專利名稱：通過d⁸或d¹⁰金屬絡(luò)合物對(duì)生物分子的無標(biāo)記光學(xué)檢測及表征的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于樣品中攜帶多個(gè)電荷的生物分子的無標(biāo)記光學(xué)檢 測及表征的方法和材沖+ 。
背景技術(shù)：
核酸，DNA或RNA,單鏈或雙鏈的，是活細(xì)胞中最基本和最重要 的生物分子。DNA編碼可在后代間進(jìn)行傳遞的遺傳信息。通過轉(zhuǎn)錄， 編碼的信息轉(zhuǎn)移到可與核糖體(特定的核糖體RNA和蛋白質(zhì)的復(fù)合物) 結(jié)合的mRNA中。在含反義密碼子和特定氨基酸的tRNA的協(xié)助下， mRNA中攜帶的信息被翻譯為由20種氨基酸組成的精確的多肽序列。 多肽折疊成確定的三維結(jié)構(gòu)，從而得到蛋白質(zhì)。各種類型的蛋白質(zhì)可 作為構(gòu)建模塊、酶和調(diào)控因子。蛋白質(zhì)與其它類型的生物分子一起負(fù) 責(zé)活細(xì)胞的構(gòu)建及執(zhí)行正確的功能。
由于核酸具有帶多個(gè)陰性電荷的磷酸功能基團(tuán)，因此是聚陰離子。 在生理?xiàng)l件下，聚(天冬氨酸)和聚(谷氨酸)形成聚羧酸酯，它們 也屬于聚陰離子。另一方面，聚賴氨酸、聚精氨酸和聚組氨酸(在酸 性水溶液中)攜帶多個(gè)陽性電荷，稱為聚陽離子。許多蛋白質(zhì)在溶液 pH不在其等電點(diǎn)(pl)值時(shí)可攜帶多個(gè)凈的陽性或陰性電荷。根據(jù)以 上所述，檢測和表征具有多個(gè)電荷的生物分子是非常重要的，這不僅 可幫助我們理解細(xì)胞是如何發(fā)揮功能的，輔助生物/生物化學(xué)研究，而 且可提供推動(dòng)生物醫(yī)學(xué)研究、臨床診斷和新藥開發(fā)的途徑。
正方形扁平的(18或d"金屬絡(luò)合物的令人驚奇的結(jié)構(gòu)和鍵合特性 已引起人們長久興趣，最近對(duì)該類金屬絡(luò)合物的分光鏡性質(zhì)產(chǎn)生了極 大的興趣。已知這些金屬絡(luò)合物在固態(tài)下具有形成高度有序的延伸的 線
配體的兀*"兀堆積相互作用導(dǎo)致可觀察到有趣的分光鏡性質(zhì)和發(fā)光特 性，最近已有基于這些發(fā)現(xiàn)而進(jìn)行分子識(shí)別、化學(xué)檢測及光電子應(yīng)用
方面的寺艮道。(17, 23, 27)
上述(18或d"金屬絡(luò)合物的代表性例子是炔基鉑(II)三聯(lián)吡啶絡(luò) 合物(25, 26， 28)。通過改變?nèi)軇┑臉O性，或使用聚電解質(zhì)(聚陰離子)， 即聚丙烯酸鹽，可誘導(dǎo)(18或cP金屬絡(luò)合物聚集和自組裝，從而使 UV/vis和發(fā)射光譜發(fā)生可觀察到的顯著變化。
目前有多種檢測方法可對(duì)多電荷生物分子進(jìn)行沖企測和表征。4旦大 部分常用的現(xiàn)存方法需要精密的分析技術(shù)和昂貴的設(shè)備。許多方法需 要用放射性同位素或熒光物質(zhì)等檢測基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記，而且需要雜交流 程進(jìn)行核酸檢測。因此，這些方法通常需要高昂的花費(fèi)，復(fù)雜的技術(shù)， 而且是耗時(shí)的。
本發(fā)明提供了一種新型的檢測和表征多電荷生物分子的無標(biāo)記檢 測法。將d8或d1Q金屬絡(luò)合物與帶相反電荷的生物分子結(jié)合可誘導(dǎo)金屬 絡(luò)合物的聚集和自組裝，從而可產(chǎn)生明顯的UV/vis、發(fā)射和CD強(qiáng)度 的變化。該檢測法不僅提供了一種檢測多電荷生物分子存在的方法， 而且可用于研究其二級(jí)結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)/構(gòu)象變化。
發(fā)明概述
一般來說，本發(fā)明提供了檢測和/或表征帶多個(gè)電荷的生物分子的 組合物、方法和試劑盒。將帶電荷的dS或d"金屬絡(luò)合物與生物分子混 合。帶電荷的金屬絡(luò)合物與帶相反電荷的生物分子的靜電結(jié)合可誘導(dǎo) 金屬絡(luò)合物通過金屬-金屬相互作用和/或金屬絡(luò)合物中相應(yīng)的配位體 間的兀， *兀堆積相互作用而進(jìn)行聚集和自組裝，從而使金屬絡(luò)合物的光 學(xué)性質(zhì)發(fā)生顯著改變，例如UV/vis、發(fā)射和CD強(qiáng)度的變化(29)。
本發(fā)明提供了 一種檢測和/或表征多電荷生物分子的包含帶電荷的 W或d"金屬絡(luò)合物的組合物，其中金屬絡(luò)合物與多電荷生物分子靜電 結(jié)合，從而誘導(dǎo)金屬絡(luò)合物通過金屬-金屬相互作用、兀*"兀相互作用 或兩種相互作用的組合而進(jìn)行聚集和自組裝。
本發(fā)明也提供了 一種檢測樣品中目標(biāo)多電荷生物分子存在的檢測 方法，所述方法包括(a)將帶電荷的W或d"金屬絡(luò)合物與可能含有 目標(biāo)多電荷生物分子的樣品在有效使(18或d"金屬絡(luò)合物與目標(biāo)多電 荷生物分子通過靜電相互作用彼此結(jié)合的條件下進(jìn)行合并，其中金屬 絡(luò)合物包含至少一種過渡態(tài)金屬和至少一種相應(yīng)的配位體，然后使帶
電荷的W或(11()金屬絡(luò)合物聚集體自組裝，和(b)檢測帶電荷的dS或d1G
金屬絡(luò)合物聚集體的光學(xué)性質(zhì)。
本發(fā)明進(jìn) 一 步提供了用于檢測樣品中多電荷生物分子的試劑盒，
包括(a)含有帶電荷的(18或(11()金屬絡(luò)合物的組合物，其中金屬絡(luò)合物 與多電荷生物分子靜電結(jié)合，以誘導(dǎo)(18或d"金屬絡(luò)合物通過金屬". 金屬相互作用和兀'"兀相互作用而聚集和自組裝，和(b)使用說明書。
附圖的簡要描述


圖1顯示了作為說明性實(shí)例的兩種陽離子dS金屬絡(luò)合物。
圖2顯示了合成圖1所示一個(gè)說明性實(shí)例(絡(luò)合物2)的代表性途徑。
圖3顯示了其中一個(gè)代表性(18金屬絡(luò)合物——30pM絡(luò)合物l(線 a )的覆蓋電子吸收光譜，以及與90pM聚(dA)2s (線b )、聚(dG)25 (線
C)、聚(dC)25 (線d)和聚(dT)25 (線e)結(jié)合后吸收光鐠的變化。
圖4顯示了其中 一個(gè)代表性d8金屬絡(luò)合物——30pM絡(luò)合物2 (線 a )的覆蓋電子吸收光譜，以及與90pM聚(dA)25 (線b )、聚(dC)25 (線 c)、 聚(dG)25 (線d)和聚(dT)25 (線e)結(jié)合后吸收光譜的變化。
圖5顯示了其中一個(gè)代表性(18金屬絡(luò)合物——30jaM絡(luò)合物l(線 a )的覆蓋發(fā)射光譜，以及與90 pM聚(dA)25 (線b )、聚(dC)25 (線c )、 聚(dG)25 (線d)和聚(dT)25 (線e)結(jié)合后發(fā)射光譜的變化。
圖6顯示了其中 一個(gè)代表性d8金屬絡(luò)合物——30pM絡(luò)合物2 (線 a)的覆蓋發(fā)射光譜，以及與90pM聚(dA)25 (線b)、聚(dC)25 (線c )、
聚(dG)25 (線d)和聚(dT)25 (線e)結(jié)合后發(fā)射光譜的變化。
圖7顯示了其中 一個(gè)代表性單鏈核酸——90jxM聚(dT)25 (線a )的 覆蓋CD光譜，以及其與(18金屬絡(luò)合物30pM絡(luò)合物1 (線b )和絡(luò)合 物2 (線c )結(jié)合后CD光譜的變化。
圖8顯示了其中一個(gè)代表性單鏈核酸——90|liM聚(dA)25 (線a) 的覆蓋CD光譜，以及其與dS金屬絡(luò)合物30pM絡(luò)合物l(線b )和30pM 和60|iiM絡(luò)合物2 (線c和d )結(jié)合后CD光譜的變化。備注通過從 線c中減去線a而得到差別CD光鐠。
圖9顯示了其中一個(gè)代表性單鏈核酸——90pM聚(dC)25 (線a) 的覆蓋CD光譜，以及其與(18金屬絡(luò)合物30|iiM絡(luò)合物l(線b )和30|uM 和45^M絡(luò)合物2 (線c和d)結(jié)合后CD光譜的變化。
圖IO顯示了其中一個(gè)代表性單鏈核酸——90pM聚(dG)25 (線a) 的覆蓋CD光譜，以及其與dS金屬絡(luò)合物30jiM絡(luò)合物1 (線b )和絡(luò) 合物2 (線c)結(jié)合后CD光鐠的變化。
圖11顯示了 G四聯(lián)體(quadruplex)結(jié)構(gòu)中4個(gè)鳥噤呤堿基間的 氫鍵。
圖12顯示了代表性(18金屬絡(luò)合物——30)uM絡(luò)合物l (線a)和2 (線b)的覆蓋電子吸收光譜，以及其與90|uM polyU (線c和d分別 為絡(luò)合物1和2)結(jié)合后吸收光譜的變化。
圖13顯示了代表性dS金屬絡(luò)合物——30)uM絡(luò)合物l (線a)和2 (線b)的覆蓋發(fā)射光譜，以及其與90pMpolyU結(jié)合后發(fā)射光譜的變 化(線c和d分別為絡(luò)合物1和2 )。
圖14顯示了其中 一個(gè)代表性(f金屬絡(luò)合物——30jaM絡(luò)合物l(線 a)的覆蓋電子吸收光譜，以及其與90pM聚(天冬氨酸鈉)(線b )和聚 (谷氨酸鈉)(線c)結(jié)合后吸收光譜的變化。
圖15顯示了其中 一個(gè)代表性dS金屬絡(luò)合物——30pM絡(luò)合物2(線 a)的覆蓋電子吸收光譜，以及其與90jaM聚(天冬氨酸鈉)(線b )和聚 (谷氨酸鈉)(線c)結(jié)合后吸收光譜的變化。
圖16顯示了代表性W金屬絡(luò)合物——30pM絡(luò)合物l (線a)和2 (線b )的覆蓋發(fā)射光譜，及其與90|iiM聚(天冬氨酸鈉)(線c和d分 別為絡(luò)合物1和2)和聚(谷氨酸鈉)(線e和f分別為絡(luò)合物1和2) 結(jié)合后發(fā)射光譜的變化。
圖17顯示了其中一個(gè)代表性dS金屬絡(luò)合物——30jiM絡(luò)合物2結(jié) 合90pM聚(天冬氨酸鈉)(線a)和聚(谷氨酸鈉)(線b)后的覆蓋CD 光譜。
圖18顯示了胞嘧啶-質(zhì)子化胞嘧啶(C-C+)堿基對(duì)間的氬鍵。
圖19顯示了 90 |uM聚(dC)25 + 30|uM絡(luò)合物2所的覆蓋UV-vis吸
收和發(fā)射光譜。介質(zhì)5 mMHOAc-NaOAc、 10mMNaCl、 pH 5.0。 圖20顯示了聚(dC)25 (線a)及其與絡(luò)合物2結(jié)合后(線b)的覆
蓋CD光"i普。介質(zhì)5mMHOAc畫NaOAc、 10mMNaCl、 pH 5.0。
圖21顯示了 30|aM絡(luò)合物2 (線a )及其與90(aM聚(dA)25結(jié)合后 (線b )的覆蓋UV-vis吸收光譜。介質(zhì)80%水緩沖液(5 mM Tris-HCl、 10 mM NaCl、 pH 7.5 ) + 20% CH3CN。
圖22顯示了 30|iiM絡(luò)合物2 (線a )及其與90)liM聚(dA》5結(jié)合后 (線b)的覆蓋發(fā)射光鐠。介質(zhì)80%水緩沖液(5 mMTris-HCl、 10 mM NaCl、 pH 7.5 ) + 20% CH3CN。
圖23顯示了 30pM絡(luò)合物2(線a)及其與寡核苦酸(CAT TAC TGG ATC TAT CAA CAG GAG )(線b )結(jié)合后的覆蓋UV-vis吸收光譜。介 質(zhì)80%水緩沖液(5 mM Tris-HCl、 10mMNaCl、 pH 7.5 ) + 20% TFE。
圖24顯示了與90|iiM(總堿基濃度)寡核苷酸(CAT TAC TGG ATC TAT CAA CAG GAG )結(jié)合后的30)liM絡(luò)合物2的CD光鐠。介質(zhì)80% 水緩沖液(5 mMTris-HCl、 10mMNaCl、 pH 7.5 ) + 20% TFE。
圖25顯示了與45|uM聚(dA)25 + 45)uM聚(dT)25 (線a ); 90|uM聚 (dA)25 + 90|liM聚(dT)25 (線b ); 180jiM ,A)25 + 180, fl(dT)25 (線 c ); 270juM聚(dA)25 + 270|liM聚(dT)25 (線d )結(jié)合后的30jiM絡(luò)合物 2的覆蓋UV-vis吸收光譜。介質(zhì)5 mM Tris-HCl、 10mMNaCl、 pH 7.5。
圖26顯示了與45|uM聚(dA)25 + 45|uM聚(dT)25 (線a ); 90|uM聚 (dA)25 + 90|uM聚(dT)25 (線b ); 180)liM聚闊25 + 180|uM ,T)25 (線 c ); 270|uM聚(dA)25 + 270|uM聚(dT)25 (線d )結(jié)合后的30)liM絡(luò)合物 2的覆蓋發(fā)射光譜。介質(zhì)5mMTris-HCl、 10mMNaCl、 pH7.5。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述 定義
以下每個(gè)在本申請(qǐng)中使用的術(shù)語除非特別聲明外均具有以下闡述 的含義
此處所用術(shù)語"單鏈核酸"可以是任何長度的，天然或人工合成的單 鏈DNA、 RNA,任何衍生物或其類似物，只要它攜帶負(fù)電荷及核堿基 序列即可。可以是雙螺旋DNA或RNA部分，任何DNA、 RNA、蛋白 質(zhì)、糖、脂的組合部分及其衍生物?？梢栽谌芤褐凶杂煞植?，或固定 在固體支持物表面。核酸可以直接從樣品溶液或從擴(kuò)增的基因或基因 片段獲得。
此處所用術(shù)語"蛋白"或"多肽"可以是任何長度的天然或人工合成 的蛋白質(zhì)，任何衍生物或其類似物，只要它帶有基本的肽序列即可。
可以是任何DNA (雙鏈或單鏈)、RNA(雙鏈或單鏈)、蛋白質(zhì)、糖、
脂的任何組合部分，或其衍生物。可以在溶液中自由分布，或固定在
固體支持物表面。
此處所用術(shù)語"生物分子"可以是DNA、 RNA、蛋白質(zhì)、糖、月旨、
其組合及帶有多電荷的衍生物。可以在溶液中自由分布，或固定在固
體支持物表面。
此處所用術(shù)語"電荷的"可以是陰離子的或陽離子的。
此處所用術(shù)語"帶電荷的W或d"金屬絡(luò)合物聚合體"可以是任何含
至少一種(18或d1Q電子構(gòu)象，帶有凈的正或負(fù)電荷的金屬中心的金屬絡(luò)
合物間的靜電相互作用而引起金屬絡(luò)合物的局部濃度濃縮。
此處所用術(shù)語"相應(yīng)的配位體"可以是任何可與金屬中心形成配<介 鍵的供體配體。
本發(fā)明實(shí)施方案
本發(fā)明提供一種檢測和/或表征多電荷生物分子的包含帶電荷的d8 或d"金屬絡(luò)合物的組合物，其中金屬絡(luò)合物與多電荷生物分子靜電結(jié) 合，以通過金屬*"金屬相互作用、兀"*兀相互作用或兩種相互作用的 組合來誘導(dǎo)金屬絡(luò)合物的聚集和自組裝。
在一個(gè)實(shí)施例中，帶電荷的(18或d^金屬絡(luò)合物包含至少一種過渡 態(tài)金屬和至少 一種相應(yīng)的配位體。過渡態(tài)金屬的非限制性實(shí)例包括可 參與金屬"'金屬相互作用的鉑(Pt)、金(Au)、 4巴(Pd)、銠(Rh)、 銥(Ir)和銀(Ag)。相應(yīng)的配位體的非限制性例子包括芳基、烷基、 炔基及其書t生物；氮供體配體包括吡咬、聯(lián)吡咬、三耳關(guān)吡i定、多吡咬、 芳基吡啶、二芳基吡啶、芳基聯(lián)吡啶、菲咯啉、二。秦、三。秦、酞菁、 亞胺、二亞胺、三亞胺、卟啉及其衍生物；硫、磷及氧供體配體包括 膦、硫醇鹽、羧酸鹽及其衍生物。相應(yīng)的配位體也可以具有以下結(jié)構(gòu) (a)<formula>formula see original document page 11</formula>
(b)<formula>formula see original document page 11</formula>
帶電荷的(58或d"金屬絡(luò)合物應(yīng)至少帶有一個(gè)正或負(fù)電荷。優(yōu)選 地，金屬絡(luò)合物具有扁平結(jié)構(gòu)或部分扁平結(jié)構(gòu)，及具有至少一個(gè)可進(jìn) 行兀* ，兀堆積相互作用的相應(yīng)的配位體。
優(yōu)選地，多電荷生物分子應(yīng)帶有至少3個(gè)凈電荷，以誘導(dǎo)帶電荷 的(18或(11()金屬絡(luò)合物的聚集。
本發(fā)明也提供了一種檢測樣品中目標(biāo)多電荷生物分子存在或不存 在的檢測方法，所述方法包括(a)將帶電荷的W或d"金屬絡(luò)合物與 可能含有目標(biāo)多電荷生物分子的樣品在有效使W或<11()金屬絡(luò)合物與 目標(biāo)多電荷生物分子通過靜電相互作用彼此結(jié)合的條件下進(jìn)行合并， 其中金屬絡(luò)合物包含至少一種過渡態(tài)金屬和至少一種相應(yīng)的配位體， 然后使帶電荷的d8或cT金屬絡(luò)合物聚集體自組裝，和(b)檢測帶電荷 的W或cT金屬絡(luò)合物聚集體的光學(xué)性質(zhì)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種檢測樣品溶液中目標(biāo)單鏈核 酸分子的方法。目標(biāo)核酸分子可直接^:分析，或在分析前進(jìn)行擴(kuò)增。 該方法包括將帶電荷的(18或d^金屬絡(luò)合物與可能含目標(biāo)核酸分子的 樣品溶液在可有效使至少一個(gè)單鏈核酸與(18或(11()金屬絡(luò)合物靜電結(jié) 合的條件下合并；測定是否至少有一個(gè)單鏈核酸與W或cT金屬絡(luò)合物 靜電結(jié)合，其中(18或(11()金屬絡(luò)合物的自組裝及隨后目標(biāo)核酸分子存在 與否通過光學(xué)性質(zhì)，例如比色檢測法、光致發(fā)光檢測法或CD光譜分析 中的變化來指示。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種表征目標(biāo)單鏈核酸的結(jié)構(gòu) 特征的方法。該方法包括將其結(jié)構(gòu)特征已良好表征的單鏈核酸分子與 帶電荷的(18或(11()金屬絡(luò)合物在有效使至少一個(gè)單鏈核酸與(18或d1Q
金屬絡(luò)合物靜電結(jié)合的條件下合并，以形成結(jié)合絡(luò)合物；然后使(f或 (T金屬絡(luò)合物進(jìn)行自組裝，其中(18或d^金屬絡(luò)合物的自組裝是通過 其光學(xué)性質(zhì)，例如比色檢測法、光致發(fā)光檢測法或CD光譜分析來進(jìn) 行記錄的。通過用不同已知結(jié)構(gòu)性質(zhì)的核酸分子進(jìn)行這種實(shí)驗(yàn)，其組 合信息可提供一種有效地推測目標(biāo)單鏈核酸結(jié)構(gòu)特征的方法。
在另 一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了 一種檢測目標(biāo)單鏈核酸結(jié)構(gòu) 變化的方法。該方法可通過兩種不同方式進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中， 該方法包括將目標(biāo)單鏈核酸分子與dS或d"金屬絡(luò)合物在有效使至少 一個(gè)單鏈核酸與dS或(11()金屬絡(luò)合物靜電結(jié)合的條件下合并，以形成結(jié) 合絡(luò)合物；然后使(18或d^金屬絡(luò)合物進(jìn)行自組裝，其中dS或d"金屬 絡(luò)合物的自組裝是通過其光學(xué)性質(zhì)，例如比色檢測法、光致發(fā)光檢測 法或CD光譜分析來進(jìn)行記錄的。通過在不同條件(例如不同溫度、不 同離子強(qiáng)度或加入可能引起目標(biāo)核酸分子結(jié)構(gòu)特征改變的化合物)下 進(jìn)行這種實(shí)驗(yàn)，記錄光學(xué)性質(zhì)，從而可通過比較光學(xué)性質(zhì)的變化而推 測其結(jié)構(gòu)性質(zhì)的變化。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括將目標(biāo)核酸分子暴露在可引起 結(jié)構(gòu)性質(zhì)變化的不同條件下；將目標(biāo)核酸分子與帶電荷的d8或d1G金屬 絡(luò)合物在有效使至少一個(gè)單鏈核酸與W或(11()金屬絡(luò)合物靜電結(jié)合的 條件下合并，以形成結(jié)合絡(luò)合物；然后使(18或d"金屬絡(luò)合物自組裝， 其中018或d"金屬絡(luò)合物的自組裝是通過其光學(xué)性質(zhì)，例如比色檢測 法、光致發(fā)光檢測法或CD光語分析來進(jìn)行記錄的。然后用記錄的光學(xué) 性質(zhì)的變化來推測目標(biāo)核酸分子結(jié)構(gòu)性質(zhì)的變化。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種檢測樣品溶液中目標(biāo)核 酸分子的突變的方法。該方法包括獲得含有目標(biāo)核酸分子的樣品溶液； 將含有目標(biāo)核酸分子的樣品溶液與具有能夠與可含有一個(gè)或幾個(gè)突變
的目標(biāo)核酸分子區(qū)雜交的核香酸序列的單鏈核酸探針合并，以形成檢 測雜交溶液；將包括不含突變的新目標(biāo)核酸分子的對(duì)照溶液與能夠和 目標(biāo)核酸分子完全雜交的單鏈核酸探針合并，以形成對(duì)照雜交溶液； 維持雜交溶液溫度在第一雜交溶液的融解溫度與第二對(duì)照雜交溶液的 融解溫度之間，將4企測和對(duì)照雜交溶液在有^^f吏雜交溶液至少一個(gè)未 雜交的探針與W或d"金屬絡(luò)合物靜電結(jié)合的條件下暴露于帶電荷的 ds或d"金屬絡(luò)合物，以形成結(jié)合絡(luò)合物；然后使dS或d"金屬絡(luò)合物
自組裝，其中W或d"金屬絡(luò)合物的自組裝是通過其光學(xué)性質(zhì)，例如比
色檢測法、光致發(fā)光檢測法或CD光譜分析來進(jìn)行記錄的；并測定檢測 和對(duì)照雜交溶液的光學(xué)性質(zhì)是否顯著不同，從而推測目標(biāo)核酸分子中 是否存在突變。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種^r測樣品溶液中目標(biāo)多 電荷蛋白存在的方法。該方法包括將帶電荷的d8或d1G金屬絡(luò)合物與可 能含有目標(biāo)多電荷蛋白的樣品溶液在有效使至少一個(gè)目標(biāo)多電荷蛋白
與dS或(11()金屬絡(luò)合物靜電結(jié)合的條件下合并，然后使(f或W金屬絡(luò) 合物自組裝；并測定是否至少有一個(gè)目標(biāo)多電荷蛋白與(18或d"金屬絡(luò) 合物靜電結(jié)合，其中d8或d1G金屬絡(luò)合物的自組裝和隨后的目標(biāo)多電荷 蛋白是否存在是通過其光學(xué)性質(zhì)的變化，例如比色檢測法、光致發(fā)光 檢測法或CD光譜分析來進(jìn)行指示。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了包括各個(gè)構(gòu)成部分，可使用戶進(jìn)行一個(gè)或多 個(gè)本發(fā)明上述方法的試劑盒。具體地，本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種用于 檢測樣品中多電荷生物分子的試劑盒，所述試劑盒包括(a)含有帶電荷 的cf或cT金屬絡(luò)合物的組合物，其中金屬絡(luò)合物與多電荷生物分子靜 電結(jié)合，以誘導(dǎo)cf或d"金屬絡(luò)合物通過金屬'"金屬相互作用和兀，"兀 相互作用而聚集和自組裝，和(b)使用說明書。
該試劑盒最少包括第一容器，所述第一容器包含可以是陽離子或 陰離子的帶電荷(18或d"金屬絡(luò)合物的溶液，和第二容器，所述第二容 器包含包括至少一個(gè)帶至少3個(gè)與dS或c^金屬絡(luò)合物的電荷相反的凈 電荷的多電荷生物分子的水溶液。
實(shí)施例
以下實(shí)施例用于舉例說明本發(fā)明，而不對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定。 本領(lǐng)域中熟練人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的各種變化和修改均不偏離其主題
和范圍。
實(shí)施例1 - (18或(11()金屬絡(luò)合物的代表性實(shí)施例
提供了兩個(gè)金屬絡(luò)合物的實(shí)例(圖1)。絡(luò)合物1是通過本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知的現(xiàn)有文獻(xiàn)中的方法制備的，而絡(luò)合物2是通過圖2所示
的合成途徑制備的。兩種金屬絡(luò)合物均具有本發(fā)明所述的特別適于聚
集研究的特征。兩種絡(luò)合物均含有一個(gè)金屬中心(Pt)，它是(18過渡態(tài)
金屬離子，能夠參與金屬*"金屬相互作用。它們也包括可通過兀"*兀 堆積相互作用而纟皮此相互作用的芳族三吡，定配體。
實(shí)施例2-通過UV/vis光譜研究圖l所示的d8金屬絡(luò)合物與單鏈DNA
的結(jié)合
聚電解質(zhì)，即去質(zhì)子化聚丙烯酸可在甲醇和乙腈的有機(jī)溶劑混合
液中誘導(dǎo)絡(luò)合物1的聚集和自組裝。誘導(dǎo)的自組裝可根據(jù)金屬絡(luò)合物
和聚電解質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行解釋。絡(luò)合物的結(jié)構(gòu)幾乎是扁平的，并且
攜帶正電荷。另一方面，去質(zhì)子化聚丙烯酸帶有負(fù)電荷。正負(fù)電荷的
靜電相互作用使金屬絡(luò)合物與聚電解質(zhì)非常接近，即引起金屬絡(luò)合物
與聚陰離子結(jié)合。因此，金屬絡(luò)合物的局部濃度增加。同樣重要地， 金屬絡(luò)合物的正電荷被聚合物的負(fù)電荷平衡，從而大大消除金屬絡(luò)合
物間的排斥力。因此絡(luò)合物可通過金屬"'金屬相互作用和兀*"兀相互
作用或兩種作用的組合而容易地聚集和自組裝。
在水溶液中，情況略微不同，但基本原理是一樣的，其中芳族三 聯(lián)吡啶配體的疏水堆積相互作用可能起更重要的作用。另外的要求是 金屬絡(luò)合物必須在水中可充分溶解。絡(luò)合物1具有有限的溶解性，而 絡(luò)合物2在水溶液中表現(xiàn)出很好的溶解性。但這兩種絡(luò)合物在適于本 發(fā)明結(jié)合和聚集研究的濃度范圍(約30pM)都是易溶解的。
圖3和4顯示的是絡(luò)合物1和2的覆蓋電子吸收光譜，以及當(dāng)與 各種寡核苷酸，即poly(dA)25、 poly(dG)25、 poly(dC)25和poly(dT)25 (此 處及全文中poly(dA)25、 poly(dG)25、 poly(dC)25和poly(dT)25分別代表 具有25個(gè)重復(fù)的A、 G、 C和T單位的寡核苷酸)混合后相應(yīng)光譜的 變化。在整個(gè)本發(fā)明中的實(shí)驗(yàn)條件下，在室溫，含有5 mM Tris pH7.5/10 mMNaCl的水溶液中，可檢測到顯著的吸收變化。吸收變化根據(jù)寡核 苷酸的序列而顯著改變。對(duì)于poly(dT)25,絡(luò)合物1和2最大的吸收增 加和新峰形成分別在約581 nm和544 nm,對(duì)于poly(dA)25,沒有新峰 形成，僅觀察到吸收變化，對(duì)于poly(dC)25和poly(dG)25,可觀察到新 峰形成及中度的吸收變化。
根據(jù)我們以前的工作和其他相關(guān)研究，絡(luò)合物1和2在更長波長 處形成的新帶是由于金屬絡(luò)合物通過金屬*"金屬相互作用，兀*"兀相 互作用或兩種作用的組合而聚集導(dǎo)致的金屬-金屬-配體電荷轉(zhuǎn)移 ("MMLCT")過渡態(tài)。
實(shí)施例3-通過發(fā)射光譜研究圖1所示的dS金屬絡(luò)合物與單鏈DNA的
結(jié)合
隨著明顯的UV/vis變化，對(duì)某些寡核苷酸來說，在聚集和自組裝 后，在約800 nm處由于MMLCT三重來源而出現(xiàn)新的發(fā)射帶。
圖5和6顯示的是絡(luò)合物1和2的覆蓋發(fā)射光譜，以及其與各種 寡核苷酸(此處和全文中，發(fā)射光譜不進(jìn)行有關(guān)PMT反應(yīng)的校正)的 混合物相應(yīng)的發(fā)射光譜?？捎^察到各種金屬絡(luò)合物-寡核苷酸混合物顯 著的發(fā)射強(qiáng)度的變化。絡(luò)合物1和2本身在研究條件下幾乎是非發(fā)射 的。強(qiáng)度變化根據(jù)寡核苷酸序列而顯著改變。對(duì)于poly(dT)25,分別在 約784 nm和760 nm》見察到絡(luò)合物1和2最大的吸收增加和發(fā)射帶， 而p對(duì)于oly(dA)25,則具有一個(gè)很寬的，幾乎無結(jié)構(gòu)的弱強(qiáng)度的帶。 對(duì)于poly(dC)25和poly(dG)25而言，觀察到新帶，其中在780-790 nm范 圍具有最大帶，并且具有中等強(qiáng)度。
實(shí)施例4-通過CD光譜研究圖1所示的d8金屬絡(luò)合物與單鏈DNA的
結(jié)合
圖7-10顯示的是被研究的寡核苷酸的CD光語，以及與絡(luò)合物1 和2混合后的相應(yīng)光譜變化。對(duì)某些寡核苷酸而言，可觀察到顯著的 光譜變化。當(dāng)絡(luò)合物2與poly(dT)25混合時(shí)，觀察到在約307 nm到550 nm的中等強(qiáng)度的寬的陰性帶，在約296 nm到278 nm的中等強(qiáng)度的陽 性帶，以及在約207 nm的一個(gè)很強(qiáng)的陽性帶(圖7 )。相反，當(dāng)絡(luò)合 物2與poly(dC)25混合時(shí)，觀察到相反結(jié)果，其中觀察到在約315 nm到 525 nm的中等強(qiáng)度的寬的陽性帶，在約294 nm、 270 nm和239 nm (肩 部)的中等強(qiáng)度的陰性帶以及在約197 nm的一個(gè)很強(qiáng)的陰性帶(圖9 )。 某些混合物表現(xiàn)出很小的光譜變化，例如當(dāng)poly(dG)25與金屬絡(luò)合物混 合時(shí)，僅可觀察到很小的強(qiáng)度改變，而且沒有新帶產(chǎn)生(圖10)。
非手性分子可通過兩條不同途徑獲得手性(i)將非手性分子接近 手性中心，即將非手性發(fā)色團(tuán)置于手性環(huán)境中(例如苯酚與環(huán)糊精結(jié) 合)，(ii)非手性分子可排列成螺旋結(jié)構(gòu)，從而獲得手性(21)。已知核 酸是天然的手性的，因?yàn)樗鼈兒惺中缘奶遣糠?。然而，我們的結(jié)果 清晰地表明絡(luò)合物與核酸的結(jié)合不總是誘導(dǎo)手性。例如，絡(luò)合物1和2 與poly(dG)25結(jié)合均不能引起任何CD光譜變化，而絡(luò)合物1與 poly(dC)25結(jié)合也只引起很小的CD光鐠變化。因此結(jié)果表明誘導(dǎo)的手 性不是簡單的將鉑絡(luò)合物與手性核酸接近的結(jié)果，而更可能與鉑絡(luò)合 物與陰離子磷酸位點(diǎn)結(jié)合，由這些正方形-扁平cf鉑(II)三聯(lián)吡啶單 位通過金屬，"金屬和w兀相互作用誘導(dǎo)而進(jìn)行螺旋排列有關(guān)。絡(luò)合 物的螺旋超分子排列的證據(jù)可通過在聚(L-谷氨酸)和聚(D-谷氨酸)存在 下獲得的CD光譜的鏡向關(guān)系和其與在也可以具有不同螺旋手性的各 種寡核苷酸存在下CD光譜的相似性而反映出來(圖17,參見實(shí)施例5)。 因此結(jié)果表明金屬絡(luò)合物陽離子與寡核苷酸結(jié)合后可自組裝成具有不 同手性的螺旋超分子排列。
金屬絡(luò)合物與各種寡核苷酸混合后光學(xué)性質(zhì)的改變明顯與絡(luò)合物 的結(jié)構(gòu)性質(zhì)相關(guān)，，以及更重要地，與寡核苷酸的一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)明顯 相關(guān)。例如，性質(zhì)與其它寡核苷酸明顯不同的poly(dA)25導(dǎo)致最小程度 的金屬絡(luò)合物聚集，這可能是由于核酸堿基腺噪呤與配體三聯(lián)吡啶環(huán) 通過芳族兀* *兀相互作用而發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，從而干涉金屬絡(luò)合物 的自組裝過程。值得注意的是，其它噤呤堿基，鳥嘌呤堿基dG可誘導(dǎo) 更好的金屬絡(luò)合物的聚集，這可能是因?yàn)閜oly(dG)25在水溶液中形成一 種非常特有的稱為G四聯(lián)體的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中鳥嘌呤堿基通過氫鍵相 互堆積在一起(圖11),因此，避免了與金屬絡(luò)合物的兀"'兀相互作用。 胸腺嘧啶堿基dT不能通過兀，"兀堆積相互作用而相互結(jié)合，而且其相 對(duì)疏水特性和較大的甲基的存在也可能阻止其與金屬絡(luò)合物的w兀 相互作用，因此，poly(dT)25可誘導(dǎo)最大程度的金屬絡(luò)合物的聚集和自 組裝。
實(shí)施例5-通過UV/vis、發(fā)射和CD光譜研究圖1中所示(18金屬絡(luò)合物
與RNA分子(polvU)、聚f天冬氨酸鈉)和聚(谷氨酸鈉)的結(jié)合
圖12和13顯示的是絡(luò)合物1或2與polyU混合后的UV/vis和發(fā) 射光譜的變化。圖14-17顯示的是絡(luò)合物1或2與聚(天冬氨酸鈉)和聚 (谷氨酸鈉)混合后UV/vis、發(fā)射和CD光譜的變化。這些生物分子在水 溶液中于接近中性pH條件下均帶有多個(gè)負(fù)電荷，因此就象與單鏈核酸 結(jié)合一樣，當(dāng)與帶正電荷的金屬絡(luò)合物混合時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)絡(luò)合物1和2 發(fā)生聚集和自組裝，從而導(dǎo)致隨后的顯著光譜性質(zhì)的變化。
實(shí)施例6-通過UV/vis、發(fā)射和CD光譜研究圖1中所示d8金屬絡(luò)合物
2與i-基序DNA結(jié)構(gòu)的結(jié)合
雖然已知poly(dC)在堿性條件下可形成螺旋構(gòu)象，但在酸性條件 下，poly(dC)作為C-C+ (胞嘧啶-質(zhì)子化胞嘧啶)堿基配對(duì)的結(jié)果而形 成非常獨(dú)特的i-基序結(jié)構(gòu)(圖18)。在pH5.0,我們的結(jié)果表明絡(luò)合物 2與poly(dC)25混合時(shí)可改善自組裝，表現(xiàn)為在UV-vis和發(fā)射光譜中 MMLCT帶均有增強(qiáng)(圖19)。然而，發(fā)現(xiàn)由金屬絡(luò)合物結(jié)合而誘導(dǎo)的 CD光譜與以前獲得的螺旋組裝非常不同，而且與金屬絡(luò)合物結(jié)合前最 初形成的i-基序結(jié)構(gòu)(圖20)的CD信號(hào)不一樣。雖然這種緊湊的i-基序結(jié)構(gòu)與CD顯示的螺旋組裝不同，但是它有利于絡(luò)合物陽離子的自 組裝。
實(shí)施例7-通過UV/vis、發(fā)射和CD光譜研究圖1中所示W(wǎng)金屬絡(luò)合物 2與單鏈DNA的結(jié)合，有機(jī)溶劑的影響
由于眾所周知加入有機(jī)溶劑可以降低水介質(zhì)中的疏水相互作用， 并且在這種情況下降低與絡(luò)合物自組裝形成竟?fàn)幍呐c寡聚體的兀* '兀 相互作用，因此研究了加入有機(jī)溶劑對(duì)絡(luò)合物自組裝性質(zhì)的影響。在 絡(luò)合物2與poly(dA)25的結(jié)合研究中，加入20% CH3CN完全消除了絡(luò) 合物單體的發(fā)射，而且UV-vis和發(fā)射光語的變化也表明絡(luò)合物形成非 常好的自組裝(圖21和22)。結(jié)果表明增加有機(jī)溶劑含量降低了帶來 絡(luò)合物單體發(fā)射光譜的金屬絡(luò)合物與與核酸堿基間的兀，"兀疏水相互 作用。但可觀察到弱的CD信號(hào)，這表明在這種條件下螺旋性降低。加 入20%三氟乙醇(TFE)也可得到類似的結(jié)果。對(duì)于poly(dT)25,在存
在20。/。TFE時(shí)，雖然比在水緩沖液中的強(qiáng)度弱一些，但根據(jù)UV-vis、 發(fā)射和CD的測定表明絡(luò)合物2可給出很確定的螺旋排列。
隨機(jī)選擇含所有四種堿基的寡核苷酸序列。序列為CATTACTGG ATCTATCAACAGGAG (標(biāo)準(zhǔn)載體引物)。在純緩沖液中，其與絡(luò)合 物2的混合物僅表現(xiàn)出很弱的絡(luò)合物的誘導(dǎo)自組裝，這可能是由于核 酸堿基與金屬陽離子間的疏水作用，以及寡核苷酸中某些未明確定義 的二級(jí)結(jié)構(gòu)造成的。然而，當(dāng)加入20y。TFE時(shí)，UV-vis和發(fā)射光譜均 表明金屬絡(luò)合物具有很好的自組裝(圖23),而且可觀察到強(qiáng)的CD信 號(hào)，表明這種排列是高度螺旋的(圖24)。
基于與四種不同核堿基的觀察表明，和DNA的疏水兀堆積相互作
用與金屬-金屬相互作用之間的微妙竟?fàn)幾饔盟鶐椭你K(II)絡(luò)合物 自組裝在控制二者間的精細(xì)平衡中起重要作用。
實(shí)施例8-通過UV/vis、發(fā)射和CD光譜研究圖1中所示(18金屬絡(luò)合物
2與雙鏈DNA的結(jié)合
我們也將我們的研究延伸到雙鏈DNA中。初步研究表明，將30|uM 絡(luò)合物2加入到通過將等量(45juM,堿基濃度)poly(dA)25和poly(dT)25 混合而制備的poly(dA)25-poly(dT)25雙鏈體(duplex)中，UV-vis和發(fā)射光 鐠均顯示明顯的MMLCT帶，也觀察到絡(luò)合物螺旋組裝而引起的典型 的CD信號(hào)變化。隨著二聯(lián)體的量增加，MMLCT吸收帶逐漸消失，在 UV-vis光鐠中425 nm處出現(xiàn)新帶(圖25 )。隨著UV-vis光鐠的改變， 在約800 nm處的發(fā)射帶逐漸消失，在約557 nm處出現(xiàn)新的強(qiáng)發(fā)射帶 (圖26)。另夕卜，在高雙鏈體濃度(270 )uM poly(dA)25 + 270fiM poly(dT)25,堿基濃度)時(shí)，加入30(iM絡(luò)合物2引起4艮小的CD光譜 變化。由于正方形扁平的鉑三聯(lián)吡啶型絡(luò)合物是眾所周知的雙螺旋 DNA嵌入劑，結(jié)果表明在低的雙鏈體濃度下，大部分絡(luò)合物與DNA 上的陰離子磷酸基團(tuán)通過靜電作用相互結(jié)合，從而導(dǎo)致螺旋自組裝， 而在高的雙鏈體DNA濃度下，大部分絡(luò)合物與雙鏈體相互嵌入，從而 沒有觀察到絡(luò)合物的自組裝。吸收和發(fā)射帶分別移動(dòng)到更短的波長425 nm和557 nm處，這強(qiáng)烈表明絡(luò)合物陽離子處于非常不同的環(huán)境中， 可能與核酸堿基對(duì)以嵌入方式而堆積在一起。
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權(quán)利要求
1.一種檢測多電荷生物分子的包含帶電荷的d8或d10金屬絡(luò)合物的組合物，其中金屬絡(luò)合物與多電荷生物分子靜電結(jié)合，以誘導(dǎo)金屬帶電荷絡(luò)合物通過金屬···金屬相互作用、π···π相互作用或兩種相互作用的組合而聚集和自組裝。
2. —種表征多電荷生物分子的包含帶電荷的(18或(11()金屬絡(luò)合物的組合物，其中金屬絡(luò)合物與多電荷生物分子靜電結(jié)合，以誘導(dǎo)金屬 絡(luò)合物通過金屬*"金屬相互作用、兀*"兀相互作用或兩種相互作用的 組合而聚集和螺旋狀自組裝。
3. 權(quán)利要求1的組合物，其中自組裝造成金屬絡(luò)合物一個(gè)或多個(gè) 光學(xué)性質(zhì)的變化。
4. 權(quán)利要求2的組合物，其中自組裝造成金屬絡(luò)合物一個(gè)或多個(gè) 光學(xué)性質(zhì)的變化。
5. 權(quán)利要求3的組合物，其中一個(gè)或多個(gè)光學(xué)性質(zhì)變化是UV/vis、發(fā)射或CD強(qiáng)度的變化。
6.權(quán)利要求1的纟且合物，其中多電荷生物分子帶有不少于3個(gè)凈電荷。
7.權(quán)利要求2的纟且合物，其中多電荷生物分子帶有不少于3個(gè)凈電荷。
8.權(quán)利要求1的組合物，其中多電荷生物分子是單鏈核酸。
9.權(quán)利要求2的組合物，其中多電荷生物分子是單鏈核酸。
10.權(quán)利要求1的組合物，其中多電荷生物分子是蛋白或多肽。
11,權(quán)利要求2的組合物，其中多電荷生物分子是蛋白或多肽。
12.權(quán)利要求1的組合物，其中金屬絡(luò)合物包含至少一種過渡態(tài)金屬和至少 一種相應(yīng)的配位體。
13. 權(quán)利要求2的組合物，其中金屬絡(luò)合物包含至少一種過渡態(tài)金 屬和至少一種相應(yīng)的配位體。
14. 權(quán)利要求8的組合物，其中單鏈核酸形成i-基序結(jié)構(gòu)。
15. 權(quán)利要求8的組合物，其中單鏈核酸形成G-四聯(lián)體。
16. 權(quán)利要求12的組合物，其中至少一種過渡態(tài)金屬是鉑(Pt)、 金(Au)、把(Pd)、銠(Rh)、銥(Ir)或銀(Ag )。
17. 權(quán)利要求12的組合物，其中至少一種相應(yīng)的配位體是芳基、 烷基、炔基及其衍生物；氮供體配體；^L、磷或氧供體配體。
18. 權(quán)利要求17的組合物，其中所述氮供體配體是吡啶、聯(lián)吡啶、 三聯(lián)吡啶、多吡啶、芳基吡啶、二芳基吡啶、芳基聯(lián)吡啶、菲咯啉、 二。秦、三溱、酞菁、亞胺、二亞胺、三亞胺、卟啉或其衍生物。
19. 權(quán)利要求17的組合物，其中所述硫、磷和氧供體配體是磷膦、 硫醇鹽、羧酸鹽或衍生物。
20. 權(quán)利要求12的組合物，其中金屬絡(luò)合物具有扁平結(jié)構(gòu)或部分 扁平結(jié)構(gòu)，及至少 一個(gè)能夠發(fā)生兀* *兀堆積相互作用的相應(yīng)的配位體。
21. 權(quán)利要求12的組合物，其中至少一種過渡態(tài)金屬是鉑(Pt)。
22. 權(quán)利要求12的組合物，其中至少一種相應(yīng)的配位體是三聯(lián)吡啶。
23. 權(quán)利要求12的組合物，其中至少一種過渡態(tài)金屬是鉑(Pt), 且至少 一種相應(yīng)的配位體是三聯(lián)吡咬。
24. 權(quán)利要求12的組合物，其中至少一種相應(yīng)的配位體具有以下 結(jié)構(gòu)<formula>formula see original document page 3</formula>
25.權(quán)利要求12的組合物，其中至少一種相應(yīng)的配位體具有以下 結(jié)構(gòu)
26. —種檢測樣品中目標(biāo)多電荷生物分子存在的檢測方法，所述方 法包括(a) 將帶電荷的(18或(11()金屬絡(luò)合物與可能含有目標(biāo)多電荷生 物分子的樣品在有效使d8或d"金屬絡(luò)合物與目標(biāo)多電荷 生物分子通過靜電相互作用彼此結(jié)合的條件下進(jìn)行合 并，其中金屬絡(luò)合物包含至少一種過渡態(tài)金屬和至少一 種相應(yīng)的配位體，然后使帶電荷的cf或d"金屬絡(luò)合物聚集體自組裝，和 (b) 檢測帶電荷的(18或(^金屬絡(luò)合物聚集體的光學(xué)性質(zhì)。
27. —種用于檢測樣品中多電荷生物分子的試劑盒，所述試劑盒包括(a) 含有帶電荷的(18或(11()金屬絡(luò)合物的組合物，其中金屬絡(luò) 合物與多電荷生物分子靜電結(jié)合，以誘導(dǎo)W或cT金屬絡(luò) 合物通過金屬"*金屬相互作用和兀，"兀相互作用而聚集 和自組裝，和(b) 使用說明書。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于檢測和/或表征多電荷生物分子的包含帶電荷的d⁸或d¹⁰金屬絡(luò)合物的組合物，其中金屬絡(luò)合物與多電荷生物分子靜電結(jié)合，從而通過金屬…金屬相互作用、π…π相互作用或這兩種相互作用的組合來誘導(dǎo)金屬絡(luò)合物的聚集和自組裝。本發(fā)明進(jìn)一步提供了使用包含帶電荷的d⁸或d¹⁰金屬絡(luò)合物的組合物進(jìn)行無標(biāo)記光學(xué)檢測和/或表征帶多電荷的生物分子，例如單鏈核酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸的檢測方法和試劑盒。
文檔編號(hào)C07D403/14GK101360739SQ200780001656
公開日2009年2月4日 申請(qǐng)日期2007年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月10日
發(fā)明者聰 于, 任詠華, 陳凱耀, 黃文忠 申請(qǐng)人:香港大學(xué)