專利名稱：：提高植物耐鹽及抗旱性的基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種核苷酸編碼序列和另一種按植物偏愛密碼子人工合成的核苷酸編碼序列,本發(fā)明還涉及所述核苷酸編碼序列在改良植物對鹽、干旱脅迫抗性上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：Deinococcusradiodurans(D.radiodurans)是至今已知生物中最高的輻射抗性的生物之一。該菌具有對致死劑量的電離輻射、UV輻射以及DNA損傷試劑的極端抗性，能將電離輻射造成上百個(gè)DNA雙鏈斷裂的基因組完整恢復(fù)如初，且不發(fā)生突變的能力。其極端的耐輻射能力及其DNA損失修復(fù)分子機(jī)制引起科學(xué)界的極大興趣，不僅對探索DNA修復(fù)分子機(jī)理的基礎(chǔ)學(xué)科有著十分重要意義，而且對促進(jìn)新的DNA技術(shù)的發(fā)展以及在環(huán)境保護(hù)和生物修復(fù)、人類健康、生物技術(shù)，乃至地外空間的開發(fā)和利用等方面的具有極大潛在應(yīng)用前景。1999年基因研究所(TIGR)完成和公布了D.radiodurans基因組全序列(White1999)。但現(xiàn)有技術(shù)中，未見D.radiodurans可提高植物對鹽、干旱脅迫的抗性的任何有關(guān)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是發(fā)現(xiàn)并人工合成提高植物耐鹽及抗旱性的DNA序列，并將該序列轉(zhuǎn)入植物中，培育耐鹽及抗旱性的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)如SEQIDNO:l和SEQIDNO:2所示的DNA序列均具有提高植物耐鹽及抗旱性功能。其中序列SEQIDNO:l來源于D.radiodurans其中的一段；SEQIDNO:2是源于SEQIDNO:l，并按植物偏愛密碼子人工合成的序列。本發(fā)明還提供了一種重組載體，它包含SEQIDNO:l所述的DNA或包含SEQIDNO:2所述的DNA。本發(fā)明用上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，這些宿主包括原核細(xì)胞，也包括真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞包括JM109，常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞和其它植物細(xì)胞。在本發(fā)明舉出的應(yīng)用實(shí)例中，宿主細(xì)胞是E.coliJM109和煙草。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種產(chǎn)生具有SEQIDNO:l或SEQIDNO:2蛋白質(zhì)活性的多肽的方法，其步驟如下(1)將SEQIDNO:l或SEQIDNO:2可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成SEQIDNO:l或SEQIDNO:2蛋白表達(dá)載體；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成重組細(xì)胞；(3)在適合表達(dá)SEQIDNO:l或SEQIDNO:2蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞；(4)分離出具有SEQIDNO:l或SEQIDNO:2蛋白活性的基本純的多肽，序列為SEGIDNO:3。本發(fā)明還提供了一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將SEQIDNO:1或SEQIDNO:2轉(zhuǎn)化入植物的方法，以提高植物對鹽、干旱脅迫抗性，其步驟如下(1)將SEQIDNO:l或SEQIDNO:2所示序列可操作地連于植物表達(dá)調(diào)控序列，形成植物表達(dá)載體；(2)將步驟(l)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞；(3)經(jīng)篩選獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞并最終再生轉(zhuǎn)基因植株及其后代，包括植物種子及植物組織。上述"可操作地連于"表示如下情況即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA;如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，"可操作地連于"意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，將步驟(l)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，將含表達(dá)載體的農(nóng)桿菌同真核宿主細(xì)胞共培養(yǎng)，在22-28。C條件下，暗培養(yǎng)l-2天后，通過篩選如抗生素篩選，獲得含有SEQIDNO:l或SEQIDNO:2基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞并最終再生轉(zhuǎn)基因植株及其后代，包括植物種子及植物組織。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，上述轉(zhuǎn)基因植株對植物鹽、干旱脅迫具有增強(qiáng)的抗性作用。上述載體可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。此外，本發(fā)明還提供了一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有SEQIDN0:1或SEQIDN0:2核苷酸編碼序列的8-100個(gè)連續(xù)核苷酸，較佳地具有15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼SEQIDN0:1或SEQIDN0:2的核酸分子。本發(fā)明還提供了檢測樣品中是否存在SEQIDN0:1或SEQIDN0:2核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于SEQIDNO:l或SEQIDN0:2核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為15-50個(gè)核苷酸。在本發(fā)明中，"SEQIDN0:1或SEQIDNO:2"指編碼具有SEQIDN0:1或SEQIDN0:2蛋白活性的多肽的核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指所述序列中有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQIDN0:1或SEQIDN0:2同源性低至約89%的簡并序列也能編碼出SEQIDN0:2所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，更佳的在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNO:l核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQIDNO:l中的核苷酸序列的同源性至少89%,較佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95。/。的核苷酸序列。該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的SEQIDN0:1或SEQIDN0:2相同功能的蛋白的SEQIDNO:l中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地l-60個(gè)，更佳地l-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。在本發(fā)明中，"基本純的"蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20%，較佳地至少50%，更佳地至少80%，最佳地至少90%(以上各百分比均指按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。在本發(fā)明中，SEQIDN0:3蛋白或多肽指具有SEQIDNO:l編碼的蛋白活性多肽。該術(shù)語還包括具有與天SEQIDNO:3的相同功能的變異形式。這些變異形式包括但并不限于若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為IO個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括SEQIDNO:3蛋白的活性片段和活性衍生物。本發(fā)明的SEQIDNO:2多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與SEQIDNO:l或SEQIDNO:2雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用SEQIDNO:3多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含SEQIDNO:3多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括SEQIDNO:3多肽的可溶性片段。通常，該片段具有SEQIDNO:3多肽序列的至少約IO個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。在本發(fā)明中，"SEQIDNO:3保守性變異多肽"指與SEQIDNO:3的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。表1氨基酸替換表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>發(fā)明還包括SEQIDNO:3蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然SEQIDNO:3多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他己知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如e、Y-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。還可用Northern印跡法技術(shù)分析SEQIDN0:1或SEQIDN0:2基因產(chǎn)物的表達(dá)，即分析SEQIDN0:1或SEQIDN0:2的RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。SEQIDNO:1或SEQIDNO:2RNA的Northern印跡分析和SEQIDNO:3特異抗體的Western印跡分析可以聯(lián)合使用，以證實(shí)SEQIDNO:1或SEQIDN0:2在生物樣本中的表達(dá)。此外，根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選SEQIDNO:l或SEQIDN0:2同源基因或同源蛋白。為了得到與SEQIDN0:1或SEQIDN0:2基因相關(guān)的D.radioduranscDNAs的點(diǎn)陣，可以用DNA探針篩選D.radioduranscDNA文庫，這些探針是在低嚴(yán)緊條件下，用"P對SEQIDNO:l或SEQIDN0:2的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫是來自D.radiodurans的文庫。構(gòu)建來自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自Clontech,Stratagene，PaloAlto，Cal.。這種篩選方法可以識(shí)別與SEQIDN0:1或SEQIDN0:2相關(guān)的基因家族的核苷酸序列。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工化學(xué)合成的方法來合成有關(guān)序列。在本申請之前，現(xiàn)有技術(shù)已完全可以通過先合成多個(gè)多核苷酸小片段，然后再進(jìn)行連接而獲得編碼本發(fā)明D.radiodurans的SEQIDNO:2蛋白的核酸序列。然后，可將該核酸序列引入本領(lǐng)域中各種現(xiàn)有的DNA分子(如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-PhasePeptideSynthesis,WHFreemanCo.,SanFrancisco;MerrifieldJ.(1963)J.AmChem.Soc85:2149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動(dòng)進(jìn)行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(FosterCity,CA)來自動(dòng)合成肽。可以分別化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。圖1是含有SEQIDN0:1表達(dá)載體的大腸桿菌在含0.75MNaCl的培養(yǎng)基中生長狀況，證明SEQIDN0:1具有耐鹽及抗旱性功能。圖中5個(gè)試管中內(nèi)容物如下1號(hào)是E.coliJM109菌株;2號(hào)是空pMD18T載體的E.coliJM109;3號(hào)、4號(hào)和5號(hào)是含有SEQIDNO:l序列表達(dá)載體的E.coliJM109菌株。圖2，圖3和圖4是含SEQIDNO:2核苷酸序列的表達(dá)載體在煙草細(xì)胞中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)。其中圖2是轉(zhuǎn)基因煙草在MS2培養(yǎng)基上生長狀況，生長狀態(tài)良好；圖3是在MS3培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)基因煙草陰性苗與陽性苗的根系生長狀況，轉(zhuǎn)基因煙草的根系生長良好，圖4是轉(zhuǎn)基因無菌苗移入珍珠巖中的生長情況，生長狀態(tài)良好。圖5是部分經(jīng)PCR檢測的陽性轉(zhuǎn)基因煙草植株的Northernblot分析結(jié)果，雜交結(jié)果表明SEQIDNO:2核苷酸序列能在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)。圖6、圖7是含SEQIDNO:2核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽及抗旱性鑒定結(jié)果對比。其中圖6是在0mmolNaCl的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草生長對比，圖7是在250mmolNaCl的培養(yǎng)基上培養(yǎng)15天后轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草生長對比，轉(zhuǎn)基因煙草能在含250mmo1的NaCl的培養(yǎng)基上正常生長，非轉(zhuǎn)基因煙草在含250mmo1的NaCl的培養(yǎng)基不能生長。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于舉例說明本發(fā)明的方法，而不用于限制本發(fā)明的范圍。凡未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1SEQIDNO:l核苷酸序列在大腸桿菌中的表達(dá)和耐鹽及抗旱性性能分析1.核苷酸序列SEQIDNO:l的克隆根據(jù)己公布的Deinococcusradiodurans基因組序列涉及一對PCR特異性引物，從D.radiodurans基因組DNA中擴(kuò)增完整的核苷酸序列。2.構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體及分子驗(yàn)證用將上述克隆片段用Ndel和SacII雙酶切消化，與含E.coli通用啟動(dòng)子groE的載體pTtSacB連接，取代SacB基因，以產(chǎn)生基因的大腸桿菌表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化E.coliJM109,涂布于含Amp的LB固體培養(yǎng)基上，挑取白色菌落堿裂解法提質(zhì)粒篩選不同的重組子，BglII酶切及測序驗(yàn)證，得到一株含該核苷酸序列表達(dá)載體的E.coliJM109菌株。酶切分析表明，含groE啟動(dòng)子的基因片段為1.2kb。3.大腸桿菌表達(dá)載體的耐鹽及抗旱性性功能驗(yàn)證將OD值相同的含有SEQIDNO:l核苷酸序列表達(dá)載體的E.coliJM109菌株，對照pMD18T和對照宿主菌株E.coliJM109以1%的接菌量分別接種于含有0.75MNaCl的MM培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)15個(gè)小時(shí)，于550nm波長測定0D值。從圖1中可看出含有SEQIDNO:l核苷酸序列表達(dá)載體的E.coliJM109菌株能耐受0.75MNaCl，生長狀況良好，而只含空載體的E.coliJM109菌株和E.coliJM109菌株在0.75MNaCl的培養(yǎng)基中不能生長。實(shí)施例2SEQIDNO:2核苷酸序列的人工合成根據(jù)己SEQIDNO:l核苷酸序列，首先分7個(gè)區(qū)段分別根據(jù)正鏈和副鏈序列，分別合成出長度150-200bp、具有粘性末端的單鏈寡核苷酸片段。將正鏈和副鏈各一一對應(yīng)的7個(gè)互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸片段分別退火，形成7個(gè)帶有粘性末端的雙鏈寡核苷酸片段。混合雙鏈寡核苷酸片段，經(jīng)T4DNA連接酶催化組裝成一個(gè)完整的基因。該合成的DNA片段的兩端含Xbal和Sacl位點(diǎn)。將上述人工合成的5'和3，端酶切位點(diǎn)為Xbal和Sacl位點(diǎn)SEQIDNO:2，用于下面高耐鹽及抗旱性基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建。實(shí)施例3SEQIDNO:2核苷酸序列在煙草細(xì)胞中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽、抗旱性鑒定(一)含目的基因表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)全長編碼序列(SEQIDNO:.2)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將序列cDNA克隆至中間載體(如pBluescript)，進(jìn)一步克隆到雙元表達(dá)載體(如pBI121和pCAMBIA2200)，在保證閱讀框架的前提下鑒定好的表達(dá)載體，再將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，利用葉盤法技術(shù)轉(zhuǎn)化模式植物煙草。(二)利用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草1.用無菌牙簽挑取YEB選擇平板上的陽性菌落,接種于2mlYEB液體(Sm+,Kan+),28度，200rpm振蕩培養(yǎng)24-36小時(shí)；2.室溫下4,000g離心10min;3.棄上清，菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋到原體積的5-20倍，使菌液的00600=0.5左右；4.取生長兩周左右的煙草的無菌葉片，去掉其主葉脈，將其剪成約1平方厘米見方的小葉片；5.將葉片放入制備好的菌液中，浸泡2-5min，在無菌濾紙上吸干菌液；6.把經(jīng)侵染的葉片放于MS培養(yǎng)基上，28。C暗培養(yǎng)48小時(shí)；7.將葉片轉(zhuǎn)到愈傷培養(yǎng)基(MS+6—BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+Kan50mg/L+cb250mg/L)上，25-28。C光照下培養(yǎng)，7-15天可見愈傷組織的形成；8.約20天后可見分化芽長出，待芽長大后，切下，置于生根培養(yǎng)基(1/2MS+NAA0.5mg/L+Kan25mg/L)上進(jìn)行生根培養(yǎng)，2-7天左右生根；9.等根系發(fā)達(dá)后，將植株取出，用無菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養(yǎng)。圖2是轉(zhuǎn)基因煙草在MS2培養(yǎng)基上生長狀況，生長狀態(tài)良好，圖3是在MS3培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)基因煙草陰性苗與陽性苗的根系生長狀況，轉(zhuǎn)基因煙草的根系生長良好，圖4是轉(zhuǎn)基因無菌苗移入珍珠巖中的生長情況，生長狀態(tài)良好。(三)利用Northernblot檢測SEQIDNO:2在轉(zhuǎn)基因煙草植株中的表達(dá)1.RNA的提取制備參考《分子克隆》(Sarabrook等，1989)2.RNA的定量:參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度計(jì)測0026。；RNA含量計(jì)算10D26。=40pg/ml。3總RNA瓊脂糖凝膠電泳分離1)取6ml25*電泳緩沖液，假如117ml無菌水，混勻。2)稱取1.5g瓊脂糖，加入到上述溶液張，于微波爐里加熱融化，轉(zhuǎn)入55。C水浴中。3)于通風(fēng)櫥中取26.8ml甲醛，加入到55。C的凝膠溶液中，混勻。4)迅速倒入制膠板中，室溫水平放置30分鐘，待膠凝固。5)將提取的RNA30ug溶解于15mlRNA稀釋溶液中，在55。C-65。C下加熱10分鐘，然后立即放在冰上。6)在樣品中加入211110*上樣緩沖液，混勻。9)在電泳液未蓋過膠的條件下點(diǎn)樣，80V電壓電泳10分鐘，待樣品全部進(jìn)入膠后，加電泳液蓋過膠面約半厘米。80-100V電泳5小時(shí)。4.RNA尼龍膜上轉(zhuǎn)移1)轉(zhuǎn)移之前，將尼龍膜用1(^SSC浸泡。2)將濕潤的膜準(zhǔn)確地蓋在膜上，將兩張與膜大小相同的濾紙置2承SSC溶液中濕潤，蓋在膜上，排除氣泡。3)濾紙上放一疊與膜大小相同的吸水紙，在吸水紙上放一玻璃板和一重物，水平放置，轉(zhuǎn)移12-20小時(shí)。4)轉(zhuǎn)移后，將膜于80。C烘烤1-2小時(shí)。5.膜上RNA的檢測1)將膜浸在^SSC中IO分鐘，取出膜置濾紙上吸去多余的液體，將膜放入預(yù)雜交液中(50%甲酰胺，5*SSC，50mmol/L磷酸鈉(Ph6.4)5*Dendart0.1%SDS，0.1mg/ml鮭魚精DNA),42°C下預(yù)雜交過夜。2)到出預(yù)雜交液，換入等量的雜交液，將用"P標(biāo)記的DNA探針在沸水中變性5分鐘，加入雜交液(50%甲酰胺，5*SSC，50mmol/L磷酸鈉(Ph6.4)10%葡聚糖硫酸月旨，l*Dendart，0.1%SDS，0.1mg/ml鮭魚精DNA)中，于42°C雜交24-48小時(shí)。3)取出膜，置洗膜液I(1*SSC，1%SDS)中，于42。C漂洗3次，每次5分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液II(0.1*SSC，1%SDS)中，于55°C-65°C漂洗1-3次。用X光片壓片l-7天，然后顯影、定影。圖5是部分經(jīng)PCR檢測的陽性轉(zhuǎn)基因煙草植株的Northernblot分析結(jié)果。圖5的雜交結(jié)果表明SEQIDNO:2核苷酸序列能在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)。(四)含SEQIDNO:2核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽及抗旱性鑒定鑒于該核苷酸序列已被證明在大腸桿菌中對鹽脅迫具有抗性，進(jìn)一步對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行耐鹽及抗旱性和抗旱性鑒定。用含有Oramol、250mrno1的NaCl的培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因煙草植株和非轉(zhuǎn)基因煙草植株，研究其對植株的存活率和發(fā)育進(jìn)度；通過5d、10d和15d的觀察。從圖6，圖7上可知轉(zhuǎn)基因煙草可在250mmol的NaCl培養(yǎng)基上正常生長，非轉(zhuǎn)基因煙草在250ramo1的NaCl培養(yǎng)基上不能生長，結(jié)果證明，該序列對鹽的脅迫確有抗性。序歹樣SEQUENCELISTING<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所<120>提高植物耐鹽及抗旱性的基因及其應(yīng)用<130>07-12<160>3<170>Patentlnversion3.3<210>1〈211〉933<212〉DNA<213〉deinococcusradiodurans<400〉1atggggcc犯肪gctaaagctgaagcctccaagccccacccccaaa/tccctgttaagctc60ccattcgtgaccgcccccgacgccctcgccgccgccaaagccaggatgcgcgacctggcg120gcggcctacgtggcggccctgcccggacgcgacacccacagcctgatggcgggggtgccc180ggcgtagacctcaaattcatgccgctcggctggcgcgacggggcgttcgaccccgagcac240aacgtcatcctcatcaactcggcggcccgccccgaacgccagcgcttcaccctcgcccac300gaaatcgggcacgcgattttactcggcgacgacgacctgctctccgacatccacgacgcc360tacgagggcg3gcggctcg33caggtC3tcg朋acgctgtgc朋cgtggcggcggcggcg420attttgatgcccgaacccgtcatcgcggaaatgctggaacgcttcggccccaccgggcgc480gccctcgccgaactcgcc犯gcgggccg犯gtcagcgcgtcgtcggcgctctacgccctg540accgagcagaccccggtgcccgtcatctacgcggtctgtgcgccgggcaagcctccgcgt600gagcaggccgcaagcgscgaggacgctggcccaagcacag幼a犯gtcctgacggtccgc660gccagcagctcgacgcggggcgtcaagtacaccctggcgagcggcacgccggtacccgcc720gaccacccggcggcgcttgccctcgccacgggcatggaagtgcgcgagga犯gctacgtg780ccctttcgctcgggccggaaaatgaaggcggaggtggacgcctacccgtcgcgcggcatc840gtggccgtcagtttcgagttcgaccccgcccgcctgggccgcaaggacagcgagcaggcc900gaccgggacg3gccgcaggacgctgcacsgtga933〈210〉2<211〉933<212〉腿〈213〉人工序列〈400〉2atgggtcc肌aggct肌ggctgaggcttctaagccacatccacaaattccagttaagctt60ccattcgttactgctccagatgctcttgctgctgct卿gctagaatgagagettcttgct120gctgcttacgttgctgctcttccaggaagagatactcattctcttatggctggagttcca180ggagttgatcttaagttcatgccacttggatggagagatggagctttcgatccagagcat240aacgttattcttatteiactctgctgctagaccagagagacaaagattcactcttgctcat300gagattggacatgctattcttcttggagatgatgatcttctttctgatattcatgatgct360tacgagggagagagacttgagcaagttattgagactctttgcaacgttgctgctgctgct420attcttatgccagagccagttattgctgagatgcttgagagattcggacc犯ctggaaga480gctcttgctgagcttgctaagagagctgaggtttctgcttcttctgctctttacgctctt540actgagcaaactccagttccagttatttacgctgtttgcgctccaggaaagccaccaaga600gagcaagctgcttctgatgaggatgctggaccatctectgagaaggttcttactgttaga660gcttcttcttctactagaggagttaagtacactcttgcttctggaactccagttccagct720gatcatccagctgctcttgctcttgctactggaatggaggtt卿gaggagtcttacgtt780ccattc卿tctggaaga犯g3tg犯ggctgaggttgatgcttacccstctagaggaatt840gttgctgtttctttcgagttcgatccagctagacttggaag犯aggattctgagc犯gct900gatag卿tgagccac犯gatgctgctcaataa933〈210〉3〈211〉310<212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉3MetGlyProLysAlaLysAlaGluAlaSerLysProHisProGinlie151015ProValLysLeuProPheValThrAlaProAspAlaLeuAlaAlaAla202530LysAlaArgMetArgAspLeuAlaAlaAlaTyrValAlaAlaLeuPro354045GlyArgAspThrHisSerLeuMetAlaGlyValProGlyValAspLeu505560LysPheMetProLeuGlyTrpArgAspGlyAlaPheAspProGluHis65707580AsnVallieLeulieAsnSerAlaAlaArgProGluArgGinArgPhe859095ThrLeuAlaHisGlulieGlyHisAlalieLeuLeuGlyAspAspAsp100105110LeuLeuSerAsplieHisAspAlaTyrGluGlyGluArgLeuGluGin115120125VallieGluThrLeuCysAsnValAlaAlaAlaAlalieLeuMetPro130135140GluProVallieAlaGluMetLeuGluArgPheGlyProThrGlyArg145150155160AlaLeuAlaGluLeuAlaLysArgAlaGluValSerAlaSerSerAla165170175LeuTyrAlaLeuThrGluGinThrProValProVallieTyrAlaVal180185190CysAlaProGlyLysProProArgGluGinAlaAlaSerAspGluAsp195200205AlaGlyProSerThrGluLysValLeuThrValArgAlaSerSerSer210215220ThrArgGlyValLysTyrThrLeuAlaSerGlyThrProValProAla225230235240AspHisProAlaAlaLeuAlaUuAlaThrGlyMetGluValArgGlu245250255GluSerTyrValProPheArgSerGlyArgLysMetLysAlaGluVal260265270AspAlaTyrProSerArgGlylieValAlaValSerPheGluPheAsp275280285ProAlaArgLeuGlyArgLysAspSerGluGinAlaAspArgAspGlu2恥295300ProGinAspAlaAlaGin305310權(quán)利要求1.一種提高植物耐鹽及抗旱性的DNA序列，如SEQIDNO1所示。2.—種提高植物耐鹽及抗旱性的DNA序列，如SEQIDN0:2所示。3.權(quán)利要求1所述DNA序列編碼的氨基酸序列，如SEQIDN0:3所示。4.包含SEQIDNO:1所述的DNA或包含SEQIDNO:2所述的DNA的重組載體。5.用權(quán)利要求4所述的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。6.權(quán)利要求1或2所述的DNA序列用于提高植物耐鹽及抗旱性的用途。7.—種用權(quán)利要求1或2所述的DNA耐鹽及抗旱性轉(zhuǎn)基因植物的方法，步驟如下(1)將SEQIDNO:l或SEQIDN0:2所示序列可操作地連于植物表達(dá)調(diào)控序列，形成植物表達(dá)載體；(2)將歩驟(l)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞；(3)經(jīng)篩選獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞并最終再生轉(zhuǎn)基因植株及其后代，包括植物種子及植物組織。8.—種檢測樣品中是否含有權(quán)利要求1或2所述的DNA序列的方法，其特征在于用SEQIDN0:1制備的抗體與樣品進(jìn)行雜交，檢測抗體與樣品探針是否發(fā)生結(jié)合；所述樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于SEQIDNO:1或SEQIDNO:2核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間，引物長度為1550個(gè)核苷酸。全文摘要本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了可提高植物耐鹽及抗旱性的一種核苷酸編碼序列以及一種按植物并偏愛密碼子人工合成的核苷酸編碼序列。本發(fā)明構(gòu)建了包含上述基因的重組載體，分別將它們轉(zhuǎn)化至原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的宿主細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明將所述基因在植物中表達(dá)后，所獲得的轉(zhuǎn)基因植物對鹽、干旱脅迫等具有增強(qiáng)的抗性。文檔編號(hào)C07K14/415GK101418300SQ20071017615公開日2009年4月29日申請日期2007年10月22日優(yōu)先權(quán)日2007年10月22日發(fā)明者周正富,平淑珍,維張,敏林,婕潘,勁王,偉陸,明陳申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所