專利名稱：細胞膜蛋白derlin-1及其制備和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新的人腫瘤抗原細胞膜蛋白DERLIN-1 、其結(jié)合配體 以及它們在篩選和/或制備用于治療和/或診斷腫瘤的藥物中的用途。
背景技術：
腫瘤是人類最常見的疾病之一，其死亡率在世界和我國的各種疾 病中分別排在第二位和第三位，嚴重影響著人類的健康。在我國隨著 社會的發(fā)展，腫瘤的發(fā)病率還在逐年上升。我國目前有腫瘤患者約 450萬人，死亡率在30%以上，而且每年新增的患者人數(shù)高達200萬 人以上。有效地醫(yī)治腫瘤已是科學研究中的當務之急。臨床治療腫瘤 的方法主要是手術切除和放、化療，但是，放、化療在殺死癌細胞的 同時，給人體正常細胞也帶來了嚴重的損傷。此外，目前治療惡性腫 瘤的手術，放療，化療三大常規(guī)治療手段并沒有明顯的降低腫瘤的死 亡率，其5年生存率僅達10-30e/。，因此全世界各國均在始終不懈的 探索，力圖尋找出更有效的治療手段。隨著對腫瘤研究的不斷深入， 人們開始嘗試采用生物方法針對腫瘤發(fā)展進程中的不同層面進行治 療并且已經(jīng)取得了一定效果，腫瘤的生物靶向治療必將成為最有前景 和最活躍的領域。
腫瘤的靶向治療很重要，"靶向"是腫瘤治療中必須遵守的原則， 高效、準確地命中腫瘤這個"耙"，實現(xiàn)有的放矢是腫瘤治療的關鍵所 在。因此，找到高效、特異的靶點是腫瘤生物靶向治療的關鍵。目前， 已經(jīng)公開報道了一些腫瘤治療耙點，它們或者參與了腫瘤的生長過 程，或者在腫瘤的轉(zhuǎn)移、耐藥性的誘導的過程中發(fā)揮作用，并且針對
4所述的靶點也設計了一些新的藥物，例如針對CD20分子的抗體類抗 淋巴瘤靶向藥物Rituxan，針對EGFR的小分子化合物類抗肺癌耙向藥 物Iressa。但是，目前開發(fā)的抗腫瘤藥物對臨床的需要來說仍然是遠 遠不夠的，因此仍然亟需發(fā)展更多的抗體類抗腫瘤藥物。
現(xiàn)有技術中顯示DERLIN-1是位于細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的蛋白，它參 與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)部錯誤折疊蛋白向胞漿中轉(zhuǎn)運的過程(Yihong Yel, Yoko Shibatal, Chi Yun2， David Ron2 & Tom A. Rapoportl. A membrane protein complex mediates retro-translocation from the ER lumen into the cytosol NATURE. 2004; (429): 841-847)。由于人們僅僅 發(fā)現(xiàn)DERLIN-1位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，且沒有如上所述腫瘤靶標方面的研究， 因此目前本領域均認為該蛋白不能用作腫瘤治療的靶點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于以下新發(fā)現(xiàn)DERLIN-1位于腫瘤的細胞膜上，并且 參與腫瘤的生長過程，因此可以作為腫瘤診斷和/或治療中的靶點。
一方面，本發(fā)明涉及細胞膜蛋白形式的DERLIN-1及其制備，其 中DERLIN-1蛋白的序列為SEQIDNO:l。
另一方面，本發(fā)明涉及細胞膜DERLIN-1蛋白作為新的腫瘤診斷 和/或治療耙點的用途。具體地，本發(fā)明的細胞膜DERLIN-1蛋白可 以作為腫瘤靶蛋白用來篩選用于治療腫瘤的藥物。
本發(fā)明還涉及DERLIN-1蛋白結(jié)合配體，其在制備腫瘤診斷劑和 /或治療藥物中的用途，以及包含抗DERLIN-1蛋白的單克隆抗體的 腫瘤診斷劑和/或治療藥物。具體地，所述DERLIN-1蛋白結(jié)合配體 是抗DERLIN-1蛋白的單克隆抗體，其可獲自穩(wěn)定分泌抗DERLIN-1 單克隆抗體的雜交瘤細胞克隆HEC252/9F12，所述雜交瘤細胞于2007 年11月2日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No. 2242。
此外，本發(fā)明還涉及利用DERLIN-1蛋白結(jié)合配體診斷和/或治 療腫瘤的方法。


圖1顯示DERLIN-1蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO: 1)。 圖2顯示用DERLIN-1蛋白多克隆抗體通過免疫組化方法檢測腫
瘤組織及配對的癌旁正常組織中DERLIN-1蛋白表達情況。
圖3和4分別顯示用活細胞免疫熒光法檢測腫瘤細胞和正常永生
化細胞中DERLIN-1蛋白基因的亞細胞定位的結(jié)果。
圖5顯示用激光共聚焦法檢測DERLIN-1蛋白在腫瘤細胞膜表面
的表達的結(jié)果。
圖6顯示用DERLIN-1蛋白多克隆抗體通過免疫組化方法檢測正 常人體組織中DERLIN-1蛋白表達情況。
圖7是DERLIN-1蛋白多克隆抗體體內(nèi)分布實驗，顯示DERLIN-1 蛋白特異分布于腫瘤細胞表面，而不在正常組織細胞表面
圖8是DERLIN-1蛋白單克隆抗體體內(nèi)顯影的分子影像學實驗， 耙向DERLIN-1蛋白的抗體在荷瘤小鼠的顯像可以確定腫瘤的部位 及大小。
具體實施例方式
根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，本發(fā)明涉及細胞膜DERLIN-1蛋白 (SEQIDNO:l)及其制備，例如可通過重組方法進行制備。 一個優(yōu) 選的實施方案中，細胞膜DERLIN-1蛋白通過如下方法制備并純化 (1)構(gòu)建^W"-7基因的cDNA的表達序列；
6(2) 將所述cDNA克隆入表達載體，并將所述表達載體轉(zhuǎn)入 原核細胞或真核細胞中；
(3) 使DERLIN-1蛋白在所述的宿主細胞中表達； (4 )純化所表達的DERLIN-1蛋白。
其中，所述表達載體優(yōu)選pET-30b載體或其他真核載體。所述宿主細
胞是本領域常用的原核或真核宿主細胞，優(yōu)選原核宿主細胞，例如 BL21E3細菌，中國倉鼠卵巢癌細胞CHO。所述的蛋白的純化方法可 采用本領域常規(guī)的方法，例如參見Novagen公司編寫的pET系統(tǒng)操作手 冊。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明涉及細胞膜DERLIN-1蛋白作 為新的腫瘤診斷和/或治療靶點的用途。具體地，本發(fā)明的細胞膜 DERLIN-1蛋白可以作為腫瘤耙蛋白篩選用于診斷或治療腫瘤的藥 物。篩選藥物的方法可以利用本領域技術人員已知的篩選方法，例如 參見"開發(fā)小肽，篩選新藥"，王克夷等，中國生化藥物雜志2003年 第24巻第1期，48-50頁；"噬菌體隨機肽庫的應用"，免疫學雜志 2000年第5期第16巻，李華朱錫華等；"小分子活性肽篩選方法"， 《生命的化學》2004年24巻1期，第16-18頁，羅以勤，王梁華， 焦炳華等。根據(jù)本發(fā)明上述篩選方法得到的抗腫瘤藥物可以是例如單
克隆抗體，或者與DERLIN-1蛋白結(jié)合的其他類型的分子，如多肽或 其他小分子藥物等。此外，可以將一些治療性物質(zhì)偶聯(lián)于與細胞膜 DERLIN-1蛋白具有高親和力的耙向藥物上以達到治療的效果，如將 放射性核素偶聯(lián)于抗DERLIN-1蛋白單克隆抗體上。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明涉及DERLIN-1蛋白結(jié)合配體， 在一個實施方案中，所述DERLIN-1蛋白結(jié)合配體是抗DERLIN-1蛋 白的單克隆抗體。本發(fā)明術語"DERLIN-1蛋白結(jié)合配體"與本領域
7技術人員通常理解的那樣，意指能與DERLIN-1蛋白高效特異性結(jié)合 的配體分子，包括例如單克隆抗體、多肽或者小分子化合物等腫瘤耙 向藥物。在一個實施方案中，所述DERLIN-1蛋白結(jié)合配體是單克隆 抗體，其可獲自穩(wěn)定分泌抗DERLIN-1單克隆抗體的雜交瘤細胞克隆 HEC252/9F12，所述雜交瘤細胞于2007年11月2日保藏于中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No. 2242。 在一個實施方案中，所述的單克隆抗體的制備和純化包括如下步
驟
(1) 用通過本發(fā)明所述方法制備并純化的DERLIN-1蛋白 免疫動物，獲得免疫血清；
(2) 利用間接ELISA測定免疫血清中抗DERLIN-1蛋白抗
體的滴度；
(3) 收集其中所述抗體的滴度達到108以上的免疫血清；
(4) 通過親和層析法純化所得的免疫血清。 其中所述的動物為哺乳動物，包括例如鼠、猴、兔、馬、牛、
羊、豬、人等。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明的DERLIN-1蛋白結(jié)合配 體可用于制備腫瘤的治療藥物。在一個優(yōu)選實施方案中，所述 DERLIN-1蛋白結(jié)合配體是本發(fā)明的單克隆抗體，具體可為保藏號 CGMCCNo.2242的雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體。所述的單克隆抗 體也可以包含在藥物組合物中。所述組合物可包含治療有效量的 DERLIN-1蛋白單克隆抗體及其他治療性藥物，從而提高治療效果。 治療效果的提高可體現(xiàn)為使得達到相同的治療效果所用的DERLIN-1 蛋白單克隆抗體或其他治療性藥物的劑量更少或?qū)ERLIN-1蛋白 單克隆抗體與其他治療性藥物組合后可以得到更好的腫瘤抑制效果。 本發(fā)明所述藥物組合物可用于治療腫瘤，在一個優(yōu)選實施方案中，所述腫瘤是胰腺癌。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述腫瘤是結(jié)腸癌。本
發(fā)明所述的組合物還可以用于其他高表達DERLIN-1蛋白腫瘤的治
療，包括卵巢癌、乳腺癌、皮膚癌、肝癌、腎癌、骨髓瘤、甲狀腺
癌，肺癌、子宮癌、前列腺癌、腦癌、胸腺癌、胃腸道腫瘤等。所述 組合物可以通過常規(guī)給藥途徑給予受試者。所述的給藥途徑例如經(jīng)胃 腸外給藥，例如經(jīng)靜脈、經(jīng)輸注、口服等。
在另一優(yōu)選的方面中，本發(fā)明涉及用DERLIN-1蛋白結(jié)合配體進 行腫瘤診斷。將包含DERLIN-1蛋白結(jié)合配體的藥物導入人體后，由 于DERLIN-1蛋白特異的高表達于腫瘤細胞膜，因此藥物能與腫瘤細 胞結(jié)合而不與正常細胞結(jié)合，因此通過分析藥物在體內(nèi)的滯留部位即
可知道腫瘤的分布，大小等信息，即分子顯影。在一個實施方案中， 將DERLIN-1蛋白單克隆抗體標記1251后能夠短時間內(nèi)清楚的顯示實 驗動物體內(nèi)的腫瘤影像。
本發(fā)明通過下述實施例進一步闡明，但任何實施例或其組合不應 當理解為對本發(fā)明的范圍或?qū)嵤┓绞降南薅?。本發(fā)明的范圍由所附權(quán) 利要求書限定，結(jié)合本說明書和本領域一般常識，本領域普通技術人 員可以清楚地明白權(quán)利要求書所限定的范圍。
實施例
實施例1:新的人腫瘤抗原DERLIN-1的制備
按照現(xiàn)有技術(分子克隆第三版)，克隆DERLIN-1基因的cDNA 編碼序列，并將其構(gòu)建在表達載體PET-30b(購自Novagen公司)上， 在BL21E3細菌(購自北京全事金生物技術有限公司)中表達 DERLIN-1蛋白。
表達得到的DERLIN-1蛋白氨基酸序列如下(SEQIDNO: 1) H2N-MSDIGD曹RSIPAITRYWFAATVAVPLVGKLGLISPAYLFL
9AQLNRDMIVSFWFGTRFKACYLPWVILGFNYIIGGSVINELIGNLV
ASMRRAADQNGGGGRHNWGQGFRLGDQ -COOH 實施例2 DERLIN-1蛋白多克隆抗體的制備
采用實施例1中表達的DERLIN-1蛋白免疫家兔(新西蘭兔，購 置維通利華公司)制備抗DERLIN-1蛋白多克隆抗體。具體步驟如下 免疫前自兔耳緣靜脈取血備檢。第一次免疫DERLIN-1蛋白與弗氏 完全佐劑按1:1的比例充分混勻后經(jīng)皮內(nèi)注射免疫家兔，每只注射 200ng DERLIN-1蛋白的KLH偶聯(lián)物。第二次免疫第一次免疫后 14天，取200pgDERLIN-1蛋白與弗氏不完全佐劑充分混勻后再次經(jīng) 皮內(nèi)注射免疫家兔。注射卡介苗第二次免疫后5天，按每只兔子 50mg卡介苗(購自北京市生物制品研究所)的劑量經(jīng)趾皮下多點注 射免疫家兔，以進一步激活家兔免疫系統(tǒng)。第三次免疫自注射卡介 苗之日算起10天后，按每只兔子200pg DERLIN-1蛋白的劑量與弗 氏不完全佐劑充分混勻后皮內(nèi)注射免疫家兔。效價測定第三次免疫 后10天自兔耳緣靜脈取血，以測定免疫血清的抗體滴度。當免疫血 清中目標抗體的滴度達到108以上時，自兔頸動脈取血，并置于直徑 為180mm的干凈平皿中，4。C過夜。次日，離心分離血清.用偶聯(lián)有 DERLIN-1蛋白的親和層析柱(參照美國安瑪西亞公司產(chǎn)品 CNBr-activated S印harose 4B使用說明書制備)純化了得到的免疫 兔血清，從中分離出只與DERLIN-1蛋白結(jié)合的抗體。所得的多克隆 抗體為純化的多克隆抗體，用于以下的實驗中。
實施例3 DERLIN-1蛋白在多種腫瘤組織中表達的檢測
1.免疫組化法
10石蠟包埋的腫瘤組織(腫瘤組織標本采集于中國醫(yī)學科學院腫瘤 醫(yī)院)進行常規(guī)石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化。3%過氧
化氫室溫10min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。切片在枸櫞酸緩沖 液(0.01M， pH6.0)中用微波加熱法進行抗原修復。用10%正常山 羊血清(購自北京中杉金橋生物技術有限公司)室溫封閉30min。棄 封閉液，加入lpg/ml的抗DERLIN-l蛋白多克隆抗體，4°C孵育過 夜。然后用PBS洗3遍，每遍5min。加入適當濃度生物素標記的羊 抗兔二抗室溫孵育30min。然后PBS洗3遍，每遍5min，加入HRP 標記的鏈霉卵白素(購自北京中杉金橋生物技術有限公司)，室溫孵 育30min。 DAB染色，蘇木素復染，封片。設正常兔IgG為陰性對 照。顯微鏡下觀察結(jié)果。在胰腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、食管癌、 前列腺癌中，DERLIN-1蛋白的表達明顯高于對應的正常組織，且可 見一定程度的細胞膜表達，而在正常組織中弱表達的DERLIN-1不在 正常細胞的細胞膜表達(圖2)。另外通過免疫組化還發(fā)現(xiàn)在肺癌中 DERLIN-1表達明顯高于對應正常組織，且也見DERLIN-1蛋白表達 于腫瘤細胞膜(圖2)。
2.活細胞免疫熒光和激光共聚焦檢測法
應用實施例2中制備的DERLIN-1蛋白多克隆抗體檢測了 DERLIN-1基因在正常細胞和腫瘤細胞中的表達的亞細胞定位。用活 細胞免疫熒光和激光共聚焦研究了 DERLIN-1蛋白在細胞膜的表達 情況。通過上述實驗，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，DERLIN-1蛋白在卵巢癌細胞、 乳腺癌細胞、結(jié)腸癌細胞系、胰腺癌細胞、肺癌細胞的細胞膜上表達， 不在永生化細胞的細胞膜上表達。
通過活細胞免疫熒光法檢測
細胞在存活時具有完整的細胞膜，抗體大分子不能直接透過細 胞膜而進入到細胞中，而僅能與位于細胞膜外膜面的蛋白分子的表位
ii反應，而用于對照的抗a -微管蛋白抗體不能與活細胞膜呈陽性反應， 僅當細胞不完整時抗a -微管蛋白抗體能進入細胞與細胞內(nèi)的a -微 管蛋白反應。因此以抗ci -微管蛋白抗體為陰性對照可反映細胞膜的 完整性，而抗DERLIN-1蛋白抗體的活細胞免疫熒光研究陽性結(jié)果則 顯示DERLIN-1蛋白位于細胞外膜面。具體的活細胞免疫熒光實驗步 驟如下
將腫瘤細胞(人胰腺癌細胞Suitn，購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī) 學研究所)接種于培養(yǎng)皿，培養(yǎng)至70%滿。將腫瘤細胞輕輕從培養(yǎng)皿 中刮下，細胞用PBS洗滌一次，再用含10%馬血清(購自北京中杉 金橋生物技術有限公司)的PBS室溫封閉，之后加入實施例2制備 的抗DERLIN-1蛋白兔多抗(liag/ml)和鼠抗a -微管蛋白抗體(sigma， 稀釋1:1000)室溫孵育lh，洗滌后加入Cy3標記的羊抗兔IgG (美 國Jackson免疫實驗公司)和Cy2標記的羊抗小鼠IgG (美國Jackson 免疫實驗公司)，室溫孵育30min， PBS洗滌，用含10嗎/mlDAPI (美 國SIGMA公司)和50%甘油的PBS覆蓋細胞，將細胞封閉于載波片 上，在熒光顯微鏡下觀察。
胰腺癌SuitII的活細胞免疫熒光為陽性表明DERLIN-1蛋白表達 于細胞外膜面(圖3)，而正常永生化細胞HEK293活細胞免疫熒光 為陰性，表明DERLIN-1蛋白不表達于細胞外膜面(圖4)。
通過激光共聚焦法檢測DERLIN-1蛋白在腫瘤細胞膜表面的表
達
將上述的用活細胞免疫熒光檢測的細胞置于激光共聚焦顯微鏡下 進行觀察，通過激光共聚焦法檢測DERLIN-1蛋白在胰腺癌細胞膜表 面的表達。結(jié)果顯示免疫熒光在胰腺癌SuitII活細胞膜表面呈典型 的環(huán)狀膜表達，如圖5所示。另夕卜，在結(jié)腸癌細胞系HCT116， Lsl80， Swl16 (購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所)等細胞中也能觀察到 DERLIN-1蛋白表達于細胞外膜面(圖5)。實施例4 DERLIN-1基因在人多種正常組織中的表達譜
用實施例2中制備的純化的DERLIN-1蛋白多克隆抗體檢測了 DERLIN-1基因在多種人體正常組織中的表達情況。正常組織中， DERLIN-1在十二指腸、睪丸、肝中均有表達，表達陽性率分別為 75%、 60%、 63.2%(圖6)。其中多種組織中的表達情況總結(jié)如表1。 DERLIN-1雖然在這些正常組織中表達，表達強度明顯較腫瘤組弱， 且不見細胞膜表達。
表1DERLIN-1在人體各種正常組織中的表達_
iii 檢測例數(shù) 陽性例數(shù) 陽性率(％)
實施例5利用免疫熒光法檢測DERLIN-1蛋白細胞在多種人腫 瘤細胞和正常細胞的細胞膜和細胞漿中的表達譜
利用實施例2制備的抗體，通過活細胞免疫熒光和固定細胞免疫 熒光的辦法(胡海，冉宇靚，陳立釗，遇瓏，孫立新，楊治華采用抗
76621119
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9 7 2 2 2 3 2
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挹 腸 腺 結(jié)
j丸 腺 管宮 直腺列腸 巴膚 髓腺巢狀
十睪肝胰胃食子肺結(jié)乳前小脾腎淋皮腦骨胸卵里
13體庫技術篩選抑制肺癌的功能性抗體腫瘤防治研究200736(6):395-8)，我們研究了 DERLIN-1蛋白在多種人腫瘤細胞和正常細胞膜和細胞漿中的表達。
活細胞免疫熒光的方法參見實施例3，固定細胞免疫熒光的方法如下按4xl0V孔將如表2中所列的腫瘤細胞(購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所)接種入96孔細胞培養(yǎng)板(美國Axygen公司產(chǎn)品)培養(yǎng)。細胞匯合后以PBS洗三遍，用丙酮/甲醇(acetone/methanol)(l:l)室溫下固定10min。用3。/。過氧化氫(hydrogen peroxide)作用10min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，用10%正常馬血清(購自北京中杉金橋生物技術有限公司)作用10min以阻斷非特異結(jié)合位點。抗DERLIN-1蛋白多克隆抗體(l嗎/ml)與細胞在室溫下孵育lh，以PBS洗三遍。用5jiig/ml生物素標記的馬抗小鼠IgG (美國Jackson免疫實驗公司)(biotinylatedhorse anti-mouse IgG)作用30min后以以PBS洗三遍，用Cy3標記的Aviding (美國Jackson免疫實驗公司)(lpg/ml)作用30min， PBS洗三遍。加入含有10)ig/mlDAPI (美國SIGMA公司)的50。/。的甘油/PBS作用10min。
實驗結(jié)果總結(jié)在表2中。從表中我們可以發(fā)現(xiàn)，在正常的永生化細胞如HEK293中，DERUN-1蛋白僅表達于細胞漿， 一般不表達于細胞膜，而在腫瘤細胞中DERLIN-1蛋白在細胞膜有一定陽性比例的表達，其陽性率從100%到18%不等，在檢測的細胞中以卵巢癌細胞系SKOV3最高達98%，乳腺癌細胞系MDA-MB-453次之約90%，結(jié)腸癌細胞系LS180約70%，胰腺癌細胞SuitII約50%左右。
表2 DERLIN-1在各種細胞中的表達情況
細胞類型_細胞膜表達陽性率 細胞漿表達陽性率
SKOV3 (卵巢癌細胞) ++ 98 ++ 100
MDA-MB-453 (乳腺癌細胞)++ 卯 ++ 100
14LS180 (結(jié)腸癌細胞) ++ 70 +++ 100
Suit II (胰腺癌) ++ 50 +++ 100
ASPC1 (胰腺癌) ++ 32 +++ 100
PANC1 (胰腺癌) + 18 +++ 100
HEK293 _ 0 +++ 100
實施例6DERLIN-1蛋白在腫瘤病人血清中的表達
利用Western方法檢測10例結(jié)腸癌患者血清，每例結(jié)腸癌上樣約5pl，同時以結(jié)腸癌細胞Ls180 (中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所)中提取的蛋白上樣10pg作為陽性對照。結(jié)果，所有腫瘤病人血清中不能檢測到DERLIN-1蛋白的表達，而Lsl80細胞中能夠檢測到DERLIN-1的表達。由于Western檢測敏感性達納克級，因此可以推斷，結(jié)腸癌患者血清中DERLIN-1含量低于每毫升l嗎。采用同樣的方法，我們還檢測了肝癌、胰腺癌、胃癌、肺腺癌、肺鱗癌、食管癌、前列腺癌和乳癌患者血清中DERLIN-1蛋白的含量。通過上述實驗，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，DERLIN-1在肝癌、胰腺癌、胃癌、肺腺癌、肺鱗癌、食管癌、前列腺癌和乳癌患者血清中均不能被檢測到，推測其含量均低于每毫升l嗎。
實施例7 DERLIN-1蛋白的體內(nèi)分布實驗
己有研究表明人DERLIN-1蛋白與小鼠DERLIN-1蛋白具有98%的同一性并且DERLIN-1的C末端在物種間完全保守。如預期那樣，抗DERLIN-1蛋白抗體也識別小鼠DERLIN-1。因此，荷有人源腫瘤的小鼠可以看作人的同源基因模型，用來檢測DERLIN-1蛋白在體內(nèi)作為腫瘤治療靶點的能力。將1251-放射標記的實施例2制備的抗DERLIN-1蛋白多克隆兔抗體經(jīng)靜脈內(nèi)給藥于荷有LS-180人結(jié)腸癌細胞系移植瘤的裸鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)。給藥后第1， 3， 5和7天處死小鼠，用于分析注射的劑量每克的百分比
15(n/。ID/g)以及腫瘤:正常組織比(T/NT)。腫瘤中的。/。ID/g增加而所有正常器官和血液中的。/。ID/g隨時間降低。注射后7天，所有觀察到的器官中的。/。ID/g明顯低于腫瘤中的情況(圖7A)。 T/NT也指示體內(nèi)抗DERLIN-1蛋白多克隆兔抗體能夠特異性免疫靶向腫瘤，因為這些值在七天中持續(xù)增加(圖7B)。將正常兔IgG用1251-放射標記后作為對照用IgG于所述分析。所有觀察的器官中的MID/g包括腫瘤中的情況，隨時間減小。從未免疫過的新西蘭兔(購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司)血清中純化獲得對照IgG。將1251-放射標記的對照IgG的T/NT不隨時間增加；表明使用正常兔IgG不能特異的靶向腫瘤細胞。這些體內(nèi)研究表明DERLIN-1蛋白能夠作為腫瘤靶向治療的耙，耙向DERLIN-1蛋白的選擇性親和DERLIN-1蛋白的藥物如抗
體等能夠在活體內(nèi)特異地聚積于腫瘤局部。
實施例8 DERLIN-1蛋白單克隆抗體的制備
采用實施例1得到100嗎人腫瘤抗原蛋白DERLIN-1，混合完全弗氏佐劑皮下免疫BALB/C小鼠(5-6周齡的雌性BALB/c裸小鼠(nu/nu)，
購于維通利華生物公司，清潔飼養(yǎng)于中國協(xié)和醫(yī)科大學實驗動物研究所)，4周后采用50^ig抗原蛋白混合完全弗氏佐劑腹腔加強免疫，4周后再次采用50)ag抗原蛋白混合完全弗氏佐劑腹腔加強免疫，總共3次加強免疫。IO天后，利用間接ELISA法測定免疫血清抗體滴度，測定所述抗體的效價>1:106。處死動物，收集脾組織，使其通過100目的篩網(wǎng)分離為單細胞。采用50n/。的PEG促融合法將500萬脾細胞與100萬SP2/0細胞(購自ATCC)融合，融合后釆用HAT培養(yǎng)基對雜交瘤細胞進行篩選培養(yǎng)。培養(yǎng)1周后采用人腫瘤抗原蛋白DERLIN-1包被的ELISA進行篩選，對陽性克隆連續(xù)進行亞克隆，篩選穩(wěn)定分泌特異抗體的克隆，從而獲得了穩(wěn)定分泌抗DERLIN-1單克隆抗體的雜交瘤細胞克隆HEC252/9F12，其于2007年11月2日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo. 2242。實施例9:抗DERLINDERLIN-1蛋白單克隆抗體HEC252/9F12的衍生物的制備
核素-抗體偶聯(lián)物的制備
(1) 188Re標記的HEC252/9F12單抗
SnC12直接還原法(楊志，劉元方，王祥云，吳永慧，王東琪，范莉。^Re直接法標記抗人結(jié)腸癌單克隆抗體CL-3的研究。同位素2000年，第02期，13巻，83-87頁)標記抗DERLIN-1歪白單克隆抗體HEC252/9F12，立即通過快速薄層層析(ITLC)測定抗體的標記效率及放化純度。標記后，ITLC實驗表明^Re-抗體標記率為90%，放化純度大于95。/。。哪Re-抗體比活為356MBq/mg。ELISA測得188Re-抗體免疫活性為65%。標記抗體的體外穩(wěn)定性實驗表明，抗體在37。C孵育24小時，無論是在生理鹽水還是人血清白蛋白中，放射性脫落都小于5%，示其在體外穩(wěn)定。
(2) 1311標記的HEC252/9F12單抗
氯胺T法(Fraker， P丄，and Speck， J.C., Jr. 1978. Protein and cellmembrane iodinations with a sparingly soluble chloroamide，l,3,4，6-tetrachloro-3a， 6a-diphrenylglycoluril. Biochem Biophys ResCommun 80:849-857.)標記抗DERLIN-1蛋白單克隆抗體HEC252/9F12，立即快速薄層層析(ITLC)測定抗體的標記效率及放化純度。標記后，ITLC實驗表明mI-抗體標記率為90%，放化純度大于95%。 '"I-抗體比活為74MBq/mg， ELISA測得1311-抗體免疫活性67.3%。
納米磁性顆粒-HEC252/9F12單抗偶聯(lián)物的制備以純水將直徑約20-50nm的鐵氧化物磁性顆粒(中科院化學所提供)超聲分散，形成膠體狀。按0.2g納米磁性顆粒加入16mg抗DERLIN-1蛋白單克隆抗體HEC252/9F12的比例加入溶于純水的所
17述抗體，迅速攪拌混合，5min后加入終濃度為1。/。的BSA，離心并采用P/。的BSA洗滌后備用。
實施例10:采用HEC252/9F12抗體對腫瘤進行治療
取荷人結(jié)腸癌裸小鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)24只，測量并計算腫瘤體積后，按腫瘤體積隨機分為3組，每組8只。第一組為PBS對照組，每只腹腔注射200|il PBS;第二組為正常鼠IgG對照組，每只腹腔注射0.2mg正常小鼠IgG (購自北京中杉金橋生物技術有限公司)；第三組為HEC252/9F12單克隆抗體治療組，每只腹腔注射0.2mg HEC252/9F12單克隆抗體。每兩天給藥一次，治療后IO次后，處死動物，分離腫瘤，稱取腫瘤重量，計算抑瘤率，抑瘤率^對照組瘤重量一治療組瘤重量)/對照組瘤重量X 100%。顯著性檢驗釆用t檢驗。
結(jié)果PBS組瘤重1.62士0.81g，正常小鼠IgG對照組瘤重1.53 ±0.67g， HEC252/9F12單克隆抗體治療組瘤重0.84 ± 0.21g ，HEC252/9F12單克隆抗體的抑瘤率為45.1。/。， P值小于O.Ol。這些結(jié)果顯示HEC252/9F12單克隆抗體在免疫導向治療結(jié)腸癌中有重要的應用價值。
實施例11:抗DERLIN-1抗體治療腫瘤無明顯副作用攜帶LS180人結(jié)腸癌異種移植物的裸鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)用DERLIN-1靶向型抗體包括抗-DERLIN-l多克隆兔抗體和HEC252/9F12單克隆抗體進行治療。用抗-DERLIN-l多克隆兔抗體或HEC252/9F12治療后平均腫瘤體積明顯低于用正常兔抗體或PBS的對照中的情況(參照實施例10)。在完成上述治療后對器官，包括心、肺、腎、和腸進行病理學分析。在治療的小鼠的器官中沒有觀察到明顯的系統(tǒng)性副作用。治療組和對照組的平均小鼠體重，除了腫瘤體重以外，在治療結(jié)束時沒有明顯差異。
18實施例12:采用抗DERLIN-1相應抗體衍生物體內(nèi)導向治療腫
瘤
取荷人結(jié)腸癌裸小鼠24只，測量并計算腫瘤體積后，按腫瘤體積隨機分為3組，每組8只。第一組為PBS對照組，每只腹腔注射200pl PBS ;第二組為正常鼠IgG對照組，每只腹腔注射9.25MBq(200jil) 1311-正常鼠IgG (購自北京中杉金橋生物技術有限公司)；第三組為偶聯(lián)^I的HEC252/9F12單克隆抗體治療組，每只腹腔注射9.25MBq(200|il) 1311-抗體。治療后10天，處死動物，分離腫瘤，稱取腫瘤重量，計算抑瘤率，抑瘤率=(對照組瘤重量_治療組瘤重量)/對照組瘤重量X100n/。。顯著性檢驗采用t檢驗。
結(jié)果PBS組瘤重1.26士0.57g，鼠IgG對照組瘤重1.20士0.51g，標記抗體治療組瘤重0.32士0.13g，標記抗體的抑瘤率為73.3%, P值小于0.01。這些結(jié)果顯示HEC252/9F12單克隆抗體偶聯(lián)核素在免疫
導向治療結(jié)腸癌中有重要的應用價值。
實施例13利用DERLIN-1蛋白作為腫瘤靶標診斷腫瘤(分子顯影)
將1251-標記的抗DERLIN-1蛋白單克隆兔抗體經(jīng)由尾靜脈注入取荷人結(jié)腸癌裸鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)用于閃爍顯像。給藥后24， 72， 120和168小時記錄自動放射攝影(圖8)。生物分布顯像顯示腫瘤中的抗DERLIN-1蛋白單克隆兔抗體的累積增加，腫瘤被顯現(xiàn)出來。，-標記的抗DERLIN-l蛋白單克隆兔抗體的腫瘤耙向可通過過量10倍的未標記抗DERLIN-1蛋白單克隆兔抗體競爭來抑制，而不會受到正常兔IgG的抑制。
19序列表
〈110>中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院
〈120〉細胞膜蛋白DERLIN-1及其制備和用途
<130〉 I200701722CB
〈160〉 1
〈170> Patentln version 3.3
〈210〉<2U〉<212〉〈213〉
1
251PRT
Artificial
<400> 1
Met Ser Asp lie Gly Asp Trp Phe Arg Ser lie Pro1 5 10
Tyr Trp Phe Ala Ala Thr Val Ala Val Pro Leu Val20 25
Leu lie Ser Pro Ala Tyr Leu Phe Leu Trp Pro Glu35 40
Arg Phe Gin lie Trp Arg Pro lie Thr Ala Thr Phe50 55 60
Gly Pro Gly Thr Gly Phe Leu Tyr Leu Val Asn Leu65' 70 75
Gin Tvi" Ser Thr Ai'g Leu Glu Thr Gly Ala Phe Asp' 85 90
Asp Tvr Leu Phe Met Leu Leu Phe Asn Trp lie Cys100 105
Glv Leu Ala Met Asp Met Gin Leu Leu Met lie Pro115 120
Val Leu Tyr Val Ti-p Ala Gin Leu Asn Arg Asp Met130 135 140
Trp Phe Gly Thr Arg Phe Lvs Ala Cys Tvr Leu Pro145 150 155
Gly Phe Asn Tyr lie lie Gly Glv Ser Val lie Asn165 170
Asn Leu Val Gly His Leu Tvr Phe Phe Leu Met Phe180 185
Ala lie Thr Arg15
Gly Lys Leu Gly30
Ala Plie Leu Tyr45
Tyr Phe Pro Val
Tyr Phe Leu Tyr80
Gly Arg Pro Al395
lie Val lie Thr110
Leu lie Met Ser125
lie Val Ser Phe
Trp Val lie Leu160
Glu Leu lie Gly175
Arg Tyr Pro Met190
Asp Leu Gly Gly Arg Asn Phe Leu Ser Thr Pro Gin Phe Leu Tyr Arg195 200 205
Trp Leu Pro Ser Arg Arg Gly Gly Val Ser Gly Phe Gly Val Pro Pro21021^ 220
Ala Ser Met Arg Arg Ala Ala Asp Gin Asn Gly Gly Gly Gly Arg His225230 235 240
Asn Trp Glv Gin Gly Phe Arg Leu Gly Asp Gin245 250
20
權(quán)利要求
1. 如SEQ ID NO1所示的細胞膜蛋白形式的DERLIN-1蛋白。
2. 包含權(quán)利要求1所述的DERLIN-1蛋白的編碼基因的載體。
3. 包含權(quán)利要求3所述的載體的宿主細胞，優(yōu)選所述宿主細胞 可為真核或原核細胞。
4. 權(quán)利要求1中所述DERLIN-1蛋白的制備方法，其通過使權(quán) 利要求3所述的宿主細胞表達而獲得。
5. 細胞膜蛋白形式的DERLIN-1蛋白在篩選抗腫瘤藥物中的用 途，優(yōu)選其中所述DERLIN-1蛋白如SEQ ID NO:l所示，并且優(yōu)選 其中所述的抗腫瘤藥物是DERLIN-1蛋白結(jié)合配體，例如抗 DERLIN-1蛋白的單克隆抗體。
6. 權(quán)利要求5的用途，其中所述的腫瘤是表達細胞膜形式的 DERLIN-1蛋白的腫瘤，優(yōu)選為胰腺癌或結(jié)腸癌。
7. 保藏號為CGMCC No. 2242的雜交瘤細胞，其產(chǎn)生抗 DERLIN-1蛋白的單克隆抗體。
8. 用于治療對象中的腫瘤的藥物組合物，其包含DERLIN-1蛋 白結(jié)合配體，例如抗DERLIN-1蛋白的單克隆抗體，并任選包含適宜 的載體或賦形劑。
9. 權(quán)利要求8的藥物組合物，其可為與其他抗腫瘤藥劑的組合的 形式，其中所述DERLIN-1蛋白結(jié)合配體是抗DERLIN-1蛋白的單克 隆抗體，其他抗腫瘤藥劑為放射性核素。
10. 權(quán)利要求9的藥物組合物，其中所述對象是哺乳動物，優(yōu)選 是人。
11. 權(quán)利要求9的藥物組合物，其中所述的腫瘤是表達細胞膜形 式的DERLIN-1蛋白的腫瘤，優(yōu)選為胰腺癌或結(jié)腸癌。
12. DERLIN-1蛋白結(jié)合配體例如抗DERLIN-1蛋白的單克隆抗體在制備用于治療對象中的腫瘤的藥物組合物中的用途.
13. 權(quán)利要求12的用途，其中所述的腫瘤是表達細胞膜形式的 DERLIN-1蛋白的腫瘤，優(yōu)選為胰腺癌或結(jié)腸癌。
14. 權(quán)利要求12的用途，其中所述對象是哺乳動物，優(yōu)選是人。
15. 用于診斷對象中的腫瘤的診斷劑，其包含DERLIN-1蛋白結(jié) 合配體例如抗DERLIN-1蛋白的單克隆抗體，優(yōu)選所述DERLIN-1蛋 白結(jié)合配體用放射性同位素例如1251標記。
16. DERLIN-1蛋白結(jié)合配體例如抗DERLIN-1蛋白的單克隆抗 體在制備用于診斷對象中的腫瘤的診斷劑中的用途，其中所述 DERLIN-1蛋白結(jié)合配體優(yōu)選用放射性同位素例如1251標記。
17. 權(quán)利要求16的用途，其中所述的腫瘤是表達細胞膜形式的 DERLIN-1蛋白的腫瘤，優(yōu)選為胰腺癌或結(jié)腸癌。
18. 權(quán)利要求16的用途，其中所述對象是哺乳動物，優(yōu)選是人。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的人腫瘤抗原細胞膜蛋白DERLIN-1以及其在篩選和/或制備用于治療和/或診斷腫瘤的藥物中的用途。其中，DERLIN-1蛋白作為新的腫瘤治療靶蛋白，其特征在于其作為腫瘤診斷和/或治療中的靶蛋白的高效性以及特異性。
文檔編號C07K14/705GK101469019SQ20071016019
公開日2009年7月1日 申請日期2007年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月26日
發(fā)明者冉宇靚, 楊治華, 海 胡 申請人:中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院