專利名稱：：可以在植物中使用的基因啟動子的制作方法可以在植物中使用的基因啟動子本發(fā)明涉及在農業(yè)領域，可能有意義的是能夠啟動或減少目的基因在植物某些組織中和/或應答于影響農作物生產力的環(huán)境因素如生物性或非生物性脅迫時的表達。本發(fā)明涉及調節(jié)芹菜(celery)中已確定的轉錄作用的新序列，其中所述序列的活性為組織-特異性、器官特異性的和/或可以由環(huán)境因素如生物性或非生物性脅迫誘導，并且涉及這些新序列在轉化植物并將目的基因(ageneofinterest)置于所述序列控制下的用途。鹽度例如是限制農作物生產力的最惡劣環(huán)境因素之一。雖然土地的鹽度大多先于農業(yè)存在，然而這個問題已經因農業(yè)活動如灌溉而加重。目前。世界上約20%耕地和幾乎一半水澆地受鹽度影響。除了巨大的財務成本之外，鹽度對基本設施、水儲備并且人類社區(qū)的社會結構及穩(wěn)定性有嚴重影響。已經對鹽度作出兩種反應(i)引進環(huán)境管理以通過管理灌溉和排水而控制土地中的鹽增加，和(ii)使用植物的基因工程以增加植物的耐鹽性。本發(fā)明尤其涉及由研究并理解由如此機理構成的第二種方法，所述的機理允許某些植物通常更好地耐受鹽和脅迫、發(fā)展#_栽培作物對鹽或其它脅迫更耐受的策略。在植物的整個壽命期間，固定在基質中的植物經歷眾多的環(huán)境條件變動，其中植物不得不通過調整其生長和發(fā)育而在所述的環(huán)境條件變動中幸存。非生物性脅迫對應于化學性或物理性環(huán)境因素的巨大變更，而生物性脅迫由植物與活生物之間相互作用所誘導。特別影響農作物產量的非生物因子包括水脅迫(千燥或水過剩)、極端溫度變動、土地中礦物元素匱乏和土地中高濃度的鹽或重金屬。由植物的環(huán)境中過高濃度的NaCl造成的鹽脅迫屬于非生物性脅迫類別。雖然Na—是一些植物、尤其鹽生植物所必需的，然而高濃度的NaCl是植物生長的限制性因素或甚至有毒因素。這種現(xiàn)象在世界范圍的宜耕表面上廣泛存在。應答于環(huán)境脅迫，植物已經發(fā)展一系列生理學策略和生物化學策略以適應或至少耐受脅迫條件。此類策略與調節(jié)基因表達(如mRNA和新合成蛋白質的量的改變所示)相關。鑒定的基因編碼與眾多功能(如離子區(qū)室化、氧化還原電位平衡、蛋白質降解或保護、合成滲透質)有關的蛋白質。已經對稱作"滲透質"的分子實施多項研究，因為在眾多非生物性脅迫中啟動了滲透質合成(Hasegawa等，2000a和b)。此類分子可以在鹽應答(或滲透脅迫)期間大量積累，因此使水平衡在細胞中恢復。已經提出代謝工程可能在增加植物的脅迫耐受性中發(fā)揮重要作用。已經顯示受轉化以表達引起某些滲透質合成的酶的植物比非轉化植物更抵抗鹽脅迫(Tarczinsky等，1993,Shen等，1997a和b)，因此證實了滲透質的重要性。然而這些結果中某些存在爭議，因為滲透質在轉基因植物的量太低以至于不能解釋透作用(Karakas等，1997)。因此，這種作用歸因于抗氧化作用，而非純粹的滲透質作用。此類滲透質的合成在源組織中發(fā)生或基于得自光同化物中的分子。因此，光同化物經長距離在韌皮部中的轉運必然在鹽脅迫期間受到影響，雖然在這個方面可用數據很少(Noiraud等，2000)。從韌皮部中產生的汁液也轉運類型廣泛的離子、代謝物和大分子如蛋白質和核酸，其中許多參與信號作用。因此,-可以認為韌皮部是維管植物中組織間通訊的主要角色(Ruiz-Medrano等，2001)。然而盡管有對多種植物模型的最新研究，不過迄今有關在韌皮部中或在根中特異性表達的基因的知識是匱乏的，尤其在蔬菜或在商品(市售)園藝物種如齊菜中是這樣(Vilaine等，2003)。有關此類基因啟動子的知識，尤其關于所述啟動子的韌皮部特異性、根特異性和脅迫誘導性特性的知識也是匱乏的直至至不存在。因為缺少這種知識，故不可能將任何編碼性序列置于可以使該編碼性序列僅在脅迫條件下、優(yōu)選地處于在韌皮部或根中表達的啟動子控制下。本發(fā)明人現(xiàn)在已經確定在維管組織并且更具體地在韌皮部或根中具有優(yōu)先活性的三種啟動子的序列，這種活性根據需要是細胞中脅迫狀況的函數。發(fā)明人還已經使用可以使目的序列僅在脅迫條件下、優(yōu)先在韌皮部中或優(yōu)先在根中表達的這些啟動子產生構建體。因此，在本發(fā)明的第一方面，本申請涉及具有轉錄啟動子活性的核酸的序列以至于所述序列包含SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3或這些序列中至少之一的一個片段或諸片段(或部分)。SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的片段或部分定義為包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的至少30個連續(xù)核苦酸的序列。苷酸，不過它可以有利地含有SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的至少50個連續(xù)核苷酸，例如正好50個或多于50個或甚至多于75、80或卯個連續(xù)核苷酸。所述部分也可以含有SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的多于100個連續(xù)核苷酸，尤其120、150個或甚至180或200個連續(xù)核苷酸。根據本發(fā)明，SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的優(yōu)選部分是這樣的片段，其與幾乎整個SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3相對應，僅具有一個在3，和/或5，端或甚至在SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3序列內的1至10、20、30或50個核苷酸缺失。還構思本發(fā)明的序列可以包含SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的至少2個片段，其中至少一個所述片段具有最小長度30個核苷酸。多種片段可以是從不同序列中得到的片段，例如SEQIDNO:l的片段和SEQIDNO:2的片段或是相同序列的片段。在后一情況下，片段優(yōu)選地是非連續(xù)的，例如由2、10、20或50個核苷酸隔開。根據本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的序列包含序列SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3之一的全部或由其組成。術語"具有轉錄啟動子活性的序列"意指這樣的序列，其具有啟動子活性，即可能在合適的輔因子(co-factor)存在下，天然地促進置于所述啟動子序列下游的序列轉錄。這種轉錄啟動子活性可以通過克隆可以在RNA聚合酶和核糖核苷酸存在下在任意待轉錄序列上游具有這種活性的序列而測試。若在測試序列的克隆不存在下獲得了RNA分子而未獲得RNA分子，可以從中推斷所述的測試序列具有轉錄啟動子活性。合適的試驗在實驗部分中描述。轉錄起始位點可以位于本發(fā)明的序列中或在本發(fā)明序列的3'端或在本發(fā)明序列的下游3，側。在第一種情況下，本發(fā)明序列的部分受到轉錄。除了序列SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3之一的全部或部分以外，本發(fā)明的序列也可以含有額外的序列，只要它們不表現(xiàn)轉錄啟動子特性。此類額外序列尤其可以是"增強子"或其它序列如多種蛋白質的結合位點。所述轉錄啟動子活性可以在RNA聚合酶及轉錄所需的全部要素存在下、尤其在核糖核苷酸存在下，在任何細胞類型、在體內和/或體外在溶液中表現(xiàn)出來。有利地，本發(fā)明的序列具有廣泛的啟動子活性，即在原核細胞和在真核細胞中、在植物或動物細胞中或在這些細胞之一的RNA聚合酶存在下有活性。本發(fā)明的序列優(yōu)選地作為在植物細胞中或在從植物細胞中得到的RNA聚合酶存在下有活性的啟動子。本發(fā)明序列的優(yōu)選特性是其在對刺激應答的植物細胞中促進轉錄的能力。所述刺激優(yōu)選地是與脅迫相關的刺激。優(yōu)選地，由本發(fā)明序列所有的轉錄啟動子活性對生物性或非生物性脅迫敏感；這種活性在生物性或非生物性脅迫條件下被誘導或增強。術語"生物性脅迫"意指植物中由植物與生物間相互作用(例如在綠色蟲牙蟲(greenfly)侵襲期間)所誘導的脅迫。另一方面，非生物性脅迫對應于化學性或物理性因素的重大變更。特別影響農作物產量的非生物因子是水脅迫(干燥或水過剩)、極端溫度變動、土地中礦物元素匱乏和土地中高濃度的鹽或重金屬?？梢栽诩毎缴?、在植物的器官或在作為整體的生物中覺察脅迫。誘導。作為實例，本發(fā)明序列的轉錄活性可以因與脅迫相關的某些因子如脅迫蛋白存在而誘導。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的序列具有在維管組織中的優(yōu)先轉錄啟動子活性。具體目的維管組織是韌皮部和/或木質部，但優(yōu)選地是韌皮部。根據另一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的序列具有在一種或多種器官中的特異性轉錄啟動子活性，即其活性在植物某些器官例如莖、葉或根中較高的或甚至限于這些器官內的啟動子。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的序列具有在根中的特異性轉錄啟動子活性。體地表現(xiàn)在商品園藝植物或蔬菜植物的細胞中，即用于蔬菜、草藥和某些果實(如甜瓜或西瓜)的單林生產或高密度生產的植物，尤其傘形科(apiaceae)、菊科(asteraceae)、十字花科(蕓苦屬植物ceae或crucifereae)、藜科(chenopodiaceae)、葫"科(cucurbitaceae)、禾本科(poaceae)、薔薇科(rosaceae)、癡科(solanaceae)、敗醬科(valerianaceae)或豆科(legumineae)。更具體地，轉錄啟動子活性自身表現(xiàn)在齊菜(西洋芽(apiumgravolensL))、擬南芥(Arabidopsisthaliana)或番癡(solanumlycopersicumL)的細胞中。本發(fā)明的序列包含SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3或這些序列中至少之一的一個或多個片段(或部分)。優(yōu)選地，本發(fā)明的序列由以下序列之一構成SEQIDNO:l、2、3、4、5或6,或它們包含這些序列中的一種。SEQIDNO:4是包含SEQIDNO:l的序列，SEQIDNO:5是包含SEQIDNO:2的序列并且SEQIDNO:6是包含SEQIDNO:3的序列。根據本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明的序列也可以是如此序列，其與根據第一方面如以上定義的序列相比，即相對于包含SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3或序列SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3中至少一種序列的一個或多個片段(或部分)的序列，具有至少5個點突變，其中所述的片段包含SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的至少30個連續(xù)核苷酸。根據本發(fā)明第二方面的序列例如可以相對于根據第一方面的序列而具有單個突變，但是優(yōu)選地具有至少2個點突變或甚至3、4或5個點突變。術語"點突變"意指對單個核酸的單獨修飾，其中與無突變或無核酸添加的序列相比，與核酸無突變或無修飾的序列相比、與無突變的序列相比，所述的修飾可能是對核酸的抑制。術語"對核酸的修飾"意指一種核酸由另一種天然核酸置換(例如將A置換為G)以及對天然核酸的化學修飾(例如由2-曱基腺苷換或4-乙酰基胞苦替換腺香)?？梢圆⑷氡景l(fā)明序列的多種修飾的核酸是技術人員眾所周知的。在具體的實施方案中，可以導入突變以除去根據本發(fā)明第一方面的序列的轉錄啟動子活性或以修改其特征。優(yōu)選地，根據本發(fā)明第二方面的序列相對于包含SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的至少40個連續(xù)核苷酸、優(yōu)選至少50個連續(xù)核苷酸的片段的序列將最多具有5個點突變。根據本發(fā)明第二方面的序列也可以具有轉錄啟動子活性，但不必然如此。與本發(fā)明第一方面的序列相比，導入的突變可以例如通過調節(jié)每秒鐘啟動速率或通過調節(jié)其細胞特異性或轉錄起始條件而調節(jié)該序列的啟動子活性。在第三方面，本發(fā)明還涉及具有轉錄啟動子活性并與選自SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6的序列具有至少70%同一性的核酸序列。優(yōu)選地，.同一性百分數大于70%，即為至少75%或80%,但優(yōu)選地是至少85°/。或90%同一性或甚至至少95%同一性。還進行構思的序列與序列SEQIDNO:l至SEQIDNO:6中之一顯示97%、98%、99%或甚至99.5%的同一性。兩種核酸序列Sl和S2之間的同一性百分數通過如此方式進行計算，即比對這兩種序列(可能通過插入空位(gap))以至于使共同序列最大化，隨后將共同核酸的總數除以最長序列中的核酸數目。高同一性百分數也導致序列Sl與S2在高嚴格性條件下雜交。確保高嚴格性的條件是技術人員眾所周知的。實際上，嚴格性由允許分子雜交的實驗條件即溫度、pH和離子強度決定。兩個參數尤其決定了嚴格性溫度和鹽濃度。高嚴格性條件例如對應于高溫度(高于Tm)和/或低離子強度以促進特異性配對。作為實例，高嚴格性條件可以由具有在實驗部分中所述特征的介質加以說明。術語"本發(fā)明的序列"還指根據本發(fā)明的第一、第二或第三方面的序列。尤其，本發(fā)明的序列可以是雙鏈DNA,也可以是單鏈DNA或部分雙鏈的DNA。此外，本發(fā)明的序列可以具有變化的拓樸學。它也可以是環(huán)狀DNA或甚至超螺旋的。本發(fā)明還涉及與上文所述序列之一互補的序列。本發(fā)明的序列可以在多種
技術領域：
并且尤其在農業(yè)、特別在轉基因植物領域中使用。本發(fā)明還涉及核酸探針，以至于所述探針能夠在高嚴格性條件下與選自SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的序列雜交。所提及的探針包含至少25個核苷酸、優(yōu)選至少30個核苷酸。然而作為一般原則，核酸探針包含少于150個、甚至少于100個或甚至少于50個核芬酸。此類探針可以鑒定多種生物中與SEQID:1、2或2之一同源的序列或可以在體外或在體內檢測一個序列或這些序列的存在。此類探針可以是DNA或RNA探針、呈單鏈或雙鏈。它們例如可以作為引物在PCR實驗或在DNA印跡實驗中使用。本發(fā)明也涉及這樣的DNA構建體或DNA構建物，其由具有如上所述啟發(fā)明的構建體以至于待轉錄目的序列位于啟動子序列的下游，即在該啟動子序列的3，端，并且目的序列的轉錄由該啟動子序列指導。本發(fā)明的序列和待轉錄序列可以是連續(xù)的或可以由介入性核酸隔開。在后一種情況下，介入性序本發(fā)明的構建體也可以包含使得轉錄終止的序列或甚至使得翻譯終止的序列(終止密碼子)。將核酸序列的轉錄稱作受啟動子指導，當所述啟動子允許該序列轉錄并且該啟動子控制這種轉錄時。目的序列因此在如此條件下受到轉錄并到達一定程度，其中所述的條件是該啟動子的函數。因此，有可能使用本發(fā)明的教授內容而將目的序列置于本發(fā)明啟動子序列控制下，以至于所述目的序列僅在脅迫條件下例如僅在鹽脅迫條件下，在植物鈿胞中或特異性地在一種植物器官(如根)或組織如(韌皮部和/或木質部)中轉錄。由于本發(fā)明啟動子序列的特殊特征，故有可能獲得目的序列優(yōu)先地在維管細胞中并且優(yōu)先地在脅迫條件下或優(yōu)先在根中轉錄。根據優(yōu)選的實施方案，將目的序列置于SEQIDNO:l或SEQIDNO:3或從這兩中序列之一中得到并具有轉錄啟動子活性的本發(fā)明序列的控制下，以至于所述目的序列的轉錄在應答脅迫、尤其鹽脅迫時并且更具體地在植物韌皮部內受到誘導。根據又一優(yōu)選的實施方案，將目的序列置于SEQIDNO:2或從SEQIDNO:2中得到并具有轉錄啟動子活性的本發(fā)明序列的控制下，以至于所述目的序列在植物的韌皮部中更大程度地得到轉錄。根據另一優(yōu)選的實施方案，將目的序列置于SEQIDNO:l或從SEQIDNO:l中得到并具有轉錄啟動子活性的本發(fā)明序列的控制下，以至于所述目的序列在根中比在莖和葉中更大程度地得到轉錄。根據本發(fā)明的具體實施方案，位于所述構建體中的啟動子序列和待轉錄目的序列是相互異源的。術語"異源的"意指它們得自不同來源，例如不同生物。兩種序列在其中至少之一是人造(即在自然界中不存在)時也稱作為異源性的。包含相對于本發(fā)明啟動子序列呈異源的待轉錄序列的構建體因此包含嵌合基根據高度優(yōu)選的實施方案，待轉錄目的序列是編碼性序列，這因此不僅對轉錄如此，對翻譯也是如此。待轉錄序列可以是整合編碼性序列，例如cDNA序列，或部分編碼性序列，例如包含內含子和外顯子的序列。由這種目的序列編碼的蛋白質或肽例如可以是抗除草劑或耐受抗生素的蛋白質，或生長因子、脅迫抗性因子或毒蛋白或致死性蛋白。需求將決定技術人員把何種目的序列置于本發(fā)明啟動子的控制下。它們優(yōu)選地是編碼植物領域中的目的肽、尤其在植物細胞中有活性或有營養(yǎng)或美學優(yōu)勢的肽或蛋白質的序列。它們也可以是可摧毀已經遭受脅迫作用的任何植物的致死性蛋白。它們也可以是允許檢測表達它們的細胞的蛋白質或肽。術語"DNA構建體"如在本發(fā)明的上下文中所用，意指任何非天然的DNA支持物。此類構建體尤其可以是允許構建體轉移至細胞中的載體(vector)。構建體優(yōu)選地是載體，例如病毒載體，但優(yōu)選地是質粒載體或質粒。在本發(fā)明的上下文中有利的一種質粒是農桿菌(農桿菌)的Ti質粒或從Ti質粒中得到的保留Ti質粒DNA轉移特性而無癌基因的質粒。除了本發(fā)明的啟動子序列和待轉錄目的序列中外，本發(fā)明的質粒可以包含尤其可允許進行正選擇或負選擇的抗性基因。所述地抗性基因可以是除草劑抗性或抗生素抗性基因。也可能有利的是本發(fā)明的構建體或質粒包括細菌抗性基因，例如以促進后繼細菌繁殖步驟。本發(fā)明還涉及植物細胞，其已經由本發(fā)明的序列、或由如以上定義的構建而無論為開展轉化時所用的方法是什么。目前，使用極多樣的方法以允許通過核酸序列而轉化細胞?？梢蕴峒暗膶嵗峭ㄟ^電穿孔、射彈轟擊和使用農桿菌的轉化。顯然，根據待轉化細胞的類型和所討論的物種，尤其植物物種，某些技術優(yōu)先于其它技術。技術人員會知道對于每種細胞類型而言哪種技術最適于實施轉化。類似地，技術人員會知道什么技術將允許瞬時地轉化細胞，遺傳物質因此被丟失，以及哪種技術允許將轉移的序列以穩(wěn)定方式整合至細胞基因組。術語"細胞的基因組"意指核基因組和葉綠體基因組或線粒體基因組，優(yōu)選地，它是核基因組。細胞可以是任何細胞類型，即原核細胞或真核細胞，雖然真核細胞在本發(fā)明的上下文中為優(yōu)選。本發(fā)明的細胞還優(yōu)選地是植物細胞，不過它也可以是細菌細胞、動物細胞例如來自哺乳動物，或任何其它類型細胞，例如酵母細胞。優(yōu)選地，本發(fā)明的細胞是來自有農學目的性(agronomicinterest)的植物的細胞。本發(fā)明還涉及在其基因組中包含本發(fā)明序列的轉基因植物，所述序列天然地具有外源性。術語"轉基因植物"和"外源序列"意指本發(fā)明的序列已經有意識地轉移至植物并且所述序列以前不天然地存在于該植物中。本發(fā)明的轉基因植物也可以包含如上所述的構建體、尤其包含相對于本發(fā)明啟動子序列為異源的待轉錄序列的構建體。本發(fā)明的轉基因植物因此在其基因組中包含本發(fā)明的序列(或構建體)；優(yōu)選地，所述序列(或構建體)插入該植物的任意細胞的核基因組中，不過本發(fā)明還包括這樣的情況，其中序列插入線粒體基因組或插入葉綠體基因組內。還有可能以體外染色體方式維持本發(fā)明的序列或構建體。優(yōu)選地穩(wěn)定插入所述序列(或包含該序列的構建體)，雖然也可以構思瞬時插入。本發(fā)明還涉及包含如上所述轉化細胞的轉基因植物。優(yōu)選地，本發(fā)明轉基因植物的全部細胞包含本發(fā)明的序列或構建體，還可構思的是僅所述植物的某些部分將包含這類轉化細胞，例如當植物呈嵌合型時或因從某些細胞中切除轉基因時。本發(fā)明還涉及所述轉基因植物的部分。具體的目的部分是果實、花、根、莖、葉以及還有種子、芽、穎果和繁殖材料(包括雄性和雌性繁殖材料)以及細胞，本發(fā)明的所述部分具有包含本發(fā)明序列或構建體的轉化細胞。優(yōu)選地，它們包含這樣的構建體，其包含相對于本發(fā)明的啟動子序列為異源的待轉化序列。所述部分因此也是轉基因的。本發(fā)明的轉基因植物可以是任意類型的植物。它可以是單子葉植物或雙子葉植物植物。優(yōu)選地，轉基因植物有農學目的性。尤其，它可以谷物植物，商品蔬菜植物或蔬菜植物或果樹。優(yōu)選地，它是除齊菜之外的植物。特別優(yōu)選來自以下科的植物即來自葫,科、藜科、十字花科、禾本科、豆科、傘形科、薔薇科、敗醬科、茄科和菊科的植物。本發(fā)明轉基因植物的特別優(yōu)選實例是番茄植物、甜瓜植物和萵苣植物。其它的優(yōu)選植物是芽菜、洋蔥(onion)、甜菜(beet)、青花菜(broccoli)、小麥(wheat)、蘆夢(asparagus)、甜馬鈴薯(sweetcorn)和油菜(rape)。本發(fā)明的轉基因植物也可以在其基因組中獨立地含有本發(fā)明序列的其它轉基因；尤其，其它轉基因可以是處于組成型啟動子控制下的抗病毒感染基因。行。本發(fā)明的轉基因植物可能已經從轉化細胞中再生出來。本發(fā)明的植物還有可能通過從本發(fā)明的另一轉基因植物中傳下而獲得。本發(fā)明還涉及在其基因組中包含核酸序列的轉基因植物，其中所述的核酸序列包含SEQIDNO:l的全部或部分，以至于所述的序列具有轉錄啟動子活性，所述的部分包含SEQIDNO:l的至少30個連續(xù)核苦酸，所述序列處于與異源編碼性序列的功能性連接中，使所述編碼性序列以特異性方式在根中表達。優(yōu)選地，所述的植物屬于傘形科、菊科、十字花科(或十字花科)、藜科、葫蘆科、禾本科、薔薇科、茄科、敗醬科或豆科。本發(fā)明還涉及在其基因組中包含核列的轉基因植物，所述核列包含SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的全部或部分，以至于所述序列具有轉錄啟動子活性；所述的部分包含SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的至少30個連續(xù)核苷酸；并且所述序列處于與異源編碼性序列的功能性連接中，使該編碼性序列以特異性方式在韌皮部中表達。在具體的實施方案中，所述序列是SEQIDNO:2或SEQIDNO:2的包含至少30個連續(xù)核苷酸的部分并且所述植物屬于傘形科、十字花科、藜科、旋花科(convolvulaceae)、葫蘆科、豆科(fabaceae)、茶薦子科(grossulariaceae)、唇形科(lamiaceae)、百合科(liliaceae)、禾本科、蓼科(polygonaceae)、薔薇科、茄科或敗醬科。在又一具體實施方案中，所述序列是SEQIDNO:l或3或SEQIDNO:l或3的包含至少30個連續(xù)核苷酸的部分，所述植物屬于十字花科并且所述編碼性序列的表達由生物性或非生物性脅迫誘導。在優(yōu)選的實施方案中，所述生物性或非生物性脅迫是鹽脅迫。本發(fā)明還涉及用于獲得本發(fā)明轉基因植物的方法。該方法包括以下步驟獲得如上所述的構建體；將所述構建體導入得自目的植物的細胞；從轉化細胞中再生轉基因植物；本發(fā)明的方法顯然可以包括在所提及法步驟之前和之后的眾多其它步驟。的補充步驟，其中所述的其它植物可以是或不是轉基因性的。顯然可以進行額外的雜交。取決于物種，也可以進行有性或無性的繁殖步驟，和獲得后代。建體的植物系。也可以分離出包含本發(fā)明序列或構建體的植物。在其基因組中包含含本發(fā)明序列或構建體并且從上述方法中得到的此類植物也形成本發(fā)明的部分。優(yōu)選地，來自包含本發(fā)明序列或構建體的后代中的植物通過選擇步驟而確定。所述的選擇可以是田間或溫室選擇或使用遺傳標記的遺傳選擇。本發(fā)明還涉及本發(fā)明序列或構建體在產生轉基因植物即在基因工程領域中的用途。如上文所述，本發(fā)明的一個應用是利用位于目的編碼序列(轉基因)上游的本發(fā)明啟動子序列以至于由該目的序列編碼的蛋白質僅在特定脅迫條件下表達，優(yōu)選地在轉基因植物的某些維管器官中表達。通過這種方法，使轉基因在正常條件下微小程度地表達或不表達并且轉基因的表達僅在脅迫條件下受到誘導。本發(fā)明的這個特征是很有重要的，因為有可能僅在證明是必需時即在脅迫條件下才表達某些轉基因，尤其抗性基因。某些基因的組成型表達有時是無用的或甚至在正常條件下是有害的。本發(fā)明意味有可能僅在脅迫條件下表達轉基因。在本發(fā)明環(huán)境下，發(fā)明人已經在芹菜(celeryapiumgraveolens)中找到新的蛋白質，即新的甘露醇轉運蛋白，命名為AgMaT3。因此，本申請還涉及包含序列的肽，其中所述的序列與SEQIDNO:8具有至少70%同一性、優(yōu)選地與SEQIDNO:8具有至少80%同一性或甚至90%或甚至95%同一性。根據本發(fā)明這個方面的優(yōu)選肽是包含SEQIDNO:ll或由其構成的肽。其它的優(yōu)選肽是由SEQIDNO:7、SEQIDNO:13或SEQIDNO:14的全部或部分或由因為遺傳密碼字簡并性而得自SEQIDNO:7、SEQIDNO:13或SEQIDNO:14的序列所編碼的那些肽。優(yōu)選地，根據本發(fā)明這個方面的這種氨基酸序列具有轉運甘露醇通過脂質雙層膜、尤其植物細胞中脂質雙層膜的能力。所述的應用還涉及編碼如上所述肽的核酸序列。根據一個可能的實施方案，所述的序列位于本發(fā)明啟動子例如SEQIDNO:l的下游。圖例圖1:所用克隆載體的圖1A:PDR195和196載體PDR195的多克隆位點Xhol-Notl-Sacll-BamHIPDR196的多克隆位點Spel-BamHI*-Smal-Pstl-EcoRI-EcoRV-Hindlll-Sall-Xhol-Acc651-Kpnl-BamHP黑體表示在質粒中其它地方不切割的酶并且*表示在多克隆位點(MCS)中切割兩次的那些酶；IB:質粒pBI101-GUS-R1R2(13942bp)和質粒pBI101-GFP5-R1R2圖2:用水或肥料溶液(對照植物)和用300mMNaCl(受脅迫植物)維持3周的芽菜；探針，對來自"對照"植物及用NaCl(300mM,3周)"受脅迫"的植物的葉柄中的貯藏實質、木質部和韌皮部進行RNA雜交。使用26S核糖體探針實施定量?？s寫PaT,對照實質；PaN，NaCl實質；XT,對照木質部；XN,NaCl木質部；PhT,對照韌皮部；PhN,NaCl韌皮部；圖4:試驗探針在RNA雜交期間作為組織函數的表達水平的圖解描述。縮寫AgMaT3，芽菜(apiumgraveolens)甘露醇轉運蛋白3;AgMT2和AgMT3,芽菜金屬碌b蛋白2和金屬硫蛋白3;圖5:作為時間的函數，由補加PDR(▲)或AgMaTl/PDR()的RS453酵母或由三個獨立AgMaT3/PDR克隆(■、O和x)對甘露醇(0.55mM)的吸收。以空質粒轉化的菌抹所產生的曲線充當對照。值對應于單個實驗的平均數土標準差，每個點重復三次；圖6:來自AgMaTl、AgMaT2和AgMaT3的cDNA的核苷酸序列比對。使用MEGALIGN程序(DNAstar,Madison,WI)的Clustal方法比對序列。與共有序列相同的殘基加下劃線。對ATG和終止密碼子加框；圖7:AgMaTl、AgMaT2和AgMaT3的蛋白質序列比對。使用MEGALIGN程序(DNAstar,Madison,WI)的Clustal方法比對推斷性氨基酸序列。與共有序列相同的殘基加下劃線。加框的殘基對應于MFS家族"糖"轉運蛋白之間的保守序列(根據NCBI保守結構域搜索器，www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)。力口框的甲石克氛酸對應于初始克隆的蛋白質序列的起點；圖8:AgMaT3的啟動子和基因組序列以及編碼區(qū)的翻譯。所述肽序列使用單字母縮寫給出。斜體的殘基對應于MFS家族"糖"轉運蛋白的亞家族中的保守序列。給推測性跨膜螺旋加下劃線。該編號基于翻譯起點；圖9:AgMaT2的啟動子序列以及編碼區(qū)的翻譯。所述肽序列使用單字母縮寫給出。該編號基于翻譯起點；圖10:AgMaT3的啟動子序列以及編碼區(qū)的翻譯。所述肽序列使用單字母縮寫給出。該編號基于翻譯起點；圖11:用于構建體的某些順式元件(由數據分析而鑒定)在AgMaT3以及AgMT2和3的啟動子區(qū)中的布置。將基序的位置顯示以翻譯起點作為起點。分布在互補鏈(-)上的元件顯示在線下方；圖12:用作啟動子的上游5'區(qū)的序列。該序列針對與翻譯起點相對應的第一個ATG而顯示。給報道基因上游的克隆區(qū)域加下劃線并且在括號中顯示其長度。序列SEQIDNO:l(AgMaT3)、SEQIDNO:2(AgMT2)和SEQIDNO:3(AgMT3)對應于加下劃線的序列；序列SEQIDNO:4(AgMaT3)、SEQIDNO:5(AgMT2)和SEQIDNO:6(AgMT3)對應于粗體序列；它們緊鄰ATG的"A"之前終止；圖13:表達以下構建體的擬南芥植物成熟葉的GUS染色AgMaT3::uiad(A、B);AgMT2::uiad3(C、D)、AgMT3::uiad3(E、F)。照片顯示完整葉(A、C、E比例條5mm)或橫截面(B、D、F,比例條50pm)。全部照片是鹽脅迫后的植物；圖14:在來自用構建體pAgMat3-GUS-tNOS轉化的植物(Kemer番茄)的根和葉片段上的GUS試驗結果。a)第一平板植物37至84和對照；b)第二平板植物85至96和對照。已經遭受鹽脅迫(50mM持續(xù)4日)作用的植物以粗斜體顯示。指定GUS染色水平為0至3。陽性GUS對照處組成型啟動子控制下并且使用非轉化的Kemer植物對照作為對照；圖15:在來自用構建體pAgMT2-GUS-tNOS轉化的6抹植物(Kemer番茄)的莖和葉片段上的GUS試驗結果。指定GUS染色水平為0至3。使用處在組成型啟動子控制下的陽性GUS對照和非轉化Kemer植物對照作為對照；圖16:用構建體pAgMT2-GUS-tNOS轉化的植物(Kemer番茄)的陽性GUS片段的組織-細胞學分析和在維管組織中的染色觀察結果。在試驗4日后記錄觀察結果。首次觀察在莖維管組織上、在一些情況下僅在葉主脈上顯出相當濃密的藍色著染(bluestain);圖17:來自用構建體pAgMT2-GUS-tNOS轉化的植物(Kemer番茄)的組織切片。組織切片來自植物13的莖(A)處并且來自植物103的葉(B)和莖(C)處。這些細胞學數據顯示在韌皮部組織中的表達。實驗部分Bohnert小組(2001)對應答鹽脅迫的多種生物(稻(rice)、冰葉日中花(mesembryanthemumcrystallinumL)、擬南芥、玉米(corn)、煙草(tobacco)和(barley))在多個發(fā)育期下的多種組織(主要是根和葉)上在高度變化的條件(濃度和持續(xù)時間)下實施大規(guī)模的基因組研究。該研究以對稻實施的插入誘變策略和QTL(定量性性狀基因座)繼續(xù)進行以鑒定使該物種耐受鹽脅迫的特征(Koyama等，2001)。還對以NaCl處理的擬南芥的轉錄組學(Kreps等，2002)和對應答中度鹽漬化(100-150mMNaCl)的稻蛋白質組學(100-150mMNaCl)進行一般研究。這些研究鹽脅迫期間植物中所表達的全部基因和蛋白質的技術僅在可獲得所研究物種的全基因組時才可以使用，這對于芽菜并非可用。Masmoidi小組(2001)通過差異性表達法研究小麥根的cDNA，其中所述cDNA的表達通過以200mMNaCl處理而調節(jié)。所用技術具有更強的方向性(旨在研究特定器官內誘導的基因)，但是仍不能鑒定很多基因。因此，本發(fā)明選擇使用允許克隆由鹽脅迫特異性誘導的基因并且產生明顯更多代表植物在這種環(huán)境約束期間轉錄狀態(tài)的大量cDNA的消減文庫技術。此外，存在很少或沒有關于涉及耐鹽性的多種基因的組織定位方面的信息。韌皮部是在多種器官間Na+再分布的關鍵組織(Lohaus等，2000)。它還參與轉運滲透質至粑積累組織(P叩ova等，2003)。肌醇和ABA迅速地被轉運至靶管，起到下傳信號(從葉至根)并且激活多種對發(fā)展鹽脅迫耐受性所需的機制的作用(Nelson等，1999)。認識到韌皮部在送遞信息分子至位于遠處的器官中發(fā)揮了重要作用(Ruiz-Medrano等，2001)。因此，研究鹽脅迫期間基因在這種復雜組織中的表達似乎是有意義的。發(fā)明人已經在這樣的消減文庫上開展工作，其中所述的消減文庫從已經遭受鹽脅迫的植物的韌皮部和來自對照植物(在正常水化作用下)的韌皮部中構建。最適合這項研究的植物表明是芽菜，其對于過多的大量元素或對鹽脅迫是中等程度敏感的(dePascale等，2003)。這種耐受性與通過調節(jié)酶活性即甘露糖-6-磷酸還原酶和甘露醇脫氫酶而針積累對有害物質蔗糖的甘露醇(滲透質)有關(Noiraud等，2000)。芹菜具有另一個優(yōu)勢，因為韌皮部組織(韌皮部實質的細胞+傳導復合體)可以便利地以顯微手術方式從傳導束的剩余部分中分離出來(Noiraud,1999)。因此，發(fā)明人使用了梗芽菜(stickcelery)變種西洋芽(apiumgraveolensLdulce)(Vertd，Elne品種)。目的是使用消減文庫技術鑒定茅菜中因鹽脅迫而在韌皮部中受到誘導的基因的啟動子。實施例1儀器和方法l.植物材料U梗H將梗芽菜的根莖播種并栽培在溫室內的土地內。植物在白天每隔三小時自動澆水90秒并且每周接受三次肥料溶液(含有N、P和K20:20:20的Peters溶液，100ppm)。每周一次用4g/1硝酸鈣輪換以10g/lCosynolSC噴灑芯部和幼葉以防止芽菜腐爛(黑心病)。/.及i艇當施加鹽脅迫時，準備兩批梗芽菜"對照"植物(T)和"受脅迫，，植物(S)。用黑色塑料薄膜覆蓋5.4l花缽以限制蒸發(fā)。在25mMNaCl濃度上開始的鹽脅迫隨后以25mM進階在每次添加水或肥料(每日早晨和晚上和每花缽2次500ml)期間增加直至想要的濃度，即300mM。對照植物以相同方式澆水，但是不添加鹽。鹽脅迫施加3周。肥料和釣以與對照植物相同的頻率施力口。/.C.遂織和器^的炎處及,威鹽脅迫3周后，根據預定標準(年齡或大小)收獲和貯存組織。小葉、實質、韌皮部、木質部和與小葉相對應的葉柄及根從幾林植物中取下并根據已經建立的標準合并成批，隨后冷凍在液氮中并在-80。C貯存。南芥屬植物用于通過處于研究中的多種基因的啟動子序列的植物轉化。將擬南芥哥倫比亞生態(tài)型(Col-0)植物播種并在溫室中土地上在短日照條件(白晝21。C,8小時和夜晚17。C,16小時)下栽培以發(fā)育蓮座葉叢，隨后在長曰照條件(白晝21。C,16小時和夜晚17。C，8小時)下栽培以誘導開花直至花穂出現(xiàn)。植物在日照期間每隔三小時自動澆水至植物的淺盤90秒并且每周接受三次肥料溶液(含有N、P和K20:20:20的彼得溶液，100ppm)。II.用于分子方法的生物學材料勿豸絲The細菌菌抹大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5a(GibcoBRL)用于克隆和擴增DNA及PCR片段。這些細菌在37""C用固體或液體dYT培養(yǎng)基在合適抗生素即100pg/ml氨芐青霉素；100pg/ml卡那霉素或50pg/ml慶大霉素存在下培養(yǎng)。//乂Z發(fā)絲RS453酵母林(Sauer和Stadler，1993)不能在無尿嘧啶的培養(yǎng)基上發(fā)育。攜帶URA3基因的PDR質粒用來轉化該菌抹。若該菌林未受到性狀補充，則該菌抹用YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)，或若未進行性狀補充，則用SC-葡萄糖培養(yǎng)基(無尿嗜咬)培養(yǎng)。^:并霧霧橫用于轉化擬南芥花穗的農桿菌菌抹是根癌農桿菌(agrobacteriumtumefaciens)LBA4404。將根癌農桿菌LBA4404在YEB培養(yǎng)基或在LB培養(yǎng)基中攪拌下在28。C在100pg/ml利福平和200pg/ml鏈霉素存在下培養(yǎng)。IIB.克隆載體。在圖1中給出所用克隆載體的圖。用來克隆PCR片段的載體是質粒pGEM國T-Easy(普洛麥格(Promega))。使用表達載體pDR195或pDR196來補充釀酒酵母(Scerevisiae)RS453菌林的性狀。這些載體用于植物甘露醇轉運蛋白在酵母中在PMA1啟動子控制下的異源表達。質粒pDONR207(Invitrogen)用作"Gateway技術"(英韋創(chuàng)津(Invitrogen))試劑盒中的供體載體。質粒pBI101-GUS-R1R2和pBI101-GFP-R1R2具有Rl和R2邊界(attRl和attR2)，其中所述的邊界允許通過在引入克隆與pBI目的載體間的重組而將目的啟動子克隆在報道基因GUS(P-葡糖醛酸酶，uidA)或GFP(綠色焚光蛋白5-ER)上游("Gateway技術"試劑盒，Invitrogen)。在重組步驟，載體BI101攜帶處于所研究啟動子控制下的編碼GUS或GFP的報道基因和終止子NOS。III.方法用來提取總RNA的技術已經由Kay等(1987)描述。將10ngofDNA導入含有250pMdNTP;1jiiM正義和反義引物；1UDNA聚合酶Taq酶"GoTaq"(Promega)和IXPCR緩沖液的50pl反應介質內。每個循環(huán)(在1分鐘94。C的第一個變性步驟和5分鐘72。C的最后延伸步驟)包含在94。C上15秒的變性步驟；在合適溫度上2分鐘的雜交步驟和在72。C的延伸步驟，延伸步驟的持續(xù)時間正比于待擴增片段的大小(1000bp/分鐘)。以下是用于向載體pDONR207中克隆的引物對對于AgMaT3的啟動子部分5'引物5'誦GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGAACAGAAACAATTGTGGATG-3'3'引物5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAATGTTGAGAAACAATGGTCG-3'對于AgMaT2的啟動子部分5'引物5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGACCCACTATCAACAATGATC-3'3'引物5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATAAGATCGTTGTGGACTCTG-3'對于AgMaT3的啟動子部分5'引物5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCTTTATTCTGCAGCTAGAGC-3'3'引物-.5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGCTTGAAGTAAGGTGGTATGC-3'雜交溫度的選擇取決于預先計算的解鏈溫度TM。荻得的擴增產物在1%瓊脂糖凝膠上分析。6pg總RNA在7(TC變性IO分鐘后，逆轉錄在42。C在2.5pM寡(dT)18引物、500pMdNTP和M-MLV逆轉錄酶(200U，Promega)存在下進行60分鐘。獲得的RNA/cDNA異雙鏈體在IO(TC變性5分鐘，隨后靶cDNA區(qū)域的PCR擴增通過采用含第一cDNA鏈的2pl合成介質作為基質而進行。///.5.義戶C7^度^/7G五Af-r-^isj;^^尹^^發(fā)pGEM-T-Easy載體系統(tǒng)(Promega)的載體是使用連接在載體每一3，端的胸苷殘基而適于直接克隆PCR產物的線性化載體。將PCR產物以插入物/載體摩爾比3連接到50ngpGEM-T-Easy質粒上，在3U的T4DNA連接酶(Promega試劑盒)存在下16。C過夜。將10pl連4妄混合物中的3pl用來轉化200piof感受態(tài)細菌.///.C.掙必J憂在義濕一f霧細麥細菌在CaCl2存在下獲得感受態(tài)。///.C/.浙^^^愛在勿,使用Sambrook等(1989)描述的方法，使大腸桿菌DH5a細菌獲得感受態(tài)。細菌隨后以200j^l等分樣冷凍在液氮中并在-80。C貯藏.瓜C脊鋪掀在械使用由Sambrook等(1989)描述的方法實施感受態(tài)大腸桿菌DH5a細菌的轉化。熱休克在42°C實施90秒。添加800)iUSoCt培養(yǎng)基，隨后在37。C攪拌下溫育1小時以允許質粒所攜帶的抗生素抗性基因的表型表達。轉化介質隨后在含有適宜抗生素的dYT平皿上涂布。隨后將這些平皿在37°。保持16小時。瓜D.l在房^、#肌2X丄醋農Z)A^順#絲這種提取法基于由Sambrook等(1989)改進的細菌堿裂解法；細菌菌落在5ml含有適宜抗生素的dYT培養(yǎng)基在37t:過夜培養(yǎng)并攪拌。來自3ml培養(yǎng)物的細胞通過在6000g上離心1分鐘而濃縮。殘余物重懸于補加終濃度1mg/ml溶菌酶的200pl溶液1(TrisHC125mM(pH8);EDTA10mM;葡萄糖50mM]中，隨后在渦旋混合后，依次添加400jal溶液2。在水中孵育5分鐘后，使細胞殘片通過在14000g上離心IO分鐘而沉淀。將上清液轉移至添加終濃度100嗎/mlRNA酶A的清潔微量離心管，隨后在65°C溫育15分鐘。上清液通過用苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)提取而純化。DNA用1體積異丙醇沉淀，隨后用70%乙醇淋洗2次、干燥并溶解于20ji1水中。1微升質粒DNA溶液(0.5g/1)用多種酶(3U)在37°C消化2小時。限制酶切產物在1%瓊脂糖凝膠上分析。瓜五.對乂發(fā)的辦和為、浙對最有意義的克隆測序。用軟件MacMollyTetra(SoftGeneGmbH)實施核苷酸序列比對、通過核酸內切酶研究限制性位點和研究開放閱讀框及翻譯DNA片段成氨基酸。使用BLAST程序在NCBI服務器上(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)上實施與數據庫中所含序列的比較。使用PLACE服務器(Higo等，1999，http:〃www.DNA.affrc.go.ip/htdocs/PLACE/signalscan.html)進行啟動子分析并研究用于調節(jié)性轉錄蛋白識別和結合的特異性盒。瓜i這種文庫代表其表達在給定處理后在組織中受到調節(jié)的全部基因。該文庫使用"SMARTPCRcDNA合成"和"PCR-選擇cDNA消減"試劑盒(Clontech)從提取自"對照"植物或"用300mMNaCl脅迫3周"的植物中的總韌皮部RNA內構建。該cDNA從總RNA中直接產生并擴增，隨后由RsaI實施酶消化。將(來自受脅迫植物S的韌皮部的)試驗cDNA—分為二并且每個亞批量與不同接頭連接，產生Sl和S2。Sl和S2與過量的(來自受脅迫植物S的韌皮部的)驅動cDNA雜交，隨后匯合而進行第二次雜交。與脅迫條件和對照條件下均表達的基因相對應的cDNA能夠發(fā)生雜交。僅可能擴增并克隆來自受脅迫植物的與對照同系物不雜交并具有不同接頭的cDNA。莽収岸^;發(fā)將PCR產物(90至900bp的片段)直接克隆至pGEM-T-Easy載體(Promega),隨后克隆至大腸桿菌DH5a菌抹。獲得的菌落分配到96孔平板，在液體dYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)并在-80。C貯藏(50°/。甘油)。微量制備直接在96孔平板上進行。將文庫復制并在深孔平板上的2mldYT培養(yǎng)基中在37。C培養(yǎng)16小時并攪拌。在離心g(4000g在4。C上持續(xù)10分鐘)，殘余物重懸于100pl溶液Pl(重懸緩沖液，Qiagen)、冷卻、添加50pg/mlRNA酶A、P2(裂解緩沖液，Qiagen)和P3(中和緩沖液，Qiagen)、冷卻并攪拌直至沉淀形成。離心后，上清液用l體積異丙醇沉淀。再次離心后，殘余物用70%乙醇洗滌，隨后干燥并在攪拌下重懸于TE緩沖液(25pl;Tris50mM,EDTA10mM)中。質粒DNA的終濃度通過分光光度法測定。/J/.i^.在處^J:沉歡將96孔平板各孔內所含的質粒DNA用NaOH(0.4M終濃度)變性并使用復制器(replicator)沉積在尼龍Hybond-N(Amersham;8x12cm)上。質粒克隆(100ng)沉積在濾膜上并通過在80。C溫育2小時而固定至膜上。濾膜在65。C(復合探針)或在42。C(T7探針)上于預雜交溶液中預雜交4小時。放射性"復合探針"通過對總RNA逆轉錄而從錨式寡dT20中產生，其中所述的總RNA代表給定處理后組織中表達的基因。這些探針隨后將差異性地與在濾膜上沉積的克隆雜交。在得自"脅迫"復合探針與"對照"復合探針的信號之間的密度差異允許鑒定最有意義的克隆。獲得的相對值通過用所沉積質粒的內部探針T7校準而修正。逆轉錄反應的第一個步驟是使混合的RNA和錨式寡核苷酸(dT)20dA、(dT)20dG、(dT)20dC(各2jug)在70。C變性IO分鐘。變性形式通過直接轉移到冰上而得到恢復。隨后將這種RNA稀釋于預加熱至42。C持續(xù)5分鐘的混合物中，其中所述的混合物由RTIX緩沖液Tris-HCI50mM,pH8.3;KCI75mM;MgCl23mM和DTT10mM)、dNTP(分別是0,8mM,除dATP為5以外)和在7.5jlU中于2.775MBq上的dATP-33P(Amersham)構成。最后向這種PCR反應物添加800U"MMLV逆轉錄酶"(Promega)并且將混合物在42。C溫育1小時并在70。C溫育15分鐘，隨后在冰中冷卻(使酶變性并且保留cDNA的線性化)。因為可能不存在對探針雜交的干擾，故通過添加8U核糖核酸酶H(Promega)在37。C持續(xù)30分鐘而摧毀基質RNA。將探針在等待摻入驗證dATP-33P的同時保存在冰上。用水以200|il部分進行洗脫并且使用閃爍計數器(Packard,TRI-CARB1900TR)估計水的放射活性。將含有探針的部分合并，并且用作"復合探針"以在65。C對濾膜雜交過夜。通過與T7探針雜交而校準在每個點上沉積的質粒DNA量。這種探針從100ngT7寡(20)聚物中產生，用yATP-"P(1.85MBq)在其(5，)端標記、通過在37"在激酶IX緩沖液(Promega)中的"T4多核苷酸激酶(10U,Promega)反應30分鐘而固定，隨后在冰上封閉。濾膜在42。C與反應產物雜交過夜。濾膜的雜交在65°C(復合探針)或在42°C(T7探針)在稀釋于雜交緩沖液(組成與預雜交緩沖液相同)中的放射標記探針存在下進行16小時。濾膜隨后在65""C或在42。C于標準枸椽酸鹽水(SSC)2X;SDS0.1°/。中洗滌2次持續(xù)10分鐘；在65。C或42。C于SSCIX;0.1°/。SDS中洗滌2次持續(xù)10分鐘、在65。C或在室溫于SSC0.5X;SDS0.1%(SSCIX:NaC10.15M和0.015M檸檬酸鈉)洗滌2次持續(xù)5分鐘。將濾膜展開放入塑料袋內并置于曝光盒中的"低能量型屏(Kodak,Amersham)下持續(xù)6日。在濾膜上存在的信號隨后使用Phospholmager系統(tǒng)(STORM820,分子動態(tài)安瑪西亞(MolecularDynamics,Amersham))定量并且以相對單位表述。以T7探針(在每個質粒內部的探針)獲得的值用來對每個點計算信號的相對密度。iVo吋;em型染^(^M4染Jt///.G./.^豕斧及A^脊移用于變性瓊脂糖凝膠電泳和通過毛細管作用轉移RNA至尼龍膜上的技術是由Noiraud等，2000描述的技術。在轉移后，RNA通過在80。C溫育2小時而在膜上固定。放射性探針從目的DNA片段中制備。在酶消化后，插入質粒的DNA在1%瓊脂糖凝膠(Sambrook等，1989)上分離并在"DNA凝膠提取試劑盒"柱(Millipore)上純化。DNA殘留物以終濃度125ng/pl重懸于水中。放射性探針用"Prime-a-基因標記系統(tǒng)"試劑盒(Promega)基于六核苷酸混合物與待標記DNA片段的雜交而產生、變性。六核苷酸起到Klenow片段的引物作用，其中Klenow片段通過摻入a32P-dCTP而合成互補鏈。探針的合成在25。C在25ng變性的基質DNA和1.51x106Bq的a32P-dCTP(專一活性220TBq/mmol)存在下進行2小時。在反應結束時，未摻入的核苷酸通過使混合物經過SephadexG-50柱而與探針分開。將含有探針的部分合并、在95。C變性3分鐘并貯存在冰上直至使用。///.GJ及A^4殺義膜在65。C于預雜交溶液中預雜交4小時。雜交在65°C在放射標記的同源性探針(芽菜/芽菜雜交)存在下進行16小時。膜隨后在65。C于SSC2X;SDS0.P/。中洗滌2次持續(xù)15分鐘；在68。C于SSC1X;0.1。/。SDS中洗滌2次持續(xù)30分鐘、在68。C于SSC0.5X;SDS0.1°/。洗滌2次持續(xù)15分鐘。將濾膜展開放入塑料袋內并置于感光屏上3小時。RNA沉積物以c^P-dCTP標記的26S齊菜核糖體探針進行校準。瓜HJL4C五？C^編碼性序列和5，和3'非翻譯部分使用"馬拉松(Marathon)cDNA擴增試劑盒"(Clontech)從提取自"T對照"植物或"S脅迫"植物的韌皮部總RNA中克隆。用于這些克隆的引物根據該試劑盒要求而選擇。PCR產物是互補性DNA并且直接克隆至pGEM-T-Easy載體(Promega),隨后克隆至大腸桿菌DH5a菌株。III.I實時逆轉錄酶PCR(RT-PCR)實時RT-PCR從RT(逆轉錄)中進行，其中對于RT-PCR從引物(Invitrogen)和Taqman探:針(應用生物系統(tǒng)英國(AppliedBiosystems,UK))中進行。這些引物選自試驗甘露醇轉運蛋白的編碼性序列的3，非翻譯區(qū)。這些區(qū)域具有最小的彼此間相似性以至所獲得的信號對于這些轉運蛋白之一的表達為特異性。定量性RT-PCR基本上如Wagner等，2001所述進行。用于AgMaT3的特異性引物是5，-ATACAGCGGGGATTATAGCTTTG-3'和5'-ATCCGCAGGTACTCCAAAAATTT-3'，以擴增對3，非編碼區(qū)為特異的101堿基對片段。擴增的片段通過測序進行驗證。FAM標記的探針是6FAM-TACCCGGTATATTCACTC-MGB(由AppliedBiosystems合成)。為擴增Ag26S(對照基因)，所用引物是5'-AGCCGCTGGACCCTACCT-3'和5'-AGTTATCTTTTCTGTTTAACAGCCT-3',而熒光探針是6FAM-CTAAGCCGTTTCCAGG-MGB.使用1.0版引物表達(PrimerExpress軟件)應用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems)確定引物和探針。通過PCR在"TaqmanUniversalPCRMasterMix"IX(AppliedBiosystems,羅氏(Roche))、5，引物和3，引物各0.9pM、0.2[iMTaqman探針和稀釋至1/300的RT產物(從10pg總RNA中產生的RT)存在下獲得片段。用ABIPRISM7700(AppliedBiosystems)檢測系統(tǒng)檢測由Taqman探針發(fā)射的熒光。使用來自芽菜的26S核糖體探針對信號定量。這產生定義為循環(huán)數的Ct值，在所述的Ct值上標準化的值ARn(報道染料的熒光密度)超過由軟件產生的閾值。因此，Ct反比例于靶序列的濃度。使用基于PCR的技術獲得基因組序列(內含子+外顯子)和序列已知的啟動子，不需要通常使用的全部篩選步驟(噬菌體庫)?；蚪MDNA分成四組，每組用不同酶消化。選擇的酶產生平末端。根據限制性位點的位置，獲得的片段大小不同。隨后將序列已知的接頭連接到消化片段的末端。用所研究基因的特異性引物(GSP1)和接頭特異性引物(API)在全部4組上進行PCR。對第一輪產物用比第一輪引物更靠內側的引物(GSP2和AP2)進行第二輪或"巢式，，PCR以優(yōu)化結果的特異性。直至4輪PCR,獲得了長度各異的片段。純化攜帶最多信息的最長PCR片段。///././.^躇iZ)A^"炎承將組織(幼小葉)在研缽內于液氮存在下研磨成細粉。每3-5g研磨粉末添加預熱至60。C的15毫升CTAB2x緩沖液[CTAB2%w/v;NaCl1.4M;EDTA20mM;Tris100mM(pH8);P-巰基乙醇0.2%v/v]并且在60。C溫育30分鐘。蛋白質和細胞殘片通過用氯仿/異戊醇[24:1v/v]提取隨后用冷異丙醇(0.5體積)沉淀并在-20。C保持30分鐘而除去。若DNA纖絲可見，則有可能取得DNA纖絲并用含有終濃度10mM乙酸銨的76%乙醇洗滌20分鐘。若不可見，在5000g離心5分鐘并且以相同方式洗滌殘余物。隨后將DNA再次離心并且殘余物經空氣千燥并隨后溶解于補加終濃度10pg/mlRNA酶A的1mTE緩沖液[Tris50mM;EDTA10mM]中并且在37。C溫育30分鐘。通過依次添加1.5mlTE緩沖液、0.5mlNaCl(5M)和2ml冷異丙醇使gDNA沉淀。在5000g上離心10分鐘后，殘余物用70%乙醇洗滌、在空氣中干燥并溶解于TE緩沖液(50^)中。DNA的量通過在210與310nm之間的分光光度測定法估計。在260nm上的1個吸光度對應于DNA濃度50ng/ml。差萄逸義岸^^建基因組文庫使用"通用基因組行走"試劑盒(Clontech)從基因組DNA中構建。所用引物根據該試劑盒中說明書而選擇。將獲得的PCR產物直接克隆至pGEM-T-Easy載體，隨后克隆至大腸桿菌DH5a菌抹用于微量制備和測序。瓜K.^//產道差厲J:游^子脊化擬/^不C7她，戎,通過轉移在報道基因上游的啟動子序列獲得啟動子的表達谞。Gateway技術允許(互補性或基因組)DNA片段從其PCR產物直接進入"供體載體"(pDONR207),隨后進入"目的載體"(pBI-GUS-RlR2或pBI-GFP-RlR2)。所產生旨在克隆這些啟動子的引物(Invitrogen)含有attB序列并且根據"Gateway技術"試劑盒(Invitrogen)中的標準加以選擇。PCR實驗在如IIIJ.1中所述而獲得的基因組DNA上進行。在每次連接后，獲得的質粒在大腸桿菌DH5a菌林中擴增。所用質粒含有ccdB基因該基因對大多數細菌是致死性的。因此，僅可以在細菌中擴增已經發(fā)生重組反應(插入DNA片段并切除ccdB基因)的質粒。J/JXZ^^^在《并,W脊必如Koncz和Schell(1986)所述實施根癌農桿菌LBA4404的制備以準備好在使用前貯藏于-80。C的40pl等分樣(細胞濃度3x10'G個細胞/ml)。遞《冶,/乙法脊^^^^"電穿孔槽在4。C置于冰上。將一個等分樣的農桿菌(40pl)解凍并添加2pl質粒DNA溶液；農桿菌隨后置于槽內。農桿菌接受在15kV/cm上5毫秒持續(xù)時間的電休克。隨后立即添加960^YEB培養(yǎng)基，隨后將混懸液轉移并在28。C溫育1小時并攪拌，以允許質粒攜帶的抗生素抗性基因的表型表達。轉化介質隨后在含有適宜抗生素的dYT平皿上涂布，其中所述平皿在28。C保持16小時。擬南芥轉化使用由Clough和Brent(1998)所述的方法進行，將轉化的農桿菌培養(yǎng)至600nm處的吸光度0.8,收獲，隨后用來轉化擬南芥花穗。瓜Z.^"凝潘發(fā)母中孩錄脊運務^W^處^7^源羞^的碌^:PDR載體具有允許轉運蛋白在酵母中表達的PMA1啟動子和ADH終止子。cDNA序列通過用切割PDR載體以產生定向克隆的相同酶進行酶消化(3U，2小時在37°C)而從擴增載體(pGEM-T-Easy)中提取。消化產物在1%瓊脂糖凝膠上監(jiān)測并純化。消化的PDR質粒隨后使用小奸(shrimp)堿性磷酸酶酶(4U，Promega)在37°C去磷酸化1小時，防止其自身環(huán)化。多種酶在每個反應后在65"上持續(xù)15分鐘而抑制。隨后使用T4-DNA連接酶(3U，Promega)在16。C過夜，使用插入物/載體比3,有可能將轉運蛋白cDNA連接在PDR中。在轉化酵母之前，制備的載體在大腸桿菌dh5a菌抹中擴增。制備感受態(tài)酵母，隨后使用Dohmen等(1991)的方法實施酵母的轉化。III.L.2.轉化的酵母對多元醇的吸收III.。2。制備用于吸收的酵母使用Noiraud等(2001)所述的方法制備酵母。26.酵母多放射標記的甘露醇和山梨醇的吸收使用Noiraud等(2001)所述的方法測量酵母對放射標記的多元醇即甘露醇和山梨醇的吸收；將100pl酵母混懸液在28°C于含有帶5.8kBq甘露醇[2-3H](特異活性6.3x108kBq/mol)的1.1mM甘露醇(終濃度0.55mM)的100^溶液存在下溫育。對于山梨醇吸收試驗，100^tl酵母混懸液含有帶16.6kBq"C-山梨醇(活性1.02x107kBq/mmol)的1.1mM總山梨醇(終濃度0.55mM)。///.Uc.在雜爭J:為V^f齊々j為吸收而制備、洗滌并在無尿嘧啶的SCMES中重懸的500jul細胞沉積在試管內并用水補齊至2ml。添加500pi15%NaOH并將細胞加熱至沸點持續(xù)5分鐘。冷卻后，添加175pi的11.75NHC1以中和溶液并且將溶液渦旋混合。使用Bearden技術(1978)基于考馬斯蘭與蛋白質結合時的顏色改變而分析蛋白質。實施例2I.鹽脅迫和芽菜為構成用于構建消減文庫和產生復合探針的組織儲備，芽菜接受與先前所實施的處理(Noiraud,1999)相比通過調整某些條件所產生的鹽脅迫。為了使器官的收獲條件標準化，將葉的真實年齡(從發(fā)生日起)而非其一般外觀(例如大小)納入考慮。脅迫對生長和葉發(fā)育有不利影響受脅迫葉和非處理葉可能顯得相同但年齡不相同。每批(對照和受脅迫)的9抹植物中，6抹用來收獲組織并提取為產生文32庫及探針所需要的RNA。僅使用來自已達到3周齡的葉柄的韌皮部以構建消減文庫。這些葉已經在脅迫條件下完全發(fā)育。在用300mMNaCl處理3周后，已影響了植物的生長。對芽菜植物整體外觀的觀察(圖2)顯出與以NaCl處理的植物中生長速率降低和出葉缺乏相關的脅迫植物和對照植物間在大小及體積方面的差異。在鹽脅迫期間，芽菜生長緩慢并且新葉出現(xiàn)緩慢。生長抑制是一種脅迫耐受策略。這種減緩是可逆的，因為當植物在鹽脅迫3周后用不含NaCl的溶液澆灌時，則生長和出葉以鹽脅迫之前所提及的相同水平迅速再次建立。最外側(最老的)的葉更迅速地變得衰老，這可能表明一種用于通過將來自最年幼器官的有毒離子積累并隔離于衰老器官中而消除這些離子的策略。這種在老葉中的隔離說明一種鹽脅迫耐受策略。在芹菜中，重要的是保存植物的分生組織完整以至于^i物可以開花。這種策略必須在完整植物層次上進行協(xié)調。通過啟動新基因表達程序，征。本研究集中于韌皮部，其中韌皮部在器官間營養(yǎng)分子和信息分子交換中發(fā)揮壓倒性作用。H.消減文庫的產生為鑒定由鹽脅迫特異性誘導的基因，使用來自Clontech的PCR選擇cDNA消減試劑盒產生消減文庫，其中所述的試劑盒可以鑒定在給定生理條件(在本例中是鹽脅迫)下其表達受到刺激的基因。理論上，僅在分析結束后才獲得這些基因。從受脅迫植物的cDNA中扣除與正常狀態(tài)下組成型表達的基因相對應的cDNA。PCR循環(huán)可以擴增對鹽脅迫特異的基因。提取的韌皮部組織的量比用葉提取的量更有限，并且因此為信使引入補充性初始擴增步驟(SmartPCRcDNA合成試劑盒，Clontech)。根據制造商說明書(PCR選擇cDNA消減試劑盒，Clontech)產生消減文庫。雖然構建了第一個韌皮部消減文庫并產生有關鹽脅迫應答的良好結果(包括熱休克蛋白和酪蛋白激酶l亞基)，然而獲得的克隆量太少以至于不能構成文庫。產生了新的韌皮部消減文庫并且提供如下詳細結果平均插入物大小90-900bp。將消減并擴增后獲得的克隆連接到pGEM-T-Easy載體(Promega)。菌落(最大，即750個中的736個)分別在96孔平板上培養(yǎng)。出于保存目的，在-80。C冷凍后復制菌落；培養(yǎng)另一復制物以通過微量制備法提取質粒DNA。//乂矛發(fā)'漯減X岸謬逸,鍵通過消減文庫法獲得的克隆數目太多(對于韌皮部消減文庫是736個)以致于不能夠分別分析它們。為改進研究，將來自所獲得克隆的質粒DNA置于濾膜上，所述的濾膜與從提取自"受脅迫"組織或"對照"組織的RNA中產生的復合探針雜交。隨后對信號定量和分析并且保留呈陽性(取決于NaC1/對照比)的克隆。選擇來標記所述探針的放射元素是磷33，質粒DNA的濃度是50ng^d。II.B.消減文庫后獲得的克隆的沉積和雜交產生硝酸纖維素濾膜(96孔)以鑒定克隆微量制備在冷凍的文庫復制后培育宿主細菌的平板上進行。因此，736個獨立克隆可以置于膜上并進行分析。膜與復合探針雜交，其中所述的復合探針通過對提取自對照韌皮部或來自受脅迫植物的韌皮部中的RNA"P標記，隨后逆轉錄而產生。對獲得的放射性標記物計數(Phospholmager)并比4交。30個克隆在脅迫條件下顯示強烈信號并對其質粒DNA測序(表I)。<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>表I.從差異性雜交期間顯示高脅迫/對照比的韌皮部消減文庫中獲得的cDNA序列。這些片段的近似大小以堿基對表示。相應的同源性和登記號通過與BLAST數據庫比較而獲得。//.C.潛耒^與^迷^敘^:部涂^^，/^^磬效茅z夷遂岸舉在30個陽性克隆中，可以鑒定出與已報道了其在脅迫中作用的基因顯示相似性的序列(尤其蛋白質如熱休克蛋白、HSP、脫水誘生蛋白和金屬硫蛋白)。三個序列與相同的基因相同并屬于該基因，并且另外8個序列未對應于任何已知的序列。剩下21個序列中，詳細研究3個序列。//.c丄/^Af"rj，#衷一種#;##虞寧#^蛋找到的部分序列極為類似于芽菜中所鑒定的其它2種甘露醇轉運蛋白AgMaTl和AgMaT2(Noiraud等，2001a)。從韌皮部消減文庫中分離的部分序列略微不同并且命名為AgMaT3。轉運蛋白如AgMaT3可能通過允許在植物中轉運滲透保護物質如甘露醇而在鹽脅迫耐受性中發(fā)揮重要作用。這種轉運蛋白代表應答鹽脅迫時韌皮部中的良好候選者。會j減蛋冷4個序列對應于金屬硫蛋白(MT)。徹底鑒定了兩個序列并且它們屬于AgMT2(齊菜金屬碌b蛋白2)的3，區(qū)。第三個序列也與AgMT2同源，但位于前兩個序列的上游。第四個序列也對應于金屬硫蛋白，但與AgMT3同源。這些命名與Vilaine等(2003)相符。金屬硫蛋白是富含半胱氨酸并且能夠結合全部物種即動物和植物及原核生物中存在的金屬(Zn、Cd)的低分子量小蛋白。它們還參與對脅迫如以金屬離子處理、熱休克(Hsieh等，1995)、葡萄糖及蔗糖缺乏(Chevalier等，1995)或在其高濃度情況下(Chatthai等，1997)、在低溫(Reid和Ross，1997)、損傷和病毒感染(Choi等，1996)的應答。對消減文庫的分析揭示了一定數目受鹽脅迫誘導的序列。雖然這些文庫/人得自韌皮部的RNA中產生，然而這不排除所鑒定基因也在其它組織中表達。出于此原因，通過逆向RNA印跡法取定所得序列的位置以確認它的韌皮部特異性。在濾膜上分析文庫后，將30個顯示最多陽性信號的克隆置于微濾膜上，所述微濾膜由從提取自源于"對照"或"受脅迫"芽菜葉柄(分別是PhT和PhN或XT和XN)的韌皮部或木質部內的RNA中產生的新復合探針雜交。10個克隆在這種分析后因特異性地受鹽脅迫誘導而保留；它們中的一些具有高韌皮部/木質部比(表II)。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表IL在差異性雜交后從韌皮部消減文庫中用復合探針獲得的cDNA序列。這些片段的近似大小以堿基對表示。根據克隆在鹽脅迫期間在韌皮部中表達的特異性分離這些克隆。僅將比值大于2的克隆插入上表中。在韌皮部與木質部間的比率在復合探針雜交后計算，其中所述的復合探針從提取自受鹽脅迫的植物的韌皮部和木質部的RNA中獲得。使用T7探針(用于克隆文庫的質粒的內部探針)對篩選標準化。目的克隆包括甘露醇轉運蛋白AgMaT3和金屬石克蛋白MT2。還包括金屬硫蛋白MT3,但是在對照韌皮部中的信號是零，雖然韌皮部/細胞激動素比高。為改進這些結果，RNA印跡實驗通過在濾膜上沉積提取自對照或受脅迫芽菜葉柄的韌皮部、木質部和貯藏實質的RNA而進行。膜與從因其組織特異性而被選擇的序列(在標記前通過消化和純化而提取試驗克隆的插入物)中產生的放射標記探針雜交。這些雜交的結果示于圖3。使用核糖體26S芽菜探針對這些雜交進行定量并且使用曝光系統(tǒng)(Phosphlmager:STORM820)測量密度。獲得的值作為百分數給出100%用于各#采針在"對照'，韌皮部(PhT)中的表達；從這種組織中實施比較(圖4)。AgMaT3探針更特異性地在"受脅迫"韌皮部(PhN,225%)上固定，從而證實了前述結果。AgMaT3的表達還在貯藏實質(PaN,171%)和在木質部中由鹽脅迫刺激。RNA印跡的結果證實AgMaT3是表達受鹽脅迫調節(jié)的基因。兩種金屬硫蛋白AgMT2和AgMT3以不同方式反應。AgMT3主要在韌皮部中表達并且這種表達在鹽脅迫后非常強烈地得到刺激(224%)。鹽脅迫后對韌皮部中AgMT2表達的刺激作用不是如此強(133%)。主要在對照和受脅迫植物的韌皮部中觀察到這兩種金屬硫蛋白的表達(即便在鹽脅迫后在木質部中也受到刺激，然而這種表達仍然顯著低于韌皮部中測量到的表達)。因此，金屬硫蛋白對韌皮部是特異性的，并且金屬硫蛋白的表達有效地由鹽脅迫誘導，尤其對AgMT3是這樣。潛論此第部分的目的是鑒定其表達在鹽脅迫期間在齊菜韌皮部中受誘導(或刺激)的基因消減文庫的產生需要發(fā)展最大數目的克隆用于擴增文庫的終末步驟僅可能使用與試劑盒制造商推薦的菌林不同的菌林進行。對減少數目的隨機選擇克隆的第一次分析表明消減作用是有效的。大量獲得的克隆促使發(fā)明人尋找可以調控消減效率的系統(tǒng)。產生的微濾膜允許對超過700個克隆測試其優(yōu)先雜交來自受脅迫植物而非對照植物的韌皮部中RNA的能力。使用克隆質粒中存在的T7探針對信號標準化。對反復地產生最強烈信號的克隆測序并做數據分析(表I)。為改進這些結果并驗證鑒定的序列是否確實對韌皮部和鹽脅迫是特異性的，將相應的29個質粒再次置于新的膜上并開展與從受脅迫或不受脅迫的植物的韌皮部中或從相同植物的木質部中產生的放射標記探針雜交，僅保留表現(xiàn)特異性和由鹽脅迫誘導的序列。因此在最終RNA印跡驗證前選擇有限數目的序列，包括貯藏實質作為追加組織。從這些結果中，似乎所述2種金屬硫蛋白以及甘露醇轉運蛋白AgMaT3顯然具有最有意義的圖譜。獲得的多種結果說服本發(fā)明人通過鑒定有意義的基因即金屬硫蛋白2和金屬硫蛋白3和新穎甘露醇轉運蛋白AgMaT3的啟動子而繼續(xù)研究。以下步驟因此是使用基因文庫研究這些基因的啟動子并監(jiān)測在鹽脅迫期間在植物多種器官和組織中的活化。III.對芽茱中的一種新甘露醇轉運蛋白AgMaT3的表征對韌皮部消減文庫的分析允許從置于膜上的736個克隆中保留脅迫條件下顯示強信號的30個克隆。保留了一種部分序列(181bp)，因為它對應于甘露醇轉運蛋白(一種適合應答鹽脅迫時作為"相容性溶質"的化合物)。目前，已經在芽菜中鑒定到2種甘露醇轉運蛋白AgMaTl和AgMaT2(Noiraud等，2001a和b)。對從提取自受脅迫韌皮部的聚腺苷酸RNA中產生的cDNA進行RACEPCR，其中接頭已經連接到所述cDNA上以擴增5，和3，部分。根據"MarathoncDNA擴增"試劑盒(Contech)中的指南，通過PCR在選自181bp部分序列(來自韌皮部消減文庫)的引物與特異性接頭引物之間擴增這些cDNA的5，和3，序列。選擇這些引物以至于可以重疊并排列5，和3'片段以重構完整的cDNA序列。一旦獲得5，和3'序列，則設計新引物以擴增完整的AgMaT3cDNA(5，引物5'GACTAGTCCCAAGAATCTGAGTTCACC-3'和3'引物5'-CCGCTCGAGCATCACAAAGCTATAATCC-3'AgMaT3的cDNA總長度是1796bp。它包括1443bp的開放閱讀框。該序列整體上與兩種其他甘露醇轉運蛋白(AgMaTl是1766bp和AgMaT2是1781bp)具有相同大小。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage39</formula>AgMaT3cDNA的1443bp開放閱讀框編碼含481個氨基酸的蛋白質，該蛋白質比AgMaTl(513aa)和AgMaT2(524aa)所編碼的蛋白質更短。AgMaT3分別與AgMaTl和AgMaT2顯示82%和73°/。的相似性。這種較短的尺寸實際上歸因于克隆性人為現(xiàn)象。實際上，通過使用新引物(5，引物5'-AGCTTCGACCATTGTTTCTC-3，和3，引物5'-CCGCTCGAGCATCACAAAGCTATAATCC-3'),本發(fā)明的作者能夠克隆長度更長的新cDNA。與最長蛋白質相對應的序列命名為AgMaT3;與最短蛋白質相對應的序列再命名為AgMaT3，。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage39</formula>數字化分析AgMaT3的基因組序列顯示一個新ATG(產生一個1572bp的開放閱讀框，SEQIDNO:14)。通過采用這個ATG作為翻譯起點(圖6和8)，編碼的蛋白質比通過RACEPCR獲得的蛋白質(481aa)更長(524aa,SEQIDNO:8)。比對蛋白質序列AgMaTl、AgMaT2和AgMaT3證明該結果似乎更為合理，就這三個序列的長度和比對結果而言存在更好的一致性(圖6)。AgMaT3cDNA的1572bp開放閱讀框編碼含524個氨基酸的蛋白質，該蛋白質的大小與AgMaTl編碼的那些蛋白質相同并且比AgMaT2編碼的那些蛋白質(518aa)(圖7)略微更長。這些轉運蛋白之間的相似性高，但是這種相似性因不同的蛋白質部分而模糊不清(圖7,未變灰的空格，其中M酸與所研究的其它兩種序列均不同源)，因此表示這些甘露醇轉運蛋白有差別并且尤其在氨基末端和羧基末端中是如此。含524個氨基酸的AgMaT3蛋白質具有理論分子量56670Da。已估計這種蛋白質的等電點是8.3,該值接近對AgMaTl和AgMaT2所測定的等電點(分別是8.3和8.4).錄種絲源奴蛋白質序列分析顯示AgMaT3與其它兩種甘露醇轉運蛋白具有強烈同源性。將AgMaT3和AgMaT3，的cDNA分別克隆至隨后起到補足RS453菌抹性狀作用的穿梭載體PDR196中。在轉化后，具有AgMaT3/PDR質粒的酵母因該質粒攜帶的URA3基因所致的尿嘧咬原養(yǎng)型而在SC葡萄糖培養(yǎng)基上分離。為驗證甘露醇轉運由AgMaT3實施，監(jiān)測由含有或不含AgMaT3cDNA或AgMaT3，cDNA的質粒補足性狀的菌抹的卩H]-甘露醇吸收動力學。與酵母中用AgMaT3/PDR的3個轉化事件相對應的3個獨立克隆受到測試。對氚標記的甘露醇的吸收是時間的函數(圖5)。表達了質粒AgMaT3/PDR的酵母吸收比以PDR轉化的酵母多得多的甘露醇。在3分鐘時的吸收值極接近于相同測量條件下對AgMaTl提到的那些吸收值。該結果因此表明AgMaT3是一種甘露醇轉運蛋白。應當指出在AgMaT3'/PDR/RS453酵母吸收甘露醇期間獲得的結果表明這種轉運蛋白有功能，盡管該蛋白質具有約40個氨基酸的缺失。瓜6.^/^gM"n^差微y^/使用如用于啟動子的相同原理，以"通用基因組行走(Universalgenomewalker)"試劑盒(Clontech),使用與允許對啟動子測序的那些引物處于反方向上的引物而實施基因組序列克隆。AgMaT3的編碼性序列由264和805bp的兩個內含子剪接而成(圖8)。部分基因組序列代表從ATG密碼子開始的2772bp。從這個基因組序列中推導出的外顯子完美地對應于cDNA序列，除在翻譯起始水平之外。注意聚腺苷酸化位點AATAAA在AgMaT3基因組序列的有義鏈(+)上第2822位置(或終止密碼子后第179bp)中存在(圖8)。,遵f4;釆if憂^應^^fl^/神邀歡^MgMarJ襲這^》浙這種分析通過實時RT-PCR對已經用300mMNaCl處理或不處理的植物的多種組織(木質部、韌皮部、葉、根和實質)實施，旨在研究應答脅迫時的表達水平和它們的刺激作用。用AgMaT3探針獲得的值以26S芽菜核糖體探針進行標準化。"對照"和"受脅迫"韌皮部之間的3.42Ct差異(見表III中的AACt)表明需要3.42個追加循環(huán)以便在對照韌皮部中獲得如在受脅迫韌皮部中那樣相同密度的信號；AgMaT3的表達在來自以NaCl處理的植物內的韌皮部中更高。此外，因為PCR循環(huán)允許指數型擴增，3.42Ct差異對應于23'42，即AgMaT3轉錄物在來自"受脅迫"植物的韌皮部中比來自"對照"的韌皮部中高10.70倍。該結果證實上文在消減文庫中以及通過RNA印跡法獲得的結果(圖3和表II)。類似地，在"對照"與"受脅迫，，根之間的7.52Ct差異(見表m中的AACt)表明需要7.52個額外循環(huán)以在對照根中獲得如"受脅迫，，根中那樣相同密度的信號。<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表III.通過實時RT-PCR用AgMaT3探針在對照或NaCl(300mM持續(xù)3周)處理的植物的多種組織(韌皮部、木質部、實質、葉、根)中獲得的結果。這些結果已經由芽菜標準26S核糖體探針的值校正。Ct對應于感知給定密度的信號所需要的循環(huán)數。ACt是在消減對26S探針獲得的Cts均值后，在對AgMaT3探針獲得的Ct均值(對于給定組織中所分析探針的重復均值)之間的差異。AACt對應于多種組織間的比較(兩個ACts間的差異)。Ct值越高，為獲得信號需要的循環(huán)越多并且因此該組織中的轉錄物越少。///.S,,f^gM373W潛論在作為時間函數的甘露醇吸收期間獲得的信息和核苷酸及蛋白質序列比對使我們得出結論AgMaT3編碼了梗芽菜中的第三種甘露醇轉運蛋白。實時RT-PCR和RNA印跡研究證實AgMaT3的表達特異性地針對鹽脅迫。這種甘露醇轉運蛋白因此可能在鹽脅迫耐受性中發(fā)揮重要作用。IV.在擬南芥中研究啟動子和異源表達為研究韌皮部中受鹽脅迫誘導的特異性啟動子，需要能夠獲得用于克隆啟動子的高性能系統(tǒng)(尤其嘗試用于篩選基因組文庫的步驟)。此外，研究來自入噬菌體基因組文庫中的AgMaTl基因的啟動子的首次嘗試沒有成功(CyrilMaingourd，2001)。為了研究幾種啟動子，需要使用更快速的技術。處于這種原因，使用從DNA序列中PCR擴增啟動子區(qū)的技術(通用基因組行走試劑盒，Clontech)。對齊菜中啟動子序列的研究對以下所選基因行進行新甘露醇轉運蛋白的AgMaT3和兩種金屬硫蛋白基因(AgMT2和AgMT3)?；疉差^jg義^;^^動fW義發(fā)來自芹菜的基因組DNA分成4組，對這4組使得四種不同的限制酶即EcoRV、Dral、Sspl和Hpal發(fā)揮作用，產生平末端，特異性接頭已經與之連接。獲得4種不同的部分，對其用待擴增序列的(接近于用于翻譯起始的ATG密碼子而選擇的)特異性引物和接頭特異性引物實施PCR。所得片段大小各異，在每種消化作用中具有特定圖譜。僅留下最長的擴增片段用于克隆和測序。就選擇所用的限制酶(由供應商推薦的其中一種酶不切割芽菜DNA)和設備而言，為獲得這種文庫必需幾個發(fā)育期。對于研究的每種基因，將ATG上游的啟動子區(qū)克隆至中間載體(pDONR207)中，隨后通過Gateway系統(tǒng)(Invitrogen)轉移至雙元表達載體(pBi-GUS-RlR2和pBi-GFP-RlR2)。這允許在轉化擬南芥植物后在所述啟動自控制下開展報道基因(GUS或GFP)的研咒。形成的構建體起到轉化農桿菌的作用。在驗證質粒于農桿菌中存在后，使用方法和儀器部分部分中所述的技術予轉化擬南芥植物。/K及J^^^gMa73#處雜/^運蛋冷^^吝^好啟動子AgMaT3啟動子代表ATG上游的589bp(圖8，SEQIDNO:4)。AgMaTl和AgMaT32啟動子區(qū)也被克隆并且是ATG上游的844bp和383bp。這三個含有眾多A/T重復作為啟動子區(qū)特征。使用PLACE軟件(h加〃麗w.DNA.affrc.go.i。/sigscan/)研究應答不同刺激的轉錄因子的結合位點。僅分析受糖信號和光調節(jié)的順式元件。所述盒的位置相對于翻譯起點(ATG密碼子)表示。調節(jié)蛋白可以與標注為(+)的有義鏈或與標注為(-)的互補性反義鏈結合。在AgMaT3啟動子中7次鑒定到對于光調節(jié)作用所需要(Teakie等，2002)的GATA盒(Gata盒、S000039)(在-299(陽)、-289(國)、-269(+)、畫264(+)、-254(-)、-154(+)和-77(+))。GT-1結合位點(GT1CONSENSUS、S000198)(Terzaghi和Cashmore，1995)在AgMaT3上游出現(xiàn)5次(國392(陽)、-291(-)、-264(+)、-201(-)和-154(+))。在單子葉植物和雙子葉植物中受光調節(jié)的基因上游為高度保守的GATAA序列(I-盒，S000199)(TerzaghietCashmore,1995)3次存在于AgMaT3上游(在-290(-)、-264(+)和-154(+))。參與由光活化的基因的"T盒"(T盒A丁GAPB、S000383、ACTTTG)存在于AgMaT3啟動子中-455(-)處。應答光時的煙草psaDb基因轉錄依賴于元件Inr("啟動者"INRNTPSADB,S000395,C/TTCANT(C/T)2，在上游出現(xiàn)2次AgMaT3(-387(+)和-189(-))?；?二^"潛浙多現(xiàn)在把糖視為能夠調節(jié)眾多基因表達的分子。應答于赤霉素并且還參與由糖所致阻遏的PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A(CCTTTT,S000259)盒(Morita等，1998)在AgMaT3啟動子序列中出現(xiàn)2次(-398(+)和-219(-))。元件TATCCA(TATCCAOSAMY，S000403)即MYB蛋白結合位點(Lu等，2002)在AgMaT3啟動子中出現(xiàn)1次(-299(+))。"W-盒"元件(W盒HVISOl，S000442,TGACT)即(由糖誘導的在大麥中起糖信號作用的)轉錄因子SUSIBA2的結合位點在AgMaT3啟動子中鑒定到3次(-419(-)、-367(-)和-74(-))。這些元件表明糖(葡萄糖、蔗糖)調節(jié)作用。發(fā)現(xiàn)金屬硫蛋白在韌皮部中并且在鹽脅迫情況下以及在綠色蟑蟲和病毒侵襲情況下受到誘導(FranchonDivol,2003)。本發(fā)明鹽脅迫分析的結果已經顯示金屬硫蛋白AgMT2和AgMT3在應答這種脅迫時特異性地表達(圖3)。所述啟動子區(qū)代表1319和648bp并且克隆在用于AgMT2和AgMT3的pBi載體的報道基因(GUS和GFP)上游(圖9和圖10)。IV.D.對脅迫應答盒的分析啟動子的數字化分析揭示與非生物性脅迫有關的眾多潛在的順式元件。脫落酸(ABA)存在于全部植物中。這種植物激素參與種子發(fā)育的幾個事件并調節(jié)眾多基因在應答環(huán)境脅迫如脫水、鹽和寒冷時的表達(Busk和Pages,1998)。分析AgMaT3、AgMT2和AgMT3的啟動子發(fā)現(xiàn)順式調節(jié)物ABRE(ABA應答元件)，其中眾多ABF(ABRE結合因子，bZIP蛋白亞家族成員)在應答ABA依賴性信號途徑(Kang等，2002)時結合至ABRE上以誘導眾多基因的表達(Choi等，2000)。在擬南芥中，ABA對rd22基因的誘導和脫水作用涉及與特異性CANNTG(MYCCONSENSUAT，S000407)或C/TAACG/TG(MYB2C。NSENSUSAT,S000409)、A/TAACCA(MYB1AT,S000408)位點結合的轉錄因子MYC和MYB(Abe等，2003和1997。CANNTG(S000407)序列也是應答寒冷時調節(jié)編碼CBF的基因轉錄(Chinnusamy等，2003)的ICE結合位點(CBF表達的誘導物)。S000407位點存在于AgMaT3的上游(-550(+/-)，圖8和H)和AgMT2的上游(-369(+/-)和-158(+/-),圖9和圖11)。在AgMT3啟動子中沒有鑒定到該位點(圖10和11)。在AgMaT3基因上游于-820(+)處、在AgMT3基因上游于-575(+)處分析出S000409序列。S000408存在于AgMT2啟動子中-642處。由脫水作用和鹽脅迫誘導的擬南芥MYB轉錄因子(Urao等，1993)識別并與共有序列TAACTG(MYB2AT，S000177)結合。這種共有序列表征于AgMT3上游于-575(+)處。CNGTTG/A(MYBCORE，S000176)序列代表擬南芥中也由水脅迫誘導的MYB的結合位點。已經在AgMT2啟動子于-820(-)處以及AgMT3啟動子(一575(-)和-563(-))中鑒定到這種序列。來自大豆(soya)的hs(熱休克)基因的熱調節(jié)表達(Rieping和Schoffl,1992)通過啟動子的HSE(熱休克元件)加以調節(jié)，但是這種活性需要額外的序列CCAAT盒(CCAAT盒1,S000030)。這些序列存在于AgMaT3基因上游(-176(+))。在AgMaT3基因上游不存在這種盒，不過在AgMT2啟動子于-1280(-)、-834(畫)、-1263(-)、-693(-)、-1057(-)和-624(+)處6次鑒定到這種盒。應答生物脅迫和非生物性脅迫的眾多信號途徑是相互交聯(lián)的。應答病原體侵襲和損傷的的轉錄因子的連接元件也留下作為鹽脅迫誘導期間的潛在候選者。例舉其中某些元件，當在AgMaT3、AgMT2和AgMT3啟動子中見到它們的基序時。眾多防御基因的表達受順式元件如在AgMaT3上游-284(-)處鑒定到的GCC(GCCCORE,GCCGCC，S000430)盒調節(jié)。基序AG(AGATCCAA，AGMOTIFNTMYB2，S000444)是足以提供誘出處理后損傷應答的元件(Sugimoto等，2003)?；騍000444已經在AgMaT3啟動子中-452處找到。生物性脅迫應答時最主要的元件是W盒，即WRKY蛋白(參與調節(jié)多種生理程序如抗病原體防御、衰老和藻絲發(fā)育的轉錄因子超家族(Eulgem等，2000))的結合位點。它們與回文TGAC序列連接。W盒如"WB盒"(WB盒PCWRKY1，TTTGACT,S000310)存在于AgMaT3上游-74(-)處和AgMT2上游-169(+)處。擬南芥NPR1基因是誘導性抗病性的陽性調節(jié)物，在其啟動子中含有"W-盒"(W盒ATNPRl,TTGAC，S000390)序列(由病原體感染或以水楊酸處理所誘導的WRKY的結合位點(Yu等，2001))。這種W-盒已經在AgMaT3啟動子(-418(-)、-366(-)和-73(-))中3次鑒定到、在AgMT2啟動子中-168(+)處和AgMT3啟動子中-496處鑒定到。這些元件在AgMaT3，AgMT2和AgMT3的啟動子區(qū)上作為其位置的函數而分布(圖11)。AgMT2的啟動子序列包含應答ABA的少量MYB、MYC結合位點但是在(-)鏈上包含不少于5個HSE元件以及LTRE元件。監(jiān)測這些啟動子在報道基因上游在鹽脅迫期間的植物組織和器官中表達因此是重要的。遞J2匸在擬/^芩^#源'/^^迷而#4動子^W^^^》浙將芽菜中鑒定并克隆的每一序列置于兩種報道基因GUS和GFP上游以使它們在擬南芥中表達?？寺∈褂?Gateway"技術(Invitrogen)在pBI載體的右邊界和左邊界之間進行。對每個基因而克隆的ATG上游區(qū)域示于圖12。克隆區(qū)域的長度是548(AgMaT3)、649(AgMT3)和1319堿基對(AgMT2)。全部的克隆序列包括推測性轉錄起始位點(位于AgMaT3的541位置，AgMT2的1502位置和AgMT3的639位置處)。植物的有效轉錄通過存在卡那霉素下的萌發(fā)和通過用特異性引物的PCR監(jiān)測進行雙重-險證。對于全部實驗，添加兩種對照非轉化的co110系和由處于ATPP2-1啟動子(Dinant等，2003)控制下的uiad基因轉化的植物，其中ATPP2-1啟動子在韌皮部中產生強烈信號。對每種啟動子構建體用5抹植物重復實驗。植物存活在用濃度50-250mM的NaCl處理后加以測試。確定用于100mM。應答后，視覺才企查在鹽脅迫之前和之后的葉的染色及橫截面以驗證韌皮部的顏色。GUS染色后，(未受脅迫的)對照植物葉的整體觀察沒有顯示任何特殊染色，ATPP2和AgMT2情況下例外。在所有情況下，染色局限于葉主脈。對于ATPP2和AgMT2，全部主脈為陽性染色(I-IV型，圖13C),而在AgMaT3和AgMT3的情況下，僅大的主脈(I型)染色(圖13A和圖13E)。在所有情況下，葉柄中的主脈也著色。此外，幼葉和成熟葉以相同方式著色。為確定GUS表達在維管束中的確切位置，穿透冷凍材料做橫截面。對于顯示強烈染色的的植物(ATPP2-1和AgMT2，圖13D),藍色著染在韌皮部細胞內明顯，還偶爾在環(huán)繞細胞中明顯。這可以歸因于染色的擴散，因為已經i正實GUS染色在ATPP2-1的情況下局限于韌皮部細胞(Dinant等，2003)。對于AgMaT3(圖13B)和AgMT3(圖13F)構建體，染色也在韌皮部細胞中是明顯的，因此證實相應cDNA對韌皮部細胞呈特異性的最初鑒定。還在實質性木質部細胞中檢測到染色。在這些細胞當中最有可能的是在功能方面認為與韌皮部的對比細胞極相似的導管相關細胞(VAC)(Fromard等，1995)。由鹽脅迫所致的誘導可以對本試驗呈特異性或形成植物應答更一般級別的脅迫(amoregeneralorder)的部分。為檢驗這種假設，來自同一轉化體的5抹植物的組接受滲透脅迫(缺水4日)、寒冷脅迫(在4。C持續(xù)4日)、熱脅迫(在30°C持續(xù)4日)和傷害脅迫(葉用鑷子扎孔3次，小心避開大的主脈)。植物在脅迫后當日收獲。5抹獨立植物的用作對照。植物如對于鹽脅迫那樣進行染色。全部植物(除水脅迫和鹽脅迫之外)每日兩次用10ml自來水澆灌或用肥料溶液(在脅迫時間期間一次)澆灌。在脅迫時間結束后對葉(完全成熟的葉或幼葉)采樣并將其用于組織化學GUS染色(Jefferson等，1987)。其它組的葉在熒光測量GUS試驗(Jefferson等，1987)之前冷凍在液氮中并在-80。C貯藏o對于AgMT2植物，難以觀察到多種脅迫之間的差異，因為染色在對照植物中已經特別強烈。然而，在染色譜方面沒有觀察到差異。在AgMaT3的情況下，全部脅迫形式產生相似的染色譜，例外是其中沒有檢測到信號的水脅迫和傷害脅迫，盡管植物仍然健康良好。在AgMT3植物中，GUS染色在全部脅迫形式中是明顯的，例外是傷害脅迫。對傷害脅迫的應答可能使用了不同的信號途徑并且可能不會導致所研究基因的活化。所述結果與用芽菜獲得結果非常相似。AgMT3的5'區(qū)域和AgMaT3的5，區(qū)域均導致報道基因在韌皮部(并且某種程度還在木質部)中表達，但是僅在受脅迫植物而不在對照植物中發(fā)生。在AgMT2的情況下，在轉化擬南芥植物的韌皮部中觀察到較大量的表達，即便在對照條件下也是如此。有趣的一點是擬南芥中的AgMT2啟動子和GUS在全部葉主脈中高度的表達重疊(圖13C),這表明表達譜對韌皮部是特異性的。實施例3:轉化蕓苔屬植物(brassica)蕓苔屬植物轉化方案基于Brasileiro等1992和Bethomieu(博士論文通過用編碼蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis)內毒素的基因的遺傳轉化而產生耐受夜蛾(noctuid)的轉基因巻心菜)。種子在拜耳氯(bayrochlore)溶液(3粒/每升去礦質化水)中攪拌消毒25分鐘，隨后用無菌水淋洗并在吸水紙上干燥。如此消毒后，將種子播種在管內Ml萌發(fā)培養(yǎng)基(4.4g/l的MS5519(Sigma)、20g/l蔗糖和8g/1瓊脂(pH5.8))上。種子在20°C(16小時光周期)培養(yǎng)15日以獲得在2-3葉期上的小植物。使用2種農桿菌C58pMP90含有帶T-DNA的pSCV質粒，其中所述的T-DNA包含處于本發(fā)明啟動子序列控制下的報道基因(GUS基因)表達盒(選擇卡那霉素50pg/ml;利福平20pg/ml),第二種農桿菌含有含有致癌性t-DNA(pT182-139)(選擇卡那霉素50|ug/ml;利福平50pg/ml和慶大霉素20|ig/ml)。細菌在含有選擇抗生素外加1ml甘油細菌貯藏物的20mlLB培養(yǎng)基(來自Difco的LuriaBertani)中預培養(yǎng)。這些預培養(yǎng)物在28。C攪拌(200轉/分鐘)24小時。通過添加1ml預培養(yǎng)物至含有選擇抗生素的20mlLB培養(yǎng)基中實施培養(yǎng)。培養(yǎng)物在28。C攪拌(200轉/分鐘)過夜。丄勿霧^;,備若過夜后兩種農桿菌培養(yǎng)物在600nm處的光密度不是1,則將它們在4000轉/分鐘離心10分鐘。細菌殘余物在含有0.88g/1MS5519和10g/1蔗糖的足量體積M4液體培養(yǎng)基(pH5.8)中溶解以得到想要的OD。這2種細菌以細菌2/細菌1比例1:1/6加以混合。4.控浙付^#和定控使用在細菌混合物中蘸過并用來在高于子葉的三個不同點上損傷莖的DEMARTEL20cm夾持鑷接種小植物。接種的小植物在溫度20。C下(光周期16小時)培養(yǎng)直至腫瘤出現(xiàn)在損傷點處。將腫瘤定植在含有4.4g/lMS5519、30g/1of蔗糖、8g/1瓊脂、400mg/1抗生素(安美汀)的M2培養(yǎng)基(pH5.8)上。.5.穿縣定植胂瘤后約l個月，芽出現(xiàn)。當芽的大小約3-4cm時，將它們分離并置于管內含有4.4g/lMS5519,30g/l蔗糖，8g/l瓊脂，200mg/1抗生素(安美汀)的M2培養(yǎng)基(pH5.8)上。將腫瘤切碎并定植在M2培養(yǎng)基上以再生另外的芽。小植物在M3培養(yǎng)基上分離出芽3-4周后生根。6.擬輛-娜將小植物轉移至土壤填料中并在22。C和80。/。相對濕度上維持l周。它們隨后作為來自所播種種子的植物處理(溫度2(TC和環(huán)境濕度)，在栽培缽內換盆以產生種子。長角果在第5個月成熟。實施例4:番茄轉化番茄轉化方案(雙元轉化系統(tǒng))來源于Filatti等，1987。人置于正方形蚊帳內并用夾子封閉的種子在拜耳氯溶液(每升去礦質化水2或3粒和幾滴Tween)中消毒20分鐘。種子隨后在無菌蒸餾水中經15分鐘淋洗3次并隨后迅速在吸水紙上干燥。將消毒的種子播種在瓶內包含2.2g/lMS6899、2ml/lNitsh和Nitsh維生素,1965、30g/1蔗糖(pH5.9,用KOH調節(jié))和8g/l瓊月旨的Tl萌發(fā)培養(yǎng)基(MS5519,Sigma)上。將平皿留在26。C的恒溫箱內黑暗中24小時。當置于光線下時，子葉發(fā)育。可以在播種7-8日使用子葉。2.系裙沐在資傳T77J:^豕##每個子葉切下一個外植體并且隨后將其置于包含4.4g/lMS6899、2ml/1Nitsh和Nisch維生素、0.9mg/1硫胺素、200mg磷酸二氫鉀(KH2P04)、30g/1蔗糖(pH5.9，用KOH調節(jié))、8g/l瓊脂、0.2mg/12，4-D(Sigma)、0.1mg/1細胞分裂素(Sigma)、200|miol/l乙酰丁香酮(Aldrich)的T2預培養(yǎng)基上。外植體的底面靠住培養(yǎng)基放置。將平皿在26。C置于光照下24小時。3.細菌的準備EHA105桿菌含有帶T-DNA的質粒pBI101,其中所述的T-DNA包含選擇基因(卡那霉素抗性基因)及報道基因(本發(fā)明啟動子序列控制下的p-葡糖醛酸酶的GUS基因的表達盒(卡那霉素抗生素50)tig/ml;利福平50|ig/ml)。細菌預培養(yǎng)通過接種1ml甘油細菌貯藏物至含有選擇抗生素的10mlLB或TP(來自Difco的酵母胰蛋白胨)培養(yǎng)基而在50mlFalcon管中進行。這些預培養(yǎng)物在黑暗下于28。C攪拌(250轉/分鐘)24小時。通過添加1ml預培養(yǎng)物至含有選擇抗生素的20mlLB或YT培養(yǎng)基中實施培養(yǎng)。培養(yǎng)物在黑暗下于28°C(250轉/分鐘)過夜。次日早晨，測量1ml細菌培養(yǎng)物在600nm上的OD。若OD不是2，則將培養(yǎng)物在3000轉/分鐘離心IO分鐘。棄去上清液并將細菌殘余物用合適體積的液體T2培養(yǎng)基重懸。4.共培養(yǎng)OD6。onm2的2.5ml細菌溶液添加至28.5ml共培養(yǎng)基(僅含乙酰丁香酮、無細胞分裂素、無2，4-D的T2液體培養(yǎng)基)每個培養(yǎng)亞。將外植體從預培養(yǎng)基中取出并添加至培養(yǎng)皿內以與細菌溫育30分鐘。外植體隨后在無菌吸水紙上干燥并再次置于用于預培養(yǎng)的相同固體T2培養(yǎng)基上。將培養(yǎng)皿在26。C置于黑暗中48小時。5外植體的洗滌將約150mlMS6899液體洗滌培養(yǎng)基置于每個(一次性)無菌缽中并且將最多50個外植體浸泡在其中(T3培養(yǎng)基4.4g/lMS6899、2ml/lNitsh和Nitsh維生素、30g/l蔗糖和400mg/l安美汀(pH5.9用KOH調節(jié))。浸泡10分鐘后，使用鑷子取出外植體并在無菌吸水紙上迅速干燥。6.外植體定植至再生培養(yǎng)基將外植體定植到澆注至高沿培養(yǎng)皿內的固體T3培養(yǎng)基上。固體T3培養(yǎng)基4.4g/1MS6899、2ml/1Nitsh和Nitsh維生素、30g/1蔗糖、8g/1瓊脂、2mg/1玉米素(西格瑪(Sigma))、500mg/1安美汀(600mg/l，當使用LBA4404細菌時)、100mg/l卡那霉素(Sigma)。在26°C光照下2周后，將外植體一分為二以使轉化事件有差異(外植體的兩端視為性質不同并且定植在新鮮T3培養(yǎng)基內)。計數共培養(yǎng)21日后再生的外植體數目。7.#備發(fā)'紹絲將芽從共培養(yǎng)4-6周后的初級外植體中分離并置于T4選擇性培養(yǎng)基(2.2g/lMS6899、2ml/1Nitsh和Nitsh維生素、20g/1蔗糖、8g/1瓊脂、0.5mg/1玉米素(Sigma)、300mg/1安美汀(600mg/l，當使用LBA4404細菌時)、50mg/1卡那霉素(Sigma))。當芽達到幾厘米高度時，將它們定植到大的TPS缽的T5生根培養(yǎng)基(2.2g/lMS6899、2ml/1Nitsh和Nitsh維生素、20g/lof蔗糖、2.5g/l植物凝膠、0.5mg/lAIA(Sigma)、300mg/l安美汀(600mg/1,當使用LBA4404細菌時)、50mg/1卡那霉素(Sigma))上。合成葉綠素并發(fā)育出根的小植物視為已經轉化。在通過流式細胞術或計數造粉體而確定每林小植物的倍性程度后，雙倍體小植物通過種植在溫室中循環(huán)。義新必-溫f神潛充分發(fā)育的小植物在10cm小室內的Steck培養(yǎng)基(定植培養(yǎng)基)上扎根。將它們用塑料膜覆蓋2周以維持高濕度。小植物隨后種植到充滿火山灰(Pouzzolane)的7升花缽中。開發(fā)鹽脅迫方案非轉基因番茄種子(Kemer)在常規(guī)萌發(fā)條件下播種帶有在水中吸飽的吸水紙的每個塑料孤10粒種子，其中所述的水補加不同濃度的NaCl(H20、50、100、150、200、250和300mM),每個濃度使用2個平皿。種子在溫度25"C于黑暗中保持3日，隨后暴露在光下。在萌發(fā)后5-6日觀察。H20對照顯示90%萌發(fā)，并且測量小植物(子葉期)為約2cm。遭遇50mMNaCl的種子顯示45%萌發(fā)并且小植物大小是1cm。遭遇100mMNaCl和更高濃度NaCl的種子在觀察時未萌發(fā)并且在2周后不萌發(fā)。使用劑量50mMNaCl來產生鹽脅迫。GUS試驗方案7.A^凝一遂^涼務28.4g/1的0.2MNa2HP04的A溶液(Merck編號238)逐步與24g/1的0.2MNaH2P04的溶液B(Merck編號6)混合，直至達到pH7。將5mgX葡糖苷酸(Clontech)溶解于50pi二曱基曱酰胺中并添加5ml0.2MNaP04,pH4(溶液A+B)以獲得反應緩沖液。2.《^試-發(fā)將200^反應緩沖液置于ELISA平板(96孔)的孔內或將700反應緩沖液置于24孔平板的孔內。隨后添加已經用解剖刀切得極細的組織(莖、葉等)片段。將平板在恒溫箱中在在37。C溫育大約18小時。出現(xiàn)藍色著色顯示GUS酶的活性?？梢杂?5。乙醇進行輕微淋洗以使組織片段脫色以便于讀數(任選項)。藍色著染的密度使用以下尺度記錄0零1+2++3+++用于對以構建體pAgMT2-GUS-tNOS轉化的植物制備組織切片的方案將陽性GUS莖垂直地放置在6%瓊脂填料內；將填料隨后塞入振動切片機(電子裝置，配以可產生1pm薄切片的保險刀片)的壓板(platen)以獲得在我們研究中使用的40urn切片。從刀片上在一滴水/甘油50/50混合物中回收這些切片；隨后將它們在載玻片和蓋片之間在光學顯微鏡(LEICA)下觀察。結果KEMER基因型番茄植物(番茄solanumlycopersicum)使用上述方案以含有pBI101質粒的EHA105農桿菌轉化，其中所述的質粒帶有包含pAgMat3-GUS-tNos或pAgMT2-GUS-tNos構建體的T-DNA。對于每種構建體獲得10-20個獨立轉化事件(T0植物)。PCR試驗在TO植物上使用擴增跨越目的啟動子與GUS基因之間序列的引物進行，旨在檢查植物是否已經得到有效轉化并包含構建體。將PCR陽性植物換盆并收獲它們的種子(Tl種子)并且在生長培養(yǎng)基補加卡那霉素(100mg/ml)上播種以產生Tl植物。在所述番茄植物上進行PCR分析以及分離和KHI2檢驗以僅僅保留顯示3:1分離的的Tl植物(KHI2小于5，表示單插入)。將每個事件的6林Tl植物換盆(移植)以觀察所研究啟動子的表達(GUS試驗)。1.在用pAgMat3-GUS-tNOS構建體轉化的植物上的鹽脅迫和GUS試驗1)用構建體pAqMat3-GUS-tNOS的轉化使用下列引物實施PCR分析啟動子引物5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGAACAGAAACAATTGTGGATG-3'(SEQID36)GUS引物5'畫CGATCCAGACTGAATGCCC-3，(SEQID37)表4中顯示PCR試驗呈陽性并且T1植物具有3:1分離(KHI2小于5)的轉化事件。<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>表IV:具有PCR陽性pAgMat3-GUS-tNOS構建體并顯示<5的檢驗KHI2的轉化事件2)鹽脅迫和GUS試驗獲得的Tl植物用含有50mMNaCl的水每日兩次澆灌，在每次澆灌是用10ml，持續(xù)4日。在第五日采取組織樣品并進行GUS試驗。還使用了2種對照。處于組成型啟動子控制下的陽性GUS對照和非轉化的KEMER植物對照。分析了11個獨立轉化事件(KHI2檢驗小于5，表明單插入)和2個對照(非轉化的和陽性GUS)。當可獲得充足的植物時，將每個轉化事件的6林Tl植物換盆并用于GUS試驗4抹經歷鹽脅迫(S)并且2抹用清水澆灌(NS)。如果少于6抹植物，使用全部可獲得的植物。GUS試驗分別在根片段和葉片段上進行。在試驗后3日進行讀數(見圖14中的平板)。轉化的植物在根處具有藍色著色。GUS在根組織中的優(yōu)先表達顯示AgMaT3啟動子在這種組織中的的活性。試驗結果示于下表5。<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>表V:在^/L4gMad-G[/5^iVaS種建##必#凝受減不凝^it^il的控浙J:的(7"5"試-發(fā)。這些數據顯示了AgMaT3啟動子的特異性根表達。II.在用pAgMT2-GUS-tNOS構建體轉化的植物上的GUS試驗1)用pAgMT2-GUS-tNOS構建體的轉化使用下列引物實施PCR分析啟動子引物5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGACCCACTATCAACAATGATC-3'(SEQID38)GUS引物5'-CGATCCAGACTGAATGCCC-3'(SEQID37)表6中顯示PCR試驗呈陽性并且T1植物具有3:1分離(KHI2小于5)的轉化事件。<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>表VI:具有PCR陽性pAgMT2-GUS4NOS構建體并顯示<5的檢驗KHI2的轉化事件2)GUS試驗分析了11個獨立轉化事件(KHI2檢驗小于5,表明單插入)和2個對照(非轉化的和陽性GUS)。將每個轉化事件的6林Tl植物換盆并用于GUS試驗。GUS試驗分別在根片段和葉片段上進行(平板實例圖15)。試驗結果示于下表7。<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>表VII:陽性GUS片段隨后用于組織細胞學分析并且觀察維管組織中的著色。在試驗后4日進行讀數。首次觀察顯示在莖的維管組織中，在某些情況下僅在葉主脈內的相當濃重的藍色著色(圖16)。3)組織切片圖17顯示植物13(a)和103在葉(b)和莖c)處的組織切片。這些細胞學數據顯示在韌皮部組織中的表達。這些數據顯示AgMT2啟動子的特異性韌皮部表達。在本申請中鑒定的SEQID序列如下SEQIDNO:l:芽菜(Apiumgraveolens)AgMaT3基因的啟動子序列；SEQIDNO:2:芽菜AgMaT2基因的啟動子序列；SEQIDNO:3:芽菜AgMaT3基因的啟動子序列；SEQIDNO:4:芽菜AgMaT3基因的完整5，序列；SEQIDNO:5:芽菜AgMaT2基因的完整5'序列；SEQIDNO:6:芽菜AgMaT3基因的完整5，序列；SEQIDNO:7:AgMaT3基因的完整序列；SEQIDNO:8:從相應DNA序列中推導的推測性AgMaT3基因；SEQIDNO:9:AgMaT2基因的完整序列；SEQIDNO:10:從相應DNA序列中推導的推測性AgMT2蛋白質;SEQIDNO:ll:AgMaT3基因的完整序列；SEQIDNO:12:從相應DNA序列中推導的推測性AgMT3蛋白質;SEQIDNO:13:無啟動子部分的AgMaT3基因的序列；SEQIDNO:14:編碼AgMaT3蛋白質(SEQIDNO:8)的cDNA。參考文獻AbeH.等，2003.植物細胞(PlantCell)15:63-78.AbeH.等，1997,植物細胞(PlantCell)9:1859-1868.BeardenJ.C.,1978.生物化學與生物物理學學報(Biochem.Biophys.Acta)533:525-529.BohnertH丄等，2001.植物生理生物化學(PlantPhysiol.Biochem)39:295-311.BrasileiroA.C.M.等，1992.轉基因研究(TransgenicRes)1:133-141BuskP.K.和PagesM.,1998.植物分子生物學(PlantMol.Biol).37:425-435.ChatthaiM.等，1997.植物分子生物學(PlantMol.Biol).34:243-254.ChevalierC等，1995,植物分子生物學(PlantMol.Biol).28:473-485.Chin畫amyV.等，2003.基因進展(GenesDev).17:1043-1054.ChoiH.等，2000.生物化學(Biol.Chem).275:1723-1730.ChoiD.等，1996.植物生理學(PlantPhysiol).112:353-359.CloughSF和BentAF,1998，植物雜志(PlantJ.)，16:735-743DePascaleS.等，2003.J.美國協(xié)會園藝科學(Amer.Soc.Hort.Sci.)128:136-143.DinantS.,ClarkA.M.,ZhuY。，VilaineF.，PalauquiJ.-C,KusiakC.和ThompsonG.A"2003.植物生理學(PlantPhysiol).131:114-128.DivolF"2004.巴黎大學植物科學院生物學論文(BiologyThesis,PlantSciencesfaculty,UniversityofParis)XI.DohmenR丄等，1991.酵母(Yeast)1:691-692.EulgemT.等，2000.趨勢植物科學(TrendsPlantSci).5:199-206.FilattiJ丄等，1987.生物技術(Bio/Technology)5:726-730.FromardL.等，1995.植物生理學(PlantPhysiol).108:913-918HasegawaP.M.等，2000a.趨勢植物科學(TrendsPlantSci).5:317-319.HasegawaP.M.等，2000b.植物生理學植物分子生物學年鑒(Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol).51:463-499.HigoK.等，1999.核酸研究(NucleicAcidsRes).27:297-300.HsiehH.-M.等，1995.植物分子生物學(PlantMol.Biol).28:381-389.JeffersonR.A.等，1987.歐洲分子生物學組織雜志(EMBOJ).6:3901-3907.KangJ.Y.等，2002.植物細胞(PlantCell)14:343-357.KarakasB.等，1997.植物細胞環(huán)境(PlantCellEnviron).20:609-616.KayR.等，1987.科學(Science)236:1299-1302.KonczC和SchellJ.1986分子基因遺傳學(Mol.Gen.Genet).204KoyamaM丄.等，2001.植物生理學(PlantPhysiol).125:406-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