專利名稱：一種多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種多肽及其應(yīng)用。
技術(shù)背景噬菌體展示技術(shù)是將高度多樣性的多肽或蛋白展示于噬菌體衣殼蛋白表面的一項(xiàng) 技術(shù)。這一技術(shù)將展示分子的基因型和表型聯(lián)系在一起，極大地方便了多肽或蛋白分子 的功能性篩選。通過"吸附-洗脫-擴(kuò)增"的親和篩選過程，可以將文庫中的篩選所得分 子進(jìn)行多至108的富集，而且由于文庫中多肽序列豐富的多樣性(>109)，這一篩選過程是高通量篩選，由此得到的具有高度特異性和極強(qiáng)親合力的多肽或蛋白在生物醫(yī)學(xué)的基 礎(chǔ)研究和臨床診斷與治療的實(shí)踐中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。隨著噬菌體展示的不斷發(fā)展， 近年來眾多的研究人員將其用于活體的體內(nèi)篩選。國內(nèi)外研究資料表明體內(nèi)篩選是噬菌體展示研究中的新興領(lǐng)域，具有更加重要的生物學(xué)意義體外表達(dá)、純化所得的靶蛋白在空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能上都可能與機(jī)體內(nèi)的 天然狀態(tài)具有很大的差異，體內(nèi)篩選的策略更好地模擬在整體狀態(tài)下的多肽和血管表面 分子之間的相互作用；體內(nèi)篩選技術(shù)有可能發(fā)現(xiàn)新的靶器官血管表面表達(dá)分子，并借助 特異性結(jié)合多肽客觀地評價(jià)器官血管表面的分子表達(dá)水平；在篩選過程中就施以體內(nèi)的 選擇壓力，從而為篩選出具有潛在的臨床價(jià)值的多肽配體奠定基礎(chǔ)，這種多肽配體可以 作為示蹤劑和藥物的靶向性載體將核素、化療藥物或具有治療作用的基因片段轉(zhuǎn)運(yùn)到病 變局部，或本身就具有生物學(xué)效應(yīng)而作為藥物有效地應(yīng)用于臨床疾病的診斷和治療。噬菌體展示隨機(jī)多肽文庫在靶向性小分子多肽的體內(nèi)篩選方面體現(xiàn)出了重要的應(yīng) 用價(jià)值。與抗體藥物相比，多肽至少具有下列優(yōu)點(diǎn)1)與重組技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工藝 相比，多肽篩選、合成與修飾的成本較底；2)以單位質(zhì)量計(jì)算具有明顯的高生物學(xué)活 性；3)在室溫下比抗體更穩(wěn)定；4)不容易產(chǎn)生免疫排異，副作用??；5)具有很強(qiáng)的 器官穿透性。Pasqualini和Ruoslahti的研究小組對小鼠的肺、皮膚、胰腺、腸、子宮、腎上腺等 組織進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)在這些臟器中均存在相應(yīng)的血管內(nèi)皮特異性分子的異質(zhì)性表達(dá)，
這就提示機(jī)體血管腔并不是一個(gè)表面分子分布均勻一致的管道，其表面分子的分布與血 管所供應(yīng)的臟器有很強(qiáng)的相關(guān)性。根據(jù)這個(gè)結(jié)果，研究人員提出了 "血管密碼(Vascular Zip Codes)"的概念，即某個(gè)個(gè)體中不同臟器的血管內(nèi)皮具有不同的分子標(biāo)志物。 Pasqualini研究小組從遺傳性肥胖的小鼠體內(nèi)篩選出了與白色脂肪組織的微血管內(nèi)皮特 異性結(jié)合的噬菌體多肽，利用相應(yīng)的合成肽作為載體將誘導(dǎo)凋亡的藥物帶到局部血管可 使其發(fā)生凋亡，白色脂肪組織明顯萎縮，肥胖小鼠的體重下降且未出現(xiàn)明顯的副作用。 體內(nèi)篩選有效地模擬了正常的生物學(xué)狀態(tài)，對認(rèn)識血管的分子表達(dá)譜具有重要的價(jià) 值，而且其研究成果可以方便地過渡到臨床診斷或治療藥物的開發(fā)，因此，近年來這一 領(lǐng)域進(jìn)展迅速。隨著免疫學(xué)研究的不斷深入，人們認(rèn)識到胸腺在成年后依然具有生物學(xué)功能，在機(jī) 體免疫中起重要作用。胸腺功能的異常與免疫缺陷、自身免疫性疾病、感染、腫瘤等有 關(guān)。臨床上，某些胸腺相關(guān)疾病發(fā)生時(shí)常常引起胸腺T細(xì)胞輸出功能的異常增強(qiáng)，從而 導(dǎo)致一系列的臨床表現(xiàn)(如胸腺瘤所致的重癥肌無力)。此類疾病可以考慮通過抑制胸 腺輸出功能來改善全身的免疫狀態(tài)。T細(xì)胞受體重排切除環(huán)(TCR rearrangement excision circles, TRECs)是T細(xì)胞發(fā)育早期重排形成T細(xì)胞受體a基因時(shí)，存在于細(xì)胞染色體 外的環(huán)形DNA切除產(chǎn)物，是初始T細(xì)胞的特異性標(biāo)志。定量檢測外周血中的TRECs 含量可以用來評價(jià)胸腺輸出功能，可用于多種疾病診療過程中機(jī)體自身免疫狀態(tài)的評 估。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種能夠與胸腺特異性結(jié)合的多肽、編碼該多肽的核苷酸序列 及其表達(dá)載體。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供上述多肽、核苷酸序列及其表達(dá)載體的應(yīng)用。 本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)的 一種多肽，其氨基酸序列如SEQIDNo.l所示。氨基酸序列如SEQ IDNo.l所示的多肽的表達(dá)載體。所述的表達(dá)載體是質(zhì)粒、噬菌粒、 噬菌體、大腸桿菌。編碼SEQ ID No.l的核苷酸序列。含有編碼SEQIDNo.l的核苷酸序列的表達(dá)載體。所述的表達(dá)載體是質(zhì)粒、噬菌粒、 噬菌體、大腸桿菌。所述的多肽在制備靶向作用于胸腺的藥物或診斷試劑中的應(yīng)用。
所述的核苷酸在制備靶向作用于胸腺的藥物或診斷試劑中的應(yīng)用。所述的表達(dá)載體在靶向作用于胸腺的制備藥物或診斷試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果本研究利用噬菌體展示的隨機(jī)多肽文庫進(jìn)行小鼠的體內(nèi)篩選，分離與胸腺結(jié)合的噬 菌體多肽，借助TRECs,的定量評價(jià)考察其對胸腺輸出功能的影響，為開發(fā)核素標(biāo)記的 靶向性多肽藥物奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明提供的多肽、核苷酸、表達(dá)載體可用于制備靶向作用 于胸腺的藥物或診斷試劑。


圖1.噬菌體文庫的體內(nèi)篩選結(jié)果。A:—輪篩選后得到的噬菌體滴度僅為1(^pfo/mL，單位質(zhì)量的滴度為3.53*102pfU/g; B:與作為對照的腎臟相比，胸腺的噬菌體滴度很低。提示一輪篩選后非特異性結(jié)合已 經(jīng)較少，可以直接進(jìn)行序列分析，尋找高頻率的序列和一致性基序。圖2.噬菌體多肽CHAQGSAEC的結(jié)合能力分析。(多肽序列的兩側(cè)均有一個(gè)文庫自帶的Cys殘基，形成二硫鍵環(huán)化的結(jié)構(gòu)，下同)A:噬菌體多肽CHAQGSAEC可與胸腺的微血管結(jié)合；B:與對照的腎臟組織不結(jié)合；C:加入野生型噬菌體的陰性對照不染色；D:不加抗M13抗體的陰性對照不染色。圖3.多肽序列CHAQGSAEC抑制胸腺輸出功能的生物學(xué)活性。CHAQGSAEC無論是以噬菌體多肽的形式還是以游離多肽的形式，都能夠有效地 抑制胸腺輸出功能。
具體實(shí)施方式
以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。實(shí)施例1主要材料本發(fā)明中所使用的噬菌體多肽文庫Ph.D,C7C購買自NEB公司。該文 庫將隨機(jī)七肽融合到M13噬菌體次要衣殼蛋白(pIII)上而構(gòu)建成的一個(gè)組合文庫。與其 他NEB展示肽庫不同的是，所展示的隨機(jī)多肽兩側(cè)各有一個(gè)半胱氨酸。在非還原條件 下，這兩個(gè)半胱氨酸自發(fā)地形成一個(gè)二硫鍵，使展示的多肽環(huán)化。這樣使得展示多肽以 類似于空間構(gòu)像的形式表達(dá)在噬菌體表面，與目的蛋白更緊密地結(jié)合。文庫中含有 1.2"09個(gè)隨機(jī)序列，每個(gè)序列有大約200個(gè)拷貝。用于擴(kuò)增噬菌體的大腸桿菌菌株 ER2738也購自NEB公司。鼠齡為6-8周的BALB/c小鼠購自南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。
實(shí)驗(yàn)方法噬菌體文庫的體內(nèi)篩選將鼠齡為6-8周的BALB/c小鼠麻醉后，由尾靜脈注射入 溶解在200nLTBS中的2xlO"個(gè)轉(zhuǎn)化單位的噬菌體多肽。循環(huán)15分鐘后，在深度麻醉 的情況下，心臟灌注50mLTBS。之后解剖小鼠，取胸腺，稱重。將目的臟器放入lmL 含有蛋白酶抑制劑(PMSF lmM,抑酞酶2(Vg/mL,亮肽酶lpg/mL)的TBS中，充分 研磨。用含有1% BSA的上述溶液將研磨的組織洗滌三次后感染大腸桿菌ER2738，進(jìn) 行滴度計(jì)數(shù)。多肽序列分析從滴度計(jì)數(shù)<100個(gè)克隆的平板上挑取單克隆，擴(kuò)增后提取重組噬 菌體的基因組DNA。用M13(-96)引物(引物是公知的通用引物)進(jìn)行測序。利用EMBL 的ClustalW 1.83分析多肽的一致性基序和氨基酸組成。噬菌體多肽結(jié)合的鑒定將出現(xiàn)頻率最高的單克隆噬菌體多肽CHAQGSAEC尾靜 脈注射入麻醉的BALB/c小鼠，循環(huán)15分鐘后將小鼠再次麻醉，心臟灌注50mLTBS， 收獲小鼠胸腺，制成冰凍切片，進(jìn)行免疫組化染色。丙酮4'C固定30分鐘，PBS洗漆5 分鐘，經(jīng)3%&02處理15分鐘后，以5XBSA封閉45分鐘。加入抗M13抗體4'C過夜， PBST洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37'C孵育1小時(shí)，以PBST洗滌后加入 DAB顯色。蘇木素復(fù)染后經(jīng)酒精梯度脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片，上鏡觀察。多肽的體內(nèi)生物學(xué)功能分析:將鼠齡為6-8周的BALB/c小鼠由尾靜脈注射入2xl011 個(gè)轉(zhuǎn)化單位的含有一致性基序的噬菌體多肽CHAQGSAEC或100pM的合成游離多肽 CHAQGSAEC。分別循環(huán)15分鐘、1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)和24小時(shí)后取外周血，提 取全血DNA，用TRECs弓l物上游引物5'-CAGAGGGGTGCCTCTGTCA-3'(SEQ ID No.2)，下游引物5'-GGACCCCTCACAAAGTGTCG-3'(SEQ ID No.3)禾a SYBR Green I進(jìn)行熒光定量PCR，通過相對定量的方法(2—^et)評價(jià)多肽對胸腺輸出功能的影響。結(jié)果利用噬菌體多肽文庫Ph.D,C7C進(jìn)行體內(nèi)篩選， 一輪篩選后得到的噬菌體滴度僅為 103pfu/mL，單位質(zhì)量的滴度為3.53*102pfWg，與作為對照的腎臟相比滴度很低(圖1 A，B)。結(jié)果提示一輪篩選后出現(xiàn)一致性基序的可能性大，所以挑取單克隆進(jìn)行測序。測序可見出現(xiàn)頻率最高的噬菌體多肽序列為CHAQGSAEC,占到陽性克隆的50%， 該結(jié)果提示胸腺特異性結(jié)合的序列得到了富集。選擇噬菌體多肽CHAQGSAEC,通過 免疫組化鑒定其結(jié)合能力。證實(shí)其可與胸腺的微血管結(jié)合(圖2A)，與對照的腎臟組織 不結(jié)合(圖2 B),加入野生型噬菌體和不加抗M13抗體的陰性對照不染色(圖2 C,D)。
結(jié)果表明噬菌體多肽CHAQGSAEC能與胸腺特異性結(jié)合。噬菌體多肽CHAQGSAEC和合成的游離多肽CHAQGSAEC注入體內(nèi)后，利用全血 DNA進(jìn)行熒光定量PCR評價(jià)TRECs的表達(dá)。該多肽在不同時(shí)段均能夠不同程度的抑制 TRECs的表達(dá)量(圖3)。結(jié)果提示CHAQGSAEC無論是以噬菌體多肽的形式還是以 游離多肽的形式，都能夠有效地抑制胸腺輸出功能。結(jié)論利用噬菌體展示多肽文庫(NEB Ph.D,C7C)進(jìn)行小鼠體內(nèi)篩選，僅一輪篩選后就 分離出與胸腺結(jié)合的噬菌體多肽，測序結(jié)果提示存在一致性基序GSA。將出現(xiàn)頻率最高 的序列CHAQGSAEC注射入小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)其能夠與胸腺特異性結(jié)合，而且其無論是 以噬菌體多肽的形式還是以游離多肽的形式，都能夠有效地抑制胸腺輸出功能。本申請?zhí)峁┑亩嚯木幋a、該多肽的核苷酸序列以及它們的表達(dá)載體可用于制備靶向 作用于胸腺的藥物或診斷試劑，其制備方法采用本領(lǐng)域公知的技術(shù)即可。
〈110〉王自正俞楊杜同信瞿衛(wèi)立彥 〈120〉 一種多肽及其應(yīng)用 〈160〉 3<210> 1 <211〉 7 <212〉 PRT <213〉人工序列 〈220〉〈223〉小鼠胸腺特異性結(jié)合多肽，并具有抑制胸腺T細(xì)胞輸出功能的生物學(xué)活性 <400> 1His Ala Gin Gly Ser Ala Glu 1 5<210> 2 <211> 19 <212〉 DNA <213>人工序列 〈220〉〈223>上游引物 〈400〉 2cagaggggtg cctctgtca 19<210〉 3 〈211> 20 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉<223>下游引物 <400> 3ggacccctca caaagtgtcg 20
權(quán)利要求
1、一種多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2、 權(quán)利要求1所述多肽的表達(dá)載體。
3、 編碼權(quán)利要求l所述多肽的核苷酸序列。
4、 含有權(quán)利要求3所述核苷酸序列的表達(dá)載體。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體是質(zhì)粒、噬菌粒、 噬菌體、大腸桿菌。
6、 權(quán)利要求1所述的多肽在制備靶向作用于胸腺的藥物或診斷試劑中的應(yīng)用。
7、 權(quán)利要求3所述的核苷酸在制備靶向作用于胸腺的藥物或診斷試劑中的應(yīng)用。
8、 權(quán)利要求2或4所述的表達(dá)載體在靶向作用于胸腺的制備藥物或診斷試劑中的應(yīng)
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，公開了一種多肽及其應(yīng)用。該多肽的氨基酸序列如SEQID No.1所示，該多肽、編碼該多肽的核苷酸序列及他們的表達(dá)載體可用于制備靶向作用于胸腺的藥物或診斷試劑。
文檔編號C07K7/06GK101210044SQ20071019234
公開日2008年7月2日 申請日期2007年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月25日
發(fā)明者楊 俞, 杜同信, 王自正, 衛(wèi) 瞿, 彥 立 申請人:王自正;俞 楊;杜同信;瞿 衛(wèi);立 彥