專利名稱：：一種從紅豆杉枝葉中提取純化兩種紫杉烷類化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種從紅豆杉枝葉中提取純化10-去乙?；涂ㄍII和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的方法。
背景技術(shù)：
：紫杉醇(paclitaxel，圖l)是具有五甲基十五碳烯骨架的二砲類化合物，是最早從太平洋紅豆杉(Taxusbrevifolia)樹皮中提取出來的一種天然抗癌藥物(Wanietal.,1971)，能與微管蛋白結(jié)合，并促進(jìn)其聚合、抑制癌細(xì)胞有絲分裂，阻止癌細(xì)胞的增殖(Kellingetal.,2003;佘琨等，2001)1992年被美國(guó)FDA正式批準(zhǔn)為抗癌新藥，紫杉醇對(duì)卵巢癌、乳腺癌、肺癌有較好的作用。近年來研究表明，紫杉醇對(duì)治療其它疾病也有一定潛力，如惡性黑色素瘤(羅士德等，1994)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(01iveretal.,1994)和早老性癡呆(Burkeetal.,1994)等。隨著國(guó)際市場(chǎng)上對(duì)紫杉醇需求量的日益增長(zhǎng)，野生紅豆杉資源遭到了毀滅性的破壞，人工種植紅豆杉己成為解決紫杉醇原料短缺的重要途徑(劉穎和肖艷，2005;黃玉仙，2005;吉前華，2004)，但如果采用傳統(tǒng)方法，從紅豆杉樹皮中提取紫杉醇，資源耗費(fèi)太大且人工種植周期長(zhǎng)，仍不能解決紫杉醇的原料問題。目前供臨床使用的紫杉醇主要從紅豆杉樹皮中提取。紫杉醇在紅豆杉植物中含量很低，即使當(dāng)前公認(rèn)含量最高的短葉紅豆杉樹皮中也僅有O.Ol%0.03%。為了解決紫杉醇供需之間的尖銳矛盾,多年來，科學(xué)工作者在尋找及擴(kuò)大紫杉醇藥源途徑方面做了不懈的努力。人們從以下幾個(gè)方面進(jìn)行了研究紅豆杉細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)、全合成和半合成，產(chǎn)紫杉醇真菌的篩選和發(fā)酵培養(yǎng),紫杉醇生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的克隆和工程菌的改造等。目前，人工種植的紅豆杉數(shù)量逐漸增加，給紫杉醇的獲得提供了新的來源，但是紅豆杉生長(zhǎng)緩慢，環(huán)境適應(yīng)性較弱，不能依靠人工種植的紅豆杉樹皮提取所需的紫杉醇，因此，應(yīng)該利用其可再生部位——枝葉，對(duì)其的枝葉進(jìn)行充分的開發(fā)利用。在許多紫杉屬植物中，含有很多與紫杉醇結(jié)構(gòu)相似的紫杉烷類化合物，含量比紫杉醇豐富得多，這些紫杉烷類化合物可以通過生物或者化學(xué)轉(zhuǎn)化的手段轉(zhuǎn)變成紫杉醇，例如10-去乙?；涂ㄍII和7-木糖基-10-去乙?；仙即?。10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙?；仙即?圖1)存在于多種紫杉屬植物中，例如T.6rew》/fa,77.6accato,r.me&a,J!c/z/wera/s,""t/Zow/^ato等，在紫杉屬植物中的含量約為0.0052%~0.1185%。在C-7位連接有木糖基的紫杉烷類化合物最初由Senilh分離得到，主要有7-木糖基-10-去乙?；仙即迹?-木糖基-10-去乙酰基三尖杉寧堿，7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇C等，這些化合物在傳統(tǒng)的提取紫杉醇的生產(chǎn)工藝中常被當(dāng)作廢物丟棄掉，既浪費(fèi)了植物資源，又污染了環(huán)境。和紫杉醇與多西紫杉醇比較，IO-去乙?；涂ㄍII幾乎不具有任何抗癌活性，然而由于其結(jié)構(gòu)與紫杉醇、多西紫杉醇相似，10-去乙?；涂ㄍII和7-木糖基-10-去乙?；仙即伎梢杂糜谧仙即寂c多西紫杉醇的半合成，因此，10-去乙?；涂ㄍ和7-木糖基-io-去乙酰基紫杉醇的制備型分離是在世界范圍內(nèi)的一個(gè)研究熱點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種以紅豆杉枝葉為原料，通過負(fù)壓空化水提對(duì)其中的10-去乙?；涂ㄍII和7-木糖基-10-去乙?；仙即歼M(jìn)行提取，通過樹脂富集和硅膠柱層析對(duì)io-去乙?；涂ㄍ和7-木糖基-io-去乙?；仙即歼M(jìn)行純化的工藝方法。本方法不僅可以獲得10-去乙?；涂ㄍn和7-木糖基-io-去乙?；仙即籍a(chǎn)品，還可提高植物固形物中紫杉醇等有效成分的后期提取純化，增加原料的利用度。一種從紅豆杉枝葉中提取純化10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙?；仙即嫉姆椒ǎ渲饕卣髟谟诩t豆杉枝葉經(jīng)過干燥粉碎后，于50°C下進(jìn)行負(fù)壓空化水提30min，過濾后濾液經(jīng)過AB-8樹脂動(dòng)態(tài)吸附，用30%乙醇進(jìn)行淋洗除去雜質(zhì)，再用80%乙醇洗脫得到目標(biāo)產(chǎn)物，從而達(dá)到對(duì)10-去乙?；涂ㄍII和7-木糖基-10-去乙?；仙即嫉某醪礁患?，后經(jīng)過中壓硅膠柱層析進(jìn)一步純化，得到純度為60%以上的10-去乙酰基巴卡亭III和67%以上的7-木糖基-10-去乙?；仙即?。按照權(quán)利要求1所述的紅豆杉枝葉，其特征在于紅豆杉枝葉主要來源包括東北紅豆杉和南方紅豆杉。按照權(quán)利要求1所述的負(fù)壓空化水提，其特征在于IO-去乙?；涂ㄍII和7-木糖基-10-去乙?；仙即际撬苄暂^大的物質(zhì)，通過負(fù)壓空化水提，可以將植物材料中的10-去乙?；涂ㄍII和7-木糖基-10-去乙?；仙即汲浞痔岢觯鴮⑵渌仙即嫉却蟛糠种苄缘奈镔|(zhì)留在植物固形物中，可作為后期提取紫杉醇的原料。通過負(fù)壓空化提取，使得提取溶劑與植物細(xì)胞有了更充分的接觸，促使植物細(xì)胞中的物質(zhì)迅速?gòu)氐椎剞D(zhuǎn)移至提取溶劑中，所用時(shí)間短，效率高。按照權(quán)利要求1所述的樹脂富集，其特征在于所用的樹脂為AB-8。該樹脂對(duì)于10-去乙?；涂ㄍII和7-木糖基-10-去乙?；仙即季哂刑禺愋晕?。所用樹脂為35g，上樣溶液為15BV，流速為1mL/min，溫度為35°C,采用梯度洗脫的方法3BV的30%乙醇洗脫除去雜質(zhì)，然后6BV80。/。乙醇洗脫，收集餾分，濃縮至干，經(jīng)過樹脂富集后，10-去乙?；涂ㄍII和7-木糖基-10-去乙?；仙即嫉暮靠煞謩e提高8.54倍以上和62.43倍以上。按照權(quán)利要求l所述的中壓硅膠柱層析，其特征在于所用硅膠為300-400目40g，柱高為14.5cm，，中壓柱層析，洗脫劑為不同比例的乙酸乙酯與石油醚的混合溶劑梯度洗脫，流速為4.3mL/min，洗脫過程中用TLC進(jìn)行檢測(cè)，利用10°/。的硫酸乙醇溶液顯色。先用600mL乙酸乙酯/石油醚(1/1，v/v)洗脫，淋洗除雜，用1.6L乙酸乙酯/石油醚(1/1.2，v/v)洗脫，收集含有IO-去乙?；涂ㄍH的餾分，后用300mL乙酸乙酯/石油醚(16/1，v/v)淋洗除雜，最后用200mL乙酸乙酯/石油醚(20/1，v/v)洗脫，收集含有7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的餾分。最終得到純度為60%以上的10-去乙?；涂ㄍII和67%以上的7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明以紅豆杉可再生枝葉為原料，不破壞植物資源，提取后的固形物可作為提純紫杉醇等有效成分的原料，實(shí)現(xiàn)了對(duì)植物資源的髙效利用。2.本發(fā)明采用負(fù)壓空化水提的方法對(duì)植物原料中的10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙?；仙即歼M(jìn)行提取，時(shí)間短，效率高。3.本發(fā)明所采用的AB-8樹脂富集方法，對(duì)粗提取物中的10-去乙?；涂ㄍII和7-木糖基-10-去乙?；仙即季哂刑禺愋晕?，可以高效地提高洗脫餾分中兩種物質(zhì)的含量。4.該方法簡(jiǎn)單易行，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。.具體實(shí)施方案實(shí)施例1稱取200g南方紅豆杉枝葉，干燥粉碎后，加入2000mL水負(fù)壓空化提取，30min后過濾，濾液加入到裝有35gAB-8樹脂的玻璃柱中，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，上樣溶液為15BV,上樣溶液中10-去乙?；涂ㄍII和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的濃度分別為0.0657mg/mL禾P0.1681mg/mL，流速為1mL/min，溫度為35°C，采用梯度洗脫的方法3BV的30%乙醇洗脫除去雜質(zhì)，然后6BV80%乙醇洗脫，收集餾分，濃縮至干，經(jīng)過樹脂富集后，10-去乙?；涂ㄍ?11和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的含量分別從0.2%和0.053%提高到了1.69%和3.34%,分別提高了8.54倍和62.43倍。樹脂富集后樣品進(jìn)行300~400目中壓硅膠柱層析純化，所用硅膠為40g，柱高為14.5cm，洗脫劑為不同比例的乙酸乙酯與石油醚的混合溶劑梯度洗脫，流速為4.3mL/min，洗脫過程中用TLC進(jìn)行檢領(lǐng)IJ，利用10%的硫酸乙醇溶液顯色。先用600mL乙酸乙酯/石油醚(1/1，v/v)洗脫，淋洗除雜，用1.6L乙酸乙酯/石油醚(1/1.2，v/v)洗脫，收集含有10-去乙?；涂ㄍII的餾分，濃縮至干，得固形物0.3g其中10-去乙?；涂ㄍII含量為60%，后用300mL乙酸乙酯/石油醚(16/1，v/v)淋洗除雜，最后用200mL乙酸乙酯/石油醚(20/1，v/v)洗脫，收集含有7-木糖基-10-去乙?；仙即嫉酿s分，濃縮至干，得固形物0.56g，其中7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的含量為70%。實(shí)施例2稱取200g東北紅豆杉枝葉，干燥粉碎后，加2000mL水負(fù)壓空化提取，30min后過濾，濾液加入到裝有35gAB-8樹脂的玻璃柱中，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，上樣溶液為15BV,上樣溶液中10-去乙?；涂ㄍII和7-木糖基-10-去乙?；仙即嫉暮糠謩e為0.0519mg/mL和0.1673mg/mL,流速為1mL/min,溫度為35。C,采用梯度洗脫的方法3BV的30。/。乙醇洗脫除去雜質(zhì)，然后6BV80。/。乙醇洗脫，收集餾分，濃縮至干，經(jīng)過樹脂富集后，10-去乙?；涂ㄍ?11和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的含量分別從0.16%和0.049%提高到了1.57%禾n3.46%，分別提高了9.81倍和70.61倍。樹脂富集后樣品進(jìn)行300-400目中壓硅膠柱層析純化，所用硅膠為40g，柱高為14.5cm，洗脫劑為不同比例的乙酸乙酯與石油醚的混合溶劑梯度洗脫，流速為4.3mL/min,洗脫過程中用TLC進(jìn)行檢測(cè)，利用10%的硫酸乙醇溶液顯色。600mL乙酸乙酯/石油醚(1/1，v/v)洗脫，淋洗除雜，用1.6L乙酸乙酯/石油醚(1/1.2，v/v)洗脫，收集含有10-去乙?；涂ㄍII的餾分，濃縮至干，得固形物0.37g其中10-去乙?；涂ㄍII含量為64%，后用300mL乙酸乙酯/石油醚(16/1，v/v)淋洗除雜，最后用200mL乙酸乙酯/石油醚(20/1，v/v)洗脫，收集含有7-木糖基-10-去乙?；仙即嫉酿s分，濃縮至干，得固形物0.48g，其中7-木糖基-10-去乙?；仙即嫉暮繛?7%。標(biāo)準(zhǔn)品10-去乙?；涂ㄍII和7-木糖基-10-去乙?；仙即嫉臉?biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司。結(jié)果定量檢測(cè)分析采用下表?xiàng)l件<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>圖1為10-去乙?；涂ㄍII的結(jié)構(gòu)式圖2為7-木糖基-10-去乙?；仙即嫉慕Y(jié)構(gòu)式。權(quán)利要求1.一種從紅豆杉枝葉中提取純化10-去乙?；涂ㄍII和7-木糖基-10-去乙?；仙即嫉姆椒?，其主要特征在于紅豆杉枝葉經(jīng)過干燥粉碎后，于50℃下進(jìn)行負(fù)壓空化水提30min，過濾后濾液經(jīng)過AB-8樹脂動(dòng)態(tài)吸附，用30％乙醇進(jìn)行淋洗除去雜質(zhì)，再用80％乙醇洗脫得到目標(biāo)產(chǎn)物，從而達(dá)到對(duì)10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙?；仙即嫉某醪礁患?，后經(jīng)過中壓硅膠柱層析進(jìn)一步純化，得到純度為60％以上的10-去乙?；涂ㄍII和67％以上的7-木糖基-10-去乙?；仙即?。2.按照權(quán)利要求1所述的紅豆杉枝葉，其特征在于紅豆杉枝葉主要來源包括東北紅豆杉和南方紅豆杉。3.按照權(quán)利要求1所述的負(fù)壓空化水提，其特征在于IO-去乙?；涂ㄍII和7-木糖基-10-去乙?；仙即际撬苄暂^大的物質(zhì)，通過負(fù)壓空化水提，可以將植物材料中的10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙?；仙即汲浞痔岢觯鴮⑵渌仙即嫉却蟛糠种苄缘奈镔|(zhì)留在植物固形物中，可作為后期提取紫杉醇的原料。通過負(fù)壓空化提取，使得提取溶劑與植物細(xì)胞有了更充分的接觸，促使植物細(xì)胞中的物質(zhì)迅速?gòu)氐椎剞D(zhuǎn)移至提取溶劑中，所用時(shí)間短，效率高。4.按照權(quán)利要求1所述的樹脂富集，其特征在于所用的樹脂為AB-8。該樹脂對(duì)于10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙?；仙即季哂刑禺愋晕?。所用樹脂為35g,上樣溶液為15BV,流速為1mL/min，溫度為35°C，采用梯度洗脫的方法3BV的30%乙醇洗脫除去雜質(zhì)，然后6BV80。/。乙醇洗脫，收集餾分，濃縮至干，經(jīng)過樹脂富集后，10-去乙?；涂ㄍII和7-木糖基-10-去乙?；仙即嫉暮靠煞謩e提高8.54倍以上和62.43倍以上。5.按照權(quán)利要求1所述的中壓硅膠柱層析，其特征在于所用硅膠為300~400目40g，柱高為14.5cm，中壓柱層析，洗脫劑為不同比例的乙酸乙酯與石油醚的混合溶劑梯度洗脫，流速為4.3mL/min，洗脫過程中用TLC進(jìn)行檢測(cè)，利用10%的硫酸乙醇溶液顯色。先用600mL乙酸乙酯/石油醚(1/1,v/v)洗脫，淋洗除雜，用1.6L乙酸乙酯/石油醚(1/1.2，v/v)洗脫，收集含有10-去乙酰基巴卡亭III的餾分，然后用300mL乙酸乙酯/石油醚(16/1，v/v)淋洗除雜，最后用200mL乙酸乙酯/石油醚(20/1，v/v)洗脫，收集含有7-木糖基-10-去乙?；仙即嫉酿s分。最終得到純度為60%以上的10-去乙?；涂ㄍII和67%以上的7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇。全文摘要本發(fā)明涉及一種通過負(fù)壓空化水提的方法，利用特異性樹脂及硅膠柱層析純化高效生產(chǎn)10-去乙?；涂ㄍII和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的方法。以紅豆杉枝葉為原料，干燥粉碎后進(jìn)行負(fù)壓空化水提，過濾后濾液經(jīng)過AB-8樹脂動(dòng)態(tài)吸附對(duì)10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙?；仙即歼M(jìn)行富集，后經(jīng)過中壓硅膠柱層析進(jìn)一步純化，得到純度為60％以上的10-去乙酰基巴卡亭III和67％以上的7-木糖基-10-去乙?；仙即?。本發(fā)明所用原料為可再生的紅豆杉枝葉，既做到了不破壞生態(tài)資源，又能高效提取得到紅豆杉有效成分及其生物半合成前體物質(zhì)。該方法操作簡(jiǎn)單易行，適于工業(yè)應(yīng)用，對(duì)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。文檔編號(hào)C07D305/14GK101235022SQ20071014453公開日2008年8月6日申請(qǐng)日期2007年11月1日優(yōu)先權(quán)日2007年11月1日發(fā)明者付玉杰,威劉,姜守剛,蕊孫,琳張,李雙明,琢汪,瑩王,祖元?jiǎng)偵暾?qǐng)人:東北林業(yè)大學(xué);付玉杰