專利名稱：：Cripto阻斷抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明廣義上涉及遺傳學、細胞及分子生物學領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及能結(jié)合和調(diào)控Cripto信號傳導(dǎo)的抗體，含有該抗體的試劑盒以及該抗體的^f吏用方法。背景4支術(shù)Cripto是在對人胚癌文庫進行cDNA篩選時偶然分離到的一種188氨基酸殘基的細胞表面蛋白質(zhì)(Ciccodicola等，1989,EMBOJ.,vol.8，no.7,pp.1987-1991)。Cripto蛋白具有至少兩個明顯的結(jié)構(gòu)域一個富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域和一個最初被認為與表皮生長因子(EGF)家族中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)域近似的結(jié)構(gòu)域。Cripto最初被歸類為EGF家族的一個成員(Ciccodicola等，上述)；但是，隨后的分析表明Cripto不能與任一已知的EGF受體結(jié)合，其EGF-樣結(jié)構(gòu)域?qū)嶋H上是從EGF家族分化而來(Bianco等，1999，J.Biol.Chem.,274:8624-8629)。盡管進行了持續(xù)的研究，Cripto信號傳導(dǎo)途徑仍然讓人琢磨不透，出現(xiàn)了支持下列幾種不同激活途徑的文獻，包括MAP激酶途徑(DeSantis等,1997,CellGrowthDiffer"8:1257-1266;Kannan等，1997,J.Biol.Chem.,272:3330-3335)、TGF-卩途徑(Gritsman等，1999,Development,127:921-932;Schier等，2000，Nature,403:385-389)、與Wnt途徑間可能的相互作用(Salomon等，EndocrRelatCancer.2000Dec;7(4):199-226;以及與EGF途徑的信息交換(Bianco等，1999,J.Biol.Chem.，274:8624-8629)。美國專利5,256，643及與其相關(guān)的兩個分案申請(美國專利5,654,140和5，792，616)公開了人Cripto基因、Cripto蛋白及抗Cripto抗體。美國專利5,264,557及與其相關(guān)的三個分案申請(美國專利5,620,866,5,650,285,和5，854,399)公開了人Cripto-相關(guān)基因及蛋白。另外還公開了能結(jié)合Cripto-相關(guān)蛋白但不能通過與Cripto蛋白本身結(jié)合而發(fā)生交叉反應(yīng)的抗體。用抗cripto短肽的兔多克隆抗體進行免疫染色表明Cripto蛋白的過表達與多種肺瘤類型(包括但不限于乳腺、睪丸、結(jié)腸、肺、卵巢、膀胱、子宮、子宮頸、胰腺以及胃)相關(guān)。Panico等1996，Int.J.Cancer,65:51-56;Byrne等，1998，JPathology,185:108-111;DeAngelis等，1999，IntJOncology,14:437_440。因此，本領(lǐng)域需要有辦法來控制、限制和/或阻止這類過表達，調(diào)控Cripto信號傳導(dǎo)，以及調(diào)控Cripto的表達結(jié)果(即，促進和/或保持細胞轉(zhuǎn)化)。發(fā)明概述本發(fā)明提供了能特異性結(jié)合Cripto的新的抗體，以及制備和使用該抗體的方法。本發(fā)明還提供了能結(jié)合Cripto并能調(diào)控Cripto信號傳導(dǎo)或蛋白相互作用的抗體，例如，結(jié)合Cripto從而使與Cripto相互作用的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的信號被下調(diào)的抗體。本發(fā)明還提供了能結(jié)合Cripto并能阻斷Cripto和ALK4間相互作用的抗體。本發(fā)明還提供了能結(jié)合Cripto并能調(diào)控腫瘤生長的抗體。本發(fā)明還提供了能結(jié)合Cripto、調(diào)控Cripto信號傳導(dǎo)以及調(diào)控腫瘤生長的抗體。本發(fā)明還提供了能結(jié)合Cripto、阻斷Cripto和ALK4間相互作用以及調(diào)控腫瘤生長的抗體。本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明所述抗體能特異性地結(jié)合選自與下列抗體結(jié)合的表位的表位A6C12.11，A6F8.6(ATCC保藏號PTA-3318),A7H1.19,A8F1.30,A8G3.5(ATCC保藏號PTA-3317),A8H3.1(ATCC保藏號PTA-3315),A8H3.2,A19A10.30,A10B2.18(ATCC保藏號PTA-3311),A27F6.1(ATCC保藏號PTA-3310),A40G12.8(ATCC保藏號PTA-3316),A2D3.23,A7A10.29,A9G9.9,A15C12.10，A15E4.14,A17A2.16,A17C12.28，A17G12.1(ATCC保藏號PTA-3314),A17H6.1，A18B3.11(ATCC保藏號PTA-3312),A19E2.7,B3F6.17(ATCC保藏號PTA-3319),B6G7.10(ATCC保藏號PTA-3313),B11H8,4。本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明所述的抗體特異性地結(jié)合Cripto配體/受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的表位。Cripto可選自CR-1(SEQIDNO:1)或CR-3(SEQIDNO:2)。在一個更具體的實施方案中，與配體/受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中表位特異性結(jié)合的抗體包括例如A6C12.11，A6F8.6(ATCC保藏號PTA-3318)，A8G3.5(ATCC保藏號PTA-3317),A19A10.30,A8H3.1(ATCC保藏號PTA-3315),A27F6.1(ATCC保藏號PTA-3310),A40G12.8(ATCC保藏號PTA-3316),A17G12.1(ATCC保藏號PTA-3314),A18B3.11(ATCC保藏號PTA-3312)和B6G7.10(ATCC保藏號PTA-3313)。一個實施方案中，本發(fā)明所述抗體結(jié)合的表位在EGF-樣結(jié)構(gòu)域中。特異性結(jié)合EGF-樣結(jié)構(gòu)域中表位的抗體包括但不限于A40G12.8(ATCC保藏號PTA-3316),A8H3.1(ATCC保藏號PTA-3315),A27F6.1(ATCC保藏號PTA-3310),B6G7.10(ATCC保藏號PTA-3313),A17G12.1(ATCC保藏號PTA-3314)和A18B3.11(ATCC保藏號PTA-3312).另一個實施方案中，本發(fā)明所述抗體特異性結(jié)合的表位在富含cys的結(jié)構(gòu)域中。特異性結(jié)合富含cys的結(jié)構(gòu)域中表位的抗體包括包括但不限于A19A10.30,A8G3.5(ATCC保藏號PTA-3317),A6F8.6(ATCC保藏號PTA-3318)和A6C12.1L另一實施方案中，本發(fā)明所述抗體結(jié)合的表位位于跨越Cripto第46-62位氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)域內(nèi)。特異性結(jié)合跨越Cripto第46-62位氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)域內(nèi)表位的抗體包括但不限于A10B2.18(ATCC保藏號PTA-3311),B3F6.17(ATCC保藏號PTA-3319)和A17A2.16。本發(fā)明還涉及特異性結(jié)合Cripto且能調(diào)控Cripto信號傳導(dǎo)的抗體。特異性結(jié)合Cripto且能調(diào)控Cripto信號傳導(dǎo)的抗體，包括但不限于，A40G12.8(ATCC保藏號PTA-3316),A8H3.1(ATCC保藏號PTA-3315),A27F6.1(ATCC保藏號PTA-3310),和A6C12.11。一個實施方案中，特異性結(jié)合Cripto且能調(diào)控Cripto信號傳導(dǎo)的本發(fā)明所述抗體能夠結(jié)合Cripto的EGF-樣結(jié)構(gòu)域或富含cys的結(jié)構(gòu)域中的表位。本發(fā)明還涉及特異性結(jié)合Cripto且能阻斷Cripto和ALK4間相互作用的抗體。特異性結(jié)合Cripto且能阻斷Cripto和ALK4間相互作用的抗體，包括但不限于，A8G3.5(ATCC保藏號PTA-3317),A6F8.6(ATCC保藏號PTA-3318)和A6C12.11。在一個實施方案中，本發(fā)明所述的特異性結(jié)合Cripto且能阻斷Cripto和ALK4間相互作用的抗體能夠結(jié)合Cripto的EGF-樣結(jié)構(gòu)域或富含cys的結(jié)構(gòu)域中的表位。另一方面，本發(fā)明涉及能特異性結(jié)合Cripto且能調(diào)控腫瘤生長的抗體。特異性結(jié)合且能調(diào)控腫瘤生長的抗體，包括但不限于，A27F6.1(ATCC保藏號PTA-3310),B6G7.10(ATCC保藏號PTA-3313)和A8G3.5(ATCC保藏號PTA-3317)。一個實施方案中，本發(fā)明所述的能特異性結(jié)合Cripto且能調(diào)控腫瘤生長的抗體能夠結(jié)合Cripto的EGF-樣結(jié)構(gòu)域或富含cys的結(jié)構(gòu)域中的表位。另一方面，本發(fā)明涉及能特異性結(jié)合Cripto、能調(diào)控Cripto信號傳導(dǎo)且能調(diào)控腫瘤生長的抗體。能特異性結(jié)合Cripto、能調(diào)控Cripto信號傳導(dǎo)且能調(diào)控腫瘤生長的抗體，包括但不限于A27F6.1(ATCC保藏號PTA-3310)。一個實施方案中，本發(fā)明所述的能特異性結(jié)合Cripto、能調(diào)控Cripto信號傳導(dǎo)且能調(diào)控腫瘤生長的抗體能夠結(jié)合Cripto的EGF-樣結(jié)構(gòu)域或富含cys的結(jié)構(gòu)域中的表位。另一方面，本發(fā)明涉及能特異性結(jié)合Cripto、能阻斷Cripto和ALK4間相互作用且能調(diào)控腫瘤生長的抗體。能特異性結(jié)合Cripto、能阻斷Cripto和ALK4間相互作用且能調(diào)控腫瘤生長的抗體，包括但不限于A8G3.5(ATCC保藏號PTA-3317)。另一實施方案中，本發(fā)明提供了由選自下列的雜交瘤制備的抗體A6F8.6(ATCC保藏號PTA-3318),A8G3.5(ATCC保藏號PTA-3317),A8H3.1(ATCC保藏號PTA-3315),A10B2.18(ATCC保藏號PTA-3311),A27F6.1(ATCC保藏號PTA-3310),A40G12.8(ATCC保藏號PTA-3316),A17G12.1(ATCC保藏號PTA-3314),A18B3.11(ATCC保藏號PTA-3312),B3F6.17(ATCC保藏號PTA-3319),和B6G7.10(ATCC保藏號PTA-3313)。本發(fā)明所述抗體包括但不限于單克隆、多克隆、人源化、嵌合及人抗體。本發(fā)明還提供了一種用于向生長有表達Cripto的腫瘤的受試者施用的組合物，該組合物包含至少一種上述抗體。在一個更具體的實施方案中，所述受試者是人。所述組合物可包含一種可藥用賦形劑。上述抗體可偶聯(lián)于一化療藥物或者與一非偶聯(lián)的化療藥物聯(lián)合提供。本發(fā)明另一方面還涉及體外調(diào)控樣本中腫瘤細胞生長的方法，該方法包括向樣本中加入上述組合物的步驟。另外還涉及體內(nèi)調(diào)控受試者腫瘤細胞生長的方法，該方法包括向受試者施用有效量的上述組合物的步驟。在一個具體實施方案中，所述受試者是人。本發(fā)明的另一方面是治療過表達Cripto的腫瘤患者的方法，該方法包括向受試者施用有效量的上述組合物。用于施用的組合物可包括可藥用賦形劑、與化療藥物偶聯(lián)的抗體以及與非偶聯(lián)化療藥物聯(lián)合施用的抗體。具體而言，本發(fā)明所述的方法可用于調(diào)控胂瘤細胞生長和/或治療生長有腫瘤的受試者(即，人)，其中所述的腫瘤細胞選自乳腺、睪丸、結(jié)腸、肺、卵巢、膀胱、子宮、子宮頸、胰腺以及胃的腫瘤細胞。另一實施方案中，本發(fā)明涉及測定組織是否表達有Cripto的方法，該方法包括用上述任一抗體通過免疫測定對取自受試者的組織進行分析的步驟。另外還涉及測定細胞系是否過表達Cripto的方法，該方法包括用上述任一抗體通過免疫測定對細胞系進行分析。本發(fā)明涉及1.一種特異性結(jié)合Cripto配體/受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的表位的抗體；2.項1中的抗體，其中所述的Cripto選自SEQIDNO:1或2;3.項2中的抗體，其中所述的表位為EGF-樣結(jié)構(gòu)域；4.項2中的抗體，其中所述的表位為富含cys的結(jié)構(gòu)域;5.項2中的抗體，該抗體選自A6C12.11,A6F8.6,A7H1.19,A8F1.30，A8G3.5,A8H3.1,A8H3.2，A19A10.30,A10B2.18,A27F6.1,A40G12.8，A2D3.23,A7A10.29，A9G9.9,A15C12.10,A15E4.14,A17A2.16,A17C12.28,A17G12.1,A17H6.1,A18B3.11，A19E2.7，B3F6.17，和B6G7.10;6.項3中的抗體，該抗體選自A40G12.8,A8H3.1,A27F6.1，B6G7.10，A17G12.1和A18B3.11;7.項4中的抗體，該抗體選自A19A10.30,A8G3.5,A6F8.6和A6C12.11;8.—種抗體，它與Cripto第46-62位氨基酸殘基所示結(jié)構(gòu)域中的表位特異性結(jié)合；9.項8中的抗體，該抗體為A10B2.18和B3F6.17;10.—種與表位特異性結(jié)合的抗體，所述表位選自可被下列抗體結(jié)合的表位A6C12.11，A6F8.6，A7H1.19,A8F1.30,A8G3.5,A8H3.1,A8H3.2，A19A10.30,A10B2.18,A27F6.1,A40G12.8，A2D3.23,A7A10.29,A9G9.9,A15C12.10,A15E4.14，A17A2.16,A17C12.28,A17G12.1,A17H6.1,A18B3.11A19E2.7,B3F6.17，和B6G7.10;11.一種特異性結(jié)合Cripto且能調(diào)控Cripto信號傳導(dǎo)的抗體；12.項11中的抗體，該抗體可特異性結(jié)合Cripto的EGF-樣結(jié)構(gòu)域中的表位；13.項12中的抗體，該抗體選自A40G12.8,A8H3.1和A27F6.1;14.項11中的抗體，該抗體可特異性結(jié)合Cripto富含cys的結(jié)構(gòu)域中的表位；15.項14中的抗體，該抗體為A6C12.11;16.項11中的抗體，該抗體選自A40G12.8,A8H3.1,A27F6.1，和A6C12.11;17.—種特異性結(jié)合Cripto且能調(diào)控腫瘤生長的抗體；18.項17中的抗體，該抗體可特異性結(jié)合Cripto的EGF-樣結(jié)構(gòu)域中的表位；19.項17中的抗體，該抗體可特異性結(jié)合Cripto富含cys的結(jié)構(gòu)域中的表位；20.項17中的抗體，該抗體選自A27F6.1,A8G3.5和B6G7.10;21.—種能特異性結(jié)合Cripto、調(diào)控Cripto信號傳導(dǎo)且能調(diào)控腫瘤生長的抗體；22.項21中的抗體，該抗體可特異性結(jié)合Cripto的EGF-樣結(jié)構(gòu)域中的表位；23.項21中的抗體，該抗體可特異性結(jié)合Cripto富含cys的結(jié)構(gòu)域中的表位；24.項21中的抗體，該抗體為A27F6.1;25.—種由選自下列的雜交瘤制備的抗體A6F8.6(ATCC保藏號PTA-3318),A8G3.5(ATCC保藏號PTA-3317),A8H3.1(ATCC保藏號PTA-3315),A10B2.18(ATCC保藏號PTA-3311),A27F6.1(ATCC保藏號PTA-3310),A40G12.8(ATCC保藏號PTA-3316),A17G12.1(ATCC保藏號PTA-3314),A18B3.11(ATCC保藏號PTA-3312),B3F6.17(ATCC保藏號PTA-3319),和B6G7.10(ATCC保藏號PTA-3313);26.—種特異性結(jié)合Cripto且能阻斷Cripto和ALK4之間相互作用的抗體；27.項26中的抗體，該抗體可特異性結(jié)合Cripto的EGF-樣結(jié)構(gòu)域中的表位；28.項26中的抗體，該抗體可特異性結(jié)合Cripto富含cys的結(jié)構(gòu)域中的表位；29.項26中的抗體，該抗體選自A8G3.5,A6F8.6和A6C12.11;30.—種能特異性結(jié)合Cripto、阻斷Cripto和ALK4之間相互作用且能調(diào)控腫瘤生長的抗體；31.項30中的抗體，該抗體可特異性結(jié)合Cripto的EGF-樣結(jié)構(gòu)域中的表位；32.項30中的抗體，該抗體可特異性結(jié)合Cripto富含cys的結(jié)構(gòu)域中的表位；33.項30中的抗體，該抗體為A8G3.5;34.—種能內(nèi)化Cripto的Cripto抗體；35.項34中的抗體，其中所述抗體與化療藥物偶聯(lián)；36.項34中的抗體，該抗體選自A27F6.1和B3F6.17;37.—種用于向患有表達Cripto的腫瘤的受試者施用的組合物，該組合物包含至少一種根據(jù)項1-35中任一項所述的抗體；38.項37中的組合物，其中所述的受試者為人；39.項37中的組合物，還包括一種可藥用賦形劑；40.項37中的組合物，其中所述的抗體與一種化療藥物偶聯(lián)；41.項37中的組合物，還包括未偶聯(lián)的化療藥物；42.—種體外調(diào)控樣本中肺瘤細胞生長的方法，該方法包括向樣本中加入項37所述組合物的步驟；43.—種調(diào)控受試者體內(nèi)腫瘤細胞生長的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的項37所述組合物；44.項43中的方法，其中所述受試者為人；45.—種治療過表達Cripto的腫瘤患者的方法，該方法包括向所述受試者施用有效量的項37所述組合物；46.—種治療過表達Cripto的腫瘤患者的方法，該方法包括向所述受試者施用有效量的項39所述組合物；47.—種治療過表達Cripto的腫瘤患者的方法，該方法包括向所述受試者施用有效量的項40所述組合物；48.—種治療過表達Cripto的腫瘤患者的方法，該方法包括向所述受試者施用有效量的項41所述組合物；49.項42中的方法，其中所述的腫瘤細胞選自乳腺卵巢、膀胱、子宮、子宮頸、胰腺以及胃的腫瘤細胞；50.項43中的方法，其中所述的腫瘤細胞選自乳腺卵巢、膀胱、子宮、子宮頸、胰腺以及胃的腫瘤細胞；51.項44中的方法，其中所述的肺瘤細胞選自乳腺卵巢、膀胱、子宮、子宮頸、胰腺以及胃的腫瘤細胞；52.項45中的方法，其中所述的腫瘤細胞選自乳腺卵巢、膀胱、子宮、子宮頸、胰腺以及胃的腫瘤細胞；53.項46中的方法，其中所述的腫瘤細胞選自乳腺卵巢、膀胱、子宮、子宮頸、胰腺以及胃的腫瘤細胞；54.項47中的方法，其中所述的腫瘤細胞選自乳腺卵巢、膀胱、子宮、子宮頸、胰腺以及胃的腫瘤細胞；55.項48中的方法，其中所述的腫瘤細胞選自乳腺卵巢、膀胱、子宮、子宮頸、胰腺以及胃的腫瘤細胞；56.—種測定組織是否表達Cripto的方法，該方法包括使用項1-37中任一項所述抗體通過免疫測定對取自受試者的組織進行分析的步驟；57.—種測定細胞系是否表達Cripto的方法，該方法包括使用項1-37中任一項所述抗體通過免疫測定對該細胞系進行分析的步驟；58.項1中的抗體，其中所述抗體為單克隆抗體；59.項1中的抗體，其中所述抗體為人源化抗體；60.項1中的抗體，其中所述抗體為人抗體；61.—種治療受試者中與不良細胞增生相關(guān)的病癥的方法，該方法包括向所述受試者施用項37所述組合物。、睪丸、結(jié)腸、肺、、睪丸、結(jié)腸、肺、、睪丸、結(jié)腸、肺、、睪丸、結(jié)腸、肺、、睪丸、結(jié)腸、月爭、、睪丸、結(jié)腸、肺、、睪丸、結(jié)腸、肺、本發(fā)明的這些方面及其它方面，在本發(fā)明的詳述部分有更詳細地描述。圖1表示人睪丸癌細月包系NCCIT對抗-CFC阻斷CriptomAbA8G3.5的應(yīng)答。圖2表示人睪丸癌細胞系NCCIT對抗-EGF阻斷CriptomAbA27F6.1的應(yīng)答。圖3表示293/ALK4細胞結(jié)合CR-Fc的FACS的結(jié)果。發(fā)明詳述能特異性結(jié)合Cripto的抗體及其用于調(diào)控Cripto信號傳導(dǎo)或蛋白相互作用，以及/或者阻斷Cripto和ALK4間相互作用，以及/或者調(diào)控腫瘤細胞生長的用途已經(jīng)被公開。已經(jīng)被公開的可特異性結(jié)合Cripto的各類抗體，包括，例如，特異性結(jié)合天然Cripto蛋白或非天然Cripto的配體/受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中表位的抗體；結(jié)合EGF-樣結(jié)構(gòu)域、富含cys的結(jié)構(gòu)域、或來自含第46-150位氨基酸殘基的區(qū)域的肽(例如，約第3-20位氨基酸)；結(jié)合Cripto且能調(diào)控Cripto信號傳導(dǎo)的抗體；結(jié)合Cripto且能調(diào)控腫瘤細胞生長的抗體；結(jié)合Cripto、調(diào)控Cripto信號傳導(dǎo)、且能調(diào)控腫瘤細胞生長的抗體。用常規(guī)體外測定篩選這些抗體，選取可結(jié)合配體/受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、可調(diào)控Cripto信號傳導(dǎo)、且能調(diào)控腫瘤細胞生長的抗體。本發(fā)明所述方法可用于治療哺乳動物的惡性或良性腫瘤，其中腫瘤的生長速率(相對于正常組織來說為異常速率)至少部分取決于Cripto。異常生長速率是指超過了正常體內(nèi)穩(wěn)態(tài)所需速率和超過了相同來源的正常組織的生長速率的生長速率。定義本申請全文中進行了各種定義。其中多數(shù)詞匯均采用本領(lǐng)域技術(shù)人員賦予這些詞匯的含義。下文或本申請其它部分專門定義的詞匯其含義在本發(fā)明上下文中前后一致且一般與本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解相同。本發(fā)明中，"區(qū)域，，一詞是指生物分子一級結(jié)構(gòu)中的空間上鄰接的部分。就蛋白質(zhì)而言，區(qū)域由該蛋白氨基酸序列中的鄰接部分限定而成。本發(fā)明中，"結(jié)構(gòu)域，，一詞是指生物分子中對該分子的已知或待求證功能作出貢獻的結(jié)構(gòu)部分。結(jié)構(gòu)域可以與區(qū)i或或其部分互為延伸；也可以并入生包括，但不限于胞外結(jié)構(gòu)域(跨^越Cripto中約第、i-約第188位殘i:所:的Cripto包括Cripto、CR-l(SEQIDNO:1)和CR-3(SEQIDNO:2))和跨膜結(jié)構(gòu)域(跨越Cripto中約第169-約第188位殘基，所述的Cripto包括Cripto、CR-l(SEQIDNO:1)和CR-3(SEQIDNO:2))。Cripto蛋白的配體/受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域跨越例如Cripto中約第75-約第150位殘基，所述的Cripto包括Cripto,CR-1(SEQIDNO:1)和CR-3(SEQIDNO:2)，其中包含Cripto的EGF-樣結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域跨越例如Cripto中約第75-約第112位殘基，所述的Cripto包括Cripto，CR-1(SEQIDNO:1)和CR-3(SEQIDNO:2)，和Cripto的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域跨越例如Cripto中約第114-約第150位殘基，所述的Cripto包括Cripto,CR-1(SEQIDNO:1)和CR-3(SEQIDNO:2)。例如，經(jīng)鑒定本發(fā)明所述的多數(shù)單克隆抗體可結(jié)合所述的EGF-樣或富含cys的結(jié)構(gòu)域。其它單克隆抗體A10B2.18(ATCC保藏號PTA-3311),B3F6.17(ATCC保藏號PTA-3319)和A17A2.16經(jīng)鑒定可結(jié)合位于EGF-樣結(jié)構(gòu)域上游、2爭越第46-62位殘基的那個區(qū)域內(nèi)所形成的表位。參見下文實施例3。配體/受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的表位，無論是天然構(gòu)象Cripto蛋白還是非天然Cripto蛋白中形成的表位，抗體都可與其結(jié)合。本發(fā)明中，"抗體"一詞是指完整無缺的抗體和Fab，F(xiàn)ab，，F(xiàn)(ab)2，及其其它片段。完整無缺的抗體包括，但不限于，單克隆抗體如鼠單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、人抗體以及人源化抗體。各種形式的抗體都可以用標準重組DNA技術(shù)(WinterAndMilstein，Nature349:293-99,1991)來制備。例建成(起初源自非人哺乳動物的抗體，通過重組DNA技術(shù)將重鏈鉸鏈區(qū)及恒定區(qū)和/或輕鏈恒定區(qū)的全部或部分用人免疫球蛋白輕鏈或重鏈的相應(yīng)區(qū)域取代)(參見，例如，Cabilly等，美國專利4,816,567;Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.81:6851-55,1984)。當用于人的臨床治療時嵌合抗體可減弱動物抗體引發(fā)的免疫反應(yīng)。此外，重組"人源化，，抗體也可以合成。人源化抗體是最初起源于非人哺乳動物的抗體，用重組DNA技術(shù)將該抗體中并非抗原結(jié)合所需的部分或全部氨基酸用人免疫球蛋白輕鏈或重鏈相應(yīng)區(qū)域中的氨基酸取代。也就是說，它們是主要包含人免疫球蛋白序列但其中已經(jīng)插入了負責特異性抗原結(jié)合的區(qū)域的嵌合體(參見，例如，PCT專利申請WO94/04679)。用目的抗原免疫動物，分離獲得相應(yīng)的抗體，取出可變區(qū)序列中負責抗原結(jié)合的部分。然后，將動物來源的抗原結(jié)合區(qū)域克隆入已經(jīng)刪除了抗原結(jié)合區(qū)域的人抗體基至最小，因而幾乎不會引發(fā)不良(unwanted)免疫反應(yīng)。靈長類源化的抗體也可用類似方法制備。本發(fā)明的另一實施方案包括人抗體的用途，該抗體可用非人動物來制備，例如含有一種或多種人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物。所述動物可用作用于制備雜交瘤的脾細胞的來源，描述見美國專利5,569,825。抗體片段和單價抗體也可用于本發(fā)明所述的方法和組合物中。單價抗體包含與第二抗體重鏈Fc(或莖干)區(qū)結(jié)合的重鏈/輕鏈二聚體。"Fab區(qū)域"是指鏈中大體上等同于或類似于包含重鏈Y分枝部分和整個輕鏈的序列的那部分，已證實所述序列聯(lián)合(集合)在一起顯示抗體活性。Fab蛋白包括一重鏈和一輕鏈的集合體(通常稱為Fab')，以及相應(yīng)于抗體Y的兩個分枝節(jié)段的四聚體(通常稱為F(ab)2)，上述任一個體可以共價方式也可以非-共價方式集合在一起，只要所述集合能與特定抗原或抗原家族特異性反應(yīng)即可。本發(fā)明所述任一抗體都可任選與化療藥物偶if關(guān)在一起，描述見下文。本發(fā)明中，"結(jié)合"一詞意指在兩種蛋白或化合物或關(guān)聯(lián)蛋白或化合物或其組合之間的物理或化學相互作用，包括抗體與蛋白間的相互作用。結(jié)合包括離子鍵、非-離子鍵、氫鍵、范德華力、疏水相互作用等。物理相互作用，結(jié)合，可以是直接的也可以是間接的，間接結(jié)合是指借助或歸因于另一種蛋白或化合物的效力，直接結(jié)合是指，不借助或歸因于另一種蛋白或化合物的效應(yīng)、反而無需借助其它實體化學介質(zhì)而發(fā)生的相互作用。結(jié)合可通過多種不同方式檢測。檢測結(jié)合的方法已為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。本發(fā)明中，"能內(nèi)化Cripto的抗體"意指在將Cripto從細胞表面除去的同時進入細胞的抗體?？梢酝ㄟ^使用焚光標記的單克隆抗體篩選能內(nèi)化Cripto的Cripto抗體。為了測定哪種抗體內(nèi)化入Cripto陽性細胞，可以通過在熒光和/或共焦顯微鏡下觀察細胞來測定抗體熒光信號的細胞攝入量。那些實現(xiàn)了內(nèi)化的抗體會在細胞漿和/或細胞嚢泡中觀察到焚光信號。能內(nèi)化Cripto的Cripto抗體的非限制性實例包括A27F6.1和B3F6.17。本發(fā)明中，"化合物"一詞意指任一可鑒定的化合物或分子，包括但不限于離子、原子、小分子、肽、蛋白質(zhì)、糖、核苷酸或核酸，以及其它天然或合成的化合物。本發(fā)明中，"調(diào)控"或"修飾，，是指一種具體活性或蛋白質(zhì)在數(shù)量、質(zhì)量或效力上的增或減。本發(fā)明中，"調(diào)控Cripto信號"是指Cripto活性在數(shù)量、質(zhì)量或效力上的增或減約5%,優(yōu)選10%,較優(yōu)選20%,更優(yōu)選30%,更優(yōu)選40%,更優(yōu)選50%,更優(yōu)選60%,更優(yōu)選70%，更優(yōu)選80%,更優(yōu)選卯％，以及最優(yōu)選100%?；钚钥捎帽绢I(lǐng)域已知方法來測量，例如實施例3所述的無效細胞試驗(nullcellAssay)。另一實施方案中，類似地可通過結(jié)合本發(fā)明所述抗體調(diào)控Cripto和另一蛋白之間的蛋白相互作用。本發(fā)明中，"阻斷Cripto和ALK4間相互作用"是指將Cripto和ALK4之間的相互作用即結(jié)合增或減約5%,優(yōu)選10%,較優(yōu)選20%，更優(yōu)選30%,更優(yōu)選40%,更優(yōu)選50%，更優(yōu)選60%,更優(yōu)選70%，更優(yōu)選80%,更優(yōu)選90%，以及最優(yōu)選100%?；钚钥捎帽绢I(lǐng)域已知方法來測量，例如實施例8所述的結(jié)合試驗。本發(fā)明中，"體外調(diào)控腫瘤細胞生長，，是指體外使腫瘤細胞數(shù)目增或減約5%,優(yōu)選10%,較優(yōu)選20%,更優(yōu)選30%,更優(yōu)選40%，更優(yōu)選50%,更優(yōu)選60%,更優(yōu)選70%,更優(yōu)選80%,更優(yōu)選90%，以及最優(yōu)選100%。腫瘤細胞生長的體外調(diào)控可通過本領(lǐng)域已知方法來測定，例如實施例4所示的GEO細胞軟瓊脂試驗。本發(fā)明中，"體內(nèi)調(diào)控腫瘤細胞生長"是指體內(nèi)使腫瘤細胞數(shù)目增或減約5%,優(yōu)選10%,較優(yōu)選20%,更優(yōu)選30%,更優(yōu)選40%，更優(yōu)選50%,更優(yōu)選60%,更優(yōu)選70%,更優(yōu)選80%,更優(yōu)選90%,以及最優(yōu)選100%。腫瘤細胞生長的體內(nèi)調(diào)控可通過本領(lǐng)域已知方法來測定，例如實施例5所示的試驗。"預(yù)防"一詞是指降低生物體發(fā)生或發(fā)展異常狀況的可能性。"治療，，一詞是指產(chǎn)生治療效果并至少部分減輕或消除生物體的異常狀況。治療包括維持已受抑制的腫瘤細胞以及誘導(dǎo)消退。"治療效果，，是指抑制一種異常狀況。治療效果可一定程度減輕異常狀況的一種或多種癥狀。就異常狀況的治療而言，治療效果可指一種或多種下述情形(a)細胞增殖、生長和/或分化的增或減；(b)抑制(即，減慢或停止)或促進細胞死亡；(c)抑制退化；(d)—定程度地減輕所述異常狀況的一種或多種癥狀；以及(e)增強細胞群的功能。顯示針對異常狀況效力的化合物可按本申請所述方法鑒定。"施用"涉及將化合物引入生物體細胞或組織的方法。當生物體的細胞生物體外的細胞可維持或生長于細胞培養(yǎng)皿中，或另一生物體內(nèi)。就包含在生物體內(nèi)的細胞而言，多種本領(lǐng)域中現(xiàn)有的技術(shù)都可以施用化合物，包括(但不限于)口服、腸胃外、皮膚、注射以及氣霧劑方式應(yīng)用。就生物體外的細胞而言，多種本領(lǐng)域中現(xiàn)有的技術(shù)都可以施用化合物，包括(但不限于)細胞顯微注射技術(shù)、轉(zhuǎn)化技術(shù)以及載體技術(shù)。施用可通過本領(lǐng)域已知的多種方式完成，例如，口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)等。當用于體內(nèi)治療時，本發(fā)明所述抗體按有效量施用給受試者。本發(fā)明中使用的"有效量"是指足以實現(xiàn)有益或期望臨床結(jié)果的量(即，消除或減輕受試者腫瘤負擔的量)。有效量可以一次或多次施用。就本發(fā)明目的而言，本發(fā)明所述抗體的有效量是指足以改善、穩(wěn)定或延緩Cripto-相關(guān)疾病病情發(fā)展的量，具體為Cripto-相關(guān)肺瘤。這些效果指征的檢測及測量在下文討論。常規(guī)治療方案的實例包括將本發(fā)明所述抗體靜脈輸注給受試者，按每周一次的治療方案，劑量為2-5mg/kg?？贵w可以在門診的化學輸注室(chemoinfusionunit)施用，除非受試者要求入院。其它本領(lǐng)域已知的施用方案也在本發(fā)明涉及范圍之內(nèi)。異常狀況也可通過向一組在向生物傳遞信號的途徑中有異常的細胞施用本發(fā)明所述抗體來預(yù)防或治療。然后，監(jiān)測施用化合物對生物的功能的影響。所述生物優(yōu)選是人。"Cripto過表達，，是指組織中Cripto的表達量以統(tǒng)計學顯著量大大超過鄰近正常組織的Cripto表達。"化療藥物"是指本領(lǐng)域已鑒定的在抑制腫瘤生長、維持已受抑的腫瘤生長、和/或誘導(dǎo)消退方面具有治療作用的任一藥物，例如天然化合物、合成化合物、蛋白質(zhì)、經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)、以及放射性化合物。本發(fā)明涉及的化療藥物包括可與本發(fā)明所述抗體偶聯(lián)的藥物或者與本發(fā)明所述抗體聯(lián)用而不與該抗體偶聯(lián)的藥物?？膳c本發(fā)明抗體偶聯(lián)的范例性的化療藥物包括，但不限于放射偶聯(lián)物(90Y,1311，99mTc,lllln,186Rh,等)、腫瘤活化藥物前體(maytansinoids,CC-1065類似物，clicheamicin衍生物，蒽環(huán)類抗生素，長春花生物堿等)、蓖麻毒素、白喉毒素、假單胞菌外毒素?；熕幬锟梢耘c本發(fā)明所述抗體聯(lián)用，而不必與其偶聯(lián)(即，非偶聯(lián)化療藥物)，包括，但不限于粕(即，順柏)，蒽環(huán)類抗生素，核苷類似物(嘌呤和嗜咬)，taxanes,喜樹堿，夕卜足葉草毒素(epipodophyllotoxins),DNA烷基化試劑，葉酸拮抗劑、長春花生物堿、核糖核苷酸還原酶抑制劑、雌激素抑制劑、孕酮抑制劑、雄性激素抑制劑、芳香酶抑制劑、干擾素、白細胞介素、單克隆抗體、紫杉酚、伊立替康(camptosar)、阿霉素(dox)，5-FU和吉西他濱(gemcitabine)。所述化療藥物可在實施本發(fā)明時通過將抗體和非偶聯(lián)化療藥物共施用而與本發(fā)明所述抗體聯(lián)用。"可藥用的載體或賦形劑"是指本領(lǐng)域已知的、用于施用本發(fā)明所述抗體的生物學惰性化合物?？山邮艿妮d體為本領(lǐng)域熟知，例如，Remington'sPharmaceuticalSciences,Gennaro，ed.,MackPublishingCo.,1990中所記載的載體。可接受的載體可以包括生物可接受的、惰性地或生物可吸收的鹽類、緩沖試劑、寡-或多糖、聚合物、粘彈性化合物如透明質(zhì)酸、增粘劑、防腐劑，等。"受試者"是指脊推動物、具體為哺乳動物成員，包括但不限于家畜、竟3支動物(sportsAnimals)及靈長類動物，包4舌人。本發(fā)明的抗體本發(fā)明所述抗體可特異性結(jié)合Cripto:本發(fā)明中，Cripto包括CR-1Cripto蛋白、CR-3Cripto蛋白、及其片段。所述片段可以是完整的結(jié)構(gòu)域，例如胞外或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，EGF-樣結(jié)構(gòu)域，富含cys的結(jié)構(gòu)域，受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，等。所述片段還可包括Cripto蛋白任一結(jié)構(gòu)域中的鄰接及非鄰接的表位。CR-1的188個氨基酸的序列如下[SEQIDNO:l]:IWP卿PAIRPRSSQRVPPMGIQHSKELNRTCCLNGGTCMLGSFCACPPSGLVMDEHLVASRTPELPPSARTTTFMLVGICLSIQSYYCR-3的188個氨基酸的序列如下[SEQIDNO:2]:MDCRKMVRFSYSVIWIMAISKAFELGLVAGLGHQEFARPSRGDLAFRDDSIWP卿PAIRPRSSQRVLPMGIQHSKELNRTCCLNGGTCMLESFCACPPSFVMDEHLVASRTPELPPSARTTTFMLAGICLSIQSYY在一個實施方案中，本發(fā)明所述抗體可結(jié)合Cripto的EGF-樣結(jié)構(gòu)域中的表位。所述EGF-樣結(jié)構(gòu)域跨越成熟Cripto蛋白質(zhì)中約第75-112位氨基酸殘基。EGF-樣結(jié)構(gòu)域中的表位可包括氨基酸殘基的線性或非線性跨幅。所述線性表位的實例包括但不限于約第75-85,80-90,85-95,90-100，95-105,100-110，或105-112位殘基。在一個實施方案中，EGF結(jié)構(gòu)域中的表位是在天然構(gòu)象Cripto蛋白中形成的相對于非天然Cripto蛋白的表位。另一實施方案中，本發(fā)明所述抗體可結(jié)合Cripto富含cys的結(jié)構(gòu)域中的表位。所述富含cys的結(jié)構(gòu)域跨越成熟Cripto蛋白中的約第114位-約150位氨基酸殘基。富含cys的結(jié)構(gòu)域中的表位可以包含線性或非線性跨幅的氨基酸殘基。涉及的線性表位的實例包括但不限于約第114-125,120-130,125-135,130-140,135-145,或140-150位殘基。一個實施方案中，富含cys的結(jié)構(gòu)域中的表位為天然構(gòu)象Cripto蛋白相對于非天然Cripto蛋白其中形成的表位。一旦生成抗體，該抗體與Cripto的結(jié)合就可以使用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，例如ELISA來測定，而細胞表面上Cripto的存在可用流式細胞計量術(shù)(FACS)測定，如實施例2所示。也可以使用測量所述結(jié)合的任一其它技術(shù)。本發(fā)明提供了Cripto特異性抗體(例如，單克隆及多克隆抗體，單鏈抗體、嵌合抗體、雙功能/雙特異性抗體、人源化抗體、人抗體及互補決定區(qū)(CDR)-移植抗體，包括包含特異性識別本發(fā)明多肽的CDR序列的化合物)或其片段。本發(fā)明還提供了抗體片段，包括Fab,Fab',F(ab')2,和Fv。"特異性"和"選擇性"當用來描述本發(fā)明所述抗體的結(jié)合時，意味著本發(fā)明所述抗體的可變區(qū)能識別和結(jié)合Cripto。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明所述的特異性抗體還可與其它蛋白(例如，金黃色葡萄球菌OSUwew^)蛋白A或ELISA技術(shù)中的其它抗體)相互作用，該作用借助于該抗體可變區(qū)外側(cè)的序列，尤其該分子的恒定區(qū)中的序列的相互作用。用于測定本發(fā)明所述抗體(即，特異性結(jié)合表位配體/受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和跨越第46-62位氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)域的抗體)的結(jié)合特異性的試驗已為本領(lǐng)域熟知并且是常規(guī)實踐。所述試驗的詳細描述，參見Harlow爭(Eds.),AntibodiesALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratory;ColdSpringHarbor,NY(1988),第6章。能夠識別和結(jié)合Cripto蛋白片段的抗體也在本發(fā)明范圍之內(nèi)，只要該抗體對于Cripto多肽是特異性的。本發(fā)明所述的多肽可用本領(lǐng)域熟知的方法制備并常規(guī)使用。一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種特異性結(jié)合Cripto配體/受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中表位的抗體?？贵w的特異性在下文有更詳細地描述。但是，應(yīng)該強調(diào)的是，用現(xiàn)有技術(shù)描述的其它多肽制備的并且恰好能與Cripto交叉反應(yīng)(例如，由于這兩種多肽中恰好存在類似的表位)的抗體稱為"交叉-反應(yīng)"抗體。這類交叉-反應(yīng)抗體不是特異性針對Cripto的抗體。測定抗體是否特異性結(jié)合Cripto表位可以用本領(lǐng)域熟知的多種方法中的任一種，例如Western印跡試-險來進行。在鑒別表達Cripto的細胞以及調(diào)控Cripto配體/受體結(jié)合活性方面，特異性結(jié)合Cripto蛋白胞外結(jié)構(gòu)域(即，Cripto蛋白可見于細胞外側(cè)的部分)的抗體都是特別有用的。一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種包含多克隆抗體的無細胞組合物，其中所述抗體中的至少一種是本發(fā)明特異于Cripto的抗體。從動物分離的抗血清是組合物一個實例，另一實例是一種含有已重懸于水或其它稀釋劑、賦形劑或載體中的抗血清之抗體組分的組合物。另一實施方案中，本發(fā)明提供了單克隆抗體。單克隆抗體具有高度的特異性，針對單一的抗原位點。另外，與多克隆抗體通常包括針對不同表位的不同抗體不同，每一種單克隆抗體都只針對抗原上的單一決定簇。單克隆抗體可用于增強利用抗原-抗體結(jié)合的診斷及測定試驗的選擇性和特異性。單克隆抗體的另一種優(yōu)勢是他們可用雜交瘤培養(yǎng)物合成，不受其它免疫球蛋白的污染。制備這類抗體的雜交瘤也是本發(fā)明的一個方面。在另一個相關(guān)實施方案中，本發(fā)明提供了一種特異性針對Cripto特異性抗體的抗-獨特型抗體。抗-獨特型抗體的更詳細描述，參見，例如，美國專利6，063，379和5,780,029。已經(jīng)熟知的是，抗體含有可用化學方法或重組技術(shù)分離的、相對較小的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這類結(jié)構(gòu)域本身就是有用的Cripto結(jié)合分子，也可被重導(dǎo)入人抗體，或融合于化療藥物或多肽。因此，在另一實施方案中，本發(fā)明提供了一種含有Cripto-特異性抗體片段的多肽，其中所述片段及相關(guān)分子，無論是那個，都可結(jié)合Cripto。本發(fā)明提供了本身是單鏈抗體和CDR-移植抗體的多肽作為非限制性實例。關(guān)于CDR-移植抗體的更詳細討論，參見，例如，美國專利5,859,205。另一實施方案中，可以用本領(lǐng)域已知的任一方法將非-人抗體人源化。人源化后的抗體可用于體內(nèi)治療用途。另外，重組"人源化"抗體可以合成。人源化抗體最初源自非人哺乳動物，但已用重組DNA技術(shù)將并非抗原結(jié)合所必需的全部或部分氨基酸用人免疫球蛋白輕鏈或重鏈相應(yīng)區(qū)域的氨基酸取代。它們是主要包含人免疫球蛋白序列但其中已經(jīng)插入了負責特異性抗原結(jié)合的區(qū)域的嵌合體(參見，例如，PCT專利申請WO94/04679)。用目的抗原免疫動物，分離獲得相應(yīng)的抗體，取出可變區(qū)序列中負責特異性抗原結(jié)合的部分。然后，將動物來源的抗原結(jié)合區(qū)域克隆入已經(jīng)刪除了抗原結(jié)合區(qū)域的人抗體基因的合適位置。人源化抗體將用于治療人的抗體內(nèi)使用的異源(種間)序列減至最小，因而幾乎不會引發(fā)不良免疫反應(yīng)。類似地，可用靈長類動物(例如，恒河猴、狒狒和黑猩猩)抗體基因，制備靈長類源化的抗體。然后，可將其它變化導(dǎo)入抗體框架調(diào)節(jié)親和力和免疫原性。參A,辨如，美國專利5,585,089，5,693,761，5，693，762,和6,180,370。本發(fā)明的另一實施方案包括人抗體的用途，該抗體可用非人動物來制備，例如含有一種或多種人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物。所述動物可用作用于制備雜交瘤的脾細胞的來源，描述見美國專利5,569,825，WO00076310,WO00058499和WO00037504,在此引入作為參考。信號調(diào)控另一實施方案中，本發(fā)明的抗體可結(jié)合Cripto,并調(diào)控Cripto信號傳導(dǎo)或Cripto-蛋白相互作用。Cripto活性的過表達會導(dǎo)致去分化狀態(tài)，該狀態(tài)促進間質(zhì)細胞的特征化、加速增殖，及細胞遷移(Salomon等，BioEssays21:61-70,1999;Ciardiello等，Oncogene9:291-298，1994;Baldassarre等，Int.J,Cancer66:538-543,1996)，瘤形成中可見的與細胞轉(zhuǎn)化相關(guān)的表型。測試抗-Cripto抗體活性及其調(diào)控Cripto信號傳導(dǎo)能力的一種方法是使用F9-Cripto敲除(KO)細胞系(MinchiottiAtAl.,Mech.Dev.90:133-142，2000)。Cripto能刺激smad2磷酸化及非洲爪蟾胚胎中的轉(zhuǎn)錄因子FAST,轉(zhuǎn)錄因子FAST的活性可通過測量來自FAST調(diào)控單元-螢光素酶報道基因的螢光素酶活性來監(jiān)測(Saijoh等，Mol.Cell5:35-47,2000)。F9-CriptoKO細胞缺失了Cripto基因，因此Cripto和Cripto-依賴性信號傳導(dǎo)是無效的(MinchiottiAtAl.，Mech.Dev.90:133-142，2000)?？梢酝ㄟ^轉(zhuǎn)染Cripto,FAST,和FAST調(diào)控單元-螢光素酶基因構(gòu)建體而在F9CriptoKO細胞中測定Cripto信號傳導(dǎo)。在這些細胞系中未發(fā)現(xiàn)Cripto依賴性FAST螢光素酶活性，除非其中轉(zhuǎn)染入了CriptocDNA,和FASTcDNA。能阻斷Cripto-依賴性Nodal信號傳導(dǎo)的抗體是可阻斷Cripto信號傳導(dǎo)功能的抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用測量Cripto活性的其它試驗，例如，軟瓊脂生長試驗(參見下文實施例4)。細胞在軟瓊脂中的生長能力與細胞轉(zhuǎn)化相關(guān)，該試驗是測量肺瘤細胞生長抑制情況的一種典型的體外試驗。用于測定對活性的抑制情況的其它試驗包括塑料上進行的體外試驗，等。治療用途本發(fā)明的抗體還可用于治療目的，例如調(diào)控腫瘤細胞生長，為診斷目的而才企測或定量Cripto,以及純4匕Cripto。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了能特異性結(jié)合Cripto且能調(diào)控受試者體內(nèi)腫瘤細胞生長的抗體。一個實施方案中，所述腫瘤細胞是乳腺、睪丸、結(jié)腸、肺、卵巢、膀胱、子宮、子宮頸、胰腺以及胃的腫瘤細胞。另一實施方案中，提供了能特異性結(jié)合Cripto且能調(diào)控過表達Cripto的腫瘤細胞的生長的抗體。一個實施方案中，所述腫瘤細胞是過表達Cripto的細胞系，例如源自乳腺、睪丸、結(jié)腸、肺、卵巢、膀胱、子宮、子宮頸、胰腺以及胃的癌細胞系?？梢园凑毡绢I(lǐng)域技術(shù)人員用到的常規(guī)方法(如下文實施例4所示)篩選抗-Cripto抗體的體內(nèi)活性，以便將其作為潛在的抗癌藥物。這些方法的實例已由國立癌癥研究聲斤(NCI)在其'7wv/vocancermodelsscreening"protocols,NIHpublicationnumber84-2635(Feb1984)中作了概述。本發(fā)明的另一實施方案中，本發(fā)明所述抗體可用于治療患有癌性腫瘤的受試者。本發(fā)明所述抗體可與藥物學可接受的賦形劑聯(lián)合，以治療有效劑量施用給受試者。關(guān)于抑制腫瘤生長方法的討論參見，例如，美國專利6,165,464。另外，本發(fā)明還包括對患有與Cripto異常水平(即，升高或耗竭)相關(guān)的病癥的受試者進行治療的方法，其中該方法包括向受試者施用有效量的可特異性結(jié)合Cripto的配體/受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中表位的抗體，所述表位包括但不限于EGF-樣結(jié)構(gòu)域或富含cys的結(jié)構(gòu)域中的表位。另外，本發(fā)明還包括對患有與Cripto異常水平(即，升高或耗竭)相關(guān)的病癥的受試者進行治療的方法，其中該方法包括向受試者施用有效量的可特異性與Cripto形成復(fù)合體且針對具有下述特征的表位的抗體，即該表位是選自下列的抗體針對的表位A6C12.11,A6F8.6(ATCC保藏號PTA-3318),A7HU9，A8F1.30,A8G3.5(ATCC保藏號PTA-3317),A8H3.1(ATCC保藏號PTA-3315),A8H3.2,A19A10.30,A10B2.18(ATCC保藏號PTA-3311),A27F6.1(ATCC保藏號PTA-3310),A40G12.8(ATCC保藏號PTA-3316),A2D3.23，A7A10.29,A9G9.9,A15C12.10,A15E4.14，A17A2.16，A17C12.28,A17G12.1(ATCC保藏號PTA-3314),A17H6.1,A18B3.11(ATCC保藏號PTA-3312),A19E27,B3F6.17(ATC保藏號。PTA-3319)和B6G7.10(ATCC保藏，PTA:3313):實現(xiàn)，這就使得本領(lǐng)域技"員可銜則Cripto在多種樣本、培#4勿等中的特異^4在。用于本發(fā)明任一目的的含本發(fā)明所述抗體的試劑盒也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。通常，本發(fā)明所述試劑盒包括一種抗體免疫特異性針對的對照抗原。實施方案包括含有所有試劑及其使用說明書的試劑盒。材料保藏以下材料已由比奧根公司(Biogen,Inc.)保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(AmericanTypeCultureCollection,Manassas,VA20110-2209,USA):<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>本發(fā)明的其它特征可從下列說明性的實施例中清楚地看出。實施例實施例1:Cripto的表達和純化通過將編碼人Cripto1-169位氨基酸殘基(即SEQIDNO:1中第1-169位氨基酸)與人IgG,Fc結(jié)構(gòu)域(即，"CR(delC)-Fc，，)融合體的cDNA亞克隆入載體pEAG1100，得到名為pSGS480的表達質(zhì)粒。該載體的更詳細描述，參見于2000年9月18日提交的同時待審的序列號為No.60/233,148的美國專利申請。載體pEAG1100是GIBCO-BRLLifeTechnologies質(zhì)粒pCMV-Sport-betagal的衍生物，其在CHO瞬間轉(zhuǎn)染中的用途由Schifferli等，1999，F(xiàn)ocus21:16所述。它是將報道基因[3-半乳糖苷酶Notl片段從質(zhì)粒pCMV-Sport-Betagal(產(chǎn)品目錄號為10586-014)中除去而得到的，該過程如下用Notl和EcoRV消化該質(zhì)粒，凝膠純化出4.38kbNotl載體骨架片段并連接。將連接后的DNA轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5a。從分離的單個克隆中分離出含目的重組體的質(zhì)粒pEAG1100。pEAG1100的序列^爭越了啟動子、多聚接頭及轉(zhuǎn)錄終止信號，這一點得到證實。將質(zhì)粒pSGS480瞬間轉(zhuǎn)染入CHO細胞，將該細胞在28°C下培養(yǎng)7天。用Western印跡試驗測定這些細胞及條件培養(yǎng)基(conditionedmedium)中有無CR(delC)-Fc蛋白的存在。就Western印跡試驗而言，將取自Cripto轉(zhuǎn)染細胞的條件培養(yǎng)基和細胞在還原條件下4-20%梯度凝膠上進行SDS-PAGE電泳，電泳轉(zhuǎn)移到消化纖維膜上，用兔抗Cripto17-元(mer)肽(含SEQIDNO:1中第97-113位殘基)-匙孔血藍蛋白偶聯(lián)物的多克隆抗血清檢測Cripto融合蛋白。離心除去細胞后，Western印跡試驗表明CR(delC)-Fc蛋白有效地分泌到適應(yīng)后培養(yǎng)基(上清)中。將該上清加樣于蛋白A-Sepaharose(Pharmacia),用25mM磷酸鈉pH2.8,100mMNaCl洗脫結(jié)合蛋白。洗脫的蛋白質(zhì)用pH8.6的0.5M磷酸鈉中和，從240-340nm處的吸光度測量值推算出總蛋白濃度，然后進行SDS-PAGE純化。洗脫后的蛋白質(zhì)用0.2微米濾器過濾，存儲于-7(fC。實施例2:抗體的制備和篩選用洗脫得到的CR(delC)-Fc蛋白注射小鼠，用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體。A.抗體的制備具體而言，用完全弗氏佐劑(GibcoBRL#15721-012)乳化后的純化人CRdelC-Fc25嗎腹膜內(nèi)免疫雌性羅伯遜小鼠(JacksonLabs)。用不完全弗氏佐劑(GibcoBRL#15720-014)乳化后的純化人CRdelC-Fc25嗎腹膜內(nèi)方式加強免疫，并用蛋白微珠上的形式加強一次。最后一次加強免疫的3周后篩選血清，具有最佳滴度的小鼠在融合的3天前用50嗎可溶性CRdelC-Fc腹膜內(nèi)加強免疫。融合的前一天用50嗎CRdelC-Fc加強免疫小鼠。將小鼠脾細胞與FL653骨髓瘤細胞以1個脾細胞6個骨髓瘤細胞的比例融合，然后以100,000，33,000和11，000個細胞/孔加入裝有選擇培養(yǎng)基的96孔組織培養(yǎng)板。1周后用FACS和ELISA篩選出生長陽性的孔。進行兩次融合。B，抗體的篩選首先，用ELISA板篩選第一或第二次融合得到的上清對CriptodelC和/或Cripto的EGF-樣結(jié)構(gòu)域蛋白的識別。用對照融合蛋白(LT-卩受體-Fc)包被ELISA板，以丟棄識別人Fc表位的單克隆抗體。按照下面C部分的描述進行ELISA。第一次融合中，初步的上清也可以通過FACS來篩選其識別睪丸腫瘤細胞系NCCIT表面Cripto蛋白的能力。第二次融合中，也可以通過FACs測試上清識別NCCIT和乳腺癌細胞系DU4475這兩種腫瘤細胞系表面的Cripto的能力。次級篩選包括測試單克隆抗體上清識別一系列腫瘤細胞系的細胞表面Cripto的能力(結(jié)果參見表1和2),免疫組化試驗中單克隆抗體識別人乳腺和結(jié)腸腫瘤組織切片上的人Cripto的能力，單克隆抗體阻斷Cripto-Nodal信號傳導(dǎo)試驗的能力，阻斷塑料或軟瓊脂試驗中腫瘤細胞系生長的能力，內(nèi)化細胞表面Cripto的能力。C.ELISAELISA試-瞼操作如下械板Costar高結(jié)合力易清洗96孔平板(07-200-642)2，抗Pierce山羊抗-鼠IgG(H+L)-HRP(P131430)底物PierceTMB底物試劑盒(34021)終止)容液1NH2S04結(jié)合緩沖液0.1MNaHP04pH9.0封閉緩沖液PBS+10%DonorCalfSerum洗滌緩沖液PBS+0.1%tween-20將抗原CR-del-C-Fc及CR-EGF-fc、作為對照用的人IgGl融合蛋白用結(jié)合緩沖液稀釋至500ng/ml。每孔加入100pl，37。C下孵育l小時或4°C孵育過夜。倒去液體，倒扣平板，吸干。然后加入250(il/孔封閉緩沖液，然后在37。C下孵育30分鐘。重復(fù)一次，倒去液體，倒扣平板，吸干。上清用洗滌緩沖液作1:50稀釋，以50)!l/孔鋪板，然后室溫孵育1小時。用250^1/孔洗滌緩沖液劇烈洗板3次。然后向每孔中加入100^用洗滌緩沖液1:10,OOO稀釋后的2'抗體，然后室溫下孵育30分鐘。然后用250pl/孔洗滌緩沖液劇烈洗板3次，然后加入底物10(Vl/孔。顯色至充分變暗，然后加入終止緩沖液100pl/孔，然后讀取該板在450nm處的吸光度。D.流式細胞計量Cripto陽性細胞系可用于經(jīng)細胞表面染色及流式細胞計量術(shù)測定單克隆抗體與Cripto的結(jié)合，操作如下37°C下用2ml加有5mMEDTA的PBS作用10分鐘，將細胞從T162燒瓶上消化下來。用加有血清的培養(yǎng)基補至20ml,上下吹打幾次，分散細胞。1200rpm離心5分鐘。用5-10ml4°C的加有0.1%BSA的PBS(洗滌緩沖液)洗滌細胞。1200rpm離心5分鐘。以4xl06-107/ml濃度重懸于洗滌緩沖液。置于冰上。制備用于染色的抗體。用洗滌緩沖液將純化后的抗體稀釋至1-10嗎/ml。將50(il細胞加入96-孔LinbroV形底的平板(ICN7632105)。待分析細胞系的每一種對照都鋪一孔細胞，包括不加抗體，只加2?？贵w，雜交瘤培養(yǎng)物、陽性對照抗體上清，如果可以，或純化抗體，以及IgG亞類對照(如果使用純化后的抗體)的細胞。待分析細胞系的每一試驗樣本都鋪一孔細胞。將平板4°C下用臺式離心機，1200rpm旋轉(zhuǎn)5分鐘。反扣平板倒出緩沖液，搖動直至液體基本清除干凈。向孔中加入40-50(il抗體(或者向不加抗體或只加2°抗體的對照孔加入洗滌緩沖液)。4°C孵育至少30分鐘至1小時。旋轉(zhuǎn)平板，1200rpm5分鐘。倒掉抗體溶液。每孔加200pl洗滌緩沖液洗孔兩次，洗滌后離心。倒掉緩沖液。將R-PE標記的Fc特異性山羊抗-小鼠IgG(JacksonImmunoresearchLaboratoriesCat#115-116-071)(用洗滌緩沖液)l:200稀釋，每孔中的細胞用該稀釋液50pl重懸。暗室中4°C孵育20分鐘。向每孔細胞加150pl洗滌緩沖液。1200rpm旋轉(zhuǎn)平板5分鐘。每孔用200pl洗滌緩沖液洗滌1次。將細胞重懸于150pl含1%PFA的PBS。將每孔內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至單個管(5mlFalcon聚苯乙烯圓底管-352052)中。用錫紙將管包起來。然后用流式細胞計量儀讀取管中的內(nèi)容物。用該方法制備的單克隆抗體的兩次篩選的結(jié)果產(chǎn)生了下列結(jié)果，概述于下表1和2,其中第一列提供的是雜交瘤亞克隆的命名，接下來給出的是ELISA篩選的結(jié)果，其余列顯示的是4種cripto-陽性細胞系流式細胞計量測定的結(jié)果。結(jié)果以平均熒光指數(shù)(MFI)為單位。表1:抗-Cripto單克隆抗體特性<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>實施例3:用于測定Cripto信號傳導(dǎo)抑制情況的無效細胞(nullcell)試驗下面描述的是用于評估對Cripto信號傳導(dǎo)的抑制的F9Cripto無效細胞信號傳導(dǎo)試驗。#0夭，用0.1%明膠包被6孔板，2ml/孔，37。C下作用15分鐘。種才直細月包，每孔6xl05個F9CRIPTO無效細胞。,/乂轉(zhuǎn)染0.5pg(N2)7螢光素酶:0.5pg(N2)7螢光素酶:0.5pg(N2)7螢光素酶,0.5嗎(化)7螢光素酶，0.5^g(N2)7螢光素酶，0.5|iig(N2)7螢光素酶，0.5pgCripto，0.5FAST,和0.5(ag空載體0.5嗎Cripto,0.5FAST,和0.5嗎空載體0.5^gCripto,0.5FAST,和0.5(ig空載體0.5|igCripto，0.5FAST,和0.5^g空載體0.5(igCripto,0.5FAST,和0.5嗎空載體0.5嗎Cripto，0.5FAST,和0.5)ig空載體向下列每一試樣加入300piOptiMeml，得到每一試樣的溶液A:試樣1:0.5嗎(N2)7螢光素酶FAST報道cDNA力口1.5|iig空載體cDNA。試樣2:0.5嗎(N2)7螢光素酶，0.5嗎FAST,和1嗎空載體cDNAs。試樣3:0.5嗎(N2)7螢光素酶，0.5嗎CriptoADD0.5FAST,和0.5pg空載體cDNAs。試樣4:cDNAs。試樣5:cDNAs。試樣6:cDNAs。試樣7:cDNAs。試樣8:cDNAs。試樣9:cDNAs。溶液B含30pi脂轉(zhuǎn)染胺試劑(Lipofectamine)外加270piOptiMeml。對于每一試樣，將溶液A與溶液B混合在一起。室溫孵育45分鐘。用2ml/孔OptiMeml洗孔。吸出后馬上進行下一步驟。向每一溶液A+B的混合物加入2.4mlOptiMeml,混合，每孔加入1.5ml，雙份孔。37。C下孵育5小時。向接受了試樣1-3的孔每孔加入1.5mlDMEM+20%FCS，2mMGln，P/S。按下述要求加入抗-Cripto抗體試樣4的孔A27F6.1,10昭/ml;試樣5的孔A27F6.1，2嗎/ml;試樣6的孔A40G12.8;10(ig/ml，試樣7的孑L:A40G12.82嗎/ml;試樣8的孔A10B2.18，10(ig/ml;試樣9的孑L:A10B2.18，2嗎/ml.#2義除去培養(yǎng)基，用PBS洗孔，2ml/孔。向相同的孔內(nèi)加入DMEM+0.5%FCS,2mMGln,P/S(其中含有與前一天相同量的Cripto抗體)。顯示螢光素酶信號。用PBS+Ca2+和Mg2+，2ml/孔，洗孑L。使用LucLite試劑盒，Packardcat#6016911。室溫加入緩沖液和底物。暗光。用10ml緩沖液重配底物。用PBS+Ca^和Mg2+作1:1稀釋。吸干孔。用連排移液槍向每孔中快速加入250|11稀釋后的底物。漩渦溶液，并轉(zhuǎn)移200pl至96孔白色、底部不透明的板，F(xiàn)alcon35-3296。使用Winglow用發(fā)光儀讀板，將數(shù)據(jù)提交到Excel。該試驗的結(jié)果概述于下表3。表3:Cripto信號傳導(dǎo)試驗用抗-Cripto單克隆抗體抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>實施例4:體外抑制腫瘤細胞生長的試驗Cripto信號傳導(dǎo)的抑制也可通過測量GEO細胞在軟瓊脂中的生長來測定。參見，例如，Ciardiello等，Oncogene.1994Jan;9(l):291-8;Ciardiello等，CancerRes.1991Feb1;51(3):1051-4。首先，熔化3%細菌培養(yǎng)用瓊脂。放置于42。C水浴中。然后，將3%細菌培養(yǎng)用瓊脂溶液與預(yù)熱的完全培養(yǎng)基混合得到0.6%細菌培養(yǎng)用瓊脂溶液，42°C保溫。向6cm平皿內(nèi)澆注4ml該溶液，冷卻至少30分鐘以形成底層瓊脂。胰蛋白酶消化GEO細胞，用完全培養(yǎng)基重懸至105個細胞/ml。向細胞懸液加入待分析抗體或?qū)φ?，?0嗎到1嗎滴定抗體。GEO細胞懸液與0.6%細菌培養(yǎng)用瓊脂等體積混合，在底層瓊脂表面覆蓋2ml。冷卻至少1小時。37°CTC02孵箱中孵育14天。計數(shù)不需顯微鏡就可見的集落。與陰性對照相比未出現(xiàn)的集落，表明測試抗體能夠體外抑制腫瘤細胞的生長。該試驗產(chǎn)生抗體A27F6.1和B6G7.10的結(jié)果，如表4所示，二者都顯示出削弱GEO細胞集落生長的能力。表4:軟瓊脂試驗中的生長結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>實施例5:體內(nèi)抑制腫瘤細胞生長的試驗為了測定肺瘤細胞生長被抑制的情況，將人肺瘤細胞系皮下植入無胸腺棵鼠(athymicnudemice)，觀察本發(fā)明所述抗體的作用效果，加或不加對腫瘤抑制有協(xié)同或輔助作用的化療。替代地，該試驗可以使用不同腫瘤細胞系，例如，GEO(—種良好分化的人結(jié)腸癌體外細胞系，獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC))，DU-4475(一種乳腺癌體外細胞系，獲自ATCC),NCCIT(—種睪丸腫瘤細胞系，獲自ATCC)，或其它本領(lǐng)域已知的細胞系。這類試驗的一個實例如下用耳朵打孔的方式單個標記動物。所述GEO細胞系體外或體內(nèi)傳代1-4代。將該GEO細胞在右側(cè)腹區(qū)域皮下植入動物。可使用下列組的動物組#治療小鼠#1.鹽水對照，0.2ml/小鼠，i.p.,每周三次(一,三，五)202.mAb,孑氐劑量，i.p.103.mAb,中劑量，i.p.104.mAb,高劑量，i.p.105.5-FU,30mg/kg/注射，腹膜內(nèi)，3Rx/wk(—,三,五)106.順柏，2mg/kg/注射，皮下，3Rx/wk(—,三,五)107.阿霉素，1.6mg/kg/注射，腹膜內(nèi)，:3Rx/wk(—,三,五)108.Irinotecan，10mg/kg/注射，腹膜內(nèi)，5Rx/wk(—-五)109.mAb，低劑量，i.p.+5-FU(中間劑量)1010.mAb,中劑量，i.p.+5-FU(中間劑量)1011.mAb,高劑量，i.p.+5-FU(中間劑量)1012.mAb,低劑量，i.p.+順鉑(中間劑量)1013.mAb，中劑量，i.p.+順鉑(中間劑量)1014.mAb,高劑量，i.p.+順鉑(中間劑量)1015.mAb,<氐劑量，i.p.+阿霉素(中間劑量)1016.mAb,中劑量,i.p.+阿霉素(中間劑量)1017.mAb,高劑量，i.p.+阿霉素(中間劑量)1018.mAb，<氐劑量，i.p.+Irinotecan(中間劑量)1019.mAb,中劑量,i.p.+Irinotecan(中間劑量)1020.mAb,高劑量，i.p.+Irinotecan(中間劑量)10第0天植入腫瘤，記錄動物的初始體重。第l天按照上述要求啟動治療。第5天開始測量腫瘤大小及體重，每周兩次直至試驗終止。測量初始體重、腫瘤大小及體重，宰殺時的組織學，以及對腫瘤的免疫組化分析，以此來分析Cripto表達、腫瘤生長、及對生長的抑制。實施例6:體內(nèi)種間胂瘤移植模型-阻斷富含cys的結(jié)構(gòu)域的抗-Cripto抗體為了評估NCCIT的應(yīng)答，將可結(jié)合Cripto富含cys的結(jié)構(gòu)域的抗體皮下植入人睪丸胂瘤細胞系。試驗方法如下。結(jié)果示于圖1。方法^才才泮+動物使用無胸腺雄性棵鼠。用耳朵打孔的方式逐個編號動物。腫瘤NCCIT,縱隔混合的生殖細胞，最初獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心的人睪丸癌體外細胞系。細胞系用不加抗生素的RPMI-1640/10%FBS體外傳代6代。在動物右側(cè)腹將5x106個細胞/0.2mlmatrigel皮下植入動^__組#__小鼠#1介質(zhì)對照，(25mM磷酸鈉，100mM氯化鈉，pH7.2)，200.2ml/小鼠,腹膜內(nèi)注射，Q14D治療從第-1天開始2.A8G3.5,1mg/kg/腹膜內(nèi)注射，Q14D10治療從第-1天開始3.A8G3.5,3mg/kg/腹膜內(nèi)注射，Q14D10治療從第-1天開始4.A8G3.5,10mg/kg/腹膜內(nèi)注射，Q14D10治療從第-1天開始5.順柏，2mg/kg/皮下注射，3x/wk(M，W，F(xiàn))共六次10治療從第1天開始測試方案第-l天將小鼠隨才幾分為對照和治療組。記錄動物初始體重。向抗體組施用第一次治療。制備計量溶液。治療對技術(shù)人員保密直至試驗結(jié)束。第0天植入肺瘤。在植入小鼠的胂瘤上澆注細菌培養(yǎng)物。第l天向陽性化療組施加第一次治療。第4天在matrigel上記錄初始腫瘤大小測量值作為腫瘤基線。繼續(xù)記錄小鼠的腫瘤大小及體重，每周2次。監(jiān)測每日研究，記錄動物的任何反常表現(xiàn)。終點初始體重胂瘤大小及體重測量值實施例7:體內(nèi)種間移植腫瘤才莫型-阻斷EGF-樣結(jié)構(gòu)域的抗-Cripto抗體為了評估NCCIT的應(yīng)答，將可結(jié)合Cripto的EGF-樣結(jié)構(gòu)域的抗體皮下植入人睪丸肺瘤細胞系。試驗方法如下。結(jié)果示于圖2。方法和材津+動物使用無胸腺雄性棵鼠。用耳朵打孔的方式逐個編號動物。腫瘤NCCIT,縱隔混合的生殖細胞，最初獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心的人睪丸癌體外細胞系。細胞系用不加抗生素的RPMI-1640/10%FBS體外傳代6代。在動物右側(cè)腹將5x106個細胞/0.2mlmatrigel皮下植入動^_組#_^_小鼠#1介質(zhì)對照，(25mM磷酸鈉，100mM氯化鈉，pH7.2),180.2ml/小鼠，腹膜內(nèi)注射，Q14D治療從第-1天開始2.A27F6.1，1mg/kg/腹膜內(nèi)注射，Q14D10治療始于第-1天，荷載劑量2.6mg/kg/小鼠3.A27F6.1，10mg/kg/腹膜內(nèi)注射，Q14D10治療從第-l天開始，荷載劑量21.2mg/kg/小鼠4.順柏，2mg/kg/皮下注射，3x/wk(M，W,F)共六次10治療從第1天開始測試方案第-1天將小鼠隨機分為對照和治療組。記錄動物初始體重。向抗體組施用第一次治療。制備計量溶液。治療對技術(shù)人員保密直至試驗結(jié)束。第0天植入腫瘤。在植入小鼠的腫瘤上澆注細菌培養(yǎng)物。采樣的24小時和48小時后，細菌培養(yǎng)物為污染物陰性。第1天向陽性化療組施加第一次治療。第4天在matrigel上記錄初始肺瘤大小測量值作為腫瘤基線。繼續(xù)記錄小鼠的腫瘤大小及體重，每周2次。監(jiān)測每日研究，記錄動物的任何反常表現(xiàn)。終點初始體重腫瘤大小及體重測量值實施例8:阻斷ALK4結(jié)合的Criptomabs為了評估Cripto-特異性單克隆抗體能否干擾Cripto結(jié)合活化素I型受體Alk4的能力，我們在流式細胞計量術(shù)中使用了穩(wěn)定表達Alk4的293細胞系。為了制備該細胞系，用表達C末端加了HA表位的Alk4的質(zhì)粒和表達藥物。票呤霉素的質(zhì)粒按10:1的比例共轉(zhuǎn)染293細胞。然后用嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染后的細胞直至集落形成。然后，挑取集落，擴增，然后用HA的western印跡試驗分析Alk4的表達。發(fā)現(xiàn)與對照用的未轉(zhuǎn)染293細胞相比，克隆21(293_Alk4-21)表達高水平的Alk4。為了用流式細胞計量術(shù)分析Cripto-Alk4結(jié)合，使用一種與人IgGFc部分(CrdelC-Fc)融合的可溶型Cripto(第1-169位氨基酸)。取約5jag/mlCrdelC-Fc或?qū)φ沼肍c蛋白，在總體積50^1的FACS緩沖液(PBS力口0.1%BSA)中與3xl05個293-Alk4-21細胞冰上孵育30分鐘。對于含有抗-Cripto抗體的試樣而言，力口纟aj胞前，5)ng/mlCrdelC-Fc與50pg/ml的每一種Cripto抗體(A10.B2.18,A40.G12.8,A27.F6.1，A8.H3.1,A19.A10.30,A6.F8.6，A8.G3.5,A6.C12.11)冰上預(yù)孵育。然后用FACS緩沖液洗滌細胞，通過用購自JacksonImmunologics的R-藻紅蛋白-偶聯(lián)的山羊抗-人IgG(Fc片段特異性)孵育細胞來檢測結(jié)合后的FC蛋白。然后再次洗滌樣本，用含1%多聚曱醛的PBS固定，用常規(guī)流式細胞計量方法分析。FACS的結(jié)果圖示于圖3。上述本發(fā)明的一些實施方案下文概述，包括但不限于下述實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，在不脫離本發(fā)明實質(zhì)的前題下可以對本發(fā)明的各種實施方案作出多種多樣的改動和修飾。無疑所有這些修改后的實施方案都落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。因此本申請中引述的每一出版物作為一個整體在此引入作為參考。序列表<110>比奧根艾迪克MA乂^司(BiogenIdeeMAInc.)米歇爾.薩尼科拉-內(nèi)德爾(Sanicola-Nadel,Michele)凱文'威廉斯(Williams,Kevin)蘇珊'希弗(Schiffer,Susan)保羅'雷霍恩(Rayhorn,Paul)<120>Cripto阻斷抗體及其用途<130>A117PCT<140>待定<141>2002-04-16<150>60/286,782<151>2001-04-26<150〉60/293,020<151>2001-05-17<150>60/301，091<151>2001-06-26<150〉60/367,002<151〉2002-03-22<160>2<170>FastSEQforWindowsVersion4.0<210>1<211>188<212>PRT<213>人(HomoSapien)<400〉1MetAspCysArgLysMet15MetAlalieSerLysVal20HisGinGluPheAlaArg35AspSerlieTrpProGin50GinArgValProProMet6570ThrCysCysLeuAsnGly85CysProProSerPheTyr100GluAsnCysGlySerValAlaPheProGlu55GlyGlyGlyPro人rgGluSer40GlulieThrArgHisPheSer10LeuGly25ArgGlyProAlaGinHisCysMet90AsnCys105AspThrTyrSerLeuValTyrLeulieArg60SerLys75LeuGlyGluHisTrpLeuVallieAlaGly30AlaPhe45ProArgGluLeuSerPheAspVal110ProLysTrp15LeuArgSerAsnCys95ArglyslieGlyAspSerArg80AlaLysCys115120125SerLeuCysLysCysTrpHisGlyGinLeuArgCysPheProGinAla130135140PheLeuProGlyCysAspGlyLeuValMetAspGluHisLeuValAla145150155160SerArgThrProGluLeuProProSerAlaArgThrThrThrPheMet165170175LeuValGlylieCysLeuSerlieGinSerTyrTyr180185<210>2<211>188<212〉PRT<213>人(HomoSapien)"00>2MetAspCysArgLysMetValArgPhe15MetAlalieSerLysAlaPheGluLeu2025HisGinGluPheAlaArgProSerArg3540AspSerlieTrpProGinGluGluPro5055GinArgValLeuProMetGlylieGin6570ThrCysCysLeuAsnGlyGlyThrCys85CysProProSerPheTyrGlyArgAsn100105GluAsnCysGlySerValProHisAsp115120SerLeuCysLysCysTrpHisGlyGin130135PheLeuProGlyCysAspGlyLeuVal145150SerArgThrProGluLeuProProSer165LeuAlaGlylieCysLeuSerlieGin180185SerTyrSerVallieTrplie1015GlyLeuValAlaGlyLeuGly30GlyAspLeuAlaPheArgAsp45AlalieArgProArgSerSer60HisSerLysGluLeuAsnArg7580MetLeuGluSerPheCysAla9095CysGluHisAspValArgLys110ThrTrpLeuProLysLysCys125LeuArgCysPheProGinAla140MetAspGluHisLeuValAU155160AiaArgThrThrThrPheMet170175SerTyrTyr權(quán)利要求1.一種特異性結(jié)合Cripto配體/受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的表位的抗體。2.權(quán)利要求l中的抗體，其中所述的Cripto選自SEQIDNO:1或2。3.權(quán)利要求2中的抗體，其中所述的表位為EGF-樣結(jié)構(gòu)域。4.權(quán)利要求2中的抗體，其中所述的表位為富含cys的結(jié)構(gòu)域。5.權(quán)利要求2中的抗體，該抗體選自A6C12.11，A6F8.6,A7H1.19,A8F1.30，A8G3.5,A8H3.1，A8H3.2，A19A10.30，A10B2.18,A27F6.1,A40G12.8，A2D3.23，A7A10.29，A9G9.9,A15C12.10，A15E4.14，A17A2.16,A17C12.28，A17G12.1，A17H6.1，A18B3.11,A19E2.7，B3F6.17,和B6G7.10。6.4又利要求3中的抗體，該抗體選自A40G12.8,A8H3.1，A27F6.1,B6G7.10，A17G12.1和A18B3.11。7.權(quán)利要求4中的抗體，該抗體選自A19A10.30,A8G3.5,A6F8.6和A6C12.11。8.—種抗體，它與Cripto第46-62位氨基酸殘基所示結(jié)構(gòu)域中的表位特異性結(jié)合。9.權(quán)利要求8中的抗體，該抗體為A10B2.18和B3F6.17。10.—種與表位特異性結(jié)合的抗體，所述表位選自可被下列抗體結(jié)合的表位A6C12.11，A6F8.6,A7H1.19，A8F1.30,A8G3.5，A8H3.1,A8H3.2,A19A10.30,A10B2.18,A27F6.1，A40G12.8,A2D3.23，A7A10.29,A9G9.9,A15C12.10,A15E4.14,A17A2.16，A17C12.28,A17G12.1,A17H6.1，A18B3.11,A19E2.7,B3F6.17,和B6G7.10。全文摘要本發(fā)明提供了Cripto阻斷抗體，或其生物功能片段。本發(fā)明提供了可結(jié)合Cripto且能調(diào)控Cripto信號傳導(dǎo)的抗體。本發(fā)明提供了可結(jié)合Cripto且能阻斷Cripto和ALK4間相互作用的抗體。本發(fā)明提供了可結(jié)合Cripto且能調(diào)控腫瘤生長的抗體。本發(fā)明提供了可結(jié)合Cripto，調(diào)控信號傳導(dǎo)，且能調(diào)控腫瘤生長的抗體。本發(fā)明提供了可結(jié)合Cripto，阻斷Cripto和ALK4間相互作用，且能調(diào)控腫瘤生長的抗體。本發(fā)明還提供了使用這些抗體進行治療、診斷和研究的方法。文檔編號C07K16/18GK101215332SQ20071016299公開日2008年7月9日申請日期2002年4月17日優(yōu)先權(quán)日2001年4月26日發(fā)明者保羅·雷霍恩,凱文·威廉斯,米歇爾·薩尼科拉-內(nèi)德爾,蘇珊·希弗申請人:比奧根艾迪克Ma公司