專利名稱：：用于抗腫瘤藥物抗葉酸劑及其鹽和中間體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種醫(yī)藥化工
技術(shù)領(lǐng)域：
的化合物，具體是一種用于抗腫瘤藥物抗葉酸劑及其鹽和中間體。
背景技術(shù)：
：還原型葉酸(FH4)是嘌呤類生物合成和脫氧尿苷酸(dUMP)轉(zhuǎn)化成胸苷酸(dTMP)過(guò)程中必需的一碳單位轉(zhuǎn)運(yùn)體。在這些生化反應(yīng)中，還原型葉酸被氧化，經(jīng)二氫葉酸還原酶(DHFR)再生為活性的還原型葉酸。甲氨蝶呤(MTX)和類似化合物是公知的強(qiáng)烈地結(jié)合DHFR的藥物，這些藥物能抑制二氫葉酸還原成四氫葉酸，導(dǎo)致dTMP和/或嘌呤類缺陷，DNA合成中斷，進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這些藥物已被研制成抗癌藥物，而且目前作為臨床藥物占據(jù)了很重要的位置。Pemetrexed(MTA)是新近研究開發(fā)的多靶點(diǎn)的抗葉酸藥物，通過(guò)抑制至少3種與葉酸代謝、嘌呤和嘧啶合成有關(guān)的酶包括DHFR，胸苷酸合酶(TS)，甘氨酰胺核苷酸甲酰轉(zhuǎn)移酶(GARFT)，對(duì)多種實(shí)體瘤有抗癌作用。Pemetrexed(MTA)于2004年4月獲得FDA批準(zhǔn)在美國(guó)上市，用于治療無(wú)法手術(shù)或不宜實(shí)行手術(shù)的胸膜間皮瘤患者。在5月1日的《腫瘤學(xué)臨床雜志》中公布的臨床試驗(yàn)結(jié)果表明和紫杉特爾(Taxotere，目前非小細(xì)胞肺癌標(biāo)準(zhǔn)二線藥物)相比，LY231514(培美曲塞)表現(xiàn)出相近的病人生存率效果，但是安全性更好，副作用更少。禮萊公司己經(jīng)向美國(guó)FDA提交LY231514作為非小細(xì)胞肺癌二線藥物的新藥申請(qǐng)，各國(guó)進(jìn)行臨床所針對(duì)的腫瘤包括乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、黑色素瘤、膀胱癌等多種實(shí)體腫瘤，所以其開發(fā)和應(yīng)用前景非常廣闊。TNP-351為一種新結(jié)構(gòu)類型的DHFR抑制劑，通?？谷~酸藥物中的蝶啶結(jié)構(gòu)被2，4-二氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶所代替，并在5-位引入了可塑性大的三亞甲基橋，以提供最有利的構(gòu)象，滿足抑制劑在靶酶空腔中與活性部位最大限度的氫鍵和疏水鍵相互作用。體外試驗(yàn)表明，該品抗KB人表皮樣瘤細(xì)胞和A549人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的作用比MTX強(qiáng)10倍以上；體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明TNP-351對(duì)MTX具有抗藥性的腫瘤細(xì)胞亦有很強(qiáng)的活性，目前正在日本進(jìn)行臨床。MTX主要通過(guò)葉酸拮抗作用抗癌，有較強(qiáng)的毒性，對(duì)實(shí)體瘤作用不大，還存在著腫瘤細(xì)胞對(duì)這種藥的抗藥性，因此不能獲得滿意的治療效果。因此特別期望開發(fā)出新的作用機(jī)理對(duì)癌細(xì)胞顯示出選擇性毒性的抗癌藥物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一類用于抗腫瘤藥物抗葉酸劑及其鹽和中間體，使其解決現(xiàn)有技術(shù)中抗癌藥物有較強(qiáng)毒性、對(duì)實(shí)體瘤作用有限、腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥物產(chǎn)生抗藥性的技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明所述的用于抗腫瘤治療抗葉酸劑及其鹽，結(jié)構(gòu)通式如下<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage4</formula>通式(I)在上述通式中，Rf,2且R2=CH3，或R產(chǎn)NHCH3且R2=H,Ar為1,4_苯基或2,5-噻吩基，R3=H或金屬陽(yáng)離子或銨離子或有機(jī)胺陽(yáng)離子，艮P:當(dāng)R產(chǎn)NH2，R2=CH3，Ar=1，4-苯基，R3=H時(shí)，化合物為N-[4_{2-(2，4-氨基-7-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-乙基卜苯甲酸]-L-谷氨酸，當(dāng)R尸NHCH3，R2=H,Ar=1，4_苯基，R3=H時(shí)，化合物為N-[4-{2_(2_氨基_4-(甲氨基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基)-乙基}-苯甲酸]-L-谷氨酸，當(dāng)R產(chǎn)NH2，R2=CH3，Ar=2，5-噻吩基，R3=H時(shí)，化合物為N-[5-[2-(2，4_二氨基-7-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基)-乙基]-噻吩-2-甲酸]-L-谷氨酸，當(dāng)&=NHCH3，R2=H,Ar=2，5-噻吩基，R3=H時(shí)，化合物為N-[5-[2-(2-氨基-4-(甲氨基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基)-乙基]-噻吩_2-甲酸]-L-谷氨酸。進(jìn)一步的，所述的鹽為鈉鹽、或者鉀鹽、或者其他適用的金屬離子鹽、或者銨鹽、或者二乙胺鹽、或者乙二胺鹽、或者其他適用的有機(jī)胺鹽。本發(fā)明還提供了上述的這類抗葉酸劑及其鹽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所涉及的用于抗腫瘤藥物抗葉酸劑及其鹽的中間體，其結(jié)構(gòu)通式(n)如下<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中R1=NH2且R2=CH3，或R1=NHCH3iR2=H，Ar為1，4-苯基或2,5-噻吩基；R4為低級(jí)垸氧基、芐氧基或谷氨酸酯。所述低級(jí)烷氧基選自甲氧基、或者乙氧基。]所述谷氨酸酯選自二甲酯、或者二乙酯。以下的合成路線以R產(chǎn)順2且R2=CH3，或K=NHCH3iR2=H，Ar為1，4_苯基或2，5-噻吩基為例，但不僅限于該官能團(tuán)。合成路線以對(duì)碘苯甲酸甲酯為原料，與烯丙醇經(jīng)Heck反應(yīng)得到3-(4-甲氧基羰基苯基)-l-丙醛，再與硝基甲垸反應(yīng)制得l-硝基-4-(甲氧基羰基苯基)-2-丁醇，脫水后得到4-(4-硝基-丁-3-烯基)-苯甲酸甲酯，然后與2,4-二氨基-6-甲氨基-嘧啶通過(guò)麥克爾加成制得4-[3-(2,4-二氨基-6-甲氨基-嘧啶-5_基)-4-硝基-丁基]-苯甲酸甲酯。該加成產(chǎn)物通過(guò)Nef反應(yīng)，關(guān)環(huán)，水解后便得4-[2-(2-氨基-4-甲氨基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-乙基]-苯甲酸和4-[2-(2，4-二氨基-7-甲基-7H-吡咯并[2，3_d]嘧啶-5-基)-乙基]-苯甲酸，它們與L-谷氨酸二乙酯鹽酸鹽縮合，水解后便得化合物N-[4^2-(2-氨基-4-(甲氨基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧淀-5-基)-乙基卜苯甲酸]-L-谷氨酸和化合物N-[4-{2-(2,4-氨基-7_甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基)_乙基}_苯甲酸]-L-谷氨酸。N-[4-{2-(2-氨基-4-(甲氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-乙基}-苯甲酸]谷氨酸與氫氧化鈉反應(yīng)后得N-[4-{2-(2-氨基-4-(甲氨基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基)-乙基卜苯甲酸]-L-谷氨酸二鈉鹽，化合物N-[4-{2-(2,4-氨基-7-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基)-乙基卜苯甲酸]-L-谷氨酸與二乙胺反應(yīng)得N-[4-{2-(2,4-氨基-7-甲基-7H-吡咯并[2，3_d]嘧啶_5_基)-乙基}-苯甲酸]-L-谷氨酸二二乙胺鹽。以噻吩-2-甲酸為原料，與液溴反應(yīng)后得5-溴-噻吩-2-甲酸，再甲酯化，然后與烯丙醇經(jīng)Heck反應(yīng)得到5-(3-氧-丙基)-噻吩-2-甲酸甲酯。化合物5-(3-氧-丙基)-噻吩-2-甲酸甲酯與硝基甲垸反應(yīng)制得5-(3-羥基-4-硝基-丁基)-噻吩-2-甲酸甲酯，脫水，再與2，4-二氨基-6-甲氨基-嘧啶通過(guò)麥克爾加成制得5-[3-(2,4-二氨基-6-(甲氨基)-嘧啶_5-基)-4-硝基-丁基]-噻吩-2_甲酸甲酯。該加成產(chǎn)物通過(guò)Nef反應(yīng)，關(guān)環(huán)，水解后便得5-[2-(2-氨基-4-(甲氨基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基)-乙基]-噻吩-2-甲酸和5-[2-(2，4-二氨基_7-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-乙基]-噻吩-2-甲酸。它們與L-谷氨酸二乙酯鹽酸鹽縮合，水解后便得化合物N-[5-[2-(2-氨基-4_(甲氨基)-H-吡咯并[2,3_d]嘧啶-5-基)-乙基]-噻吩-2-甲酸]-L-谷氨酸和化合物N-[5-[2-(2,4_二氨基_7-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基)-乙基]_噻吩-2-甲酸]-L-谷氨酸。N-[5-[2-(2-氨基-4-(甲氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-乙基]-噻吩-2-甲酸]-L-谷氨酸與氫氧化鉀反應(yīng)后得N-[5-[2-(2-氨基-4-(甲氨基)_711-吡咯并[2，3_d]嘧啶-5-基)-乙基]-噻吩-2-甲酸]-L-谷氨酸二鉀鹽，N-[5-[2-(2，4-二氨基-7-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-乙基]-噻吩-2-甲酸]-L-谷氨酸(19)與氨水反應(yīng)后得N-[5-[2-(2，4-二氨基-7-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基)-乙基]-噻吩-2-甲酸]-L-谷氨酸二銨鹽。雖然不對(duì)稱碳原子存在于本發(fā)明的化合物及其中間體中，但除了谷氨酸的側(cè)鏈中不對(duì)稱碳原子具有S(L)的絕對(duì)構(gòu)型之外，其它不對(duì)稱中心的絕對(duì)構(gòu)型可以是S或R的混和物。在這種情況下，存在非對(duì)映異構(gòu)體，而且需要時(shí)可通過(guò)常規(guī)分離和純化手段對(duì)其進(jìn)行分離。本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其技術(shù)進(jìn)步是顯而易見(jiàn)的。以往所用的抗葉酸類抗腫瘤藥物作用比較單一，易產(chǎn)生耐藥性。本發(fā)明的這類抗葉酸劑及其鹽可以對(duì)多個(gè)腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)大的抑制生長(zhǎng)活性，有望克服抗腫瘤藥物產(chǎn)生的耐藥性問(wèn)題，有很好地應(yīng)用于臨床治療的前景，同時(shí)也大大補(bǔ)充了抗葉酸類抗腫瘤藥物的化合物數(shù)據(jù)庫(kù)。具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。本發(fā)明的這類抗葉酸劑及其鹽可以通過(guò)多種方法合成，以下以R尸NH2且RfCH3，或R1=NHCH3iR2=H,Ar為1,4-苯基或2,5-噻吩基為例，來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的合成路線，但不僅限于該官能團(tuán)。步驟14-[3-(2，4-二氨基-6-甲氨基-嘧啶-5-基)-4-硝基-丁基]-苯甲酸甲酯1的合成反應(yīng)式<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage7</formula>將4-(4-硝基-丁-3-烯基)-苯甲酸甲酯(0.69g，2.93鵬ol)和2，4-二氨基-6-(甲氨基)-嘧啶(0.41g，2.93mmol)加入到乙酸乙酯水(l:l，12ml:12ml)中，升溫至5(TC，在此溫度下攪拌反應(yīng)48h。48h后，原料基本反應(yīng)完畢，停止攪拌，冷卻后。蒸干溶劑，過(guò)柱純化，洗脫劑二氯甲垸甲醇=20:1，純化后得蠟狀液體(0.3g，27.4%)。'H麗R(DMS0-de,300MHz)S:1.88,1.98(m，2H，Bz-CH廠),2.45，2.65(m，2H，Ph-CH廠)，2.73(d,3H，4-NH迅)，3.64(m，1H,Bz_CH2—③-)，3.80(s，3H，CH3)，4.86(dd，t,2H，02N—CH2-)，5.73(s,2H,NH2)，5.78(s，2H，NH2),6.40(m，1H,4-MCH3)，7.26,7.83(AA，BB，，d，d，4H,C6H4)。ESI-MS:m/z375(MH+)。步驟24-[2-(2-氨基-4-(甲氨基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶_5_基)乙基]苯甲酸2和4-[2-(2，4-二氨基-7-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5_基)乙基]苯甲酸3的合成反應(yīng)式<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage8</formula>將4-[3-(2,4-二氨基_6-甲氨基-嘧啶-5-基)_4-硝基-丁基]-苯甲酸甲酯(0.44g,1.18醒ol)加入到無(wú)水甲醇(6ml)中，加入5NNaOH(2.9ml，14.5mmol)，在rt下攪拌反應(yīng)4h。4h后，減壓蒸去甲醇，將其慢慢滴加到0。C的3NH2S04(5.5ml，16.5mmol)，在(TC下攪拌反應(yīng)3h。用5NNaOH將反應(yīng)液pH調(diào)至7-8，再在rt下攪拌反應(yīng)lh，用稀硫酸將反應(yīng)液pH調(diào)至3，有大量灰白色固體析出，濾餅用蒸餾水(3mlx3)洗滌后，干燥，得一淺灰色固體(0.29g，79%)。ESI-MS:m/z311(MH+)。步驟3N-[4-{2_(2-氨基-4-(甲氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基}苯甲酸]-L-谷氨酸二乙酯4和N-[4-(2-(2,4-氨基-7-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶_5-基)乙基)苯甲酸]-L-谷氨酸二乙酯5的合成反應(yīng)式<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage8</formula>操作步驟將關(guān)環(huán)的羧酸混合物(2和3)(0.29g，0.93mrno1)溶于DMF(12ml)中，再加入2-氯-4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪(O.2g，1.12腿ol)，4-甲基嗎啉(113mg，1.12raraol)，^保護(hù)，室溫下攪拌反應(yīng)2h。然后加入L-谷氨酸二乙酯鹽酸鹽(268mg，1.13誦o1)，和4-甲基嗎啉(113mg,1.12mmol)，繼續(xù)反應(yīng)3.5h。反應(yīng)完畢，蒸去溶劑，將剩余物過(guò)柱純化，得一略透明的固體4(0.15g,33%)和5(0.1g，22%)。4:'HNMR(DMSO-d6，300MHz)S:1.14(t，3H,CH3)，1.17(t，3H,CH3),1.98，2.07(m,m,2H，—OOC—CH2—逃—)，2.41(t，2H，—OOC—CH2—)，2.86(d,3H，4—NH逃)，2.91-2.97(m，4H，8,9_CH2CH2-)，4.01(q,2H，COOCH廠)，4.07(q,2H，COOCH廠)，4.38(m,1H，—00C-CH—)，5.62(s，2H，2—NH2),6.13(m'1H，4—,CH:!)6.35(s，1H，C=CH_),7.32，7.78(AA'BB，，d，d,4H,C6H4)，8.64(Ph—CO—NH-)，10.45(s，1H，NH)。ESI-MS:m/z497(MH+)。5:LHNMR(CDC13—d6，300MHz)S:1.21(t,3H，CH3)，1.28(t,3H，CH3)，2.17,2.23(m，m，2H,-OOC-CH廠迅-)，2,50(t，2H,-OOC-CH廠)，2.96(m,4H,8，9-CH2CH2_),3.51(s，3H,7-N逃)，4.08(q,2H,COOCH廠)，4.22(q，2H，COOCH2-),4.76(m，1H，-OOC-CH-)，5.62(s，2H，2_NH2)，6.31(s，1H，C=CH-)，6.45(s，2H，4—NH2),7.22，7.72(AA，BB，，d，d，4H,C6H4)。ESI-MS:m/z497(MH+)。步驟4N-[4-{2-(2-氨基-4-(甲氨基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基)乙基}苯甲酸]-L-谷氨酸6的合成反應(yīng)式<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage9</formula>將N-[4-{2-(2-氨基-4-(甲氨基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶_5-基)乙基}苯甲酸]-L-谷氨酸二乙酯(80mg,0.16,1)，CH3OH(6ml)，IN的氫氧化鈉溶液(1.6ml)依次加入到兩口燒瓶中，室溫下攪拌反應(yīng)12h。蒸去CH30H，用稀鹽酸將反應(yīng)液pH調(diào)至4，溶液中有大量灰白色固體析出。過(guò)濾，濾餅用蒸餾水(2mlx3)洗3次，將固體冷凍干燥后，得類白色固體(48mg,68.2%),熔點(diǎn)227-230°C(dec)。^隨R(DMS0-d6,300MHz)S:1.94，2.08(m,m，2H，-OOC-CH廠逃-)，2.33(t,2H，-OOC-CH2-)，2.89(d，3H，4-NH迅)，2.91-2.97(m，4H，8，9-^^-)，4.38(m，1H,-OOC-CH-)，5.93(s，2H，2-NH2),6.36(m，1H，4—膽CH3),6.39(s,1H，C=CH_)，7.32，7.78(AA，BB，，d，d，4H，C6H4)，8.48(Ph-CO-NH-)，10.62(s，1H，NH)。13C麗R(DMSO-d6，75MHz)S:26.73，28.19，28.67，31.17，36.06，52.67,96.07，114.71，115.44，127.98，129.04，132.18,146.11，150.41,157.89,157.97，167.09，174.20，174.58。HRESI-MScalcdforC21H25N605(MH+)441.1886,found441.1876。步驟5N-[4-{2-(2，4-氨基-7-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶_5-基)乙基}苯甲酸]-L-谷氨酸7的合成反應(yīng)式<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage10</formula>取N-[4-{2-(2，4-氨基-7-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基)乙基}苯甲酸]_卜谷氨酸二乙酯(54mg，O.llmraol)，按照上述制備化合物6的方法，得灰黃色固體(36mg，74.4%)，熔點(diǎn)241-243°C(dec)。'HNMR(CDC1廠d6，300MHz)S:1.96,2.07(ra，m，2H，—00C—CH2—逃—)，2.33(t，2H，-OOC_CH2-)，2.91-2.99(m，4H，8，9-CH2CH2_)，3.41(s，3H，7-N迅)，4.38(m，1H,-00C-CH-)，5.74(s，2H,2-NH》，6.31(s，1H,C=CH_)，6.46(s，2H，4-NH2)，7.33，7.79(AA，BB，，d,d，4H，C6H4)，8.46(Ph—CO—NH-)。13CNMR(DMSO-d6,75MHz)S:26.83,27.99，31.00,31.25,36.35，52.76，95.81，114.42，120.27,127.99，128.98,132.23'146.04，153.34，157.64，158.73，167.05，174.40，174.69。HRESI-MScalcdforC21H25N605(MH+)441.1886，found441.1880。步驟6N-[4-!2-(2-氨基-4-(甲氨基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5_基)乙基}苯甲酸]-L-谷氨酸二鈉鹽8的合成反應(yīng)式<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage11</formula>化合物6(50.0mg，114umol)加入到一燒瓶中，再加入蒸餾水(2ml)，1NNaOH溶液(0.23ml)，室溫下攪拌反應(yīng)0.5小時(shí)，減壓下蒸去溶劑，用水-乙醇重結(jié)晶，得到固體(33mg，60%)。ESI-MS:m/z219.1(Neg)。步驟7N-[4-{2-(2，4-氨基-7-甲基-7H-吡咯并[2,3_d]嘧啶-5-基)乙基}苯甲酸]-L-谷氨酸二二乙胺鹽9的合成反應(yīng)式<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage11</formula>化合物7(44.0rag，100umol)加入到一燒瓶中，再加入蒸餾水(2.0ml),二乙胺(15mg，200!imol),室溫下攪拌反應(yīng)0.5小時(shí)，減壓下蒸去溶劑，用水-乙醇重結(jié)晶，得到固體(32mg，55%)。ESI-MS:m/z(Neg)219.0。步驟85-(3-氧-丙基)-噻吩-2-甲酸甲酯10的合成反應(yīng)式:<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage12</formula>將5-溴-噻吩-2-甲酸甲酯(6.0g,27.3mraol)，碳酸氫鈉(5.0g,60.0咖ol)，醋酸鈀(O.6g，2.7ramol)，四丁基溴化銨(8.9g，27.3誦ol)，4A分子篩(5.4g),烯丙醇(2.4g，41.4咖ol)加入到120mlDMF中，&保護(hù)下，水浴加熱至35'C，在此溫度下攪拌反應(yīng)72h。72h后，原料反應(yīng)完畢，停止攪拌，冷卻后。將反應(yīng)液抽濾，濾餅用DMF(20mlx4)洗滌。將濾液倒入800ml的蒸餾水中，攪拌后用乙醚萃取(200mlx7),合并有機(jī)層，用無(wú)水硫酸鎂干燥，抽濾，濾液減壓濃縮干后，過(guò)柱純化，洗脫劑環(huán)己垸乙酸乙酯=8:1，純化后得淺黃色硬化狀液體產(chǎn)品(4.8g，88.8%)。NMR(CDC13,300MHz)S:2.86(m，2H，—CH2C^CH0)，3.16(t，2H，-Q|2CH2CHO)，3.84(s,3H，CH3)，6.81(d，H,-,C-CH2CH2CH0),7.61(d,H，-CH=CC00CH3)，9.81(s，1H，CHO)。步驟95-(3-羥基-4-硝基-丁基)-噻吩-2-甲酸甲酯11的合成反應(yīng)式<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage12</formula>將5-(3-氧-丙基)-噻吩-2-甲酸甲酯(7.8g，39.2mmol)加入到45ml無(wú)水乙醇中，攪拌溶解后，再加入硝基甲烷(2.4g，39.2mmol)，滴加10N氫氧化鈉(0.2ml)，加熱升溫到38'C，在此溫度下攪拌反應(yīng)48h。48h后，原料基本反應(yīng)完畢，停止攪拌，冷卻后。將反應(yīng)液倒入300ml溶液(環(huán)己烷乙酸乙酯=1:l)中，有機(jī)層用蒸餾水(40mlx3)洗滌后，分出有機(jī)層，用無(wú)水硫酸鎂干燥后，抽濾，濾液減壓濃縮干后，過(guò)柱純化，洗脫劑環(huán)己垸乙酸乙酯=4:1，純化后得淺黃色液體(5.7g，61.2%)。'H醒R(CDCl3，300MHz)S:1.89(m，2H，-<:),3.07(d，H,-OH),3.08(m，2H，—Qi2CH2CH-)，3.87(s，3H，CH3),4.36(m，H，—CH2CH2Qi-),4.42(d，2H,—CH2N02),6.84(d，H，_Cg=C—CH2CH2—),7.64(d,H，_Cg=CC00CH3)。EI-MS:m/z259。步驟105-(4-硝基-丁-3-烯基)-噻吩-2-甲酸甲酯12的合成反應(yīng)式<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage13</formula>將5-(3-羥基-4-硝基-丁基)-噻盼-2-甲酸甲酯(6.9g，26.5mmol)加入到120ml二氯甲垸中，鹽冰浴冷卻至0。C,加入甲磺酰氯(3.03g，26.5腿ol)，慢慢滴加三乙胺(5.4g，53.1咖ol),20min加完，反應(yīng)液顏色加深，由橙紅色變成褐色。0.5h后，點(diǎn)板可知原料反應(yīng)完畢。將反應(yīng)液倒入30ml蒸餾水中，用二氯甲烷(25mlx3)萃取后，合并有機(jī)層，用無(wú)水硫酸鎂干燥后，抽濾，濾液減壓濃縮干后，過(guò)柱純化，洗脫劑環(huán)己垸乙酸乙酯=8:1，純化后得淺黃色硬化狀液體產(chǎn)品(4.8g，75%)。NMR(CDCU300MHz)S:2.68(m,2H,—CH2Cg2CH=),3.08(t，2H,—Q]2CH2CH=),3.87(s,3H,CH3)，6.84(d，H,-Qi=C—CH2CH2—)，7.00(d，H,-CH=CgN02),7.24(m，H,-Qi=CHN02)，7.64(d,H，-Q1=CC00CH3)。EI-MS:m/z241。步驟115-[3-(2，4-二氨基-6-(甲氨基)-嘧啶-5-基)-4-硝基-丁基]-噻吩-2-甲酸甲酯13的合成反應(yīng)式<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage13</formula>將5-(4-硝基-丁-3-烯基)-噻吩-2-甲酸甲酯(l.0g，4.15聽l)和2，4_二氨基-6-(甲氨基)-嘧啶(0.58g,4.15mmol)加入到乙酸乙酯水(l:l，25ml:25ml)中，升溫至5(TC，在此溫度下攪拌反應(yīng)48h。48h后，原料基本反應(yīng)完畢，停止攪拌，冷卻后。蒸干溶劑，過(guò)柱純化，洗脫劑二氯甲烷甲醇=20:1，純化后得蠟狀液體(443mg，28.1%)。NMR(DMS0_d6，300MHz)S:1.90,2.09(m，2H，—C&CH2C—S—),2.65，2.82(m，2H,—CH2Qi2C—S—)，2.71(d,3H,NHC&),3.63(m，H'-Qpi2N02)，3.76(s，3H,CH3)，4.86(m'2H，—CH2N02),5.59(s，4H,2，4—NH2),6.23(m，1H，腿CHj,6.89(d，1H，—Qi=C-CH2CH2—)，7.61(d，1H，-Qi=CCOOCH3)。13C-R(DMSO-d6，75MHz)S:28.18，29.41，30.84，31.00,33.09，52.73，76.43,81.92，126.63,130.64，134.47,153.46,162.44。ESI-MS:m/z381(MH+)。步驟125-[2-(2-氨基-4_(甲氨基)-7H-吡咯并[2,3_d]嘧啶-5-基)-乙基]-噻吩_2-甲酸14和5-[2-(2，4-二氨基-7-甲基-7H-吡咯并[2,3_d]嘧啶-5-基)-乙基]-噻吩-2-甲酸15的合成反應(yīng)式<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage14</formula>將5-[3-(2，4-二氨基-6-(甲氨基)-嘧啶-5-基)-4-硝基_丁基]-噻吩-2-甲酸甲酯(432mg，1.14鵬ol)加入到無(wú)水甲醇(6ml)中，加入5NNaOH(1.82ml，9.1mmol)，在rt下攪拌反應(yīng)4h。4h后，減壓蒸去甲醇，將其慢慢滴加到0。C的3NH2S04(4.94ml，14.82mmol)，在(TC下攪拌反應(yīng)3h。用5NNaOH將反應(yīng)液pH調(diào)至7-8，再在rt下攪拌反應(yīng)lh,用稀硫酸將反應(yīng)液pH調(diào)至3，有大量灰白色固體析出，濾餅用蒸餾水(3mlx3)洗滌后，干燥，得一淺灰色固體(0.3g，82.7%)。ESI-MS:m/z318(MH+)。步驟13N-[5-[2-(2-氨基-4-(甲氨基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶_5-基)_乙基]-噻吩-2-甲酸]-L-谷氨酸二乙酯16和N-[5-[2-(2，4-二氨基-7-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)-乙基]-噻吩-2-甲酸]-L-谷氨酸二乙酯17的合成反應(yīng)式<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage15</formula>將關(guān)環(huán)的羧酸混合物(14和15)(0.3g，0.94mmol)溶于DMF(15ml)中，再加入2-氯-4，6-二甲氧基-1,3，5-三嗪(0.2g，1.13mrao1)，4-甲基嗎啉(114mg,1.13mmol)，&保護(hù)，室溫下攪拌反應(yīng)2h。然后加入L-谷氨酸二乙酯鹽酸鹽(271mg，1.13mmo1)，和4-甲基嗎啉(114mg，1.13mmol),繼續(xù)反應(yīng)3.5h。反應(yīng)完畢，蒸去溶劑，將剩余物過(guò)柱純化，得到略透明的固體16(0.15g，32%)和17(0.1g，21%)。16:^陋R(DMS0—d6,300MHz)S:1.14(t，3H,CH3)，1.17(t'3H，CH3)，1.95，2.05(m，m，2H,—00C_CH2—逃—)，2.40(t,2H,-OOC-CH廠)，2.98(d,3H,NH逃)，3.06(m，4H，8，9-CH2CH2_)，4.03(q，2H,C00CH廠)，4.09(q,2H，C00CH廠)，4.36(m，1H，—00C—CH—)，6.60(s，1H，C=CH—)，6.91(d，1H，-QH>CH2CH2-),7.05(s，2H,2-NH》，7.27(m，1H，4-塑CH3)，7.68(d，1H,—CH=CC0NH)，8.63(d，1H，C0—NH-)，11.36(s，1H,7—NH)。ESI-MS:m/z503(MH+)。17:W麗R(DMS0-de，300MHz)S:1.14(t，3H，CH3)，1.17(t,3H,CH3)，1.95，2.05(m，m,2H，—OOC—CH2—迅—)，2.40(t'2H，—00C—CH2—),3.06(ra，4H，8，9-CH線-)，3.45(s，3H，7-N-CH3)，4.03(q,2H，C00CH廠)，4.09(q，2H，C00CH2-)，4.36(m，1H,-00C-CH-),6.44(s，2H，4-NH》'6.64(s，1H，C=CH-)，6.92(d，1H，—C旦:OCH2CH2—)，7.05(s,2H，2—NH2),7.68(d,1H，-C旦二CCONH)，8.60(d,1H，C0-NH-)。ESI-MS:m/z503(MH+)。步驟14N-[5-[2-(2_氨基-4-(甲氨基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基)-乙基]-噻吩-2-甲酸]-L-谷氨酸18的合成反應(yīng)式:將N-[5-[2-(2-氨基-4-(甲氨基)-7H-吡咯并[2，3_d]嘧啶-5-基)-乙基]-噻吩-2-甲酸]-L-谷氨酸二乙酯(62mg，0.12mmol)，CH30H(6ml)，IN的氫氧化鈉溶液(1.2ml)依次加入到兩口燒瓶中，N2保護(hù)，室溫下攪拌反應(yīng)12h。蒸去CH30H，用稀鹽酸將反應(yīng)液pH調(diào)至4,溶液中有大量灰白色固體析出。過(guò)濾，濾餅用蒸餾水(2mlx3)洗3次，將固體冷凍干燥后，得類白色固體(28mg,52.3%)，熔點(diǎn)225-228。C(dec)。'HNMR(DMS0-de，300MHz)S:1.92,2.05(ra，m,2H，-00C-CH2-逃—)，2.31(t，2H，—00C—CH廠)，2.87(d，3H，NH迅)，2.99—3.08(m,4H,8,9_CH2CH2-),4.30(m，1H,-00C—CH-)，5.65(s，2H，2—NH2)，6.17(m，1H,4-膽CH3)，6.41(s，1H，C=CH-)，6.90(d，1H，-Cg=C-CH2CH2-)，7.68(d，1H，-CH=CC0NH-)，8,63(d，1H,C0-NH-),10.50(s，1H，7-NH)。13CNMR(DMS0-d6,75MHz)S:26.81，28.52，28.78，30.90，31.14，52.50，96.11，113.69,115.35，126.30,129.16,137.28，150.71,151.99，158.26，159.01,162.08,174.11,174.52。HRESI-MScalcdforC19H23N605S(MH+)447.1451，found447.1451。步驟15N-[5-[2-(2，4-二氨基-7-甲基-7H-吡咯并[2,3_d]嘧卩定_5-基)-乙基]-噻吩-2-甲酸]-L-谷氨酸19的合成反應(yīng)式<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage17</formula>取N-[5-[2-(2，4-二氨基-7-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基)-乙基]-噻吩-2-甲酸]-L-谷氨酸二乙酯(17)(70mg，0.14mmol)，按照上述制備化合物18的方法，得到類白色固體19(39mg，62.5%)，熔點(diǎn)227_230°C(dec)。'HR(DMS0-d6,300MHz)5:1.92，2.05(m，m,2H,-00C-CH2--)，2.32(t，2H，-00C-CH2-)，2.99-3.09(m，4H,8，9-CH-)，3.44(s，3H，7_N_CH3)，4.33(m，1H，-00C-CH-),5.84(s，2H,2-NH2),6.40(m,1H,4-NH2)，6.54(s，1H,C=CH-)，6.92(d，1H，-Cg=C-CH2CH2-)，7.68(d，1H，-Qi=CC0NH-)，8.46(d，1H，C0-NH-)。13CNMR(DMS0—d6,75MHz)5:26.82,28.36，31.06,31.12，52.52，95.62,113.85，120.73,126.27，129.20，137.29，150.51，153.23，157.23，158.25'162.07,174.16,174.51。HRESI-MScalcdforC19H23N605S(MH+)447.1451,found447.1446。步驟16N-[5-[2-(2-氨基-4-(甲氨基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶_5-基)-乙基]-噻吩-2-甲酸]-卜谷氨酸二鉀鹽20的合成反應(yīng)式<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage18</formula>化合物18(45mg，101umol)加入到一燒瓶中，再加入蒸餾水(2ml)，INKOH溶液(0.2ml),室溫下攪拌反應(yīng)0.5小時(shí)，減壓下蒸去溶劑，用水-乙醇重結(jié)晶，得到固體(29.5mg，56%)。ESI-MS:m/z(Neg)222.0。步驟17N-[5-[2-(2，4_二氨基-7-甲基-7H-吡咯并[2，3_d]嘧啶-5_基)-乙基]-噻吩-2-甲酸]《_谷氨酸二銨鹽21的合成反應(yīng)式<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage18</formula>化合物19(30mg，67umol)加入到一燒瓶中，再加入蒸餾水(1.5ml)，1N,H溶液(O.15ml)，室溫下攪拌反應(yīng)l小時(shí)，減壓下蒸去溶劑，用水-乙醇重結(jié)晶，得到固體(19.4mg，60%)。ESI-MS:m/z(Neg)222.0。試驗(yàn)證明，本發(fā)明的這類抗葉酸劑及其鹽對(duì)多個(gè)腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)大的抑制生長(zhǎng)活性，可以用于制備抗腫瘤藥物，并有望克服抗腫瘤藥物產(chǎn)生的耐藥性問(wèn)題。例化合物6、7、18、19的抗腫瘤生物活性測(cè)試選用了四氮唑鹽(microculturetetrozolium,MTT)還原法，分別對(duì)人白血病細(xì)胞株(CCRF-CEM)，人肺癌細(xì)胞株(A549)和小鼠白血病細(xì)胞株(L1210)三種細(xì)胞株的抑制活性進(jìn)行了試驗(yàn)?；衔?、7、18、19的抗腫瘤生物活性<table>complextableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>從藥物濃度與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率關(guān)系以及根據(jù)正規(guī)Bliss法計(jì)算出的IC5。，可以推測(cè)出如下結(jié)論1.化合物6和化合物7對(duì)CCRF-CEM、L1210和A549腫瘤細(xì)胞均有抑制作用，且化合物7比化合物6活性好。2.化合物18和化合物19對(duì)CCRF-CEM、L1210和A549腫瘤細(xì)胞均有抑制作用，且化合物19比化合物18活性好?；衔?、7、18、19顯示對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞均有抑制活性，有較好地應(yīng)用于臨床治療的前景。權(quán)利要求1.一種用于抗腫瘤治療抗葉酸劑及其鹽，其特征在于，結(jié)構(gòu)通式如下在上述通式中，R1＝NH2且R2＝CH3，或R1＝NHCH3且R2＝H，Ar為1，4-苯基或2，5-噻吩基，R3＝H或金屬陽(yáng)離子或銨離子或有機(jī)胺陽(yáng)離子。2.如權(quán)利要求1所述的用于抗腫瘤治療抗葉酸劑及其鹽，其特征是所述的鹽是金屬離子鹽、或有機(jī)胺鹽。3.如權(quán)利要求1所述的用于抗腫瘤治療抗葉酸劑及其鹽，其特征是所述的鹽是鈉鹽、或者鉀鹽。4.如權(quán)利要求1所述的用于抗腫瘤治療抗葉酸劑及其鹽，其特征是所述的鹽是銨鹽、或者二乙胺鹽、或者乙二胺鹽。5.—種如權(quán)利要求l所述的用于抗腫瘤治療抗葉酸劑及其鹽的中間體，其特征在于，結(jié)構(gòu)通式如下其中R尸NH2且R2=CH3,或R尸NHCH3iR2=H，Ar為1,4-苯基或2，5_噻吩基，R4為低級(jí)烷氧基、節(jié)氧基或谷氨酸酯。6.如權(quán)利要求5所述的用于抗腫瘤治療抗葉酸劑及其鹽的中間體，其特征是所述的低級(jí)垸氧基選自甲氧基、或者乙氧基。7.如權(quán)利要求5所述的用于抗腫瘤治療抗葉酸劑及其鹽的中間體，其特征是所述的谷氨酸酯選自二甲酯、或者二乙酯。全文摘要本發(fā)明公開了一類用于抗腫瘤治療抗葉酸劑及其鹽和中間體，所述抗葉酸劑及其鹽通式如下所示，其中R₁＝NH₂且R₂＝CH₃，或R₁＝NHCH₃且R₂＝H，Ar為1，4-苯基或2，5-噻吩基，R₃＝H或金屬陽(yáng)離子或銨離子或有機(jī)胺陽(yáng)離子。本發(fā)明還公開了上述的這類抗葉酸劑及其鹽在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的抗葉酸劑及其鹽可以對(duì)多個(gè)腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)大的抑制生長(zhǎng)活性。文檔編號(hào)C07D487/00GK101195625SQ200710171870公開日2008年6月11日申請(qǐng)日期2007年12月6日優(yōu)先權(quán)日2007年12月6日發(fā)明者劉增路,朱高軍,毛振民申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)