速與溶于5mL偶聯(lián)緩沖液的合成多肽500ijg混合，室溫t旋 轉(zhuǎn)混合2小時。加入0.2mol/L甘氨酸4mL終止反應(yīng)，室溫下旋轉(zhuǎn)混合1 小時。用偶聯(lián)緩沖液和甘氨酸緩沖液交替洗凝膠各2次，再用50mL磷酸 鹽緩沖液洗凝膠，按終止?jié)舛?.02。/。加疊氮鈉(NaN3)，置4。C保存。
② 親和層析純化抗多肽抗體:將20mL兔抗多肽血清與1.6mL多肽偶 聯(lián)的S印harose4B共同加入50mL離心管，4。C旋轉(zhuǎn)混合6小時。括凝 膠加入層析柱，棄去流出液，用15mL磷酸鹽緩沖液沖洗凝膠。每次加 0.8mLpH2.9， 0.1mol/L甘氨酸緩沖液洗脫，共8次，洗脫液分別加入8 支預(yù)先加入80mL 2mol/L Tris-HCL緩沖液(pH7.5) ， 20mL磷酸鹽緩沖 液洗凝膠。上述全部操作過程在4。c下完成。毎管取洗脫液2ijL，稀釋 50倍后測280nm的OD值，計算蛋白質(zhì)含量并繪制洗脫曲線。
實施例5:抗體的鑒定，使用間接ELISA方法檢測抗體相對親和常數(shù)。用合成肽交聯(lián)BSA，分別以5 ug/mL和10 ug/mL的濃度，在4 度下包被ELISA檢測板過夜，10。/。的山羊血清室溫封閉2小時后加入倍 比稀釋的已知蛋白濃度的純化后的抗體，再加入HRP標記的羊抗兔lgG 二抗0.1mL， TMB顯色測定A45o。以抗體濃度的對數(shù)為橫坐標，以曲線 達到水平時的A45Q值為100%,以其他相對于該濃度的百分數(shù)為縱坐標作 圖，求出A50即50% A值對應(yīng)的抗體濃度。按照Kaff=(n-1 )/2(n[Ab'] t-2[Ab] t)算出抗體相對親和常數(shù)，其中[Ab' ]t 、 [Ab]t指的是A5o時即包被抗原 分別為g/mL和10y g/mL時抗體半飽和時抗體的摩爾濃度，[Ag] t、 [Ag'] t指的是包被的抗原濃度本實驗中即指10 ii g和5 " g， n=[Ag] t/[Ag'] t，本實驗中n=2。
試驗效果
1. Eme1合成多肽HPLC純化后，使用液相色譜鑒定純度為89.0。/。。 多肽分子量理論值為1942.3，質(zhì)譜鑒定實測值M+H+為 1943.36。
2. 多肽與載體的偶聯(lián)效率SDS-PAGE電泳鑒定偶聯(lián)效率與樣品回 收率大致相符，大于80%。
3. 抗體效價多只家兔得到的抗血清效價均在1:10萬以上。
4. 抗體親和力相對親和常數(shù)為106-107L/mol。
5. 抗體的應(yīng)用以上技術(shù)指標的實現(xiàn)保證該抗體完全可以應(yīng)用于蛋 白印跡和各種酶免實驗，以及建立相應(yīng)體外免疫分析試劑。序列表
<110>北京意宏安生物科技有限公司
<120> —種N端特異的人Eme1多肽及其抗體制備方法 <160>2
<210> 1 <211>570 <212> PRT <213>人
<400> 1
MALKKSSPSLDSGDSDSEELPTFAFLKKEPSSTKRRQPEREEKIVW DISDCEASCPPAPELFSPPVPDIAETVTQTQPVRLLSSESEDEEEFIPLAQ RLTCKFLTHKQLSPEDSSSPVKSVLDHQNNEGASCDWKKPFPKIPEVPL HDTPERSAADNKDLILDPCCQLPAYLSTCPGQSSSLAVTKTNSDILPPQK KTKPSQKVQGRGSHGCQQQRQARQKESTLRRQERKNAALVTRMKAQR PEECLKHIIWLDPVLLQMEGGGQLLGALQTMECRCVIEAQAVPCSVTWR RRAGPSEDREDWVEEPTVLVLLRAEAFVSMIDNGKQGSLDSTMKGKETL QGFVTDITAKTAGKALSLVIVDQEKCFSAQNPPRRGKQGANKQTKKQQQ RQPEASIGSMVSRVDAEEALVDLQLHTEAQAQIVQSWKELADFTCAFTKA VAEAPFKKLRDETTFSFCLESDWAGGVKVDLAGRGLALVWRRQIQQLNR<formula>formula see original document page 10</formula>
權(quán)利要求
1.一種N端特異的人Eme1多肽，其特征在于多肽的氨基酸序列為LKKEPSSTKRRQPER。
2. —種特異的抗人EmelN端合成多肽的抗體，其特征在于該抗體效價在1: 100000以上， 特異性強，親和力高達106—1071711101。
3. —種特異的抗人EmelN端合成多肽抗體的制備方法，其特征在于以人Emel氨基酸序列 中第26到第40位的LKKEPSSTKRRQPER肽段序列作為抗原肽合成人Emel抗原肽；純 化的抗原肽與蛋白載體偶聯(lián)，經(jīng)柱層析純化后；制備出人工免疫原，免疫動物，制備多肽 抗體，并經(jīng)親和層析純化而成。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于載體蛋白為鑰孔嘁血藍素。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于偶聯(lián)的KLH—多肽加福氏佐劑免疫后收集 抗體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于抗原肽與載體蛋白偶聯(lián)作為免疫原，免疫家 兔制備兔抗人Emel合成多肽抗體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于合成多肽偶聯(lián)Sepharose4B，制備親和層析 柱，用于純化抗多肽抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種N端特異的人Eme1多肽及其抗體的制備方法，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。N端特異的人Eme1多肽的氨基酸序列為LKKEPSSTKRRQPER?？谷薊me1多肽抗體按以下方法制備(1)人Eme1抗原表位的分析；(2)人Eme1 N端多肽的合成；(3)合成多肽與載體蛋白交聯(lián)；(4)制備兔抗人Eme1多肽抗體；(5)收集、分離得到含有抗體的血清，純化抗體，即得到抗人Eme1多肽抗體。本發(fā)明制備的N端特異的抗人Eme1合成多肽抗體效價高、親和力強、特異性好，可與天然人Eme1發(fā)生特異性結(jié)合；制備成本低；純化后的抗體可完全用于免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附實驗，以及建立體外免疫分析方法。該抗體為Eme1在DNA損傷和基因組穩(wěn)定性方面的生物學(xué)作用研究提供了有用的工具。
文檔編號C07K7/00GK101318999SQ200710100199
公開日2008年12月10日 申請日期2007年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月6日
發(fā)明者杜宏武, 王德仙, 陳光宇, 陳吾奇 申請人:北京意宏安生物科技有限公司