專利名稱：：新穎的脂肪酶及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新鑒定的包含下述基因的多核苷酸序列，所述基因編碼新穎的脂肪分解酶。所述酶可以從Magm^oW/^gn'^e分離。本發(fā)明描述了新穎基因的全長編碼序列，以及全長功能蛋白質(zhì)的氨基酸序列和基因或氨基酸序列的功能等同物。本發(fā)明還涉及在工業(yè)工藝(例如烘焙工業(yè))中使用這些酶的方法。本發(fā)明還包括用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化的適用于生產(chǎn)這些蛋白質(zhì)的細(xì)胞，和其中本發(fā)明的脂肪酶通常被遺傳修飾以增強(qiáng)或降低其活性和/或表達(dá)水平的細(xì)胞。
背景技術(shù)：
：為了改進(jìn)面團(tuán)的操作特性和/或烘焙制品的最終特性，存在開發(fā)具有改進(jìn)的特性的加工助劑(aids)的持續(xù)努力。在本文中，操作助劑被定義為促進(jìn)面團(tuán)的加工特性和/或烘焙產(chǎn)物最終特性的化合物。可以被改進(jìn)的面團(tuán)特性包括穩(wěn)定性、可加工性、氣體保留能力、降低的起泡(blistering)、降低的粘稠度、彈性、延展性、可模壓性(moldability)等?？梢员桓倪M(jìn)的烘焙制品的特性包括面包體積、外皮易碎性(crustcrispiness)、碎屑紋理(crumbtexture)、碎屑結(jié)構(gòu)(crumbstructure)、碎屑柔軟性、香味相關(guān)的腐敗(flavourrelativestaleness)和保質(zhì)期。改進(jìn)面團(tuán)和/或烘焙制品的加工助劑可以被分為兩組化學(xué)添加劑和酶(也被稱作烘焙酶)。具有改進(jìn)特性的化學(xué)添加劑包括氧化劑如抗壞血酸、溴酸鹽和偶氮碳酸氫鹽(azodicarbonate)，還原劑如L-半胱氨酸和谷胱甘肽，作為面團(tuán)調(diào)節(jié)劑(如二乙酰酒石酸酯)發(fā)揮作用的乳化劑如單/雙甘油酯(DATEM)、硬脂酰乳酸鈉(sodiumstearoyllactylate,SSL)或硬脂酰乳酸鈣(CSL)，或作為面包防硬劑發(fā)揮作用的如單硬脂酸甘油酯(GMS)等，脂肪材料如甘油三酯(脂肪)或卵磷脂等等。作為消費(fèi)者驅(qū)動的、用更多天然產(chǎn)物代替化學(xué)添加劑的需要的結(jié)果，已經(jīng)開發(fā)了許多烘焙酶，所述烘焙酶具有面團(tuán)和/或烘焙產(chǎn)物改進(jìn)特性并被用于取決于特定的烘焙應(yīng)用條件的所有可能的組合中。應(yīng)用于烘焙烘焙工業(yè)中的乳化劑可以被大致地分為碎屑軟化劑(cmmbsofteningagent)或面團(tuán)強(qiáng)化劑。經(jīng)蒸餾的甘油單酯主要被用于碎屑軟化。甘油單酯與淀粉的復(fù)合阻止了淀粉的完全重結(jié)晶，這導(dǎo)致烘焙產(chǎn)物的最初碎屑軟化和/或在保質(zhì)期間碎屑硬化率(crumbfirmingrate)的降低。對于面團(tuán)強(qiáng)化而言，應(yīng)用極性脂質(zhì)的少數(shù)不同的合成類似物，如DATEM、CSL和SSL。它們在面包烘焙中的作用是改進(jìn)面團(tuán)穩(wěn)定性，提高面包體積和誘導(dǎo)精細(xì)且均一的碎屑結(jié)構(gòu)。關(guān)于后一方面應(yīng)當(dāng)注意應(yīng)用這些乳化劑時也包括碎屑軟化。也可以實(shí)現(xiàn)降低的面團(tuán)粘稠度、改進(jìn)的面團(tuán)可加工性、提高的烘焙產(chǎn)物面包體積、改進(jìn)的碎屑結(jié)構(gòu)、改進(jìn)的碎屑柔軟性、改進(jìn)的外皮易碎性。乳化劑因?yàn)槠錁O性和非極性的基元，可以在油-水和氣-水界面濃縮。在面包制作中，泌氣細(xì)胞(gascell)最初被包封在麩質(zhì)-淀粉基質(zhì)中，但是在發(fā)酵期間，泌氣細(xì)胞體積增加，泌氣細(xì)胞之間的界面僅包含表面活性材料的液體膜。小麥面粉的內(nèi)源極性脂質(zhì)以及所添加的乳化劑存在于這些液體膜中。已知極性的二?；视?如由二?；视彤a(chǎn)生的DATEM或卵磷脂)與它們的單?；视拖嗨莆锵啾葧r，在面包烘焙中僅具有有限的作用。本領(lǐng)域己知某些脂肪分解酶可以被用作DATEM替代品，例如由L.Chirstiansenetal在ProceedingsoftheThirdSymposiumonEnzymesinGrainProcessing,25-27September2002,p269-274中公開的。脂肪分解酶是催化脂質(zhì)底物中酯鍵水解的酶。脂肪分解酶可作用于若干種類型的脂質(zhì)上，范圍包括甘油酯(例如甘油三酯)、磷脂、鞘脂(sphingolipid)或糖脂，如半乳糖脂。甘油酯是甘油和脂肪酸的酯。甘油三酯(也已知為三?；视突蛉；视王?主要存在于植物油和動物脂肪中。脂肪酶(EC3丄1.3)在本文中被定義為水解一種或多種來自于脂質(zhì)的脂肪酸的酶，更特別地，它們水解脂肪酸和甘油的羥基之間的酯鍵。半乳糖脂由外部(sn-l)和中部(sn-2)位置中帶有兩個酯化脂肪酸的甘油主鏈組成，而第三個羥基與糖殘基如半乳糖結(jié)合，例如單半乳糖基甘油二酯或雙半乳糖基甘油二酯。半乳糖酯酶(EC3丄1.26)催化分別來自半乳糖甘油二酯的sn-l和sn-2位置中的一個或兩個脂肪?；乃?。磷脂由外部(sn-l)和中部(sn-2)位置中帶有兩個酯化脂肪酸的甘油主鏈組成，而甘油的第三個羥基被磷酸酯化。磷酸可以依次被例如氨基醇如乙醇胺(磷脂酰乙醇胺)、膽堿(磷脂酰膽堿)酯化。磷脂酶在本文中定義為殘余磷脂中一個或多個鍵水解的酶。脂肪分解酶包括例如脂肪酶、半乳糖酯酶和磷脂酶，例如磷脂酶Al、A2和溶血磷脂酶，這取決于它們作用于的底物。存在對可以在面包生產(chǎn)中被用作化學(xué)乳化劑如DATEM、CSL和SSL的替代品的改進(jìn)的脂肪分解酶的持續(xù)需要。發(fā)明目的本發(fā)明的一個目的是提供下述新穎的脂肪分解酸，所述脂肪分解酶適合被用作化學(xué)乳化劑的酶替代品。另外，本發(fā)明的一個目的是提供編碼新穎的脂肪分解酶的多核苷酸。另一個目的是提供天然和重組生產(chǎn)的脂肪分解酶以及生產(chǎn)所述脂肪分解酶的重組菌株。融合多肽以及制造和使用本發(fā)明的多核苷酸和多肽的方法也是本發(fā)明的部分。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了新穎的脂肪分解酶，所述脂肪分解酶適合被用作化學(xué)乳化劑的酶替代品。令人驚奇的是，所述新穎的脂肪分解酶極其適合被用作化學(xué)乳化劑的替代品，因?yàn)槊冈诿鎴F(tuán)中被使用時原位具有至少一種以下特性針對非極性脂質(zhì)相對低的活性針對極性二?；|(zhì)、至少針對二?；肴樘侵鄬Ω叩幕钚葬槍O性單?；衔锏南鄬Φ偷幕钚浴＠?，本發(fā)明的酶可以原位顯示相對低的溶血磷脂酶活性和相對低的脂肪酶活性。當(dāng)被用作面團(tuán)中化學(xué)乳化劑的替代品時，發(fā)現(xiàn)這些預(yù)料外的特性均是有利的。如果在本文中使用，則新穎的脂肪分解酶產(chǎn)生一種或多種經(jīng)改進(jìn)的面團(tuán)和/或烘焙產(chǎn)物特性，所述特性選自提高的面團(tuán)強(qiáng)度、提高的面團(tuán)彈性、提高的面團(tuán)穩(wěn)定性、降低的面團(tuán)粘稠度、改善的面團(tuán)延展性、改善的面團(tuán)可加工性、提高的烘焙制品體積、改善的烘焙制品碎屑結(jié)構(gòu)、降低的烘焙制品起泡、改善的烘焙制品柔軟性、改善的烘焙制品抗腐性(anti-staling)、改善的烘焙制品外皮或具有廣泛的底物特異性。本發(fā)明還提供了編碼新穎脂肪分解酶的新穎多核苷酸。本發(fā)明尤其提供了具有下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列優(yōu)選地在高嚴(yán)格度條件下與根據(jù)SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4(下文稱作"SEQIDNO:2-4")任一的序列雜交。因此，本發(fā)明提供了與根據(jù)SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4的序列至少85%、優(yōu)選地至少88%、更優(yōu)選地至少90%、進(jìn)一步更優(yōu)選地至少95%、96%、97%、98%或99%同源的核酸。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這類經(jīng)分離的多核苷酸，所述多核苷酸可得自絲狀真菌，尤其優(yōu)選地，A^gm^oWAe，進(jìn)一步更優(yōu)選地，在另一實(shí)施方案中，這類經(jīng)分離的多核苷酸可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法合成獲得。還在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含下述核酸序列的經(jīng)分離的多核苷酸，所述核酸序列編碼具有SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14(下文稱作"SEQIDNO:5-14")所示氨基酸序列的多肽或其功能等同物。一在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了經(jīng)分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼根據(jù)SEQIDNO:5-14任一的多肽或其功能等同物的至少一個功能結(jié)構(gòu)域。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)SEQIDNO:2-4任一的脂肪分解酶基因或其仍然編碼活性酶的變體或片段。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多核苷酸序列的載體和可用于擴(kuò)增或檢測本發(fā)明的DNA的引物、探針和片段。在又一優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了下述載體，其中本發(fā)明的多核苷酸序列與至少一個調(diào)節(jié)序列功能性連接，所述至少一個調(diào)節(jié)序列適用于所編碼的氨基酸序列在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)，所述宿主細(xì)胞例如Asp&rg"/w51，更特異地為爿，rg/腸w扭r、或"^Mfl"s。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是J5^;^7/mm'gw。本發(fā)明還提供了用于制備本發(fā)明的多核苷酸和載體的方法。本發(fā)明還涉及重組產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有本發(fā)明的異源或同源的多核苷酸。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了重組的宿主細(xì)胞，其中本發(fā)明的脂肪分解酶的表達(dá)被顯著提高，或其中脂肪分解酶的活性被提高。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了重組生產(chǎn)的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有本發(fā)明的異源或同源的DNA，其中所述細(xì)胞能夠生產(chǎn)本發(fā)明的功能性脂肪分解酶，優(yōu)選地是能夠過表達(dá)本發(fā)明的脂肪分解酶的細(xì)胞，例如包含提高拷貝數(shù)的本發(fā)明基因的J^^^7/W5菌株。在本發(fā)明的又一方面，提供了經(jīng)純化的多肽。根據(jù)本發(fā)明的多肽包括由根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽。特別優(yōu)選的是根據(jù)SEQIDNO:5-14任一的多肽或其任何的功能等同物。包含本發(fā)明多肽的融合蛋白質(zhì)也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明還提供了制造本發(fā)明的多肽的方法。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的脂肪分解酶在本文所述的任何工業(yè)工藝中的用途。發(fā)明詳述多核苷酸在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼脂肪分解酶的多核苷酸，所述脂肪分解酶暫時稱作LIPOl，其具有根據(jù)SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7(下文稱作"SEQIDNO:5-7")任一或其任何的功能等同物的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼脂肪酶的多核苷酸，所述脂肪酶暫時稱作LIP02，其具有根據(jù)SEQIDNO:8、SEQIDNO:9(下文稱作"SEQIDNO:8-9")任一或其任何的功能等同物的氨基酸序列。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼脂肪酶的多核苷酸，所述脂肪酶暫時稱作LIP03，其具有根據(jù)SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12;SEQIDNO:13;SEQIDNO:14(下文稱作"SEQIDNO:10-14")任一或其任何的功能等同物的氨基酸序列。通過對得自ATagwopoWAe的根據(jù)SEQIDNO:1的基因組克隆加以測序，來確定編碼LIPOl的基因的序列。通過對得自Mag"a，4egn;sfle的根據(jù)SEQIDNO:1的基因組克隆加以突變，來確定編碼LIPOl的基因的序列。LIP02由關(guān)于LIPOl的點(diǎn)突變構(gòu)成。本發(fā)明提供了包含下述基因的多核苷酸序列，所述基因編碼LIP01-LIP03脂肪分解酶及其編碼序列。因此，本發(fā)明涉及經(jīng)分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含根據(jù)SEQIDNO:2-4任一或其功能等同物的核苷酸序列。本發(fā)明尤其涉及下述經(jīng)分離的多核苷酸，所述多核苷酸能夠在嚴(yán)格條件下、優(yōu)選地在高嚴(yán)格度條件下與根據(jù)SEQIDNO:2-4的多核苷酸雜交。有利地，這類經(jīng)分離的多核苷酸可以得自絲狀真菌，尤其是來自Mag"a/or說flceae如A/agwoportAe，例如gr^ae、072ae、poae、/^'zop/n7a、m/w'w'z'，優(yōu)選地來自^Mag"opoW/zegn'5ae。更牛寺另lj地，本發(fā)明涉及下述經(jīng)分離的多核苷酸，所述多核苷酸具有根據(jù)SEQIDNO:2的核苷在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及下述經(jīng)分離的多核苷酸，所述多核苷酸能夠在嚴(yán)格條件下、優(yōu)選地在高嚴(yán)格度條件下與根據(jù)SEQIDNO:3或SEQIDNO:4的多核苷酸雜交。這類經(jīng)分離的多核苷酸可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法合成獲得。進(jìn)一步更有利地，這類經(jīng)分離的多核苷酸可以通過突變得自絲狀真菌、尤其是來自Afegw^or說aceae如A/agwopoW/e，例如gr&ae、0^zae、/oae、r/n'zo/sa/vfw7，優(yōu)選地來自Magw印orAe的多核苷酸獲得，最優(yōu)選地通過突變包含下述多核苷酸獲得，所述多核苷酸包含根據(jù)SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及經(jīng)分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼根據(jù)SEQIDNO:5-14任一的多肽或其任何的功能等同物的至少一個功能結(jié)構(gòu)域。本文使用的術(shù)語"基因"和"重組基因"指可從染色體DNA中分離的、包含編碼蛋白質(zhì)(例如Mag"^oW^脂肪分解酶)的開放讀碼框的核酸分子?；蚩砂幋a序列、非編碼序列、內(nèi)含子和調(diào)節(jié)序列。此外，基因是指本文定義的經(jīng)分離的核酸分子。可以使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)和本文提供的序列信息，來分離本發(fā)明的核酸分子，如具有SEQIDNO:2-4任一或其功能等同物的核苷酸序列的核酸分子。例如，使用SEQIDNO:2-4任一的所有或部分核酸序列作為雜交探針，能夠使用標(biāo)準(zhǔn)雜交和克隆技術(shù)(例如描述于Sambrook,J.,Fritsh，E.F.,andManiatis,T.MolecularCloning:ALaboratoryManual.2nd,ed.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor,NY，1989中)分離根據(jù)本發(fā)明的核酸分子。另外，可以使用合成的寡核苷酸引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，來分離包含SEQIDNO:2-4任一的所有或部分的核酸分子，所述引物以SEQIDNO:2-4任一中含有的序列信息為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)?？梢允褂胏DNA、mRNA或者基因組DNA作為模板，并使用適當(dāng)?shù)墓押塑账嵋锔鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增技術(shù)，來擴(kuò)增本發(fā)明的核酸。這樣擴(kuò)增的核酸可以被克隆進(jìn)適當(dāng)?shù)妮d體中并通過DNA序列分析被表征。另外，可以通過標(biāo)準(zhǔn)的合成技術(shù)(例如使用自動化DNA合成儀)制備下述寡核苷酸，所述寡核苷酸對應(yīng)于本發(fā)明的核苷酸序列或能夠與本發(fā)明的核苷酸序列雜交。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的經(jīng)分離的核酸分子包含SEQIDNO:2-4任一中所示核苷酸序列。SEQIDNO:2的序列對應(yīng)于以根據(jù)SEQIDNO:1的基因組DNA序列為基礎(chǔ)的脂肪分解酶cDNA的編碼區(qū)。該cDNA包含編碼根據(jù)SEQIDNO:5-7任一的^fag"apoWAegn'MeLIP01的序列。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的經(jīng)分離的核酸分子包含下述核酸分子，所述核酸分子是SEQIDNO:2-4中所示核苷酸序列或這些核苷酸序列功能等同物的互補(bǔ)體。與另一核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分子是與所述另一核苷酸序列足夠互補(bǔ)，從而其能夠與所述另一核苷酸序列雜交形成穩(wěn)定雙鏈體的核酸分子。本發(fā)明的一個方面涉及經(jīng)分離的核酸分子，所述核酸分子編碼本發(fā)明的多肽或其功能等同物(如生物活性片段或結(jié)構(gòu)域)，以及足夠用作雜交探針(以鑒定編碼本發(fā)明多肽的核酸分子)的核酸分子，和適合用作PCR引物(用于擴(kuò)增或突變核酸分子)的這類核酸分子的片段。"經(jīng)分離的多核苷酸"或"經(jīng)分離的核酸"是與所述DNA或RNA來源的天然存在的生物基因組中緊鄰的兩條編碼序列(一個在5，端，一個在3'端)均不緊鄰的DNA或RNA。因此，在一個實(shí)施方案中，經(jīng)分離的核酸包含與編碼序列緊鄰的部分或所有5，非編碼(例如啟動子)序列。該術(shù)語因此包括例如被整合進(jìn)載體、整合進(jìn)自主復(fù)制的制粒或病毒、或整合進(jìn)原核生物或真核生物的基因組DNA中的重組DNA，或作為不依賴于其它序列的獨(dú)立分子(例如通過PCR或限制性內(nèi)切酶處理產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片段)存在的重組DNA。其還包括編碼下述額外多肽的雜交基因的一部分的重組DNA，所述額外多肽基本不含細(xì)胞材料、病毒材料或培養(yǎng)基(通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)時)或化學(xué)前體或其它化學(xué)品(化學(xué)合成時)。另外，"經(jīng)分離的核酸片段"是天然不作為片段存在并且在天然狀態(tài)下不被發(fā)現(xiàn)的核酸片段。本文使用的術(shù)語"多核苷酸"或"核酸分子"旨在包括DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)和使用核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或RNA類似物。核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，但是優(yōu)選是雙鏈DNA?？梢允褂霉押塑账犷愃莆锘蜓苌?例如肌苷或硫代膦酸核苷酸)來合成核酸。這類寡核苷酸可被用于例如制備核酸，所述核酸具有改變的堿基配對能力或提高的核酸酶抗性。本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供了經(jīng)分離的核酸分子，所述核酸分子與LIP01-LIP03核酸分子(例如LIP01-LIP03核酸分子的編碼鏈)是反義的。還包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的是本文所述核酸分子的互補(bǔ)鏈。領(lǐng)!l序錯誤(sequencingerrors)本文提供的序列信息不應(yīng)被狹義地解釋為要求包括錯誤鑒定的堿基。本文公開的特定序列可以容易地被用于從絲狀真菌(尤其是Mflg"^or^egn'^e)分離整個基因，隨后可容易地對所述基因進(jìn)行進(jìn)一步序列分析，從而鑒定測序錯誤。除非另有說明，通過對本文的DNA分子測序確定的所有核苷酸序列均使用自動DNA測序儀測定，由本文測定的DNA分子編碼的多肽的所有氨基酸序列是通過翻譯如上測定的DNA序列來預(yù)測的。因此，如本領(lǐng)域所已知的，對通過該自動化途徑測定的任何DNA序列而言，本文測定的任何核苷酸序列可含有一些錯誤。通過自動化測定的核苷酸序列與被測序的DNA分子的實(shí)際核苷酸序列典型地至少約90%同一，更典型地至少約95%到至少約99.9。％同一?？梢酝ㄟ^其它途徑(包括本領(lǐng)域公知的手動DNA測序法)更精確地測定實(shí)際序列。又如本領(lǐng)域所已知的，與實(shí)際序列相比，被測定的核苷酸序列中的單個插入或刪除會引起核苷酸序列翻譯中的移碼(frameshift)，從而由被測定的核苷酸序列編碼的預(yù)測氨基酸序列會與由被測定的核苷酸序列實(shí)際編碼的氨基酸序列完全不同(從該插入或刪除的位點(diǎn)開始)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠鑒定這類被錯誤鑒定的堿基，并知道如何糾正這類錯誤。核苷酸片段、探針和引物根據(jù)本發(fā)明的核酸分子可僅包含根據(jù)SEQIDNO:2-4任一的核酸序列的部分或片段，例如可以用作探針或引物的片段或編碼LIP01-LIP03蛋白質(zhì)的部分的片段。通過克隆LIP01-LIP03基因和cDNA測定的核苷酸序列允許生產(chǎn)探針和引物，所述探針和引物被設(shè)計(jì)為用于鑒定和/或克隆其它LIP01-LIP03家族成員，以及來自其它物種的LIP01-LIP03同源物。探針/引物典型地包含基本上被純化的寡核苷酸，所述寡核苷酸典型地包含下述核苷酸序列，所述核苷酸序列優(yōu)選地在高度嚴(yán)格的條件下與根據(jù)SEQIDNO:2-4任一的核苷酸序列或其功能等同物的至少約12或15個、優(yōu)選約18或20個、優(yōu)選約22或25個、更優(yōu)選約30、35、40、45、50、55、60、65或75個或更多個相鄰的核苷酸雜交。以LIP01-LIP03核苷酸序列為基礎(chǔ)的探針可以被用于檢測轉(zhuǎn)錄本或基因組LIP01-LIP03序列，所述轉(zhuǎn)錄本或基因組LIP01-LIP03序列編碼例如其它生物中的相同或同源蛋白質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，探針還包含與之結(jié)合的標(biāo)簽基團(tuán)，例如所述標(biāo)簽基團(tuán)可以是放射性同位素、熒光化合物、酶，或酶輔因子。這類探針也可以被用作診斷測試試劑盒的部分，所述試劑盒用于鑒定表達(dá)LIP01-LIP03蛋白質(zhì)的細(xì)胞。同一性&同源性術(shù)語"同源性"或"同一性百分比"在本文可互換使用。就本發(fā)明的目的而言，其在本文被定義來測定兩條氨基酸序列或兩條核酸序列的同一性百分比，所述序列就最適比較的目的被排列(例如為了與第二氨基酸或核酸序列最適比對，可以向第一氨基酸或核酸序列的序列中引入缺口)。然后比較相應(yīng)的氨基酸位置或核苷酸位置上的氮基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝粭l序列中的一個位置被與第二序列中相應(yīng)位置上相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時，則所述分子在該位置上是同一的。兩條序列之間的同一性百分比是所述序列共享的同一位置數(shù)的函數(shù)(即％同一性=同一位置數(shù)/位置總數(shù)(即重疊位置)x100)。優(yōu)選兩條序列是相同的長度。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白下述事實(shí)可獲得若干種不同的計(jì)算機(jī)程序以測定兩條序列之間的同源性。例如，可以使用數(shù)學(xué)算法完成兩個序列之間的序列比較和同一性百分比測定。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用NeedlemanandWunsch(J.MoLBiol.(48):444-453(1970))算法，使用Blossom62矩陣或PAM250矩陣和16、14、12、10、8、6或4的缺口權(quán)重和1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重測定兩條氨基酸序列之間的同一性百分比，所述算法已經(jīng)被整合進(jìn)AccelrysGCG軟件包內(nèi)的GAP程序中(可得自http:〃www.accelrys.com/products/gcg/)。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道這些不同的參數(shù)會產(chǎn)生輕微差異的結(jié)果，但是使用不同的算法時兩條序列的整體同一性百分比不會顯著改變。還在另一實(shí)施方案中，使用AccelrysGCG軟件包(可得自http:〃www.accelrys.com/products/gcg/)中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩陣和40、50、60、70或80的缺口權(quán)重和1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重測定兩條核苷酸序列之間的同一性百分比。在另一實(shí)施方案中，使用E.MeyersandW.Miller算法(CABIOS,4:11-17(1989))，使用PAM120權(quán)重殘表、12的缺口長度罰分和4的缺口罰分測定兩條氨基酸或核苷酸序列的同一性百分比，所述算法已被整合進(jìn)ALIGN程序(2.0版)中(可得自使用Genestream服務(wù)器IGHMontpellierFrance的ALIGNQuery:http:〃vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi)。本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)序列還可以被用作"查詢序列"，針對公開數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，以例如鑒定其它家族成員或相關(guān)序列。這類搜索可以使用Altschul,etal.(1990)J.Mol.Biol.215:403—10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)進(jìn)行。可以使用NBLAST程序(計(jì)分=100，字長=20)進(jìn)行BLAST核苷酸搜索，以獲得與本發(fā)明的LIP01-LIP03核酸分子同源的核苷酸序列?？梢杂肵BLAST程序(計(jì)分=50，字長=3)進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)搜索，以獲得與本發(fā)明的LIP01-LIP03蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了獲得加缺口的比對用于比較的目的，可以如Altschuletal.,(1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402中所述使用GappedBLAST。使用BLAST禾BGappedBLAST程序時，可以使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。見http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov上的NationalCenterforBiotechnologyInformation主頁。雜交本文使用術(shù)語"雜交"旨在描述用于下述雜交和洗滌的條件，典型地，在所述條件下彼此至少約60%、至少約70%、至少約80%、更優(yōu)選地至少約85%、進(jìn)一步更優(yōu)選地至少約90%、最優(yōu)選地至少95%同源的核苷酸序列保持彼此雜交。這類雜交條件的一個優(yōu)選的非限制性例子是于約45"下在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，然后于50°C、優(yōu)選55°C、優(yōu)選60。C和進(jìn)一步更優(yōu)選65'C下，在1XSSC、0."/。SDS中洗滌一次或多次。高度嚴(yán)格條件包括例如于6纊C下在5xSSC/5xDenhardt's溶液/1.0%SDS中雜交并于室溫下在0.2xSSC/0.1%SDS中洗滌?；蛘?，洗滌可以在42"C進(jìn)行。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道對于嚴(yán)格和高度嚴(yán)格的雜交條件而言應(yīng)用何種條件。涉及這類條件的其它指示在該領(lǐng)域能夠容易地獲得，例如在Sambrooketal.,1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.;禾nAusubeletal.(eds.),1995，CurrentProtocolsinMolecularBiology,(JohnWiley&Sons,N.Y.)中。當(dāng)然，僅與多聚A序列(例如mRNA的3'末端多聚(A))或互補(bǔ)的T(或U)殘基段雜交的多核苷酸不應(yīng)被包括于與本發(fā)明的核酸部分特異雜交的本發(fā)明多核苷酸中，因?yàn)檫@類多核苷酸會與含有多聚(A)段或其互補(bǔ)體的任何核酸分子(例如尤其是任何雙鏈cDNA克隆)雜交。從其它生物獲得全長DNA可以以一種典型的途徑，來篩選從其它生物(例如絲狀真菌，尤其是來自Mag"oporAe的種)構(gòu)建的cDNA文庫。例如，可以通過Northern印跡針對同源的LIP01-LIP03多核苷酸篩選Mag"^oWAe菌株。檢測到與根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸同源的轉(zhuǎn)錄物后，可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從分離自適當(dāng)菌株的RNA構(gòu)建cDNA文庫?；蛘?，可以使用能夠與根據(jù)本發(fā)明的LIP01-LIP03多核苷酸雜交的探針來篩選總基因組DNA文庫?？梢岳缤ㄟ^進(jìn)行PCR分離同源的基因序列，所述PCR使用以本文所述核苷酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的兩個簡并寡核苷酸引物池。用于反應(yīng)的模板可以是通過反轉(zhuǎn)錄mRNA獲得的cDNA，所述mRNA從已知或懷疑表達(dá)本發(fā)明多核苷酸的菌株中制備?？梢詫CR產(chǎn)物進(jìn)行亞克隆和測序，以確保被擴(kuò)增的序列代表了新LIP01-LIP03核酸序列的序列或其功能等同物。然后可以通過多種已知方法，使用PCR片段來分離全長cDNA克隆。例如，被擴(kuò)增的片段可以被標(biāo)記，并用于篩選噬菌體或粘粒cDNA文庫。或者，被標(biāo)記的片段可以被用于篩選基因組文庫。也可以用PCR技術(shù)來從其它生物中分離全長cDNA序列。例如，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟從合適的細(xì)胞或組織來源中分離RNA?？梢允褂锰禺愑诒粩U(kuò)增片段最5'端的寡核苷酸引物，引導(dǎo)第一鏈合成，針對RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。然后可以使用標(biāo)準(zhǔn)的末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)將得到的RNA/DNA雜交體"加尾"(例如用鳥嘌呤)，可以用RNaseH消化所述雜交體，然后(例如用多聚-C引物)引物起始第二鏈合成。因此，被擴(kuò)增片段上游的cDNA序列可以容易地被分離。有用的克隆策略的綜述，參閱例如上文Sambrooketal.;和上文的Ausubeletal.。載體本發(fā)明的另一方面涉及含有下述核酸的載體，優(yōu)選表達(dá)載體，所述核酸編碼LIP01-LIP03蛋白質(zhì)或其功能等同物。本文使用的術(shù)語"載體"指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與之連接的另一核酸的核酸分子。一種類型的載體是"質(zhì)粒"，質(zhì)粒是指其中可以連接其它DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的載體是病毒載體，其中其它DNA區(qū)段可以被連接進(jìn)病毒基因組中。某些載體在它們被引入的宿主細(xì)胞中能夠自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加體哺乳動物載體)。其它載體(例如非附加體哺乳動物載體)在引入宿主細(xì)胞時被整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組中，從而隨宿主細(xì)胞的基因組一起被復(fù)制。另外，某些載體能夠指導(dǎo)與它們可操作地連接的基因的表達(dá)。這類載體在本文中被稱作"表達(dá)載體"。一般而言，重組DNA技術(shù)中使用的表達(dá)載體通常是以質(zhì)粒的形式存在的。術(shù)語"質(zhì)粒"和"載體"在本文中可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的載體形式。然而，本發(fā)明旨在包括這類表達(dá)載體的起等同作用的其它形式，如病毒載體(例如復(fù)制缺陷反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。本發(fā)明的重組表達(dá)載體以適合核酸在宿主細(xì)胞中表達(dá)的形式包含本發(fā)明的核酸，這意味著重組表達(dá)載體含有一個或多個與待表達(dá)的核酸序列可操作地連接的調(diào)節(jié)序列，以要用于表達(dá)的宿主細(xì)胞為基礎(chǔ)選擇所述調(diào)節(jié)序列。在重組表達(dá)載體中，"可操作地連接"旨在表示感興趣的核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列以允許核苷酸序列表達(dá)(例如在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯體系中或當(dāng)載體被引入宿主細(xì)胞中時在宿主細(xì)胞中)的方式連接。術(shù)語"調(diào)節(jié)序列"旨在包括啟動子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)控制元件(例如多腺苷酸化信號)。這類調(diào)節(jié)序歹U描述于例如Goeddel;GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)中。調(diào)節(jié)序列包括在許多類型的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列組成型表達(dá)的那些和僅在某種宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列表達(dá)的那些(例如組織特異調(diào)節(jié)序列)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道對表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可以以下述因素為基礎(chǔ)，如待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、期望的蛋白質(zhì)表達(dá)水平等。本發(fā)明的表達(dá)載體可以被引入宿主細(xì)胞中，從而生產(chǎn)由本文所述的核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽(例如LIP01-LIP03蛋白質(zhì)，LIP01-LIP03蛋白質(zhì)的突變體形式，其片段、變體或功能等同物，融合蛋白等)?？梢詫Ρ景l(fā)明的重組表達(dá)載體加以設(shè)計(jì)，以用于LIP01-LIP03蛋白質(zhì)在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中的表達(dá)。例如LIP01-LIP03蛋白質(zhì)可以在細(xì)菌細(xì)胞如E.coli、昆蟲細(xì)胞(使用桿狀病毒表達(dá)載體)、酵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。合適的宿主細(xì)胞在Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)中進(jìn)一步討論。或者，可以例如使用T7啟動子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶體外轉(zhuǎn)錄和翻譯重組表達(dá)載體?？捎糜诒景l(fā)明的表達(dá)載體包括來自染色體、附加體和病毒的載體，例如來自細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母附加體、酵母染色體元件、病毒(如桿狀病毒、乳多空病毒、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒)的載體和來自其組合的病毒，如來自質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件的病毒(如粘粒和噬菌粒)。DNA插入物應(yīng)與合適的啟動子可操作地連接，所述啟動子如噬菌體XPL啟動子，co/Hac、trp和tac啟動子，SV40早期和晚期啟動子和反轉(zhuǎn)錄病毒LTR的啟動子，但不限于這些。其它合適的啟動子是技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道的。在一個特定的實(shí)施方案中，能夠在絲狀真菌中指導(dǎo)脂肪分解酶高水平表達(dá)的啟動子是優(yōu)選的。這類啟動子是本領(lǐng)域已知的。表達(dá)構(gòu)建體可含有轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、終止位點(diǎn)和(在被轉(zhuǎn)錄的區(qū)域中)用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建體表達(dá)的成熟轉(zhuǎn)錄本的編碼部分應(yīng)包含位于起點(diǎn)的翻譯起始AUG和適當(dāng)?shù)匚挥诖g多肽末端的終止密碼子?？梢酝ㄟ^常規(guī)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體DNA引入原核或真核細(xì)胞中。本文使用的術(shù)語"轉(zhuǎn)化"和"轉(zhuǎn)染"旨在表示用于向宿主細(xì)胞中引入外源核酸(例如DNA)的多種本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔。用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的合適方法可見于Sambrook,etal.(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nd,ed.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989)，Davisetal.,BasicMethodsinMolecularBiology(1986)禾口其它實(shí)驗(yàn)室手冊中。對于哺乳動物細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染而言，已知取決于使用的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，只有非常小的細(xì)胞級分可以將外源DNA整合進(jìn)它們的基因組中。為了鑒定并選擇這些整合體，通常將編碼可選擇標(biāo)記(例如抗性或抗生素)的基因與感興趣的基因一起引入宿主細(xì)胞中。優(yōu)選的可選擇標(biāo)記包括賦予藥物(例如G418、潮霉素和甲氨喋呤)抗性的基因。編碼可選擇標(biāo)記的核酸可以被引入宿主細(xì)胞中與編碼LIP01-LIP03蛋白質(zhì)的核酸相同的載體上，或可以被引入獨(dú)立的載體上?？梢酝ㄟ^藥物選擇來鑒定用被引入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(例如，已經(jīng)整合了可選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞能夠存活，而其它細(xì)胞死亡)。蛋白質(zhì)在原核生物中的表達(dá)常在E.coli中用下述載體完成，所述載體含有指導(dǎo)融合或非融合蛋白質(zhì)表達(dá)的組成型或誘導(dǎo)型啟動子。融合載體向其中編碼的蛋白質(zhì)(例如對重組蛋白質(zhì)的氨基端)添加大量氨基酸。這類融合載體典型地提供下述三種目的1)提高重組蛋白質(zhì)的表達(dá)；2)提高重組蛋白質(zhì)的溶解度；和3)通過作用于親和純化中的配體幫助重組蛋白質(zhì)的純化。通常在融合表達(dá)載體中，蛋白水解性切割位點(diǎn)被引入融合基元和重組蛋白質(zhì)的接點(diǎn)處，使得重組蛋白質(zhì)能夠與融合基元分離以隨后純化融合蛋白。如所指出的，表達(dá)載體優(yōu)選地含有可選擇標(biāo)記。這類標(biāo)記包括用于真核細(xì)胞培養(yǎng)的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，和用于在五.co"和其它細(xì)菌中培養(yǎng)的四環(huán)素或氮芐西林抗性。合適的宿主細(xì)胞的代表性例子包括細(xì)菌細(xì)胞，如E.co/z'、iSV尸e;fcwj;ce5禾口Sa/mowe〃a^Az'mw7'wm;真菌細(xì)胞，如酵母；昆蟲細(xì)胞如DrosophinaS2和Spodoptera;動物細(xì)胞如CHO,COS和Bowesmelanoma;和植物細(xì)胞。用于上述宿主細(xì)胞的適當(dāng)培養(yǎng)基和條件是本領(lǐng)域已知的。優(yōu)選用于細(xì)菌中的載體例如在WO-A1-2004/074468中被公開，其通過引用并入本文。其它合適的載體是技術(shù)人員容易知道的。適用于本發(fā)明的己知的細(xì)菌啟動子包括WO-A1-2004/074468中公開的啟動子，其通過引用并入本文。可以通過向載體中插入增強(qiáng)子序列，來提高高等真核生物對編碼本發(fā)明多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子是DNA的順式作用元件，通常約10到300bp，其作用于提高啟動子在給定的宿主細(xì)胞類型中的轉(zhuǎn)錄活性。增強(qiáng)子的例子包括SV40增強(qiáng)子(其位于復(fù)制起點(diǎn)下游的bp100到270)、巨細(xì)胞病毒早期啟動子增強(qiáng)子、復(fù)制起點(diǎn)下游的多瘤增強(qiáng)子和腺病毒增強(qiáng)子。為了將翻譯的蛋白質(zhì)分泌進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中、進(jìn)入壁膜間隙中或進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境中，可以向被表達(dá)的多肽中整合進(jìn)適當(dāng)?shù)姆置谛盘枴Ｋ鲂盘枌Χ嚯目梢允峭吹幕蛩鼈兛梢允钱愒葱盘?。LIP01-LIP03多肽可以以經(jīng)修飾的方式(例如融合蛋白)被表達(dá)，并可不僅含有分泌信號而且含有額外的異源功能區(qū)。因此，例如額外氨基酸區(qū)(尤其是帶電荷的氨基酸)可被添加至多肽的N端，以促進(jìn)純化期間或隨后的操作和儲存期間在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性和持久性。還可向多肽添加肽基元，以便于純化。根據(jù)本發(fā)明的多肽本發(fā)明提供了經(jīng)分離的多肽，所述經(jīng)分離的多肽具有根據(jù)SEQIDNO:5-14任一的氨基酸序列，和可以通過在適當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_(dá)SEQIDNO:2-4的任一多核苷酸獲得的氨基酸序列。包含上述多肽的功能等同物的肽或多肽也包括在本發(fā)明中。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所己知的，由于成熟期間的加工錯誤，SEQIDNO:5-14的N末端以及SEQIDNO:5-14的C末端可能是異源的。這類加工錯誤尤其可能在多肽的過表達(dá)時發(fā)生。另外，外蛋白酶活性可能導(dǎo)致異源性。異源性發(fā)生的程度也取決于使用的宿主細(xì)胞和發(fā)酵方案。這類C末端加工假象(artefact)可能導(dǎo)致如SEQIDNO:5-14所指示的更短的多肽或更長的多肽。作為這類錯誤的結(jié)果，N端也可能是異源的。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了經(jīng)分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼根據(jù)SEQIDNO:5-14任一的多肽的至少一個功能結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域含有額外的殘基并在位置一1或一2或一3等開始?；蛘撸淇赡苋狈δ承埢?，并且因而在位置2或3或4等處開始。更特別地，對LIP01而言，在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，SEQIDNO:5公開了從SEQIDNO:2中給出的cDNA直接翻譯的蛋白質(zhì)。這類蛋白質(zhì)在產(chǎn)生成熟的蛋白質(zhì)之前通常會被加工，并會例如丟失信號序列，優(yōu)選地因此產(chǎn)生SEQIDNO:6或7。對于SEQIDNO:6和SEQIDNO:7中所示的氨基酸序列而言，N端萬一含有額外的殘基，則可能含有以下的額外氨基酸序列R、GR或EGR，分別對應(yīng)于在位置一1、一2或一3處的N端啟始。類似的C端加工假象可能導(dǎo)致更短的多肽或更長的多肽。在SEQIDNO;7的特定情況下，C端萬一含有額外的殘基，則優(yōu)選地含有以下的氨基酸序列R、RR或RRD，分別對應(yīng)于在位置310+1、十2或+3處延長的C上山順。更特別地，對LIP02而言，在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了經(jīng)分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼下述多肽的核酸序列，所述多肽具有SEQIDNO:9中所示的氨基酸序列或其任何的功能等同物。SEQIDNO:8公開了從SEQIDNO:3給出的cDNA直接翻譯的蛋白質(zhì)。這類蛋白質(zhì)在產(chǎn)生成熟的蛋白質(zhì)之前通常會被加工，并會例如丟失信號序列，優(yōu)選地因此產(chǎn)生SEQIDNO:9。可能得到的蛋白質(zhì)的C端和N端是異源的，例如歸因于加工假象。更特別地，對LIP03而言，SEQIDNO:10公開了從SEQIDNO:4中給出的cDNA直接翻譯的蛋白質(zhì)。這類蛋白質(zhì)在產(chǎn)生成熟的蛋白質(zhì)之前通常會被加工，并會例如丟失信號序列，優(yōu)選地因此產(chǎn)生SEQIDNO:11、12、13或14。上述多肽集體包含在術(shù)語"本發(fā)明的多肽"中。術(shù)語"肽"和"寡肽"被認(rèn)為是同義的(如其通常被認(rèn)為的那樣)，且當(dāng)上下文需要表示通過肽鍵偶合的至少兩個氨基酸鏈時，每個術(shù)語可以互換使用。詞語"多肽"在本文中使用表示含有多于七個氨基酸殘基的鏈。所有的寡肽和多肽式或序列在本文中從左到右和從氨基端到羧基端的方向書寫。本文使用的單字母氨基酸代碼是本領(lǐng)域普遍已知的，并可見于Sambrook,etal.(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nd,ed.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989)。"分離的"多肽或蛋白質(zhì)表示被從其天然環(huán)境中取出的多肽或蛋白質(zhì)。例如，就本發(fā)明的目的而言，在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組產(chǎn)生的多肽和蛋白質(zhì)被認(rèn)為是分離的，與通過任何合適的技術(shù)已基本純化的天然或重組多肽一樣，所述合適的技術(shù)例如SmithandJohnson，Gene67:31-40(1988)中公開的單步驟純化方法?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法(ProteinPurificationProtocols,MethodsinMolecularBiologyseriesbyPaulCutler,HumanaPress,2004)從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化根據(jù)本發(fā)明的LIP01-LIP03脂肪分解酶。本發(fā)明的多肽包括天然純化的產(chǎn)物、化學(xué)合成步驟的產(chǎn)物，和通過重組技術(shù)從原核或真核宿主生產(chǎn)的產(chǎn)物，所述宿主包括例如細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞。取決于重組生產(chǎn)步驟中使用的宿主，可以將本發(fā)明的多肽糖基化或不糖基化。另外，本發(fā)明的多肽也可以包含最初被修飾的殘基(在一些情況下由宿主介導(dǎo)的過程產(chǎn)生)。蛋白質(zhì)片段本發(fā)明還包括根據(jù)本發(fā)明的多肽的生物活性片段。本發(fā)明多肽的生物活性片段包括下述多肽，所述多肽包含與LIP01-LIP03蛋白質(zhì)的氨基酸序列(例如SEQIDNO:5-14的氨基酸序列，其包含比全長蛋白質(zhì)更少的氨基酸，但是顯示相應(yīng)的全長蛋白質(zhì)的至少一種生物活性)足夠同一或者來自LIP01-LIP03蛋白質(zhì)氨基酸序列的氨基酸序列。典型地，生物活性片段包括具有LIP01-LIP03蛋白質(zhì)的至少一種活性的結(jié)構(gòu)域或基序。本發(fā)明的生物活性片段可以是長度為例如10、25、50、100或更多個氨基酸的多肽。另外，其它生物活性蛋白質(zhì)(其中蛋白質(zhì)的其它區(qū)域被刪除)可以通過重組技術(shù)被制備，并針對本發(fā)明多肽天然形式的一種或多種生物活性進(jìn)行評價。本發(fā)明還包括編碼LIP01-LIP03蛋白質(zhì)的上述生物活性片段的核酸片段。融合蛋白本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其功能等同物(例如其生物活性部分)可以與非-LIP01-LIP03多肽(例如異源的氨基酸序列)可操作地連接，形成融合蛋白。"非-LIP01-LIP03多肽"是指具有對應(yīng)于下述蛋白質(zhì)的氨基酸序列的多肽，所述蛋白質(zhì)與LIP01-LIP03基本不同源。這類"非-LIP01-LIP03多肽"可來自相同或不同的生物。在LIP01-LIP03融合蛋白中，LIP01-LIP03多肽可對應(yīng)于LIP01-LIP03蛋白質(zhì)的全部或其生物活性片段。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，LIP01-LIP03融合蛋白由LIP01-LIP03蛋白質(zhì)的至少兩個生物活性部分組成。在融合蛋白中，術(shù)語"可操作地連接"旨在表示LIP01-LIP03多肽和非-LIP01-LIP03多肽彼此按照讀碼框融合。非-LIP01-LIP03多肽可以與LIP01-LIP03多肽的N端或C端融合。例如，在一個實(shí)施方案中，融合蛋白是GST-LIP01-LIP03融合蛋白，其中LIP01-LIP03序列與GST序列的C端融合。這類融合蛋白可協(xié)助對重組LIP01-LIP03的純化。在另一實(shí)施方案中，融合蛋白是N端含有異源^言號序列的LIP01-LIP03蛋白質(zhì)。在某些宿主細(xì)胞(例如哺乳動物和酵母宿主細(xì)胞)中，可以通過使用異源信號序列來提高LIP01-LIP03的表達(dá)禾口/或分泌。在另一例子中，可以使用桿狀病毒包膜蛋白的gp67分泌序列作為異源iW號序歹廿(CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubeletal.，eds.,JohnWiley&Sons,1992)。真核異源信號序列的其它例子包括蜂毒肽和人胎盤堿性磷酸酶的分泌序列(Stratagene;LaJolla,California)。又在另一個例子中，有用的原核異源信號序列包括phoA分泌信號(Sambrooketal.,見上文)禾卩蛋白A6、泌"言號(PharmaciaBiotech;Piscataway,NewJersey)?？墒褂眯盘栃蛄衼砗喕景l(fā)明蛋白質(zhì)或多肽的分泌和分離。信號序列典型地通過疏水氨基酸核心來表征，分泌期間所述信號序列通常在一個或多個切割事件中從成熟的蛋白質(zhì)上被切除。這類信號肽含有加工位點(diǎn)，所述加工位點(diǎn)允許在經(jīng)過分泌途徑時從成熟蛋白質(zhì)上切除信號序列。信號序列指導(dǎo)蛋白質(zhì)的分泌(例如從表達(dá)載體被轉(zhuǎn)化進(jìn)入的真核宿主中分泌)，所述信號序列隨后或同時被切除。然后可通過已知方法從細(xì)胞外培養(yǎng)基容易地純化蛋白質(zhì)?；蛘撸梢允褂煤喕兓男蛄?如GST結(jié)構(gòu)域)將信號序列與感興趣的蛋白質(zhì)連接。因此，編碼多肽的序列可以與標(biāo)記物序列(如編碼肽的序列)融合，這簡化了融合多肽的純化。在本發(fā)明該方面的某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，標(biāo)記物序列為六組氨酸肽，如pQE載體(Qiagen,Inc.)中提供的標(biāo)簽，以及其它，其中許多是可商業(yè)獲得的。如Gentzetal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821-824(1989)中所述，例如六組氨酸提供了融合蛋白的便利純化。HA標(biāo)簽是適用于純化的另一種肽，其對應(yīng)于例如由Wilsonetal.,Cell37:767(1984)描述的流感血凝素蛋白衍生的表位。優(yōu)選地，通過標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)來生產(chǎn)本發(fā)明的LIP01-LIP03融合蛋白。例如，根據(jù)常規(guī)技術(shù)將編碼不同多肽序列的DNA片段按照讀碼框連接在一起，例如通過使用用于連接的平末端或交錯末端(stagger-ended)、限制性酶消化以提供適當(dāng)?shù)哪┒?、填充合適的粘末端、堿性磷酸酶處理以避免不期望的接合，和酶連接。在另一實(shí)施方案中，可以通過常規(guī)技術(shù)(包括自動化DNA合成儀)合成融合基因?；蛘呖梢允褂缅^定引物進(jìn)行基因片段的PCR擴(kuò)增，所述錨定引物產(chǎn)生兩個相鄰基因片段之間的互補(bǔ)懸突，所述兩個相鄰的基因片段可隨后被退火并再擴(kuò)增，以產(chǎn)生嵌合的基因序歹U(參閱例如CurrentProtocolsinMolecularBiology,eds.Ausubeletal.JohnWiley&Sons:1992)。另外，可商業(yè)獲得已經(jīng)編碼融合基元(例如GST多肽)的許多表達(dá)載體?？梢詫IP01-LIP03編碼核酸克隆進(jìn)這類表達(dá)載體中，使得融合基元與LIP01-LIP03蛋白質(zhì)按照讀碼框連接。功能等同物術(shù)語"功能等同物"和"功能變體"在本文可互換使用。LIP01-LIP03DNA的功能等同物是編碼下述多肽的經(jīng)分離的DNA片段，所述多肽顯示本文公開的LIP01-LIP03脂肪分解酶的具體功能。根據(jù)本發(fā)明的LIP01-LIP03多肽的功能等同物是顯示本文定義的Mag加戶We脂肪分解酶的至少一種功能的多肽。因此，功能等同物包括生物活性片段。功能蛋白質(zhì)或多肽等同物可含有SEQIDNO:5-14的僅一個或多個氨基酸的保守取代或非必需氨基酸的取代、插入或刪除。因此，非必需氨基酸是SEQIDNO:5-14中能夠被改變而基本不改變生物功能的殘基。例如，在本發(fā)明的LIP01-LIP03蛋白質(zhì)間保守的氨基酸殘基被預(yù)測為尤其不應(yīng)進(jìn)行改變。另外，在根據(jù)本發(fā)明的LIP01-LIP03蛋白質(zhì)和其它脂肪分解酶間保守的氨基酸可能不適合被改變。術(shù)語"保守取代"旨在表示下述取代其中氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基取代。這些家族是本領(lǐng)域已知的，并包括具有堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、酸性側(cè)鏈(天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、^-分支側(cè)鏈(蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。典型地，功能核酸等同物可含有沉默突變或不改變所編碼的多肽生物功能的突變。因此，本發(fā)明提供了編碼下述LIP01-LIP03蛋白質(zhì)的核酸分子，所述蛋白質(zhì)含有對于具體生物活性并非必需的氨基酸殘基改變。這類LIP01-LIP03蛋白質(zhì)在氨基酸序列上與SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4;SEQIDNO:5;SEQIDNO:6差異，但仍保留至少一種生物活性。在一個實(shí)施方案中，經(jīng)分離的核酸分子包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，其中所述蛋白質(zhì)含有與SEQIDNO:5-14所示氨基酸序列至少約60%,優(yōu)選地65%，更優(yōu)選地70%,進(jìn)一步更優(yōu)選地75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更同源的基本同源的氨基酸序列。例如，涉及如何制造表型沉默氨基酸取代的指南在Bowie,J.U.etal.,Science247:1306-1310(1990)中和其中引用的參考文獻(xiàn)中提供。如作者所述，這些研究揭示了蛋白質(zhì)對氨基酸取代是驚人地耐受的。作者還指出何種改變很可能在蛋白質(zhì)的某位置上是允許的?？梢匀缦挛乃鰜碇圃炀幋a與分別根據(jù)SEQIDNO:5-7、SEQIDNO:8-9、SEQIDNO.10-14任一的蛋白質(zhì)同源的LIP01-LIP03蛋白質(zhì)的經(jīng)分離的核酸分子向分別根據(jù)SEQIDNO:2-4任一的編碼核苷酸序列中引入一個或多個核苷酸取代、添加或刪除，使得一個或多個氨基酸取代、刪除或插入被引入所編碼的蛋白質(zhì)中。這類突變可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)引入，如定點(diǎn)誘變和PCR-介導(dǎo)的誘變。術(shù)語"功能等同物"還包括LIP01-LIP03蛋白質(zhì)的直向同源物。LIP01-LIP03蛋白質(zhì)的直向同源物是能夠從其它菌株或物種中分離并具有相似或相同生物活性的蛋白質(zhì)。這類直向同源物可容易地被鑒定，因?yàn)楹信cSEQIDNO:5-14基本同源的氨基酸序列。本文定義術(shù)語"基本同源"是指含有與第二氨基酸或核苷酸序列足夠或最少的同一或等同(例如具有相似側(cè)鏈)的氨基酸或核苷酸的第一氨基酸或核苷酸序列，使得所述第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有共同的結(jié)構(gòu)域。例如，含有下述共有結(jié)構(gòu)域的氨基酸或核苷酸序列在本文中被定義為足夠同一，所述共有結(jié)構(gòu)域具有約60%、優(yōu)選65%、更優(yōu)選70%、進(jìn)一步更優(yōu)選75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性或更多。此外，編碼其它LIP01-LIP03家族成員的核酸(其因而具有與SEQIDNO:2-4不同的核苷酸序列)也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，編碼來自不同物種的LIP01-LIP03蛋白質(zhì)的核酸(其能夠具有與SEQIDNO:2-4不同的核苷酸序列)在本發(fā)明的范圍內(nèi)。可以根據(jù)它們與本文公開的LIP01-LIP03核酸的同源性，使用本文公開的cDNA或其合適的片段作為雜交探針，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的雜交技術(shù)，優(yōu)選地在高度嚴(yán)格的雜交條件下，來分離對應(yīng)于本發(fā)明的LIP01-LIP03DNA的變體(例如天然等位基因變體)或同源物的核酸分子。除了LIP01-LIP03序列的天然存在的等位基因變體外，技術(shù)人員知道，可以通過突變向SEQIDNO:2-4的核苷酸序列中引入改變，從而導(dǎo)致LIP01-LIP03蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的改變，而不顯著改變LIP01-LIP03蛋白質(zhì)的功能。在本發(fā)明的另一方面，提供了經(jīng)改進(jìn)的LIP01-LIP03蛋白質(zhì)。經(jīng)改進(jìn)的LIP01-LIP03蛋白質(zhì)是其中至少一種生物活性被改進(jìn)的蛋白質(zhì)。這類蛋白質(zhì)可以如下獲得沿全部或部分LIP01-LIP03編碼序列隨機(jī)地引入突變，重組表達(dá)得到的突變體并針對生物活性進(jìn)行篩選。例如，本領(lǐng)域提供了用于測量脂肪分解酶酶活性的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)，因而經(jīng)改進(jìn)的蛋白質(zhì)可以容易地被選擇。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，LIP01-LIP03蛋白質(zhì)具有分別根據(jù)SEQIDNO:5-7、SEQIDNO:8-9、SEQIDNO:10-14的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，LIP01-LIP03多肽與根據(jù)SEQIDNO:5-14的氨基酸序列基本同源，并保留根據(jù)SEQIDNO:5-14的多肽的至少一種生物活性，但是由于如上所述的天然變異或誘變而在氨基酸序列上有差異。在又一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，LIP01-LIP03蛋白質(zhì)具有由下述經(jīng)分離的核酸片段編碼的氨基酸序列，所述經(jīng)分離的核酸片段能夠與分別根據(jù)SEQIDNO:2-4的核酸優(yōu)選地在高度嚴(yán)格的雜交條件下雜交。因此，LIP01-LIP03蛋白質(zhì)優(yōu)選地是包含下述氨基酸序列的蛋白質(zhì)，所述氨基酸序列與SEQIDNO:5-14所示氨基酸序列至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99。/?；蚋嗤?，并保留根據(jù)SEQIDNO:5-14的多肽的至少一種功能活性。也可以如下文所述來鑒定根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的功能等同物例如，針對脂肪分解酶活性，篩選本發(fā)明蛋白質(zhì)的突變體(例如截短突變體)的組合文庫。在一個實(shí)施方案中，通過核酸水平上的組合誘變產(chǎn)生有斑文庫(variegatedlibrary)?？梢酝ㄟ^例如將合成的寡核苷酸混合物酶連接為基因序列來產(chǎn)生變體的有斑文庫，從而可能的蛋白質(zhì)序列的簡并集合(degenerateset)可作為個體多肽表達(dá)，或者作為一組更大的融合蛋白表達(dá)(例如用于噬菌體展示)。存在可用于從簡并寡核苷酸生產(chǎn)本發(fā)明多肽的可能變體文庫的多種方法。用于合成簡并寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的(見例如Narang(1983)Tetrahedron39:3;ltakuraetal.(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323;ltakuraetal.(1984)Science198:1056;Ikeetal.(1983)NucleicAcidRes.11:477)。另外，本發(fā)明多肽的編碼序列的片段文庫可以被用于產(chǎn)生有斑的多肽群，用于篩選隨后的變體選擇。例如，可以如下產(chǎn)生編碼序列片段的文庫在每個分子僅發(fā)生約一次切割的條件下用核酸酶處理感興趣的編碼序列的雙鏈PCR片段，變性雙鏈DNA，將DNA復(fù)性形成雙鏈DNA(其可包含來自被不同切割的產(chǎn)物的有義/反義對)，通過用SI核酸酶處理從再形成的雙鏈體上去除單鏈部分，并將得到的片段文庫連接進(jìn)表達(dá)載體中。通過該方法，可以得到下述表達(dá)文庫，所述表達(dá)文庫編碼感興趣的蛋白質(zhì)的不同大小的N-末端和內(nèi)部片段。本領(lǐng)域已知有若干種技術(shù)可用于篩選組合文庫(其通過截短的點(diǎn)突變制造)的基因產(chǎn)物，和用于篩選cDNA文庫以獲得具有選定特性的基因產(chǎn)物。用于篩選大基因文庫的、適用于高通量分析的、最廣泛使用的技術(shù)典型地包括將基因文庫克隆進(jìn)可復(fù)制的表達(dá)載體中，用得到的載體文庫轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞，和在下述條件下表達(dá)組合基因，所述條件下想要的活性的檢測簡化編碼基因(其產(chǎn)物被檢測)的載體的分離。循環(huán)總體誘變(Recursiveensemblemutagenesis,REM)，一種增強(qiáng)文庫中功能突變體頻率的技術(shù)，可以與篩選實(shí)驗(yàn)組合使用以鑒定本發(fā)明蛋白質(zhì)的變體(ArkinandYourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:7811-7815;Delgraveetal.(1993)ProteinEngineering6(3):327-331)。除了SEQIDNO:2-4中分別所示的LIP01-LIP03基因序列外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道給定的種群中可存在DNA序列多態(tài)，所述多態(tài)導(dǎo)致LIP01-LIP03蛋白質(zhì)氨基酸序列中的改變。這類遺傳多態(tài)性可存在于來自不同種群的細(xì)胞中或由于天然等位基因變異而存在于一個種群中。等位基因變體也可包括功能等同物。根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的片段也可包括不編碼功能多肽的多核苷酸。這類多核苷酸可作為PCR反應(yīng)的探針或引物作用。根據(jù)本發(fā)明的核酸無論是編碼功能多肽還是無功能的多肽，均可被用作雜交探針或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物。不編碼具有LIP01-LIP03活性的多肽的本發(fā)明核酸分子的用途尤其包括(l)從cDNA文庫分離編碼LIP01-LIP03蛋白質(zhì)的基因或其等位基因變體，所述cDNA文庫例如來自除M"g"^oW/^gnbe之外的其它生物；(2)與中期染色體涂片原位雜交(例如FISH)以提供LIP01-LIP03基因的精確染色體定位，如Vermaetal.,HumanChromosomes:aManualofBasicTechniques,PergamonPress,NewYork(1988)所述；(3)Northern印跡分析，用于檢測LIP01-LIP03mRNA在特定組織中的表達(dá)；和4)能夠被用作診斷工具來分析給定的生物(例如組織)樣品中核酸存在的探針和引物，所述核酸能與LIP01-LIP03探針雜交。本發(fā)明還包括獲得LIP01-LIP03基因功能等同物的方法。這類方法需要獲得被標(biāo)記的含有被分離的核酸的探針，所述被分離的核酸編碼根據(jù)SEQIDNO:5-14的蛋白質(zhì)序列或其任何的變體的全部或部分；在允許探針與文庫中的核酸片段雜交從而形成核酸雙鏈體的條件下，用被標(biāo)記的探針篩選核酸片段文庫，和從任何被標(biāo)記的雙鏈體中的核酸片段制備全長的基因序列，以獲得與LIP01-LIP03基因相關(guān)的基因。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的LIP01-LIP03核酸與SEQIDNO:2-4任一分別所示的核酸序列或其互補(bǔ)體至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、％%、97%、98%、99%或更加同源。宿主細(xì)胞在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括細(xì)胞，例如含有本發(fā)明所包括的核酸的經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或重組的宿主細(xì)胞。"經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞"或"重組細(xì)胞"是其中(或其祖先中)已經(jīng)借助于重組DNA技術(shù)引入了本發(fā)明核酸的細(xì)胞。原核和真核細(xì)胞均包括在內(nèi)，例如細(xì)菌、真菌、酵母等等，特別優(yōu)選的是來自絲狀真菌(尤其是i^fag"apoWAeg&ae或^per^7/ws的種如j<sperg/〃iwm'ger或o"zae)的細(xì)月包?？蛇x用調(diào)控插入序列表達(dá)并以特異的、期望的方式加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的這類修飾(例如糖基化)和加工(例如切割)可促進(jìn)蛋白質(zhì)發(fā)揮最佳功能。多種宿主細(xì)胞具有用于翻譯前加工和修飾蛋白質(zhì)和基因產(chǎn)物的特性和特異機(jī)制?？蛇x用分子生物學(xué)和/或微生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的適當(dāng)細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)，以確保對所表達(dá)的外源蛋白質(zhì)的想要的和正確的修飾與加工。為此，可以使用具有下述細(xì)胞機(jī)制的真核宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞機(jī)制用于適當(dāng)?shù)丶庸ぴ嫁D(zhuǎn)錄本、糖基化和磷酸化基因產(chǎn)物。這類宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域公知的。宿主細(xì)胞還包括但不限于哺乳動物細(xì)胞系如CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WB8和脈絡(luò)叢細(xì)胞系。如果需要的話，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系可以生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的多肽。公眾可獲得多種適用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞的載體，用于構(gòu)建這類細(xì)胞系的方法也是公眾已知的，例如Ausubeletal.(上文)中。LIP01-LIP03脂肪分解酶在工業(yè)工藝中的用途令人驚奇的是，本發(fā)明的脂肪分解酶不限制于對僅僅一種特定底物的水解，其能夠有不同類型的脂肪分解活性，即磷脂酶、脂肪酶和半乳糖酯酶活性。本發(fā)明的脂肪分解酶可同時顯示這些活性，或可具有單一活性并且很少或無其它活性的狹窄特異性，或其可具有單一主要活性和少量其它活性的更寬特異性，取決于面團(tuán)的組成、反應(yīng)時間、pH、溫度、水含量。因?yàn)槠涠鄻有?，本發(fā)明的脂肪分解酶可以被用于許多工業(yè)應(yīng)用中，包括從含雙半乳糖甘油二酯的來源中生產(chǎn)雙半乳糖甘油單酯或修飾磷脂乳化劑。磷脂乳化劑的一個實(shí)例是卵磷脂，其為極性和中性脂質(zhì)二者的混合物，其中極性脂質(zhì)的含量為至少60%。磷脂乳化劑具有許多食物和非食物應(yīng)用，例如卵磷脂被用作例如乳制品(特別是蛋黃醬、涂抹物(dressing)、餡餅皮等)中的乳化劑，例如大豆卵磷脂被用作(低卡路里)醬、面包、人造黃油、化妝品等中的乳化劑，其它卵磷脂被用在例如巧克力、牛飼料(calffeed)中。用本發(fā)明的脂肪分解酶修飾磷脂乳化劑可引起油/水混合物乳化的提高。用本發(fā)明的脂肪分解酶修飾磷脂乳化劑可提高乳劑在更廣泛或不同的pH和/或溫度范圍內(nèi)的穩(wěn)定性，所述修飾得自添加經(jīng)修飾的磷脂乳化劑。用本發(fā)明的脂肪分解酶修飾磷脂乳化劑可提高乳劑的穩(wěn)定性，所述修飾得自在存在C或Mg^時添加經(jīng)修飾的磷脂乳化劑。本發(fā)明的脂肪分解酶的工業(yè)應(yīng)用的另一個例子是其可以在植物油加工中被用于植物油脫膠。在典型的脫膠工藝中，通過用水洗滌油相(其中在高切應(yīng)力條件下混合水和油使得大量卵磷脂進(jìn)入水相，所述水相隨后在分液器中被去除)從植物油中去除卵磷脂，以提高植物油的穩(wěn)定性，所述植物油例如為大豆油、菜籽(蕓苔)油、亞麻子油、葵花子油。在該所謂的水脫膠階段中，只有可快速水合的磷脂(例如磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇和磷脂酰乙醇胺)被容易地去除。由高達(dá)50%的鎂鹽和/或鈣鹽組成的不能水合的磷脂/磷脂(phosphatide)"^大部分是磷脂(phosphatide)"^不能容易地在水脫膠步驟中被回收。不能水合的磷脂/磷脂(phosphatide)暴露于本發(fā)明的脂肪分解酶使得這些磷脂更溶于水，并因此在水脫膠階段更容易被萃取。本發(fā)明的脂肪分解酶的工業(yè)應(yīng)用的另一個例子是去除沉淀物，所述沉淀物在糖化小麥麩質(zhì)或小麥淀粉(借助于a-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶)以產(chǎn)生葡萄糖糖漿期間產(chǎn)生。隨后對得到的葡萄糖糖漿的過濾顯著加速了沉淀物的去除。本發(fā)明脂肪分解酶在食物中的工業(yè)應(yīng)用的又一例子是其在烘焙應(yīng)用中改善面團(tuán)或烘焙制品品質(zhì)的用途。令人驚奇的，本發(fā)明的脂肪酶在面團(tuán)中(和在其它所述工業(yè)工藝中)被使用時原位顯示至少一種以下特性針對非極性脂質(zhì)相對低的活性針對極性二?；|(zhì)、至少針對二?；肴樘侵鄬Ω叩幕钚葬槍O性單?；衔锏南鄬Φ偷幕钚浴＠?，本發(fā)明的酶可以原位顯示相對低的溶血磷脂酶活性和相對低的脂肪酶活性。當(dāng)被用作面團(tuán)中化學(xué)乳化劑的替代品時，這些預(yù)料外的特性被發(fā)現(xiàn)均是極端有利的。水解酯鍵(其連接脂肪?；c甘油主鏈)的若干種類型的磷脂酶活性可以被區(qū)分開磷脂酶A1(EC3丄1.32)和A2(EC3丄1.4)分別催化來自二酰甘油磷脂sn-l和sn-2位置中的一個脂肪?；拿擋；饔?，產(chǎn)生溶血磷脂。這是乳化劑替代品的一種期望活性。溶血磷脂酶(EC3.1.1.5—也被NomenclatureCommitteeoftheInternationalUnionofBiochemistryandMolecularBiology稱作磷月旨酶B(EnzymeNomenclature,AcademicPress,NewYork,1992))催化溶血磷脂中剩余的脂肪?；Ｒ呀?jīng)報(bào)道過來自Penidlliumnotatum(Saitoetal.，1991，MethodsinEnzymology197:446-456)的酯酶B，其催化來自二?；视土字膬蓚€脂肪酸的脫?；饔茫⑶覂?nèi)在具有溶血磷脂酶活性。對于乳化劑替代而言，溶血磷脂酶活性是較不期望的，因?yàn)檫@會導(dǎo)致極性頭和非極性尾組合的刪除，使得到的產(chǎn)物不能夠影響表面特性。令人驚奇地顯示，本發(fā)明的脂肪酶在面團(tuán)中顯示相對低的溶血磷脂酶活性。小麥粉含約2.2-2.9%的脂質(zhì)。面粉脂質(zhì)可以被分為淀粉脂質(zhì)(0.8-0.9%)和非淀粉脂質(zhì)(1.4-2.0%)。盡管淀粉脂質(zhì)主要由極性溶血磷脂組成，但是非淀粉脂質(zhì)由約40%的中性甘油三酯和40%的極性磷脂和糖脂組成。為了面粉脂質(zhì)級分的最優(yōu)化，通過添加本發(fā)明的酯酶，本發(fā)明的酯酶能夠在面團(tuán)中原位水解極性脂質(zhì)，即磷脂和糖脂，更特別的是半乳糖脂。WO04/104193公開了來自Afeg"oporZ;^的磷脂酶C在烘焙應(yīng)用中的用途。然而，對于要被用于替換化學(xué)乳化劑的酶而言，磷脂酶C活性是人們不想要的，因?yàn)槠洳划a(chǎn)生足夠的表面活性化合物。另外，WO04/104193中公開的磷脂酶C與SEQIDNO:3、4或5是不同源的。WO98/45453公開了來自^^，7/m5似&gew^的具有脂酶活性的多肽，所述多肽也顯示對雙半乳糖甘油二酯的水解活性。然而該酶在面包中原位具有對半乳糖甘油二酯相對低的特異活性和對甘油三酯相對高的活性(實(shí)施例IO)，這使得該酶不適合被用作化學(xué)乳化劑的完全替代品。烘焙酶可以被用于許多烘焙制品中。術(shù)語"烘焙制品"在本文中被定義為包括面包制品，如模制面包(tinbread)、面包棍(loavesofbread)、法式面包以及巻、蛋糕、餡餅、松餅、發(fā)酵的面包圈(yeastraiseddoughnut)和蛋糕面包圈(cakedoughnut)等等。本發(fā)明的脂肪分解酶可例如被用于烘焙制品中。烘焙制品如面包由面團(tuán)制備，所述面團(tuán)通常由基本成分(面)粉、水和任選的鹽制成。取決于烘焙制品，添加的其它成分可以是糖、調(diào)味劑等。對于發(fā)酵制品而言，最初使用面包酵母，隨后使用化學(xué)發(fā)酵體系，如酸(產(chǎn)酸化合物)和碳酸氫鹽的組合。酵母、酶和化學(xué)添加劑通常被獨(dú)立地添加至面團(tuán)?？梢砸愿稍锏?例如顆粒)形式或液體形式添加酶?；瘜W(xué)添加劑在大部分情況下以粉末形式添加。適合特定烘焙應(yīng)用的加工助劑組合物可由化學(xué)添加劑和酶的專用混合物組成。從上述成分和加工制劑制備面團(tuán)是本領(lǐng)域公知的，其包括將所述成分和加工助劑混合，和一個或多個制模和發(fā)酵的步驟。從這類面團(tuán)制備烘焙制品也是本領(lǐng)域公知的，并可包括面團(tuán)的制模和成形和進(jìn)一步發(fā)酵，隨后在需要的溫度和烘焙時間下烘焙。本發(fā)明致力于至少一個(如果不是所有的話)上述問題。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的脂肪分解酶在大量工業(yè)工藝中的用途。盡管用這些工藝獲得了長期經(jīng)驗(yàn)，但是本發(fā)明的脂肪分解酶具有超過目前使用的酶的大量顯著的優(yōu)點(diǎn)。取決于特定的應(yīng)用，這些優(yōu)點(diǎn)可包括如下述的方面更低的生產(chǎn)成本、對底物的更高特異性、更少的抗原性、更少的不想要的副活性、在合適的微生物中生產(chǎn)時更高的產(chǎn)率、更合適的pH和溫度范圍、更好的最終產(chǎn)物口味以及食物級別和猶太教清潔食物(kosher)方面。本發(fā)明還涉及用于制備面團(tuán)或烘焙制品的方法，所述方法包括向面團(tuán)中摻入有效量的本發(fā)明的脂肪分解酶，這相對于其中未摻入多肽的面團(tuán)或烘焙制品而言促進(jìn)面團(tuán)或得自面團(tuán)的烘焙制品的一種或多種特性。短語"摻入面團(tuán)中"在本文中定義為向面團(tuán)中、要用于制造面團(tuán)的任何成分中、和/或要制造面團(tuán)的面團(tuán)成分的混合物中添加根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶。換言之，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可以在面團(tuán)制備的任何步驟中被添加，并可以在一個、兩個或更多步驟中被添加。根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶被添加進(jìn)面團(tuán)的成分中，所述成分使用本領(lǐng)域公知的方法被揉捏和烘焙以制造烘焙制品。參閱例如U.S.專利No.4,567,046、EP-A-426，211、JP畫A國60-78529、JP-A畫62曙111629和JP-A-63-258528。術(shù)語"有效量"在本文中定義為根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶的下述量，所述量足夠?qū)γ鎴F(tuán)和/或烘焙制品的至少一個感興趣的特性提供可測量的作用。術(shù)語"經(jīng)改進(jìn)的特性"在本文中定義為面團(tuán)和/或得自面團(tuán)的制品(尤其是烘焙制品)的任何特性，所述特性相對于其中未摻入本發(fā)明脂肪分解酶的面團(tuán)或產(chǎn)物而言被本發(fā)明的脂肪分解酶的作用改進(jìn)。經(jīng)改進(jìn)的特性可包括但不限于提高的面團(tuán)強(qiáng)度、提高的面團(tuán)彈性、提高的面團(tuán)穩(wěn)定性、降低的面團(tuán)粘稠度、提高的面團(tuán)延展性、提高的面團(tuán)可加工性、提高的烘焙制品體積、經(jīng)改進(jìn)的烘焙制品香味、經(jīng)改進(jìn)的烘焙制品碎屑結(jié)構(gòu)、經(jīng)改進(jìn)的烘焙制品碎屑柔軟性、降低的烘焙制品起泡和/或經(jīng)改進(jìn)的烘焙制品抗腐性?？梢愿鶕?jù)以下實(shí)施例中所述的本發(fā)明的方法，通過將添加和不添加本發(fā)明多肽而制備的面團(tuán)和/或烘焙制品進(jìn)行比較，來測定經(jīng)改進(jìn)的特性。感覺品質(zhì)可以使用烘焙工業(yè)中明確的流程來評價，并可包括例如使用一組受過訓(xùn)練的口味測試人員(apaneloftrainedtaste-testers)。術(shù)語"提高的面團(tuán)強(qiáng)度"在本文中定義為面團(tuán)的下述特性，所述面團(tuán)一般具有更具彈性的特性和/或需要更多的勞動輸入來用模具成形和造型。術(shù)語"提高的面團(tuán)彈性"在本文中定義為面團(tuán)的下述特性，所述面團(tuán)具有在經(jīng)受過某些物理張力之后恢復(fù)其原始形狀的更高趨勢。術(shù)語"提高的面團(tuán)穩(wěn)定性"在本文中定義為面團(tuán)的下述特性，所述面團(tuán)對機(jī)械損傷更不敏感，因此更好地維持其形狀和體積，所述特性可以通過正常和/或擴(kuò)展的醒發(fā)后面包橫斷面的高度:寬度比例來評價。術(shù)語"降低的面團(tuán)粘稠度"在本文中定義為面團(tuán)的下述特性，所述面團(tuán)具有更小的與表面(例如在面團(tuán)生產(chǎn)機(jī)器中)粘附的趨勢，并如本領(lǐng)域所已知的，由熟練的測試烘焙者根據(jù)經(jīng)驗(yàn)評價或通過使用紋理分析儀(例如TAXT2)領(lǐng)懂。術(shù)語"經(jīng)改進(jìn)的面團(tuán)延展性"在本文中定義為面團(tuán)的下述特性，所述面團(tuán)可以接受提高的張力或拉伸而不破裂。術(shù)語"經(jīng)改進(jìn)的面團(tuán)可加工性"在本文中定義為面團(tuán)的下述特性，所述面團(tuán)一般更不粘和/或更堅(jiān)硬和/或更有彈性。術(shù)語"提高的烘焙制品的體積"被測量為給定的面包的體積，這典型地通過自動化的面包體積分析儀(例如BVM-3,TexVolInstrumentsAB,Viken，瑞典)使用本領(lǐng)域已知的超聲或激光檢測法來測定。術(shù)語"降低的烘焙制品起泡"在本文中定義為視覺確定的烘焙面包外皮上起泡的降低。術(shù)語"經(jīng)改進(jìn)的烘焙制品面包屑結(jié)構(gòu)"在本文中定義為烘焙制品的特性，所述烘焙制品的面包屑中具有更精細(xì)的細(xì)胞和/或更薄的細(xì)胞壁和/或細(xì)胞在面包屑中更均一/同質(zhì)的分布，并通常由烘焙者通過視覺評價或通過本領(lǐng)域已知的數(shù)碼圖像分析評價(例如C-cell,CalibreControlInternationalLtd,Appleton,V/arrington，UK)。術(shù)語"經(jīng)改進(jìn)的烘焙制品柔軟性"是"硬度"的反義詞，并在本文中定義為烘焙制品的特性，所述烘焙制品更容易被壓縮，并且如本領(lǐng)域已知由熟練的測試烘焙者根據(jù)經(jīng)驗(yàn)評價或通過使用紋理分析儀(例如TAXT2)測量。術(shù)語"經(jīng)改進(jìn)的烘焙制品香味"由受過訓(xùn)練的測試組評價。術(shù)語"經(jīng)改迸的烘焙制品抗腐性"在本文中被定義為烘焙制品的特性，所述烘焙制品儲存期間具有降低的品質(zhì)參數(shù)(例如柔軟度和/或彈性)衰退速率。術(shù)語"面團(tuán)"在本文中被定義為面粉和其它成分的混合物，所述混合物足夠堅(jiān)硬到被揉捏或滾動。面團(tuán)可以是新鮮的、冷凍的、預(yù)先暴露的(pre-bared)或預(yù)先烘焙的。冷凍面團(tuán)的制備由KulpandLorenz在FrozenandRefrigeratedDoughsandBatters中描述。術(shù)語"烘焙制品"在本文中被定義為從面團(tuán)制備的、具有軟或脆特征的任何制品?？捎欣赜杀景l(fā)明生產(chǎn)的烘焙制品(無論是白色、淺色或深色類型)的例子為面包(尤其是白面包、全麥面包或裸麥面包)，典型地以棍或巻(loavesorrolls)的形式，法棍面包，意大利面，面條(煮過的或(快速)油煎過的)，皮塔(pita)面包，玉米餅(tortillas)，墨西哥玉米巻，蛋糕，煎餅，餅干，曲奇，炸面包圈，百吉餅，餡餅皮(piecrust)，饅頭和脆面包(crispbread)等等。本發(fā)明的脂肪分解酶和/或本發(fā)明方法中要使用的其它酶可以是適用于所述用途的任何形式，例如干粉、凝聚的粉末、顆粒(尤其是無塵顆粒)、液體(尤其是經(jīng)穩(wěn)定的液體)或受保護(hù)的酶(如WO01/11974和WO02/26044中所述)的形式?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法制備顆粒和凝聚的粉末，例如通過將根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶噴霧在流動床顆粒劑上的運(yùn)載體上。運(yùn)載體可由顆粒核心組成，所述顆粒核心具有合適的顆粒大小。運(yùn)載體可以是可溶的或不溶的，例如鹽(例如NaCl或硫酸鈉)、糖(例如蔗糖或乳糖)、糖醇(例如山梨糖醇)、淀粉、稻、玉米粒或大豆。根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶和/或其它酶可以含在緩釋的配方中。用于制備緩釋配方的方法是本領(lǐng)域公知的。添加營養(yǎng)學(xué)可接受的穩(wěn)定劑(如糖、糖醇或其它多元醇和/或乳酸或根據(jù)已知方法的其它有機(jī)酸)可例如對液體酶制劑加以穩(wěn)定。根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶也可以被摻入包含酵母的組合物中，如EP-A-0619947、EP-A-0659344和WO02/49441中公開的組合物。對于包含在面粉的預(yù)先混合物中而言，根據(jù)本發(fā)明的多肽是干燥制品(例如無塵顆粒)是有利的，而對于與液體一起被包含而言，液體形式是有利的。還可以向面團(tuán)中摻入一種或多種其它酶。所述其它酶可以是任何來源，包括哺乳動物和植物來源，優(yōu)選地為微生物(細(xì)菌、酵母或真菌)來源，其可通過本領(lǐng)域常用技術(shù)獲得。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，其它酶可以是淀粉酶如O!-淀粉酶(適用于提供可被酵母發(fā)酵的糖并延緩腐敗)或/5-淀粉酶，麥芽糖淀粉酶或非麥芽糖淀粉酶，環(huán)糊精葡萄糖轉(zhuǎn)位酶，肽酶尤其是外肽酶(適用于增強(qiáng)香味)、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，脂肪酶(適用于修飾面團(tuán)或面團(tuán)組分中存在的脂類以軟化面團(tuán))，半乳糖酯酶，磷脂酶，纖維素酶，半纖維素酶，尤其是戊聚糖酶如木聚糖酶(適用于戊聚糖的、更特別地適用于阿拉伯木聚糖的部分水解，這提高面團(tuán)的延展性)，蛋白酶(適用于削弱麩質(zhì)，尤其是使用硬小麥粉時)，蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶，例如WO95/00636中公開的蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶，糖基轉(zhuǎn)移酶，過氧化物酶(適用于改進(jìn)面團(tuán)的稠度)，漆酶，或氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、醛糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、脂肪氧化酶或L-氨基酸氧化酶(適用于改進(jìn)面團(tuán)的稠度)。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的方法要添加一種或多種其它酶添加劑時，這些添加劑可以單獨(dú)地或與根據(jù)本發(fā)明的多肽一起，任選地作為面包改進(jìn)和/或面團(tuán)改進(jìn)組合物的組分被添加。其它酶活性可以是上述的任何酶，并可以根據(jù)已確立的烘焙實(shí)踐確定劑量。本發(fā)明還涉及用于制備烘焙制品的方法，包括烘焙通過本發(fā)明方法獲得的面團(tuán)，以生產(chǎn)烘焙制品。烘培面團(tuán)以生產(chǎn)烘培制品可以通過本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行。本發(fā)明還涉及分別通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的面團(tuán)和烘焙制品。本發(fā)明還涉及用于面團(tuán)和/或由面團(tuán)制成的烘焙制品的預(yù)混合物(例如為面粉組合物形式)，其中所述預(yù)混合物包含本發(fā)明的多肽。術(shù)語"預(yù)混合物"在本文定義為以其常規(guī)含義理解，即作為烘焙劑的混合物，一般包含不僅可用于工業(yè)面包烘焙劑中的面粉，一般包含不僅可用于工業(yè)面包烘焙工廠/設(shè)施、而且也可用于零售面包房的面粉。可以通過將本發(fā)明的多肽或包含多肽的本發(fā)明的面包改進(jìn)和/或面團(tuán)改進(jìn)組合物與合適的運(yùn)載體(如面粉、淀粉、糖或鹽)混合來制備預(yù)混合物。預(yù)混合物可含有其它面團(tuán)改進(jìn)和/或面包改進(jìn)添加劑，例如包括上述酶的任何添加劑。本發(fā)明還涉及顆粒或凝聚粉末形式的烘焙添加劑，所述添加劑包含本發(fā)明的多肽。烘焙添加劑優(yōu)選地具有狹窄的顆粒大小分布，多于95%(按重量計(jì))的顆粒在25到500/mi的范圍內(nèi)。在面團(tuán)和面包制造中，本發(fā)明可與前文定義的加工助劑組合使用，所述加工助劑如化學(xué)加工助劑，如氧化劑(例如抗壞血酸)、還原劑(例如L-半胱氨酸)、和/或乳化劑(例如DATEM、SSL和/或CSL)和/或酶加工助劑如氧化還原酶(例如葡萄糖氧化酶)、多糖修飾酶(例如a-淀粉酶、半纖維素酶、分支酶等)和/或蛋白質(zhì)修飾酶(內(nèi)切蛋白酶、外切蛋白酶、分支酶等)。本發(fā)明的脂肪分解酶的上述工業(yè)應(yīng)用僅包括一些例子，并且該列表不旨在限制?？稍谖⑸镏斜憷厣a(chǎn)LIP01-LIP03脂肪分解酶。在上述工藝中，使用通過重組DNA技術(shù)獲得的脂肪分解酶是有利的。這類重組酶具有超過它們經(jīng)傳統(tǒng)純化的副本的大量優(yōu)點(diǎn)?？梢缘统杀緝r格、高產(chǎn)率產(chǎn)生重組酶，所述重組酶不含污染物質(zhì)(如細(xì)菌或病毒)并且不含細(xì)菌毒素或其它污染酶活性。下文通過以下的非限制性實(shí)施例來闡述本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1Aspergillusniger的發(fā)酵如下構(gòu)建由本文提供的核苷酸序列SEQIDN0:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4編碼的脂肪分解酶構(gòu)建含有DNA序列的表達(dá)質(zhì)粒、用這類質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Am'ger菌株，并以以下方式培養(yǎng)^/^^'//船w'ger菌株。將Am'gw的新鮮孢子(106-107)接種于20mlCSL-培養(yǎng)基(100ml帶蓋燒瓶)中，并在34。C和170rpm下培養(yǎng)20-24小時。在100mlCSM培養(yǎng)基(500ml帶蓋燒瓶)中接種5-10mlCSL預(yù)培養(yǎng)物后，將菌株在34。C和170rpm下發(fā)酵3-5天。通過在50mlGreiner管中離心(30分鐘，5000rpm)獲得無細(xì)胞的上清液。在GF/AWhatmanGlass微纖維濾器(150mmA)上預(yù)過濾上清液以去除較大的顆粒，用4NKOH調(diào)節(jié)至pH5(如果必需的話)，并在0.2pm(瓶頂)濾器上用吸力無菌過濾以去除真菌材料。將上清液儲存于4°C(或醒20。C)。CSL培養(yǎng)基由以下物質(zhì)組成(以每升用量計(jì))100gCornSteepSolids(Roquette)、1gNaH2P04H20,0.5gMgS047H20、10g葡萄糖H20禾卩0.25gBasildon(消泡劑)。將成分溶于軟化水(demi-water)中，并用NaOH或H2SCMtpH調(diào)節(jié)至pH5.8;向100ml帶蓋和起泡球(foamball)的燒瓶中填充20ml發(fā)酵液，并在12(TC滅菌20分鐘，之后在冷卻至室溫后向每個燒瓶中添加含有5000IU/ml青霉素和5mg/ml鏈霉素的200pl溶液。CSM培養(yǎng)基由以下物質(zhì)組成(以每升用量計(jì))150g麥芽糖H20、60gSoytone(蛋白胨)、1gNaH2P04H20、15gMgS047H20、0.08gTween80、0,02gBasildon(消泡劑)、20gMES、1gL-精氨酸。將成分溶于軟化水中，并用NaOH或H2SCU#pH調(diào)節(jié)至pH6.2;向500ml帶蓋和起泡球的燒瓶中填充100ml發(fā)酵液，并在120°C滅菌20分鐘，之后在冷卻至室溫后向每個燒瓶中添加含有5000IU/ml青霉素和5mg/ml鏈霉素的1ml溶液。實(shí)施例2純化本發(fā)明的脂肪分解酶步驟1-制備超濾液對按照實(shí)施例1獲得的培養(yǎng)物上清液進(jìn)行超濾，以去除可能影響酶活性測定和烘焙測試的低分子污染。在裝備有濾膜(具有10kDa界限)的MilliporeLabscaleTFF體系中進(jìn)行30ml上清液的超濾。取決于樣品的顏色，將它們用40倍體積的冷的100mM磷酸鹽緩沖液pH6.0(含0.5mMCaCl2)洗滌3-5次。酶溶液的終體積為30ml，也被稱作"超濾液"。使用Bradford方法(TheProteinProtocolsHandbook,2ndedition,EditedbyJ.M.Walker，HumanaPressInc，Totowa2002,pl5-21)測定樣品的總蛋白質(zhì)含量。步驟2-通過A280和HPSEC測定脂肪分解酶濃度根據(jù)由脂肪分解酶產(chǎn)生的280nm處的消光(A280)和計(jì)算出的脂肪分解酶分子消光系數(shù)，來計(jì)算超濾液中的脂肪分解酶濃度。A280的測量在UvikonXLSecomam分光光度計(jì)(BeundeRonde,Abcoude，荷蘭)中進(jìn)行。酶的分子消光系數(shù)可以從每個酶分子中的酪氮酸、色氨酸和半胱氨酸殘基數(shù)計(jì)算(S.C.GillandP.H.vonHippel，Anal.Biochem.182,319-326(1989))。這些氨基酸的分子消光系數(shù)分別為1280、5690和120M—Vcm^本發(fā)明脂肪分解酶中的酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸殘基數(shù)可以從選自SEQIDNO:5-14的蛋白質(zhì)序列推導(dǎo)。計(jì)算出的消光系數(shù)在表1中顯示。表1:LIP01-LIP03酶的計(jì)算出的消光系數(shù)和M.W.<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>由脂肪分解酶產(chǎn)生的超濾液在280rnn處的消光(A280)取決于酶樣品的純度。使用HPSEC(高效尺寸排除色譜)，用TSKSW-XL柱(300*7,8mm;MW范圍10-300kDa)來測定該純度。洗脫緩沖液由25mM磷酸鈉緩沖液pH6.0組成，并以lml/分鐘的流速使用。注射5-100/xl的樣品。測量280nm處的吸光度。從色譜中各脂肪分解酶峰的峰表面與在280nm處吸收的峰的總表面的比值獲得由本發(fā)明的脂肪分解酶產(chǎn)生的超濾液中的A280。然后通過將超濾液的A280乘以上述比例，除以針對脂肪分解酶計(jì)算的消光系數(shù)(1mg/ml溶液-表l最右列)，來計(jì)算超濾液中的脂肪分解酶濃度。實(shí)施例3活性測量在實(shí)施例2中獲得的超濾液可以被用來進(jìn)行以下的酶活性測量，以確立下述脂肪分解酶脂肪酶'磷脂酶A1或A2溶血磷脂酶半乳糖酯酶活性的特異性。通過使用顯色底物棕櫚酸對硝基苯基酯(pNPP)，用分光光度計(jì)來測量脂肪酶活性。在該測定法中，顯色底物對硝基苯基酯(pNPP)被溶解于2-丙醇中，并在存在0.1%阿拉伯膠和0.25%去氧膽酸鈉時將其懸浮于磷酸鹽緩沖液pH7.4中。用該底物溶液在37。C下孵育脂肪酶，并在405nm處將形成的對硝基苯基(pNP)測量2.6分鐘。該測定法也可以在不同的pH值下進(jìn)行，以測定脂肪酶的pH依賴性。應(yīng)當(dāng)明白在不同的pH值下可能需要不同的緩沖液，或可能必需不同的去污劑用于乳化底物。例如在pH=4時，使用含1.0%TritonX-100的100mM醋酸鹽緩沖液。一個脂肪酶單位被定義為在所述反應(yīng)條件下每分鐘釋放1微摩爾對硝基苯酚的酶量。應(yīng)當(dāng)明白下述內(nèi)容不是常規(guī)分析中稀有的實(shí)踐使用標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)酶溶液(其具有在不同的測定法中測定的已知活性)校正給定的測定的活性(其具有在校準(zhǔn)測定中將被測定的單位)?；蛘?，可以通過使用2,3-巰基-l-丙醇-三丁酸酉旨(TBDMP)作為底物測定脂肪酶活性。脂肪酶水解TBDMP的硫酯鍵，從而釋放丁酸和2,3-巰基-1-丙醇-二丁酸酯、2,3-巰基-1-丙醇-單丁酸酯或2,3-巰基-1-丙醇。被釋放的巰基在隨后與4,4,-二硫代雙吡啶(DTDP)形成4-硫代吡P定酮的反應(yīng)中被滴定。后者處于與4-巰基吡啶(其在334nm處吸收)的互變異構(gòu)平衡中。反應(yīng)在含0.2%Triton-X100、0.65mMTBDMP和0.2mMDTDP的0.1M醋酸鹽緩沖液pH5.0中于37。C下進(jìn)行。一個脂肪酶單位被定義為在所述反應(yīng)條件下每分鐘釋放1微摩爾4-硫代吡啶酮的酶量。通過使用1,2-二巰基二辛?；?磷脂酰膽堿作為底物，用分光光度計(jì)測定磷脂酶A活性。磷脂酶A水解位置l(PLAl)或位置2(PLA2)處的硫酯鍵，從而釋放辛酸和1,2-二巰基-單-辛?；?磷脂酰膽堿或1,2-二巰基-磷脂酰膽堿。在隨后與4,4'-二硫代吡啶形成4-硫代吡啶酮的反應(yīng)中滴定被釋放的巰基。后者處于與4-巰基吡啶(其在334nm處吸收)的互變異構(gòu)平衡中。反應(yīng)在0.1M醋酸鹽緩沖液pH4.0+0.2%Triton-X100中于37。C下進(jìn)行。一個磷脂酶A單位(APLU)被定義為在所述反應(yīng)條件下每分鐘釋放1微摩爾4-硫代吡啶酮的酶量?？梢酝ㄟ^使用溶血磷脂酰膽堿作為底物，用"P-NMR光譜法來測定溶血磷脂酶活性。溶血磷脂酶水解酯鍵，從而從甘油基元釋放脂肪酸。使用NMR定量這樣形成的甘油磷酸膽堿。反應(yīng)在還含有l(wèi)mg/ml溶血磷脂酰膽堿和5mMCaCl2的50mM醋酸緩沖液pH4.5中于55'C進(jìn)行30分鐘。一個溶血磷脂酶單位(LPC)被定義為在所述反應(yīng)條件下每分鐘形成1微摩爾甘油磷酸膽堿的酶量。通過使用雙半乳糖甘油二酯作為底物，根據(jù)HirayamaandMatsuda(1972)Agric.Biol.Chem.36,1831所述方法用H-NMR光譜法測定半乳糖酯酶活性。半乳糖酯酶水解脂肪酸和甘油主鏈之間的酯鍵，從而釋放一個或兩個脂肪酸。反應(yīng)在還含有4mMCaCl2、0.2%TritonX-100和1mg/ml雙半乳糖甘油二酯(LipidProducts)的50mM醋酸緩沖液pH4.5中、于3CTC進(jìn)行30分鐘。一個半乳糖酯酶單位被定義為在所述反應(yīng)條件下每分鐘形成l微摩爾脂肪酸的酶量。除了分光光度計(jì)測量以外，還可以使用滴定測量來測定脂酶活性。例如，可以以三丁酸甘油酯作為底物，根據(jù)FoodChemicalCodex，F(xiàn)orthEdition,NationalAcademyPress,1996,p803來測量脂肪分解酶的酯酶活性。優(yōu)選地，使用與更長脂肪酸(例如棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸)的甘油三酯底物測定脂肪酶活性。在這類測定法中常應(yīng)用橄欖油。原則上也可以用滴定測量法分析磷脂酶、溶血磷脂酶和半乳糖酯酶。除了提到的脂肪分解活性以外，樣品中也可以存在非脂肪分解的副活性，例如a-淀粉酶活性。可以使用PhadebasAmylase測試片劑(Pharmacia)來測量真菌a-淀粉酶的活性。Phadebas片劑含有水溶性的淀粉底物和通過交聯(lián)與底物結(jié)合的藍(lán)色染料。底物被真菌淀粉酶水解，向溶液中釋放有色的可溶的麥芽糖糊精。用含有參考真菌a-淀粉酶活性的溶液制備校準(zhǔn)曲線。從參考和未知的樣品制備50mM蘋果酸緩沖液pH5.5中的合適稀釋液。在3(TC下將5ml樣品孵育5分鐘，添加Phadebas片劑，并在15分鐘后通過添加1.0ml0.5N氫氧化鈉終止反應(yīng)。允許混合物冷卻至室^L，保持5分鐘，之后添加4.0ml水，用手晃動15分鐘后將樣品在4700rpm離心10分鐘。在620nm處測量上層的消光。OD620nm是對真菌a-淀粉酶活性的度量。一個真菌淀粉酶單位(FAU)在本文中被定義為每小時將1克淀粉(100%干物質(zhì))轉(zhuǎn)化為下述產(chǎn)物的酶量，所述產(chǎn)物在與已知強(qiáng)度的lf典溶液在所述反應(yīng)條件下反應(yīng)后在620nm處具有透射(transmission)。除了提到的活性外，還存在葡萄糖淀粉酶、蛋白酶和木聚糖酶的小量活性，然而，這樣低的量使得這些酶不干預(yù)以下實(shí)施例中所述的烘焙實(shí)驗(yàn)。如表2所概述，對實(shí)施例1中獲得的無細(xì)胞超濾液進(jìn)行脂肪酶、磷脂酶和半乳糖酯酶測定。表2.實(shí)施例1中制備的無細(xì)胞澄清濾液中的脂肪分解酶活性(脂肪酶活性在pH5測定)。<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>應(yīng)當(dāng)注意在多種測定法中僅存在單一的底物，并且活性數(shù)并不預(yù)測多種脂樣底物的混合物中或工業(yè)應(yīng)用(如面團(tuán))中的實(shí)際活性。在這類情況下，底物的親和力或特異性將會重要。對酶的表征用NuPage4-12%MESSimplyBlueSafeStain對超濾液樣品進(jìn)行SDS-PAGE分子量估計(jì)。對LIP01而言，估計(jì)的Mw=33kD。對LIP02而言，估計(jì)的Mw=33kD。對LIP03而言，觀察到對應(yīng)于Mw=33kD和Mw=41kD的兩條主要條帶。等電聚焦實(shí)驗(yàn)對于LIP01275氨基酸蛋白質(zhì)而言計(jì)算的pI:5。對于LIPOl的被翻譯的基因而言計(jì)算的pl:5.4。對于LIP02的被翻譯的基因而言計(jì)算的pi:5.4。對于成熟的276個氨基酸LIP02蛋白質(zhì)而言計(jì)算的pI:5.5。使用凝膠電泳和兩性電解質(zhì)范圍3-10用實(shí)驗(yàn)測定LIP02的pl。IEF實(shí)驗(yàn)顯示在范圍4-5中的多個條帶，主條帶在pl-4.7和p^4.3處。對于成熟的276個氨基酸LIP03蛋白質(zhì)而言計(jì)算的pi:5.1(使用SEQ1)對于348個氨基酸的被翻譯的LIP03基因而言計(jì)算的pi:5.1(使用SEQ10)對于314個氨基酸的被翻譯的LIP03而言計(jì)算的pi:4.8(使用SEQ14)在A.niger中產(chǎn)生的LIP03脂肪酶的等電聚焦顯示在pl=4和高達(dá)pl=5.0范圍內(nèi)的多個條帶，主要的條帶在pl=4.7和pl=4.4左右。對糖基化的測定糖基化可能影響在PAA-SDS凝膠上觀察到的分子量。通常分子量被高估。為了確認(rèn)LIP01-03蛋白質(zhì)是否被糖基化并有效地測定蛋白質(zhì)分子量，用PNGASE-F糖苷酶(glycosidase)處理蛋白質(zhì)樣品，從而對蛋白質(zhì)進(jìn)行去糖基化。隨后對經(jīng)處理的和未經(jīng)處理的樣品進(jìn)行PAA-SDS凝膠電泳。兩個可能的N-糖基化位點(diǎn)存在于成熟的275LIP01氨基酸蛋白質(zhì)中126NLTF和264NYTF。一個可能的糖基化位點(diǎn)存在于成熟的276氨基酸LIP02蛋白中264NYTF。未處理的LIP02顯示在33kD左右的條帶，而糖基化后觀察到在30kD左右的條帶。一個可能的N-糖基化位點(diǎn)存在于成熟的276氨基酸蛋白質(zhì)中264NYTF。未處理的LIP03顯示兩個條帶，一個在33kD左右，一個在41kD左右。糖基化后再次觀察到兩個條帶，一個在30kD左右，一個在3汰D左右。這些結(jié)果提示存在兩種形式的LIP03，其均被糖基化至相同的程度。對糖蛋白的表征和f喿作在TheProteinProtocolsHandbook,2ndedition,EditedbyJ.M.Walker,HumanaPressInc,Totowa2002,chapterVI中被廣泛描述?？梢允褂肔C/MS根據(jù)以下的方案測定產(chǎn)生的脂肪分解酶的完整質(zhì)量(intactmass)-洗脫劑A:MQ中0.1%TFAB:ACN中0.1%TFA梯度從0%B開始，在15分鐘內(nèi)提高至80%B，并保持15分鐘體積ProsphereC4300)um*50腿流動2(il/min注射體積5pl/minMS設(shè)備Qtof-2(SM06)LC/MSNanoESI/posMS完全掃描500-3000amu通過在13000rpm，于4。C下離心15分鐘濾過10kDa離心設(shè)備濾器(Pall)，將蛋白質(zhì)樣品脫鹽。用肽-N-糖苷酶F(PNGase,RocheDiagnosticsGmbH，ManheimGermany)通過酶去糖基化進(jìn)行去糖基化。將LIP01-LIP03的濾液溶解于100mM碳酸氫銨中，并通過在95i:孵育十分鐘來變性。向樣品中添加PNGASE-F(20個單位)，并通過在37"孵育過夜進(jìn)行去糖基化。去糖基化后，通過在13000rpm離心15分鐘再次濾過10kDa離心設(shè)備濾器(Pall)來去除糖。來自脫鹽的濾液和糖基化后的濾液在50/50/5AcN/MQ/FA中溶解至約1mg/mL的終濃度。通過直接灌輸將樣品注^t在QTOFII質(zhì)譜儀上，并使用Masslynx軟件(版本4sp2,Waters)中的MaxEntl算法計(jì)算完整質(zhì)量。對于LIP02而言，通過重疊完整LIP02樣品的MS譜計(jì)算出32265的分子量。對于去糖基化的LIP02而言，計(jì)算出29905Da的完整質(zhì)量，其對應(yīng)于理論氨基酸序列(SEQNO2)的殘基35-310。去糖基化之前和之后觀察到的完整質(zhì)量差異可能對應(yīng)于與蛋白質(zhì)結(jié)合的2個GlcNAC基團(tuán)和12個甘露糖基。對于去糖基化的LIP03而言，觀察到多于一個的完整質(zhì)量。計(jì)算出了含有或不含有C端肽的LIP03的完整質(zhì)量，分別為MW=29835(SEQ3,35-310)和MW^34100(SEQ6,35-348)。另外，MW=29835(SEQ3)片段的C端是粗糙的(ragged)，因?yàn)橐灿^察到殘基35-309(SEQ4)和35-308(SEQ5)的質(zhì)量，其中特別地與殘基35-310相比殘基35-309非常富集。這指出LIP03的C端切割不是完全特異的。pH最適度可以通過進(jìn)行下述測定法來測定脂肪分解酶的pH最適度依賴性，所述測定法在不同的pH值下測量某類型的脂肪分解活性。觀察到最大活性的pH是具體酶的pH最適度。因?yàn)閜H最適度可取決于底物類型和所應(yīng)用的測定條件，所以使用不同的底物或測定條件顯著改變時應(yīng)當(dāng)重建pH最適度。溫度最適度通過在不同的溫度下進(jìn)行給定的測定法來測定脂肪分解酶的溫度最適度。通過將活性繪制為溫度的函數(shù)，可以測定酶的溫度最適度。熱穩(wěn)定性可以借助于差示掃描量熱法(DSC)測定脂肪分解酶的熱穩(wěn)定性?；蛘呖梢酝ㄟ^T50測定分析熱穩(wěn)定性。T50被定義為將脂肪分解酶在給定條件下加熱20分鐘后喪失50%活性的溫度?？梢酝ㄟ^將脂肪分解酶儲存于某條件某溫度下來測定儲存穩(wěn)定性。跨越不同的時間后，取樣并在標(biāo)準(zhǔn)測定條件下測定這些樣品中的殘余活性。實(shí)施例4烘焙實(shí)驗(yàn)一迷你巴塔德(Mini-batard)從150克面團(tuán)塊烘焙迷你巴塔德，所述面團(tuán)塊通過將200g面粉(KolibriTM)、4.6g壓縮酵母、4g鹽、68ppm抗壞血酸、1ppmBakezymeP500(真菌ce-淀粉酶)、5ppmBakezymeHSP6000(真菌半纖維素酶)和114ml水混合獲得。在葉式攪拌機(jī)(pinmixer)中混合6分鐘和15秒后，將面團(tuán)分為150g的兩塊，弄圓并在環(huán)境溫度和90%的相對濕度下醒發(fā)25分鐘。然后將面團(tuán)塊制模和成形，并在32X:和85%的相對濕度下醒發(fā)100分鐘。切割完全醒發(fā)的面團(tuán)塊并在烘箱中于24(TC下烘焙20分鐘，最初添加蒸汽。將不同劑量的脂肪分解酶LIP01-LIP03的多種效應(yīng)與空白的、不含其它添加物的面包和含0.3%DATEM(Panodan80CP)的對照面包比較。在面包冷卻后通過自動化面包體積分析儀(BVM-3，TexVolInstrumentsAB,Viken,Sweden)測定面包體積。根據(jù)表3所列的尺度，由有經(jīng)驗(yàn)的烘焙者來評價其它作用。表3.在迷你巴塔德中觀察到的作用評分<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>實(shí)施例5烘焙實(shí)驗(yàn)一全規(guī)模巴塔德ffiillscalebatard)還在全規(guī)模巴塔德中測試脂肪分解酶LIP01-LIP02的烘焙性能。在Diosna混合器中將3000g面粉(KolibriTM)、70g壓縮酵母、60g鹽、50ppm抗壞血酸、2ppmBakezymeP500(真菌a-淀粉酶)、15ppmBakezymeHSP6000(真菌半纖維素酶)和1740ml水混合(速度1下2分鐘，速度2下100分鐘)至27卩的最終面團(tuán)溫度。將面團(tuán)分為350g的6±央，弄圓并在32'C和90%相對濕度下醒發(fā)20分鐘。然后將面團(tuán)塊制模和成形，并在34。C和90%的相對濕度下醒發(fā)100分鐘。切割完全醒發(fā)的面團(tuán)塊并在烘箱中于24(TC下烘焙30分鐘，最初添加蒸汽。將不同劑量的脂肪分解酶對面團(tuán)和對最終烘焙產(chǎn)物的多種作用與空白的、不含其它添加物的面包和含0.3%DATEM(Panodan80CP)的對照面包比較。冷卻至室溫后，通過自動化面包體積分析儀(BVM-3，RICardsInstrumentsAB，Viken,Sweden)測定面包的體積。由有經(jīng)驗(yàn)的烘焙者根據(jù)表6所列尺度手工和視覺評價其它作用。結(jié)果在表7和表8中給出。表6.在全規(guī)模巴塔德中觀察到的作用評分<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>表7.不同劑量(每kg面粉mg蛋白質(zhì)(根據(jù)Bradford測定))下脂肪分解酶LIP01的烘焙性能<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>表8.不同劑量(每kg面粉mg蛋白質(zhì)(根據(jù)Bradford測定))下脂肪分解酶LIP02的烘焙性能<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>實(shí)施例6在迷你巴塔德的面團(tuán)中測定脂質(zhì)轉(zhuǎn)化極性脂質(zhì)通過用水飽和的丁醇來劇烈搖動經(jīng)凍干并磨碎的完全醒發(fā)的面團(tuán)(見實(shí)施例3)，來萃取脂質(zhì)。離心后，在LiChrospher100DIOL5mm(250x4.0mm)上用HPLC分析澄清的上清液，通過EvaporativeLightScattering(AlltechELSD2000ES)在1.51/min的氮流、8(TC的溫度、壓縮器打開時檢測脂樣組分。使用兩個流動相在梯度程序中以1.0ml/min的流速進(jìn)行洗脫A:庚垸/異丙醇/丁醇/四氫呋喃/異辛烷/水(64.5/17.5/7/5/5/1)B:異丙醇/丁醇/四氫呋喃/異辛烷/水(73/7/5/5/10)。為了兩次溶液洗脫，每升添加77ml氨溶液(ammoniacsolution)和77ml三氟醋酸。梯度程序在25分鐘內(nèi)從IOOXA到100%B的線性，然后100%B5分鐘，然后從100%B到100。XA線性梯度0.5分鐘，最終100%A5分鐘，注射體積為20ml,柱溫度為80°C。使半乳糖脂，磷脂，甘油三酯、二酯和單酯(例如單半乳糖甘油二酯、單半乳糖甘油單酯、雙半乳糖甘油二酯、雙半乳糖甘油單酯)磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰膽堿來指示多種化合物的洗脫順序，并計(jì)算它們的反應(yīng)因子和存在于面團(tuán)中的量。在表9和10中，展示完全醒發(fā)的面團(tuán)(含多種量的LIP01-LIP02)中主要的極性脂質(zhì)的量。這些結(jié)果還澄清了，LIP01-LIP02有效地以相對低的劑量將半乳糖甘油二酯轉(zhuǎn)化為半乳糖甘油單酯，優(yōu)選雙半乳糖甘油二酯與單半乳糖甘油二酯相比，也與磷脂酰膽堿相比。還清楚的是2.4ppm(Bradford蛋白)劑量的實(shí)施例4的最佳烘焙結(jié)果與雙半乳糖甘油單酯的最高水平一致。表9，含多種量LIPOl(表達(dá)為mgBradford蛋白每kg面粉)的完全醒發(fā)的面團(tuán)中的極性脂質(zhì)(表達(dá)為g每kg凍干的面團(tuán))<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>MGDG:單半乳糖甘油二酯；MGMG-單半乳糖甘油單酯；DGDG=雙半乳糖甘油二酯；DGMG-雙半乳糖甘油單酯；PC4粦脂酰膽堿；LPC二溶血磷脂酰膽堿。表10.含多種量LIP02(表達(dá)為mgBradford蛋白每kg面粉)的完全醒發(fā)的面團(tuán)中的極性脂質(zhì)(表達(dá)為g每kg凍干的面團(tuán))<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>MGDG二單半乳糖甘油二酯；MGMG^^單半乳糖甘油單酯；DGDG=雙半乳糖甘油二酯；DGMG-雙半乳糖甘油單酯；PC^磷脂酰膽堿；LPC=溶血磷脂酰膽堿。非極性脂質(zhì)通過用含1%醋酸的庚烷來劇烈搖動經(jīng)凍千并磨碎的完全醒發(fā)的面團(tuán)(見烘焙實(shí)施例1)，來萃取非極性脂質(zhì)。離心后，在SpherisorbS3CN(PhenomenexOOD-0097-EO;100x4.6mm)上用HPLC分析澄清的上清液，通過EvaporativeLightScattering(AlltechELSD2000ES)在1.51/min的氮流、4(TC的溫度、壓縮器關(guān)閉時檢測脂樣組分。使用兩個流動相在以下的線性梯度程序中以1.0ml/min的流速、20ml的注射體積和環(huán)境柱溫度進(jìn)行<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>使用甘油三、二、單酯和脂肪酸的參考，來指示多種化合物的洗脫順序，并計(jì)算它們的反應(yīng)因子和面團(tuán)中存在的量。權(quán)利要求1.經(jīng)分離的多核苷酸，所述多核苷酸能夠與根據(jù)SEQIDNO:2-4任一的多核苷酸雜交或與其至少85％同源。2.根據(jù)權(quán)利要求的經(jīng)分離的多核苷酸，所述多核苷酸能夠在高嚴(yán)格度條件下與根據(jù)SEQIDNO:2-4任一的多核苷酸雜交。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)的經(jīng)分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼脂肪分解酶。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的經(jīng)分離的多核苷酸，所述多核苷酸是通過合成生產(chǎn)的。5.經(jīng)分離的多核苷酸，其編碼包含根據(jù)SEQIDNO:5-14任一或其任何的功能等同物的氨基酸序列的多肽。6.經(jīng)分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼根據(jù)SEQIDNO:5-14任一的多肽或其任何的功能等同物的至少一個功能結(jié)構(gòu)域。7.經(jīng)分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含根據(jù)SEQIDNO:2-4任一的核苷酸序列或其功能等同物。8.根據(jù)SEQIDNO:2-4中任一項(xiàng)的經(jīng)分離的多核苷酸。9.包含根據(jù)權(quán)利要求1到8的多核苷酸序列的載體。10.根據(jù)權(quán)利要求9的載體，其中根據(jù)權(quán)利要求1到8的所述多核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列可操作地鏈接，所述調(diào)節(jié)序列適合所述多核苷酸序列在合適的宿主細(xì)胞中的表達(dá)。11.根據(jù)權(quán)利要求10的載體，其中所述合適的宿主細(xì)胞是絲狀真菌，優(yōu)選地是Asprgillus的種，更優(yōu)選地是Asprgillusniger。12.用于制造根據(jù)權(quán)利要求1-8的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求9到11的載體的方法，所述方法包括步驟培養(yǎng)用所述多核苷酸或所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，和從所述宿主細(xì)胞中分離所述多核苷酸或所述載體。13.根據(jù)SEQIDNO:5-14中任一項(xiàng)的經(jīng)分離的多肽或其任何的功能等同物。14.經(jīng)分離的多肽，所述多肽能夠通過在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1到8的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求9到11的載體獲得，所述宿主細(xì)胞例如Aspergilusniger。15.包含LIP01-LIP03多肽的功能結(jié)構(gòu)域的重組烘焙酶。16.用于制造根據(jù)權(quán)利要求13到15的多肽的方法，所述方法包括步驟用根據(jù)權(quán)利要求1到8的經(jīng)分離的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求9到11的載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，在允許所述多核苷酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞，和任選地從所述細(xì)胞或培養(yǎng)基中純化所述被編碼的多肽。17.包含根據(jù)權(quán)利要求1到8的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求9到11的載體的重組的宿主細(xì)胞。18.表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求13到15的多肽的重組的宿主細(xì)胞。19.根據(jù)權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)的經(jīng)分離的多肽在面團(tuán)制備中的用途。20.面團(tuán)的制備方法，其包括下述步驟向至少一種所述面團(tuán)成分中添加根據(jù)權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)的所述多肽。21.包含根據(jù)權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)的多肽的面團(tuán)。22.根據(jù)權(quán)利要求21的面團(tuán)，其具有改進(jìn)的面團(tuán)穩(wěn)定性。23.根據(jù)權(quán)利要求21-22中任一項(xiàng)的面團(tuán)，其具有至少一種下述改進(jìn)的特性，所述改進(jìn)的特性選自由提高的強(qiáng)度、提高的彈性、提高的穩(wěn)定性、降低的粘稠度和/或改進(jìn)的面團(tuán)延展性組成的組。24.烘焙產(chǎn)物的制備方法，所述方法包括烘焙根據(jù)權(quán)利要求21-23任一項(xiàng)的所述面團(tuán)的步驟。25.能夠根據(jù)權(quán)利要求24獲得的烘焙產(chǎn)物。26.根據(jù)權(quán)利要求25的烘焙產(chǎn)物，其為面包。27.根據(jù)權(quán)利要求25-26任一項(xiàng)的烘焙產(chǎn)物，其具有提高的面包體積。28.根據(jù)權(quán)利要求25-27任一項(xiàng)的烘焙產(chǎn)物，其具有至少一種改進(jìn)的特性，所述特性選自由提高的體積、改進(jìn)的香味、改進(jìn)的碎屑結(jié)構(gòu)、改進(jìn)的碎屑柔軟性、降低的起泡和/或改進(jìn)的防腐性組成的組。29.根據(jù)權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)的經(jīng)分離的多肽在下述工業(yè)工藝之一中的用途，所述工業(yè)工藝選自由a.制備烘焙產(chǎn)物，b.從含雙半乳糖甘油二酯的來源生產(chǎn)雙半乳糖甘油單酯c.從小麥麩質(zhì)生產(chǎn)葡萄糖糖漿，d.植物油脫膠，或e.修飾磷脂乳化劑組成的組。全文摘要本發(fā)明涉及新鑒定的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含編碼新穎的脂肪酶LIP01-LIP03的基因。LIP01酶可分離自Magnaporthegrisae，LIP02和LIP03可以通過突變編碼LIP01的多核苷酸序列獲得。本發(fā)明描述了新穎基因的全長編碼序列(其適用于在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá))，以及全長功能蛋白質(zhì)的氨基酸序列和基因或氨基酸序列的功能等同物。本發(fā)明還涉及在工業(yè)工藝(例如在烘焙工業(yè)、植物油脫膠、生產(chǎn)或修飾食物乳化劑和從小麥麩質(zhì)生產(chǎn)葡萄糖)中使用這些蛋白質(zhì)的方法。文檔編號C07K14/37GK101389644SQ200780006670公開日2009年3月18日申請日期2007年2月22日優(yōu)先權(quán)日2006年2月23日發(fā)明者瑪格特·伊麗莎白·弗蘭克希斯·休恩瓦爾德-貝格曼斯,簡·米特斯卡·拉恩·凡·德申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司