專利名稱：一種地西泮人工抗原的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種地西泮人工抗原的制備方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
地西泮(Diazepam)為苯二氮卓類鎮(zhèn)靜安眠藥，化學(xué)名稱為l-甲基-5-苯 基-7-氯-l,3-二氫-2H-l,4-苯并二氮卓-2-酮。其曾被用作動(dòng)物飼料添加劑，作為生 長(zhǎng)促進(jìn)劑，具有使動(dòng)物嗜睡少動(dòng)，生長(zhǎng)快且有改變?nèi)赓|(zhì)的作用。也用在屠宰和動(dòng) 物檢疫之前，或?qū)?dòng)物轉(zhuǎn)移屠宰之前，起鎮(zhèn)靜作用，以減輕動(dòng)物緊張狀態(tài)，降低 動(dòng)物傷害和死亡率。此類藥物常見嗜睡，可見無力、頭痛、暈眩、惡心、便秘，偶 見皮疹、肝損害、骨髓抑制等不良反應(yīng)。若隨意在詞料中添加此類藥物，蓄積的 藥物通過食物鏈進(jìn)入人體，將造成巨大的危害。為此許多國家將此類藥物列入禁 用藥物名單。目前，國內(nèi)外有關(guān)地西泮的檢測(cè)主要有高效液相色譜法(HPLC)、 氣相色譜法(GC)、薄層色譜法(TLC)、氣-質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)、液-質(zhì)聯(lián)用法(LC -MS)等，但這些方法不僅需要昂貴的儀器設(shè)備，對(duì)檢材的要求也比較高，需要 進(jìn)一步的提純處理才能進(jìn)行，這已經(jīng)不能達(dá)到現(xiàn)代檢測(cè)對(duì)快速、方便、準(zhǔn)確的 要求。近年來，國外已經(jīng)開展了關(guān)于苯二氮卓類免疫分析方法的研究，但國內(nèi) 目前在這方面還是一片空白。為了加強(qiáng)對(duì)國內(nèi)肉制品的監(jiān)督力度和保障人民的 身體健康，有必要展開關(guān)于苯二氮卓類免疫分析方法的研究，有必要提供一種 有效的地西泮人工抗原的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種地西泮人工抗原的制備方法，所制備的產(chǎn)品可用 于苯二氮卓類免疫分析方法的研究，為今后人們的研究提供了方便的途徑。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種地西泮人工抗原的制備方法，第一步為半抗原的 制備及檢測(cè)以地西泮，丁二酸酐為原料，利用付-克?；磻?yīng)在地西泮的5位 苯環(huán)上引入羧基；第二步為人工抗原的制備及檢測(cè)利用混合酸酐法使之與牛 血清蛋白結(jié)合制備地西泮的人工抗原即地西泮-牛血清蛋白。其反應(yīng)方程式為
COC^COOH—BSA 地西泮 地西泮-3'-琥珀酸半酯 地西泮-牛血清蛋白工藝步驟為1) 人工半抗原的制備地西泮和丁二酸酐配料摩爾比為1:1,分別稱取無水氯化鋁2.5mmol和丁 二酸酐lmmol于50mL圓底燒瓶中，加入10mL硝基苯，4(TC條件下攪拌至固 體完全溶解；另稱取地西泮lmmol，分3次加入上述的反應(yīng)液中，反應(yīng)溫度逐 漸提高至70。C，反應(yīng)過夜；在劇烈攪拌下，將反應(yīng)液傾入適量冰水中，靜置分 層后，取有機(jī)層進(jìn)行減壓蒸餾，得到的殘留用少量熱甲醇溶液溶解，低溫析出 沉淀，過濾、干燥得到0.8mmol半抗原備用；反應(yīng)終點(diǎn)監(jiān)測(cè)采用薄層層析法進(jìn)行監(jiān)測(cè)，硅膠薄板下端lcm處作一水平 線，吸取反應(yīng)液lpL點(diǎn)于線上，點(diǎn)樣結(jié)束后吹干，將薄板放入層析缸中，層析 液為甲苯:乙醚:乙酸:甲醇，體積比為60:30:9:1，展開至薄板0.35-0.4cm處，取 板，吹干溶劑；將薄板置于紫外分析儀中，在254nm波長(zhǎng)觀察，在Rf為0.53 處觀察到顯色點(diǎn)作為反應(yīng)終點(diǎn)；2) 人工抗原的制備制備A液稱取O.lmmol半抗原于20mL燒杯中，加入5mL 二氧六環(huán)和0.2mL 的三乙胺，冷卻至5t:;然后加入0.15mL氯甲酸異丁酯，低溫下攪拌lh，此液 為A液；制備B液稱取0.003mmo1的牛血清蛋白溶于10mL水和8mL 二氧六環(huán)的 溶液中，并用1N的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH8-9，低溫保存，此液為B液；在4'C低溫?cái)嚢柘?，將A液逐滴地滴加到B液，并用1N的氫氧化鈉溶液調(diào) 節(jié)pH，使pH保持在8-9; 4'C條件下，攪拌保存過夜，即得到人工抗原混合液; 將人工抗原混合液移入透析袋中，用2X2L的0.05M的碳酸氫鈉溶液和2X2L 的去離子水透析4-6天，使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，即得到人工抗 原地西泮-牛血清蛋白。3) 地西泮人工抗原的鑒定偶聯(lián)比測(cè)定估算偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子的比率(偶聯(lián)比率)的方法<formula>formula see original document page 4</formula>
雖很多，但都是依據(jù)檢測(cè)偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子含量(或相對(duì)含量)的原 理建立起來的。分光光度法是利用物質(zhì)對(duì)光的吸收與其濃度呈比例關(guān)系的原理 分別測(cè)定被偶聯(lián)的兩種分子濃度。在大分子與小分子偶聯(lián)物中，兩種分子均有 各自不同的紫外掃描光譜，并表現(xiàn)出光譜圖迭加的性質(zhì)。摩爾吸收系數(shù)s:配制地西泮濃度為0， 10， 20， 30 iig'mL-1的20°/。乙醇溶 液，通過紫外掃描可知地西泮的最大吸收波長(zhǎng)為253nm，在253nm處測(cè)吸光值， 每個(gè)濃度做平行樣。摩爾吸光系數(shù)計(jì)算為「吸光值/摩爾濃度。本發(fā)明計(jì)算得 s=8732.44 L，r1偶聯(lián)物蛋白濃度測(cè)定配制濃度為0， 40， 60， 80， 100， 120， 160， 200嗎'mL" 的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考馬斯亮藍(lán)染色液，立即混勻，30'C水浴 溫?zé)?分鐘，每個(gè)濃度做平行樣，在595nm處測(cè)吸光值，繪制蛋白濃度與吸光 值的關(guān)系曲線。將抗原溶液按一定比例稀釋，在595nm處測(cè)定抗原溶液的吸光 值，從曲線上得到抗原溶液的相應(yīng)的蛋白濃度。本發(fā)明計(jì)算得抗原溶液的蛋白 濃度為QJSmg'mL^偶聯(lián)比測(cè)定配制150收mL"牛血清蛋白的20。/。乙醇溶液，將偶聯(lián)產(chǎn)物用 20%乙醇稀釋到lSOpg.mL-1,在242nm處測(cè)吸光值，以20%乙醇為空白，測(cè)出 的吸光值為Al， A2,則偶聯(lián)比率為Y: y = ["-4)/f]/(150x10-3/65000)，本發(fā)明 計(jì)算得Y"17。其中s為摩爾吸光系數(shù)(L'mor1)， 65000為牛血清蛋白的分子量，150xl(T3 為牛血清蛋白濃度(嗎'ml/1)。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明合成了地西泮的人工抗原，合成步驟簡(jiǎn)潔，有 效，完全可用于免疫分析中，為以后人們的研究提供了方便的途徑，可以滿足 國內(nèi)對(duì)其研究的需要。


圖l地西泮人工半抗原的液相色譜圖。 圖2地西泮人工半抗原的質(zhì)譜圖。 圖3地西泮人工抗原制備前后的紫外掃描圖。
具體實(shí)施方式
(1)人工半抗原的制備分別稱取2.5mmo1無水氯化鋁和lmmol 丁二酸酐于50mL圓底燒瓶中，加入 lOmL硝基苯，4(TC條件下攪拌至固體完全溶解。另稱取地西泮lmmol，分3次 加入上述的反應(yīng)液當(dāng)中，反應(yīng)溫度逐漸提高至70°C，反應(yīng)過夜。在劇烈攪拌下， 將反應(yīng)液傾入一定量冰水中，靜置分層后，取有機(jī)層進(jìn)行減壓蒸餾，得到的殘 留用少量熱甲醇溶液溶解，低溫析出沉淀，過濾、干燥得到0.8mmo1半抗原備 用。
反應(yīng)終點(diǎn)監(jiān)測(cè)硅膠薄層板的制作，稱取硅膠12g，溶解在40rnL 0.5%質(zhì)量 濃度的羥甲基纖維素鈉溶液中，用玻璃棒充分?jǐn)嚢璩珊隣?，超聲波振蕩l分鐘， 均勻涂布在玻璃板上，置于陰涼處自然干燥后，放入105。C的烘箱中活化lh， 最后放入干燥箱中備用。
薄層層析法檢測(cè)硅膠薄板下端lcm處作一水平線，吸取反應(yīng)液lpL點(diǎn)于 線上，點(diǎn)樣結(jié)束后吹干，將薄板放入層析缸中，層析液為甲苯乙醚乙酸 甲醇，體積比為60 : 30 : 9 : 1，展開至薄板0.35-0.4cm處，取板，吹干溶劑。 將薄板置于紫外分析儀中，在254nm波長(zhǎng)觀察，在Rf為0.53處觀察到顯色點(diǎn) 作為反應(yīng)終點(diǎn)。
(2) 人工抗原的制備
制備A液稱取O.lmmol半抗原于20mL燒杯中，加入5mL 二氧六環(huán)和0.2mL 的三乙胺，冷卻至5。C。然后加入0.15mL氯甲酸異丁酯，低溫下攪拌lh，此液 為A液。
制備B液稱取0.003mmo1的牛血清蛋白溶于10mL水和8mL 二氧六環(huán)組 成的溶液中，并用1N的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH8-9，低溫保存，此液為B液。
在4-C低溫?cái)嚢柘?，將A液逐滴地滴加到B液中，并用1N的氫氧化鈉溶液 調(diào)節(jié)pH，使pH保持在8-9。 4'C條件下，攪拌保存過夜，即得到人工抗原混合 液。
透析袋前處理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用6(TC的去離 子水沖洗3min，保存在4'C去離子水中備用。
將人工抗原混合液移入透析袋中，用2X2L的0.05M的碳酸氫鈉溶液和2 X2L的去離子水透析4-6天。最后使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，即 得到地西泮人工抗原地西泮-牛血清蛋白。
(3) 地西泮人工抗原的鑒定
偶聯(lián)比測(cè)定估算偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子的比率(偶聯(lián)比率)的方法，
雖然種類很多，但都是依據(jù)檢測(cè)偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子含量(或相對(duì)含量) 的原理建立起來的.分光光度法是利用物質(zhì)對(duì)光的吸收與其濃度呈比例關(guān)系的 原理分別測(cè)定被偶聯(lián)的兩種分子濃度.在大分子與小分子偶聯(lián)物中，兩種分子 均有各自不同的紫外掃描光譜，并表現(xiàn)出光譜圖迭加的性質(zhì)。
摩爾吸收系數(shù)s:配制地西泮濃度為O， 10， 20， 30嗎'mL"的20。/。乙醇溶 液，通過紫外掃描可知地西泮的最大吸收波長(zhǎng)為253nm，在253nm處測(cè)吸光值， 每個(gè)濃度做平行樣.摩爾吸光系數(shù)計(jì)算為s-吸光值/摩爾濃度。本發(fā)明計(jì)算得 s=8732.44 L，r1
偶聯(lián)物蛋白濃度測(cè)定配制濃度為0， 40， 60， 80， 100， 120， 160， 200 ixg'mU1 的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考馬斯亮藍(lán)染色液，立即混勻，30。C水浴
溫?zé)?分鐘，每個(gè)濃度做平行樣.在595nrn處測(cè)吸光值，繪制蛋白濃度與吸光 值的關(guān)系曲線。將抗原溶液按一定比例稀釋，在595nm處測(cè)定抗原溶液的吸光 值，從曲線上得到抗原溶液的相應(yīng)的蛋白濃度。本發(fā)明計(jì)算得抗原溶液的蛋白 濃度為9.33mg'mL"。
偶聯(lián)比測(cè)定配制150嗎TIlL"牛血清蛋白的20。/。乙醇溶液，將偶聯(lián)產(chǎn)物用 20%乙醇稀釋到lSO^ig'mL-1,在242nm處測(cè)吸光值，以20%乙醇為空白，測(cè)出 的吸光值為A1， A2,則偶聯(lián)比率Y為"=[(4-乓)/^/(150><10—3/65000)，本發(fā)明
計(jì)算得Y"17。
其中s為摩爾吸光系數(shù)(L.mor1)， 65000為牛血清蛋白的分子量，150x10—3 為牛血清蛋白濃度(吸mU1)。
權(quán)利要求
1.一種地西泮人工抗原的制備方法，其特征是以地西泮，丁二酸酐為原料，利用付-克?；磻?yīng)在地西泮的5位苯環(huán)上引入羧基；利用混合酸酐法使之與牛血清蛋白結(jié)合制備地西泮的人工抗原即地西泮-牛血清蛋白；步驟為1)人工半抗原的制備地西泮和丁二酸酐配料摩爾比為1∶1，分別稱取無水氯化鋁2.5mmol和丁二酸酐1mmol于50mL圓底燒瓶中，加入10mL硝基苯，40℃條件下攪拌至固體完全溶解；另稱取地西泮1mmol，分3次加入上述的反應(yīng)液中，反應(yīng)溫度逐漸提高至70℃，反應(yīng)過夜；在劇烈攪拌下，將反應(yīng)液傾入適量冰水中，靜置分層后，取有機(jī)層進(jìn)行減壓蒸餾，得到的殘留用少量熱甲醇溶液溶解，低溫析出沉淀，過濾、干燥得到0.8mmol半抗原備用；反應(yīng)終點(diǎn)監(jiān)測(cè)采用薄層層析法進(jìn)行監(jiān)測(cè)，硅膠薄板下端1cm處作一水平線，吸取反應(yīng)液1μL點(diǎn)于線上，點(diǎn)樣結(jié)束后吹干，將薄板放入層析缸中，層析液為甲苯∶乙醚∶乙酸∶甲醇，體積比為60∶30∶9∶1，展開至薄板0.35-0.4cm處，取板，吹干溶劑；將薄板置于紫外分析儀中，在254nm波長(zhǎng)觀察，在Rf為0.53處觀察到顯色點(diǎn)作為反應(yīng)終點(diǎn)；2)人工抗原的制備制備A液稱取0.1mmol半抗原于20mL燒杯中，加入5mL二氧六環(huán)和0.2mL的三乙胺，冷卻至5℃；然后加入0.15mL氯甲酸異丁酯，低溫下攪拌1h，此液為A液；制備B液稱取0.003mmol的牛血清蛋白溶于10mL水和8mL二氧六環(huán)的溶液中，并用1N的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH8-9，低溫保存，此液為B液；在4℃低溫?cái)嚢柘?，將A液逐滴地滴加到B液，并用1N的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，使pH保持在8-9；4℃條件下，攪拌保存過夜，即得到人工抗原混合液；將人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.05M的碳酸氫鈉溶液和2×2L的去離子水透析4-6天，使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，即得到人工抗原地西泮-牛血清蛋白。
全文摘要
一種地西泮人工抗原的制備方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明第一步為半抗原的制備及檢測(cè)以地西泮，丁二酸酐為原料，利用付-克酰化反應(yīng)在地西泮的5位苯環(huán)上引入羧基；第二步為人工抗原的制備及檢測(cè)利用混合酸酐法使之與牛血清蛋白結(jié)合制備地西泮的人工抗原即地西泮-牛血清蛋白。本發(fā)明合成了地西泮的人工抗原，合成步驟簡(jiǎn)潔，有效，完全可用于免疫分析中，為以后人們的研究提供了方便的途徑，可以滿足國內(nèi)對(duì)其研究的需要。
文檔編號(hào)C07K14/765GK101161678SQ200710135000
公開日2008年4月16日 申請(qǐng)日期2007年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月2日
發(fā)明者彭池方, 徐一平, 李秋生, 昉 秦, 胡擁民, 胥傳來, 媛 袁, 偉 陳, 陶冠軍 申請(qǐng)人:江南大學(xué)