專利名稱：一種雙氟米松人工抗原的制備方法
一種雙氟米松人工抗原的制備方法技術(shù)領(lǐng)域一種雙氟米松人工抗原的制備方法，屬于生物化工領(lǐng)域。
技術(shù)背景雙氟米松(Flumethasone，F(xiàn)LM)屬人工合成類糖皮質(zhì)激素，化學(xué)名稱為6a，9a-雙氟孕甾-16a-甲基-lip， 17a， 21-三羥基-1， 4-二烯-3， 20二酮。具有抗過敏、 抗炎的作用，其具有蓄積毒性，許多國家將此藥物列入禁用藥物名單，尤其是 牛肉制品及牛奶中不得檢出。當(dāng)今國際上常用的雙氟米松殘留的檢測方法有 薄層色譜(TLC)、液相色譜(LC)、氣相色譜(GC)、氣-質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)、液-質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)等，但這些儀器分析方法不僅需要昂貴的儀器設(shè)備，對檢材 的要求也比較高，需要經(jīng)過復(fù)雜的樣品前處理才能進行。國外早已經(jīng)開展了對 雙氟米松免疫分析方法的研究，但國內(nèi)目前在這方面還是一片空白。為了加強 對國內(nèi)肉制品的監(jiān)督力度和保障人民的身體健康，有必要展開對雙氟米松免疫 分析方法的研究，有必要提供一種有效的雙氟米松人工抗原的制備方法。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種雙氟米松人工抗原的制備方法，所制備的產(chǎn)品可 用于糖皮質(zhì)激素類免疫方法的研究，為今后人們的研究提供了方便的途徑。本發(fā)明的技術(shù)方案 一種雙氟米松人工抗原的制備方法，以雙氟米松為原 料，利用丁二酸酐與雙氟米松反應(yīng)生成雙氟米松琥珀酸半酯，得到人工半抗原; 利用活性酯法使半抗原轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚怎ブ虚g體，然后使之與牛血清蛋白結(jié)合，制 備雙氟米松的人工抗原即雙氟米松-牛血清蛋白。其反應(yīng)方程式為雙氟米松一牛血清蛋白 工藝步驟為-(1) 人工半抗原的制備雙氟米松和丁二酸酐配料摩爾比為1 : 3，稱取雙氟米松0.4mmol和丁二酸 酐1.2mmol置于50mL圓底燒瓶中，加入2.5mL無水吡啶，在6(TC下加熱攪拌 6h,將反應(yīng)物轉(zhuǎn)入10mL含10%鹽酸的4卩冰水中，有白色沉淀析出，離心除去 吡啶及過量的丁二酸酐，濾餅用去離子水洗滌數(shù)次，離心，干燥箱干燥后得到 雙氟米松半抗原，置于4'C保存；硅膠薄層板的制作稱取硅膠12g，溶解在40mL0.5M質(zhì)量濃度的羥甲基纖 維素鈉溶液中，用玻璃棒充分?jǐn)嚢璩珊隣?，超聲波振?分鐘，均勻涂布在玻 璃板上，置于陰涼處自然干燥后，放入105。C的烘箱中活化lh，最后放入干燥 箱中備用；薄層層析法檢測硅膠薄板下端lcm處作一水平線，吸取反應(yīng)液1^L點于 線上，點樣結(jié)束后吹干，將薄板放入層析缸中，層析液為甲醇氯仿氨水體 積比為21 : 78 : 1，展開至薄板3.5-4cm處，取板，吹干溶劑，將薄板置于紫外 分析儀中，在254nm波長觀察，在Rf為0.21處觀察到顯色點作為反應(yīng)終點；(2) 人工抗原的制備制備A液稱取0.09mmol半抗原，0.09mmol N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)， 0.099mmol N，N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)于20mL燒杯中，溶解于1.8mL的 二氧六環(huán)中，室溫下攪拌過夜，離心后棄沉淀，清液為活性酯中間體，為A液；磷酸鹽緩沖液(PBS):配制0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液磷酸氫二鈉71.64g 加水至1000mL。配制0.2mol/L的磷酸二氫鈉溶液磷酸二氫鈉35.61g加水至 lOOOmL。將0.2mol/L的磷酸氫二鈉溶液94.7mL與0.2mol/L的磷酸二氫鈉溶液 5.3mL混合即為pH8.0的磷酸鹽緩沖液；制備B液稱取120.6mg的牛血清蛋白溶解于9mL的pH 8.0的磷酸鹽緩沖 液中，4'C低溫攪拌半小時，此液為B液；在4'C低溫攪拌下，將A液逐滴地滴加到B液中，全部滴完后，混合液攪 拌1小時恢復(fù)至室溫，即得到人工抗原混合液；透析袋前處理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸10min，再用6(TC的去離 子水沖洗3min，保存在4T:去離子水中備用；將人工抗原混合液移入透析袋中，用2x2L的超純水透析3天，最后使用凍干 法將透析袋中的液體制成粉末，即得到人工抗原雙氟米松-牛血清蛋白。 (3)雙氟米松人工抗原的鑒定估算偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子的比率(偶聯(lián)比率)的方法，雖然種類很 多，但都是依據(jù)檢測偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子含量(或相對含量)的原理建 立起來的.分光光度法是利用物質(zhì)對光的吸收與其濃度呈比例關(guān)系的原理分別 測定被偶聯(lián)的兩種分子濃度.在大分子與小分子偶聯(lián)物中，兩種分子均有 各自不同的紫外掃描光譜，并表現(xiàn)出光譜圖迭加的性質(zhì)。偶聯(lián)物蛋白濃度測定配制濃度為0， 40， 60， 80， 100， 120， 160， 200嗎-ml/1 的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考馬斯亮藍(lán)染色液，立即混勻，3(TC水浴 溫?zé)?分鐘，每個濃度做平行樣.在595nm處測吸光值，繪制蛋白濃度與吸光 值的關(guān)系曲線。將抗原溶液按一定比例稀釋，在595nm處測定抗原溶液的吸光 值，從曲線上得到抗原溶液的相應(yīng)的蛋白濃度。本實驗計算得抗原溶液的蛋白 濃度為3.20mg，mL—1。偶聯(lián)比測定配制雙氟米松濃度為50嗎TIlL"的20%乙醇溶液，通過紫外 掃描可知雙氟米松的最大吸收波長為241nm.配制200嗎.ml/1牛血清蛋白的水溶液，將偶聯(lián)產(chǎn)物用去離牛水稀釋到約 200嗎'mL'1，在241nm處測吸光值，以去離子水為空白，測出吸光值。將FLM，F(xiàn)LM 一BSA,BAS的質(zhì)量濃度根據(jù)其相對分子質(zhì)量轉(zhuǎn)換為摩爾濃度，然后根據(jù)公式(1) 算出各自的摩爾消光系數(shù)摩爾消光系數(shù)￡=| (1)其中，A為吸光度，C為摩爾濃度。 再根據(jù)公式(2)估算交聯(lián)率Mdex: Mbas=(Sflm-bsa - ^bas )/ sflm (2) 本發(fā)明計算得交聯(lián)率約為17。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明合成了雙氟米松的人工抗原，所制備的產(chǎn)品可 用于糖皮質(zhì)激素類免疫方法的研究，合成步驟簡潔，有效，完全可用于免疫分 析當(dāng)中，為以后人們的研究提供了方便的途徑，可以滿足國內(nèi)對其研究的需要。


圖l雙氟米松人工半抗原的液相色譜圖。圖2雙氟米松人工半抗原的質(zhì)譜圖。 圖3雙氟米松人工抗原制備前后的紫外掃描圖具體實施方式
(1)人工半抗原的制備稱取0.16g雙氟米松和0.12g 丁二酸酑于50mL圓底燒瓶中，加入2.5mL無 水吡啶，混合物在6(TC下加熱攪拌6h，將反應(yīng)物轉(zhuǎn)入含10X鹽酸(v/v)的冰水 (4°C)中，有白色沉淀析出，離心出去吡啶及過量的丁二酸酐，去離子水洗滌 數(shù)次，離心，干燥箱干燥后保存。反應(yīng)終點監(jiān)測硅膠薄層板的制作，稱取硅膠12g，溶解在40mL 0.5%質(zhì)量 濃度的羥甲基纖維素鈉溶液中，用玻璃棒充分?jǐn)嚢璩珊隣?，超聲波振蕩l分鐘，
均勻涂布在玻璃板上，置于陰涼處自然干燥后，放入105'C的烘箱中活化lh， 最后放入干燥箱中備用。薄層層析法檢測硅膠薄板下端lcm處作一水平線，吸取反應(yīng)液lpL點于 線上，點樣結(jié)束后吹干，將薄板放入層析缸中，層析液為甲醇氯仿氨水， 體積比為21 : 78 : 1，展開至薄板3/4處，取板，吹干溶劑。將薄板置于紫外分 析儀中，在254nm波長觀察，在Rf為0.21處觀察到顯色點作為反應(yīng)終點。(2) 人工抗原的制備制備A液稱取45.93mg (0.09mmo1)半抗原，10.35mg (0.09mmol)N-羥基琥 珀酰亞胺(NHS) ,20.4mg(0.099mmol)N，N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)于20mL 燒杯中，溶解于1.8mL的二氧六環(huán)中，室溫下攪拌過夜，離心后棄沉淀，清液 為活性酯中間體,為A液。磷酸鹽緩沖液0.2mol/L磷酸氫二鈉液磷酸氫二鈉71.64g加水至1000mL。 配0.2mol/L的磷酸二氫鈉液磷酸二氫鈉35.61g加水至1000mL。將94.7mL的 磷酸氫二鈉液與5.3mL的磷酸二氫鈉液混合即為pH8.0的磷酸鹽緩沖液。制備B液稱取120.6mg的BSA溶解于9mL的pH 8.0的磷酸鹽緩沖液中， 低溫攪拌半小時，此液為B液。在低溫(4°C)攪拌下，將A液逐滴地滴加到B液，全部滴完后，混合液 攪拌1小時恢復(fù)至室溫，即得到人工抗原混合液。透析袋前處理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸10min，再用6(TC的去離 子水沖洗3min，保存在4'C去離子水中備用。將人工抗原混合液移入透析袋中，用2X2L的超純水透析3天。最后使用 凍干法將透析袋中的液體制成粉末，即得到人工抗原雙氟米松-牛血清蛋白。(3) 雙氟米松人工抗原的鑒定 估算偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子的比率(偶聯(lián)比率)的方法，雖然種類很多，但都是依據(jù)檢測偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子含量(或相對含量)的原理建 立起來的.分光光度法是利用物質(zhì)對光的吸收與其濃度呈比例關(guān)系的原理分別 測定被偶聯(lián)的兩種分子濃度.在大分子與小分子偶聯(lián)物中，兩種分子均有各自 不同的紫外掃描光譜，并表現(xiàn)出光譜圖迭加的性質(zhì)。偶聯(lián)物蛋白濃度測定配制濃度為0， 40， 60， 80， 100， 120， 160， 200嗎'mU1 的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考馬斯亮藍(lán)染色液，立即混勻，3(TC水浴 溫?zé)?分鐘，每個濃度做平行樣.在595nm處測吸光值，繪制蛋白濃度與吸光 值的關(guān)系曲線。將抗原溶液按一定比例稀釋，在595nm處測定抗原溶液的吸光 值，從曲線上得到抗原溶液的相應(yīng)的蛋白濃度。本實驗計算得抗原溶液的蛋白 濃度為3.20mg'mU1。偶聯(lián)比測定配制雙氟米松濃度為50嗎TIlL"的20。/。乙醇溶液，通過紫外掃
描可知雙氟米松的最大吸收波長為241nm。配制200吸ml/1牛血清蛋白的水溶液，將偶聯(lián)產(chǎn)物用去離子水稀釋到約 200嗎'mL'1，在241nm處測吸光值，以去離子水為空白，測出吸光值。將 FLM,FLM—BSA，BAS的質(zhì)量濃度根據(jù)其相對分子質(zhì)量轉(zhuǎn)換為摩爾濃度，然后根 據(jù)公式(1)算出各自的摩爾消光系數(shù)摩爾消光系數(shù)￡=* (1)其中，A為吸光度，C為摩爾濃度。 再根據(jù)公式(2)估算交聯(lián)率Mdex: Mbas=(Sflm-bsa - Sbas )/ Sflm (2) 本發(fā)明計算得交聯(lián)率約為17。
權(quán)利要求
1.一種雙氟米松人工抗原的制備方法，其特征是以雙氟米松為原料，利用丁二酸酐與雙氟米松反應(yīng)生成雙氟米松琥珀酸半酯，得到人工半抗原；利用活性酯法使半抗原轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚怎ブ虚g體，然后使之與牛血清蛋白結(jié)合，制備雙氟米松的人工抗原即雙氟米松-牛血清蛋白；步驟為(1)人工半抗原的制備雙氟米松和丁二酸酐配料摩爾比為1∶3，稱取雙氟米松0.4mmol和丁二酸酐1.2mmol置于50mL圓底燒瓶中，加入2.5mL無水吡啶，在60℃下加熱攪拌6h，將反應(yīng)物轉(zhuǎn)入10mL含10％鹽酸的4℃冰水中，有白色沉淀析出，離心除去吡啶及過量的丁二酸酐，濾餅用去離子水洗滌數(shù)次，離心，干燥箱干燥后得到雙氟米松半抗原，置于4℃保存；硅膠薄層板的制作稱取硅膠12g，溶解在40mL 0.5％質(zhì)量濃度的羥甲基纖維素鈉溶液中，用玻璃棒充分?jǐn)嚢璩珊隣睿暡ㄕ袷?分鐘，均勻涂布在玻璃板上，置于陰涼處自然干燥后，放入105℃的烘箱中活化1h，最后放入干燥箱中備用；薄層層析法檢測硅膠薄板下端1cm處作一水平線，吸取反應(yīng)液1μL點于線上，點樣結(jié)束后吹干，將薄板放入層析缸中，層析液為甲醇∶氯仿∶氨水體積比為21∶78∶1，展開至薄板3.5-4cm處，取板，吹干溶劑，將薄板置于紫外分析儀中，在254nm波長觀察，在Rf為0.21處觀察到顯色點作為反應(yīng)終點；(2)人工抗原的制備制備A液稱取0.09mmol半抗原，0.09mmol N-羥基琥珀酰亞胺，0.099mmol N，N-二環(huán)己基碳二亞胺于20mL燒杯中，溶解于1.8mL的二氧六環(huán)中，室溫下攪拌過夜，離心后棄沉淀，清液為活性酯中間體，為A液；磷酸鹽緩沖液將0.2mol/L的磷酸氫二鈉溶液94.7mL與0.2mol/L的磷酸二氫鈉溶液5.3mL混合即為pH8.0的磷酸鹽緩沖液；制備B液稱取120.6mg的牛血清蛋白溶解于9mL的pH 8.0的磷酸鹽緩沖液中，4℃低溫攪拌半小時，此液為B液；在4℃低溫攪拌下，將A液逐滴地滴加到B液中，全部滴完后，混合液攪拌1小時恢復(fù)至室溫，即得到人工抗原混合液；透析袋前處理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸10min，再用60℃的去離子水沖洗3min，保存在4℃去離子水中備用；將人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的超純水透析3天，最后使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，即得到人工抗原雙氟米松-牛血清蛋白。
全文摘要
一種雙氟米松人工抗原的制備方法，屬于生物化工領(lǐng)域。本發(fā)明是以雙氟米松為原料，利用丁二酸酐與雙氟米松反應(yīng)生成雙氟米松琥珀酸半酯，得到人工半抗原；利用活性酯法使半抗原轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚怎ブ虚g體，然后使之與牛血清蛋白結(jié)合，制備雙氟米松的人工抗原即雙氟米松-牛血清蛋白。本發(fā)明合成了雙氟米松的人工抗原，所制備的產(chǎn)品可用于糖皮質(zhì)激素類免疫方法的研究，合成步驟簡潔，有效，完全可用于免疫分析當(dāng)中，為以后人們的研究提供了方便的途徑，可以滿足國內(nèi)對其研究的需要。
文檔編號C07K14/765GK101161681SQ20071013524
公開日2008年4月16日 申請日期2007年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月1日
發(fā)明者彭池方, 李秋生, 胥傳來, 媛 袁, 謝會玲 申請人:江南大學(xué)