專利名稱：金黃色葡萄球菌粘附素功能肽及其編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及新的編碼牛源金黃色葡萄球菌粘附 素功能肽的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和功能多 肽的可能用途和制備。
背景技術(shù)：
奶牛乳腺炎(Mastitis)是造成奶牛業(yè)生產(chǎn)效率低、成本高的主要原因，全國(guó)奶牛 每年因乳腺炎造成的損失達(dá)100多億元。目前己證明引發(fā)奶牛乳腺炎的微生物約有150 多種，其中金黃色葡萄球菌感染引發(fā)的乳腺炎約占30. 6%—41. 7%。金黃色葡萄球菌感染 破壞乳腺組織，導(dǎo)致受感染乳腺泌乳功能下降或喪失，它還釋放毒素導(dǎo)致奶牛急性死亡； 其次，金黃色葡萄球菌具有傳染性，?？蓪?dǎo)致整個(gè)牛場(chǎng)乳腺炎蔓延；再者，金黃色葡萄 球菌是人、畜共染病原菌，能通過(guò)食物鏈?zhǔn)谷嘶疾?，?yán)重危害人類健康。
目前，應(yīng)用抗生素防治金黃色葡萄球菌乳腺炎臨床上起到了一定效果，但也帶來(lái)了 "抗性乳"及耐藥菌株等危及人類健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題，因此，受到越來(lái)越多的限制。 接種疫苗預(yù)防是一種最為方便、有效和經(jīng)濟(jì)的措施，但國(guó)內(nèi)至今還沒(méi)有一種具有自主知 識(shí)產(chǎn)權(quán)的金黃色葡萄球菌疫苗可供生產(chǎn)上使用。
金黃色葡萄球菌的毒力因子主要包括莢膜多糖、粘附素、溶血素、腸毒素和殺白細(xì) 胞素等。金黃色葡萄球菌感染機(jī)體首先開(kāi)始于細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的粘附。在所有脊椎動(dòng)物 的組織和器官的細(xì)胞表面存在細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，它除了介導(dǎo)細(xì)胞的支持，增殖及調(diào)節(jié) 基因表達(dá)外，更是通過(guò)它和各種病原菌的粘附素(細(xì)菌表面組分)之間的結(jié)合作用，病 原菌才得以粘附并侵襲細(xì)胞。金黃色葡萄球菌粘附素歸于一個(gè)單獨(dú)的群體，叫做細(xì)胞 表面成分識(shí)別粘附因子(MSCRAMM)。金黃色葡萄球菌的粘附素除了介導(dǎo)細(xì)菌粘附外，還 賦予細(xì)菌逃避宿主防御機(jī)制的功能，主要是通過(guò)粘附素將機(jī)體的可溶性ECM(纖連蛋白、 膠原蛋白和纖維蛋白原等)大量結(jié)合在細(xì)菌的表面，使細(xì)菌完全被宿主的ECM包被，從 而不被宿主的免疫系統(tǒng)所識(shí)別。
幾乎所有的金黃色葡萄球菌都具有纖連蛋白結(jié)合蛋白(FnBP)，它由兩個(gè)十分相近 的基因分別編碼兩個(gè)相似的FnBP分子(FnBP A和FnBP B)，這兩個(gè)基因在革蘭氏陽(yáng)性 菌中相當(dāng)保守，并且這兩種粘附因子具有相同的粘附作用。金葡菌通過(guò)表面的粘附素與 宿主的細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生特定的相互作用，是細(xì)菌感染的先決條件，阻斷細(xì)菌粘附環(huán)節(jié)， 細(xì)菌就無(wú)法定居和繁殖，也不能產(chǎn)生和釋放胞外酶和外毒素，就可降低乳腺炎的發(fā)病率。 因此基于細(xì)菌表面蛋白的粘附機(jī)制去研究抗金黃色葡萄球菌疫苗具有廣闊的研究前景。
經(jīng)檢索，本領(lǐng)域還未見(jiàn)有公開(kāi)的金黃色葡萄球菌粘附素，因此開(kāi)發(fā)金黃色葡萄球菌 粘附素迫在眉睫，這有助于進(jìn)一步研究金黃色葡萄球菌引發(fā)乳腺炎的致病機(jī)理和研究相 應(yīng)的疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供金黃色葡萄球菌粘附素功能肽以及其片段、類似物和衍生物。 本發(fā)明的另一目的是提供編碼所述金黃色葡萄球菌粘附素功能肽及其片段、類似物 和衍生物氨基酸序列的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供制備所述功能肽的方法以及該功能肽和編碼序列的用途。 本發(fā)明以如下技術(shù)方案實(shí)施完成-
采集奶牛急性壞疽型乳腺炎乳樣，分離金黃色葡萄球菌，提取DNA作為模板，利用 設(shè)計(jì)合成的特異性引物對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行纖連蛋白連接蛋白A (Fnbp A)功能基因 的PCR擴(kuò)增，將目的基因回收并連接到T載體，鑒定后進(jìn)行測(cè)序，然后將FnbpA基因 連接到pET32a(+)質(zhì)粒中，經(jīng)鑒定后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行 SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)表達(dá)情況。親和層析法分離純化目的蛋白(金黃色葡萄球菌粘附素 功能肽)。表達(dá)產(chǎn)物活性分析與檢測(cè)。利用基因工程蛋白混合佐劑免疫試驗(yàn)小鼠，通過(guò) i5ZZS4方法檢測(cè)血清中的抗體，分析表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性。
本發(fā)明提供的金黃色葡萄球菌粘附素功能肽，其特征在于，它包含SEQ IDN0:2所 示牛源金黃色葡萄球菌纖連蛋白連接蛋白Fnbp的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異 多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQIDNO:2所示牛源 金黃色葡萄球菌纖連蛋白連接蛋白Fnbp的氨基酸序列的多肽。更佳地，該多肽不含信 號(hào)肽序列。
本發(fā)明提供的編碼金黃色葡萄球菌粘附素功能肽的多核苷酸，其特征在于它包括
(a) 編碼SEQ IDN0:2所示氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片 段、或其活性衍生物的多核苷酸；或
(b) 編碼SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多核苷酸；或
(c) 與(a)或(b)所述多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸；或
(d) 與(a)、 (b)或(c)所述多核苷酸序列有至少80%相同性的核苷酸序列。 較佳地，所述多核苷酸是編碼具有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多核苷酸。 更佳地，所述多核苷酸是具有SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列的多核苷酸。 本發(fā)明提供的載體，其特征在于，所述載體含有如上所述的多核苷酸。 本發(fā)明提供的遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是被如上所述的
多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或是被如上所述的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。 本發(fā)明所述金黃色葡萄球菌粘附素功能肽的制備方法，其特征在于，所述方法包含
(a) 在適合表達(dá)金黃色葡萄球菌粘附素功能肽的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿 主細(xì)胞；
(b) 從培養(yǎng)物中分離出金黃色葡萄球菌粘附素功能月i。
本發(fā)明從奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌臨床分離株擴(kuò)增出編碼粘附素的基因(Fnbp A),與標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行核苷酸同源性比較，序列同源性為98%。蛋白誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE分析 發(fā)現(xiàn)在80ku處出現(xiàn)特異性條帶，其中包括原核表達(dá)載體融合蛋白組氨酸標(biāo)簽20.5ku， 并通過(guò)組氨酸標(biāo)簽親和純化試劑盒純化獲得了預(yù)期蛋白。本發(fā)明成功地克隆到FnbpA 基因，構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒/^T-尸/7&在大腸桿菌BL21中獲得高效表達(dá)，蛋白表達(dá)量為 33. 4%,并得到了特定標(biāo)簽純化的蛋白質(zhì)。對(duì)所表達(dá)的基因工程蛋白進(jìn)行活性檢測(cè)試驗(yàn) 發(fā)現(xiàn)，其具有相應(yīng)的粘附活性，該基因工程蛋白可以阻止73.24%的金黃色葡萄球菌粘附 到哺乳動(dòng)物細(xì)胞，這為進(jìn)一步研究其致病與免疫機(jī)理、疫苗設(shè)計(jì)奠定了良好的基礎(chǔ)。
本發(fā)明獲得的金黃色葡萄球菌粘附素功能肽具有良好的抗原性，經(jīng)ELISA法測(cè)定抗 體效價(jià)。試驗(yàn)小白鼠在免疫后，血清中檢測(cè)到的特異性抗體效價(jià)呈明顯上升趨勢(shì)，在15d 后(二免后第一次采血)時(shí)各組的抗體效價(jià)呈快速升高，于免疫后28d內(nèi)各組抗體效價(jià)
持續(xù)升高，抗體效價(jià)動(dòng)態(tài)趨勢(shì)基本相同(如表l數(shù)據(jù)的抗體效價(jià)動(dòng)態(tài)變化曲線所示)。 本發(fā)明所述金黃色葡萄球菌粘附素功能肽和其編碼序列的應(yīng)用。
獲得抗體所制備的抗體為能與如上所述的金黃色葡萄球菌粘附素功能肽特異性結(jié) 合的抗體。
本發(fā)明的金黃色葡萄球菌粘附素功能肽序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴(kuò)增 反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)。
檢測(cè)金黃色葡萄球菌粘附素功能肽的試劑盒所述試劑盒含有如上所述的抗體和/ 或能特異性檢測(cè)金黃色葡萄球菌粘附素功能肽的核酸分子引物。
應(yīng)用上述試劑盒檢測(cè)樣品中是否存在粘附素的方法是將樣品與粘附素的特異性抗 體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在金黃色葡萄球 菌粘附素。
疫苗組合物以安全有效量的本發(fā)明的金黃色葡萄球菌粘附素功能肽或其片段再輔 以藥學(xué)上可接受的載體可制備成應(yīng)用于奶牛的疫苗組合物。
本發(fā)明的金黃色葡萄球菌粘附素功能多肽可用作研究其對(duì)乳腺致病機(jī)理的工具。


圖1. Fnbp A基因的PCR擴(kuò)增。
其中M Marker DL2000; 1金黃色葡萄球菌ATCC 25923; 2大腸桿菌ATCC 35218; 3無(wú)乳鏈球菌CVCC 1886: 4 9金黃色葡萄球菌分離株。 圖2.重組質(zhì)粒P^T-的PCR鑒定。
其中M Marker DL2000;1金黃色葡萄球菌ATCC 25923;2 13重組質(zhì)粒
圖3.重組質(zhì)粒>^57-/=>3&的雙酶切鑒定
其中M: Marker DL2000; 1 8重組質(zhì)粒/^T-尸/ Ztp。 圖4.表達(dá)蛋白SDS-PAGE電泳檢測(cè)。
其中M蛋白Marker; l純化后蛋白；2表達(dá)細(xì)菌裂解液。 圖5.粘附素活性檢測(cè)試驗(yàn)。
圖6.金黃色葡萄球菌黏附試驗(yàn)(10X100倍鏡檢)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，從奶牛乳腺炎臨床病例中分離到致病性金黃色葡 萄球菌，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)克隆到粘附素Fnbp功能基因，經(jīng)測(cè)序鑒定后釆用基因工 程原核表達(dá)方法，成功獲得了具有生物活性的基因工程粘附素多肽，在此基礎(chǔ)上完成了 本發(fā)明。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"粘附素功能肽"，指具有金黃色葡萄球菌粘附素纖連蛋白連接 蛋白(Fnbp)的氨基酸序列的蛋白或多肽。它們包括含有或不含有信號(hào)肽的粘附素。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明有關(guān)內(nèi)容。下列實(shí)例中未注明的具體試驗(yàn) 方法，通常按照分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中所述的條件，或按照制造廠商提供的條件。
實(shí)施例1
材料和方法
菌株和質(zhì)粒以常規(guī)方式分離、鑒定獲得金黃色葡萄球菌奶牛乳腺炎臨床分離株；
大腸桿菌BL21(DE3); pMD18-T載體購(gòu)自TaKaRa; pET32a+載體購(gòu)自Novagen。
試劑高保真DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶(BamHI和HindIII)、 T4DNA連接酶均購(gòu) 自TaKaRa; DNA膠回收試劑盒購(gòu)自U-gene;氨芐青霉素購(gòu)自華美公司；Ni-NTA親和層析 柱是QIAGEN公司產(chǎn)品。
試驗(yàn)動(dòng)物昆明系小白鼠，體重18 22g，購(gòu)自山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
實(shí)施例2
PCR擴(kuò)增Fnbp基因及其測(cè)序分析
采用酚-氯仿方法提取金葡菌DNA模板。根據(jù)GenBank上發(fā)表的Fnbp基因序列，設(shè)計(jì) 并合成了一對(duì)引物
上游(含BamHI酶切位點(diǎn))KF1: 5' — AAA6WOGCATCAGAACAAAAGACA-3';
下游(含SalI酶切位點(diǎn))KF2: 5' — AGAg7n7感TACTCAGAGGACTCAGTGTA—3'。
50uLPCR反應(yīng)體系:10XPCRbuffer 5uL， Mg2+ (25mM) 3uL， dNTP (25mM) 4uL, Taq酶(2.5U) 0.5uL，引物各luL，模板2nL，無(wú)菌雙蒸水33. 5 y L。循環(huán)條件94°C 預(yù)變性5min;94。C lmin， 50。Clmin, 72。C3min, 30個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min。
PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化￡ coh' DH5 a ，提取質(zhì)粒經(jīng)BamH I和Sal I雙酶 切后瓊脂糖電泳鑒定。鑒定陽(yáng)性的克隆由上海生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序。PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)到1.7kb左右的特異性條帶，與預(yù)期大小相符(見(jiàn)圖l)。 測(cè)序結(jié)果顯示該基因全長(zhǎng)約為1722bp，編碼574個(gè)氨基酸；核苷酸序列如SEQ ID N0:1所 示，氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。與標(biāo)準(zhǔn)株(GenBank公布的Fnbp A序列)進(jìn)行核苷 酸同源性比較，序列同源性為98%。
實(shí)施例3
重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
提取實(shí)施例2中陽(yáng)性質(zhì)粒，經(jīng)BamH I和Sal I雙酶切后,用試劑盒回收目的片段，與 同樣經(jīng)過(guò)BamHI和Sal I雙酶切的pET-32a+表達(dá)載體連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pET32a+-Fnbp，并將重組質(zhì)粒進(jìn)行BamH I 、 Sal I雙酶切鑒定和PCR鑒定。雙酶切后可 見(jiàn)在1. 7kb左右處有一條特異的條帶，并且經(jīng)PCR鑒定在1. 7kb左右處擴(kuò)增出特異條帶， 說(shuō)明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確(鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2、 3)。
實(shí)施例4
Fnbp基因在大腸桿菌中的表達(dá)及SDS-PAGE分析
將重組表達(dá)質(zhì)粒061323+-Fnbp及空載體pET32a+質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)， 挑取單個(gè)菌落，37'C振蕩過(guò)夜培養(yǎng)。過(guò)夜培養(yǎng)物以l : 100擴(kuò)大培養(yǎng)2 4h至OD6。。值達(dá) 0.3 0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為lmmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)。分別于lh、 2h、 3h及4h取2ml菌 液，離心收集菌體。SDS-PAGE電泳鑒定表達(dá)情況，試驗(yàn)步驟參照《蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)》 進(jìn)行。
SDS-PAGE結(jié)果如圖4所示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)株在80kD左右出現(xiàn)一條特異蛋白帶，與預(yù)測(cè) 分子量一致。經(jīng)BandScan5.0分析，蛋白產(chǎn)量約占菌體總蛋白的33. 4%。 實(shí)施例5
親和層析法分離純化目的蛋白
重組質(zhì)粒 ￡7323+^^ 轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單菌落接種LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜后按1% 的比例接種于LB培養(yǎng)基，37"C培養(yǎng)至菌液的0D6。。達(dá)到0.4，加IPTG至終濃度為l國(guó)ol/L， 37'C誘導(dǎo)表達(dá)3h后，離心收獲菌體，沉淀用磷酸鹽緩沖液懸浮，超聲波破碎菌體，再離
心收集上清，經(jīng)Ni-NTA親和層析柱分離純化收集目的蛋白(金黃色葡萄球菌粘附素功能 肽)。
蛋白純化完后，依次用15L 0.2M乙酸，15mL 30%甘油，15mL純水，15mL 30%乙醇處 理。最后用乙醇3保存于4。C，備用。 實(shí)施例6
表達(dá)產(chǎn)物(金黃色葡萄球菌粘附素功能肽)的生物活性分析
培養(yǎng)牛胎腎(MDBK)細(xì)胞，以處理的載波片覆蓋培養(yǎng)，作為細(xì)胞爬片。純化的重組蛋 白50倍和100倍稀釋，進(jìn)行細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性封閉(對(duì)照組用普通牛血清)，然后取lml (103cfu/ml)金葡菌培養(yǎng)稀釋菌液覆蓋細(xì)胞，粘附培養(yǎng)lh。洗滌5次，革蘭氏染色后 進(jìn)行顯微鏡下細(xì)菌計(jì)數(shù)，每組計(jì)數(shù)20個(gè)視野，取平均值。
與對(duì)照組相比，利用稀釋后的重組粘附素蛋白預(yù)處理過(guò)的牛腎細(xì)胞周?chē)掣降慕瘘S 色葡萄球菌數(shù)量相對(duì)明顯減少，差異極顯著。經(jīng)數(shù)據(jù)分析處理，各組粘附細(xì)菌數(shù)分別為 對(duì)照組為16.22±6.88個(gè)/細(xì)胞；蛋白稀釋50倍組為5.95士2.84個(gè)/細(xì)胞(p〈0.01);蛋白 稀釋100倍組為4.34土3.26個(gè)/細(xì)胞(p〈0.01)(對(duì)比曲線如圖5、粘附照片見(jiàn)圖6)。
實(shí)施例7
表達(dá)產(chǎn)物(金黃色葡萄球菌粘附素功能肽)的免疫原性分析
rFnbp蛋白為所純化蛋白，將其配制濃度為0. lmg/ml，然后將蛋白與佐劑按照1: 1的比例充分混合乳化后用于動(dòng)物免疫。將所制備的疫苗取少量涂布于5%綿羊血瓊脂 平板中，37t:培養(yǎng)48h，觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。并將疫苗進(jìn)行動(dòng)物安全檢驗(yàn)，分別用18-22g 的小白鼠6只，皮下注射疫苗10ug/只，觀察二周。注意觀察小白鼠的精神狀態(tài)。在所 有疫苗涂布的5%綿羊血瓊脂平板中無(wú)任何細(xì)菌生長(zhǎng)，表明所制備的疫苗無(wú)菌性良好。 所注射疫苗的小白鼠在觀察二周后均健活，精神狀態(tài)良好，注射部位無(wú)化膿現(xiàn)象。小鼠 隨機(jī)分組，每組6只。第一組注射rrFnbp蛋白疫苗，第二組為注射生理鹽水的對(duì)照組。 將疫苗分別注射小鼠腹部皮下，并于實(shí)驗(yàn)的第O、 14、 28天免疫。免疫后第1、 2、 3、 4周采取血樣，間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)。試驗(yàn)小白鼠在免疫后所采集的血清中檢測(cè) 到了特異性抗體，抗體效價(jià)呈明顯上升趨勢(shì)，在15d后(二免后第一次采血)時(shí)各組的 抗體效價(jià)呈快速升高，于免疫后28d內(nèi)各組抗體效價(jià)持續(xù)升高，抗體效價(jià)動(dòng)態(tài)趨勢(shì)基本 相同(如表l數(shù)據(jù)的抗體效價(jià)動(dòng)態(tài)變化曲線所示)。
表1 ELISA檢測(cè)抗體水平
對(duì)照組粘附素免疫
第一次0.041±0. 02c0. 163±0. 08 a
第二次0. 052 ±0. 03 e0. 288 ±0. 09 b
第三次0. 058±0.03e0. 329±0. 15 a
第四次0. 075±0. 03°0. 5紙0. 22 b
注a、 b、 c表示差異性(p〈0.01)
實(shí)施例8
檢測(cè)金黃色葡萄球菌粘附素功能肽的試劑盒將含有如上所述的抗體和/或能特異性檢測(cè)金黃色葡萄球菌粘附素功能肽的核酸分 子引物以本領(lǐng)域常用方法制成試劑盒，用于金黃色葡萄球菌粘附素的檢測(cè)。
應(yīng)用上述試劑盒檢測(cè)樣品中是否存在粘附素的方法是將樣品與粘附素的特異性抗 體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在金黃色葡萄球 菌粘附素。
實(shí)施例9
疫苗
以安全有效量的本發(fā)明的金黃色葡萄球菌粘附素功能肽或其片段再輔以藥學(xué)上可 接受的載體，以常規(guī)方式可制備成應(yīng)用于奶牛的疫苗組合物。
序列表
〈110〉山東省農(nóng)科院奶牛研究中心
〈120>金黃色葡萄球菌粘附素及其編碼序列
〈141〉 2007-10-20
〈160〉 2
〈210〉 1
〈211〉 1722
〈212〉醒
〈213〉金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureuse)
〈400〉 1
gca/tc3g犯ctacagtagaaga犯atgggsattcagctactgataataaa60
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〈210〉 2 〈211〉 574 〈212〉 PRT
〈213〉金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureuse) 〈400〉 2
Ala Ser Glu Gin Lys Thr Thr Thr Val Glu Glu Asn Gly Asn Ser Ala Thr Asp Asn Lys 15 10 15 20
Val Asn Glu Thr Gin Thr Thr Thr Thr Asn Val Asn Thr lie Asp Glu Thr Gin Ser Tyr
25 30 35 40
Ser Ala Thr Ala Thr Glu Gin Pro Ser Asn Ala Thr Gin Val Thr Thr Glu Lys Ala Pro
45 50 55 60
Lys Ala Val Gin Ala Val Gin Ala Pro Gin Thr Ala Gin Pro Ala Asn Leu Glu Thr Val
65 70 75 80
Lys Glu Glu Val Val Lys Glu Glu Ala Lys Pro Gin Val Lys Glu Thr Thr Gin Ser Gin
85 90 95 100
Asp Asn Ser Gly Asp Gin Arg Gin Val Asp Leu Thr Pro Lys Lys Ala Thr Gin Asn Gin
105 110 115 120
Val Ala Glu Thr Gin Val Glu Val Ala Gin Pro Arg Thr Val Ser Glu Ser Lys Pro Arg
125 130 135 140
Val Thr Arg Ser Ala Asp Val Val Asp Ala Lys Glu Ala Ser Asp Val Ser Glu Val Lys
145 150 155 160
Gly Thr Asp Val Thr Ser Lys Val Thr Val Glu A印Glu Ser Lys lie Glu Ala Pro Lys
165 170 175 180
Gly Asn Asn Val Gin Pro His Glu Gly Gin Arg Val Val Leu Lys Tyr Lys Leu Lys Phe
185190195200
Gin AspGly LeuLysThrGly Asp Tyr PheAsp Phe Thr LeuSerAsn Asn ValAsnThr
205210215220
His GlyVal SerThrlieArg Lys Val ProAsp lie Lys AsnGlySer Leu ValMetAla
225230235240
Lys GlyGin ValLeuAspAsn Gly Arg lieArg Tyr Thr PhelieAsp Tyr lieLysAsp
245250255260
Lys ValAsn ValThrAlaAsn Leu GlulieAsn Leu Phe lieAspPro Lys ThrValGin
265270275280
Ser AsnGly GinGinThrlie Thr SerLysLeu Asn Gly LysGluThr Ser GlyThrMet
285290295300
Gin lieThr TyrLysAspGly Val LysAsnGin Tyr Thr AsnValAsn Gly SerlieGlu
305310315320
Thr PheAsp LysGluLysAsn Lys PheThrHis Val Ala TyrlieLys Pro lieAsnGly
325330335340
Asn AsnSer AspSerValThr Val ThrGlyMet Leu Thr GinGlySer Asn GluAsnGly
345350355360
Thr GinPro AsnValLyslie Tyr GluTyrVal Gly Thr GluAsnGly Leu ProGinSer
365370375380
Val TyrAla AsnThrAlaAsp Ser ThrGinLeu Lys Asp ValThrAsn Gin MetSerAsp
385390395400
Lys LeuLys ValGinAsnAsn Gly SerTyrSer Leu Asn PheAspLys Leu AspLysThr
405410415420
Tyr Vallie HisTyrThrGly Asp TyrLeuAsn Gly Thr SerGluV3l Asn PheArgThr
425430435440
Gin LeuThr GinTyrProGlu Asn ArgTyrLys Thr Tyr TyrTyrAsn Asn GlyTyrlie
445450455460
Leu ThrTrp AspAsnGlyLeu Val LeuTyrSer Asn Lys AlaAsnGly Asp GlyLysTyr
艦470475480
Gly Prolie ValAspSerAsn Asn PheGluPhe Ser Glu AspSerGly Asn GlySerlie
485490495500
Ser GlyGin TyrAspAlaLys Gin lielieGlu Thr Glu GluAsnGin Asp AsnThrPro
505510515520
Leu Asplie AspTyrHisThr Ala lieAspGly Glu Gly GlyTyrVal Asp GlyTyrlie
525 530 535 540
Glu Thr lie Glu Glu Thr Asp Ser Ser Ala lie A印lie Asp Tyr His Thr Ala Val Asp
545 550 555 560
Ser Glu Ala Gly His Val Gly Gly Tyr Thr Glu Ser Ser Glu
565 570
權(quán)利要求
1.一種金黃色葡萄球菌粘附素功能肽，其特征在于，它包含SEQ ID NO2所示牛源金黃色葡萄球菌纖連蛋白連接蛋白Fnbp的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2. 如權(quán)利要求l所述的多肽，其特征在于，所述多肽是具有SEQ ID N0:2所示牛源 金黃色葡萄球菌纖連蛋白連接蛋白Fnbp的氨基酸序列的多肽。
3. —種編碼金黃色葡萄球菌粘附素功能肽的多核苷酸，其特征在于它包括-(a) 編碼權(quán)利要求1所述多肽的多核苷酸；或(b) 編碼權(quán)利要求2所述多肽的多核苷酸；或(c) 與(a)或(b)所述多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸；或(d) 與(a)、 (b)或(c)所述多核苷酸序列有至少80%相同性的核苷酸序列。
4. 如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸是編碼具有SEQ IDN0:2所示氨基酸序列的多核苷酸。
5. 如權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸具有SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。
6. —種載體，其特征在于，所述載體含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7. —種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是被權(quán)利要求3所述的 多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或是被權(quán)利要求6所述的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì) 胞。
8. 權(quán)利要求1所述金黃色葡萄球菌粘附素功能肽的制備方法，其特征在于，所述方 法包含(a) 在適合表達(dá)金黃色葡萄球菌粘附素功能肽的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿 主細(xì)胞；(b) 從培養(yǎng)物中分離出金黃色葡萄球菌粘附素功能肽。
9. 一種抗體，其特征在于，所述抗體為能與權(quán)利要求1所述的金黃色葡萄球菌粘附 素功能肽特異性結(jié)合的抗體。
10. —種檢測(cè)金黃色葡萄球菌粘附素功能肽的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有 權(quán)利要求9所述的抗體和/或能特異性檢測(cè)金黃色葡萄球菌粘附素功能肽的引物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌粘附素功能肽，編碼粘附素蛋白的多核苷酸和經(jīng)基因工程技術(shù)制備粘附素蛋白功能肽的生物學(xué)方法；同時(shí)還公開(kāi)了所述金黃色葡萄球菌粘附素蛋白功能肽在相關(guān)領(lǐng)域可能的用途。本發(fā)明助于進(jìn)一步研究金黃色葡萄球菌引發(fā)乳腺炎的致病機(jī)理和研究相應(yīng)的疫苗。
文檔編號(hào)C07K14/31GK101177451SQ20071011329
公開(kāi)日2008年5月14日 申請(qǐng)日期2007年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月2日
發(fā)明者仲躋峰, 楊宏軍, 楊少華, 王長(zhǎng)法, 高運(yùn)東 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心