專利名稱：：提取rna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于捕獲和提取核糖核酸(特別是來自生物來源材料的核糖核酸)的簡化方法的材料。
背景技術(shù)：
：應(yīng)用到臨床研究、臨床診斷測試和藥物開發(fā)中的現(xiàn)代分子生物學(xué)方法越來越多地利用了核糖核酸(RNA)的研究。RNA以信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運RNA(tRNA)和核糖體RNA(rRNA)的形式存在。一些現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)例如Northern印跡、核糖核酸酶保護測定和RT-PCR需要在分析之前分離純的未降解的RNA。對特定mRNA序列的存在性以及mRNA表達(dá)水平的研究已經(jīng)大量應(yīng)用。分析mRNA(尤其是使用微陣列)是分子生物學(xué)研究中的有力工具。通過測定樣品中mRNA序列的水平可以確定單個基因的上調(diào)或下調(diào)。mRNA水平可以作為外部刺激或疾病狀態(tài)的函數(shù)而被評估。例如，p53mRNA水平的變化與多種細(xì)胞類型的癌癥正相關(guān)。另外，許多對人類健康有重大影響的病毒(包括HIV、HCV、西尼羅河病毒、馬腦炎病毒和埃博拉病毒)具有RNA基因組。從體液或組織中快速且清潔地提取病毒RNA的能力對于病毒學(xué)研究和傳染病診斷及治療是重要的。當(dāng)前提取RNA的方法從多種方法之一開始，以破壞或裂解細(xì)胞、釋放RNA進入溶液以及防止RNA被內(nèi)源RNA酶降解。裂解將RNA與DNA和蛋白質(zhì)一道釋放出來，然后必須再從中分離RNA。之后，處理所述RNA以將其溶解或沉淀。Chirgwin等，Biochem，！￡，5294-5299(1979)公開了使用離液胍鹽以同時裂解細(xì)胞、溶解RNA和抑制RNA酶。另一些方法通過在低pH下用苯酚/氯仿提取將溶解的RNA與蛋白質(zhì)和DNA相分離(D.M.Wallace,Meth.Enzym.，if,33-41(1987))。常用的一步法RNA分離包括依次用4M胍鹽、醋酸鈉(pH4)、苯酚和氯仿/異戊醇處理細(xì)胞。將樣品離心，通過加入乙醇將RNA從上層中沉淀出來(P.Chomczynski,Anal.Biochem.,162，156-159(1987))。美國專利4，843，155描述了一種方法，其中將酸性pH下的苯酚和胍鹽穩(wěn)定混合物加入到細(xì)胞。在使用氯仿進行相分離之后，通過用乙醇沉淀回收水相中的RNA。另一些方法包括將熱苯酚加入到細(xì)胞混懸液中，然后進行乙醇沉淀(T.Maniatis等，MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory(1982));使用陰離子或非離子表面活性劑以裂解細(xì)胞并釋放細(xì)胞質(zhì)RNA;以及使用RNA酶抑制劑例如氧釩核糖核普復(fù)合物(vanadylribosidecomplex)和焦碳酸二乙酯(L.G.Davis等,"GuanidineIsothiocyanatePreparationofTotalRNA"和"RNApreparation:MiniMethod"inBasicMethodsinMolecularBiology,Elsevier,NewYork,pp.130-138(1991))'美國專利5,234,809(Boom等)中公開了通過結(jié)合于玻璃或其它固相之上從生物來源中同時分離DNA和RNA的技術(shù)。通過暴露于含EDTA和表面活性劑TritonX-100的TrisHCl(pH8.0)中的強(>5M)硫氰酸胍溶液來裂解生物來源(例如血清或尿)中的細(xì)胞。通過與硅藻土或二氧化硅顆粒(其與DNA和RNA形成可逆的復(fù)合物)一起孵育從生物材料中純化DNA和RNA。Gillespie的美國專利5,155,018提供了從生物來源中分離和純化生物活性RNA的方法，所述生物來源還可以包括DNA、蛋白質(zhì)、碳水化合物和其它細(xì)胞物質(zhì)。通過在包含濃的酸性離液鹽的結(jié)合溶液存在下使生物來源接觸玻璃細(xì)粉或硅藻土來分離RNA。在這些條件下，其聲稱RNA選擇性地結(jié)合顆?；墓璨牧?，但是還公開了用乙醇鹽溶液處理固體物質(zhì)以除去DNA。其它研究人員后來的工作證實了確實有DNA污染。結(jié)合到所述顆粒的RNA很容易與樣本中所含的其它生物物質(zhì)相分離。優(yōu)選地，清洗與顆粒結(jié)合的RNA以除去非特異性吸附的物質(zhì)。通過用稀的鹽緩沖液洗脫來釋放結(jié)合的RNA，從而回收基本純的生物活性RNA。還公開了加入核酸酶以除去洗脫液中的DNA，這帶來了對選擇性結(jié)合RNA的權(quán)利要求的進一步質(zhì)疑。Kuroita等的US5，990，302給出了Gillespie方法的變型，其通過將樣品、離液劑、鋰鹽、酸溶液和核酸載體合并來分離RNA。Ekenberg的US6,218,531提供了另一種改進，其中將含有RNA和雜質(zhì)的溶液與稀釋緩沖液混合以形成澄清的裂解液，然后將RNA與二氧化硅固相結(jié)合。通過沉淀DNA和蛋白質(zhì)使之澄清。所述稀釋緩沖液可以是水，但更優(yōu)選是具有中性pH的緩沖液例如SSC,其中含有鹽并且更優(yōu)選含有去污劑例如SDS。美國專利5,010,183和5，985，572描述了帶一價電荷的單體陽離子表面活性劑裂解細(xì)胞并將RNA和DNA從溶液中同時沉淀下來的能力。在這些專利中，首先使RNA為不可溶的。在，183專利的方法中，季銨表面活性劑和40%尿素以及其它添加劑的溶液被加入到細(xì)胞混懸液中，將混合物離心。沉淀重懸于乙醇中，通過加入鹽使核酸從其中沉淀下來。Michelsen等的U.S.6，355，792公開了以下分離核酸的方法，即用pH小于6.5的緩沖液酸化液體樣品，將所酸化的溶液與帶羥基的無機氧化物材料接觸，將結(jié)合有核酸的固相材料與液體分離，以及用pH在7.5至11(優(yōu)選8-8.5)的堿性溶液洗脫。酸性溶液不含離子型去污劑，離液劑和任何離子〈0.2M。已經(jīng)完成的實例反映出，所述方法的使用具有下述前提，即核酸在被捕獲之前已經(jīng)釋放到溶液中。WO00/66783和EP1206571B1公開了分離樣品中游離的細(xì)胞外核酸的方法，即通過使懷疑含有核酸的樣品在pH小于7的條件下接觸水溶性的弱堿性聚合物使得弱堿性聚合物與樣品中所有核酸形成水不溶性沉淀，將水不溶性沉淀與樣品分離，以及將所述沉淀與堿接觸以提高溶液的pH至高于7，由此從弱堿性聚合物中釋放核酸。所述聚合物含有在酸性pH下質(zhì)子化但是通過升高pH可被中和的氨基。Backus等的US5,582，988和EP0707077Bl公開了提供了來自裂解物的核酸的方法，其包括以下步驟在小于7的pH條件下，使懷疑含有核酸的裂解物與足量的水溶性弱堿性聚合物接觸使得所述弱堿性聚合物與所述裂解物中的核酸形成水不溶性沉淀，從所述裂解物中分離所述水不溶性沉淀，將所述沉淀與堿接觸以提高溶液pH至大于7，由此從所述弱堿性聚合物中釋放所述核酸。Heath的US5,973,137公開了從生物樣品中分離基本未降解的RNA的方法，即使用由陰離子去污劑、螯合劑和pH小于6的緩沖溶液組成的細(xì)胞裂解試劑處理樣品。所述陰離子去污劑的作用據(jù)信是裂解細(xì)胞和/或溶解蛋白質(zhì)和脂類以及使蛋白質(zhì)變性。當(dāng)用于從全血中分離RNA時，首先用含NH4C1、NaHC03和EDTA的試劑裂解紅細(xì)胞，分離白細(xì)胞以及在蛋白質(zhì)-DNA沉淀試劑存在下獨立地裂解白細(xì)胞。所述沉淀試劑通常是高濃度的鈉鹽或鉀鹽(例如醋酸鹽或鹽酸鹽)。最后的步驟是通過加入低級醇使含RNA的上清沉淀。從酵母和革蘭氏陽性菌中分離RNA需要另外使用裂解酶、甘油和氯化鉤以消化制備物中的細(xì)胞從而釋放核Collis的US5,973,1387>開了用于4吏核酸與酸性溶液中順磁顆?；鞈乙嚎赡嫘越Y(jié)合。此方法中所公開的顆粒是棵露的鐵氧化物、鐵硫化物或鐵氯化物。所述酸性溶液被認(rèn)為增強所述顆粒鐵部分的正電性，由此促進核酸的負(fù)電磷酸基團的結(jié)合。相關(guān)美國專利6,433,160公開了相似的方法，其中所述酸性溶液含有鹽酸甘氨酸。Bhikhabhai的U.S.6,410,274公開了通過在不溶性基質(zhì)上進行分離來純化質(zhì)粒DNA的方法，其包括a)裂解細(xì)胞；b)用二價金屬離子沉淀大多數(shù)DNA和RNA;c)除去所述沉淀；d)用陰離子交換樹脂純化所述裂解液(使用pH4-6的酸性緩沖液，然后使用更為堿性的緩沖液)；和e)進一步用第二離子交換樹脂純化所述質(zhì)粒。Cros等的US6,737,235公開了使用包含或包被了含陽離子基團的親水交聯(lián)聚丙烯酰胺聚合物的顆粒來分離核酸的方法。通過所述聚合物上胺基在低pH下的質(zhì)子化形成陽離子基團。在低離子強度緩沖液中低pH條件下結(jié)合核酸，在更高離子強度緩沖液中釋放。所述聚合物必須具有25-45lC的較低臨界溶解溫度。堿性pH和較高溫度也促進解吸附。Simms的U.S.6,875，857公開了從植物材料中分離RNA的方法和試劑，其使用了包含非離子表面活性劑IGEPAL、EDTA、陰離子表面活性劑SDS和高濃度2-巰基乙醇的試劑組合物。Sprenger-Haussels的US7,005,2667>開了用于從含核酸加工酶抑制劑的樣品(例如糞便)中純化、穩(wěn)定或分離核酸的方法，其通過勻漿樣品，然后用pH2-7、鹽濃度〉100mM并且含苯酚中和物質(zhì)(例如聚乙烯吡咯烷酮)并任選地含有去污劑和螯合劑的溶液處理所勻漿樣品以形成裂解物。然后在基于二氧化硅的常規(guī)固相材料上處理所述裂解物。例如US6，270，970、6,310,199、US5，652,348、US5，945，520、WO96/09116、WO99/029703、EP1234832A3、EP1036082B1、U.S.專利申請7〉開2001/0018513、2003/0008320和2003/0054395等的一些專利和申請公開了將核酸可逆地捕獲到結(jié)合材料上，其是由結(jié)合和洗脫緩沖液之間pH變化改變結(jié)合材料上胺基的質(zhì)子化狀態(tài)來介導(dǎo)的。類似的，Bayer4"的US6,447,764公開了從含水系統(tǒng)中分離陰離子有機物質(zhì)(包括核酸)的方法，這是通過可逆地結(jié)合陽離子質(zhì)子化形式的非交聯(lián)聚合物納米顆粒，將它們從介質(zhì)中分離以及提高pH使所述顆粒去質(zhì)子化以釋放所述陰離子有機物質(zhì)來實現(xiàn)的。Kausch等的U.S.5,665,582>開了可逆地將生物材料錨定到固體支持物上的方法，其包括將可逆聚合物置于固體支持物上，將可逆接頭連接到所述聚合物，以及使用結(jié)合組合物將生物材料連接到可逆接頭，所述結(jié)合組合物包含核酸、抗體、抗獨特型抗體或蛋白A，以使得所述生物材料可逆地錨定到固體支持物上，其中所述生物材料可以是核酸。Burgoyne的US5,756,126公開了用于保存遺傳材料樣品的干燥固體介質(zhì)，所述介質(zhì)包含固體基質(zhì)和吸附到所述基質(zhì)的組合物，所述組合物包含弱堿、螯合劑和陰離子去污劑。Fomovskaia等的US6，746，841^>開了純化核酸的方法，其中一部分包括提供了包含由用于細(xì)胞裂解的陰離子表面活性劑所包被的固體基質(zhì)的干燥基底，將樣品施加到所述基底以及捕獲核酸。捕獲RNA的用途并未具體公開或舉例說明。Hollander等的US20040014703公開了在酸性pH下用含季銨或季鱗鹽化合物和質(zhì)子供體(例如有機羧酸、硫酸銨或磷酸鹽)的組合物穩(wěn)定RNA。GB2419594A1公開了用氨基表面活性劑以及任選地用非離子表面活性劑穩(wěn)定核酸。Augello的美國專利6,602,718、6,617,170和6,821,789和美國專利申請公開2005/0153292公開了通過抑制或阻斷基因誘導(dǎo)或核酸降解來保存生物樣品(例如全血)和保存RNA和/或DNA的方法。所述基因誘導(dǎo)阻斷劑可包含穩(wěn)定劑和酸性物質(zhì)。陽離子去污劑是優(yōu)選的穩(wěn)定劑。后者裂解細(xì)胞并造成核酸作為與所述去污劑的復(fù)合物而沉淀。US6,916，608B2公開了穩(wěn)定核酸的方法和組合物，其包含與二甲亞砜相混合的醇和/或酮。美國專利6,204,375和6,528,641公開了穩(wěn)定細(xì)胞RNA成分的方法，其通過將例如pH4-8的硫酸銨鹽溶液加入到細(xì)胞來進行。所述鹽溶液使細(xì)胞透化，造成RNA與細(xì)胞蛋白質(zhì)一起沉淀，使得RNA不能接近可能分離RNA的上述方法麻煩的多步驟特征使得RNA在臨床實踐中的應(yīng)用復(fù)雜化。方法必須克服在RNA被核酸酶(例如RNA酶)降解之前將RNA與細(xì)胞中的蛋白質(zhì)和DNA分離開來的困難。這些核酸酶存在于血液中，其量足以快速破壞未保護的RNA。因此，從細(xì)胞分離RNA的成功方法必須能夠阻止RNA酶的降解。本領(lǐng)域中仍然需要快速簡便地從生物樣品中提取RNA的方法。這些方法將使RNA的水解和降解最小化，使得其可用于多種分析和下游過程。共同擁有的美國專利申請公開2005/0106576、2005/0106577、2005/0106589、2005/0106602、2005/0136477和2006/0234251公開了用于從生物材料中提取核酸(包括RNA)的材料和方法。所述方法依賴于用于破壞細(xì)胞或病毒的獨特類型的固體材料，并且不需要進行化學(xué)裂解處理。
發(fā)明內(nèi)容在一個方面，本發(fā)明提供了快速簡便地從生物樣品中提取和分離RNA的新方法，其包括使用酸性溶液和固相結(jié)合材料。實施本發(fā)明中的情況下從生物樣品中釋放核酸的能力。所述固相結(jié)合材料可以包含季銨基團、季鱗基團或叔锍基團。在另一個方面，本發(fā)明提供了從生物樣品中提取和/或純化RNA的方法，其包括使用酸性溶液和具有基質(zhì)部分和絲基并且另外還包含連接基質(zhì)部分和総基的可切割接頭的固相結(jié)合材料，所述鎗基選自季銨基團、季鱗基團或叔锍基團。發(fā)明詳述定義烷基含有l(wèi)-20個碳的支鏈、直鏈或者環(huán)狀的烴基，所述烴基可以被1個或更多個除氫之外的取代基所取代。本文中所使用的低級烷基指含有可多達(dá)8個碳的烷基。芳烷基用芳基取代的烷基。芳基含有l(wèi)-5個碳環(huán)芳香環(huán)的含芳香環(huán)基團，其可被l個或更多個除氫之外的取代基所取代。生物材料包括全血、抗凝全血、血漿、血清、組織、細(xì)胞、細(xì)胞成分和病毒。細(xì)胞材料完整細(xì)胞或包含動物、植物或細(xì)菌來源的完整細(xì)胞的材料(包括組織)。細(xì)胞可以是完整的活性代謝細(xì)胞、凋亡細(xì)胞或死細(xì)胞。細(xì)胞核酸成分指細(xì)胞材料內(nèi)的核酸，其可以是基因組DNA和RNA以及其它核酸，例如來自傳染性物質(zhì)(例如病毒和質(zhì)粒)的核酸。磁性顆粒對外部磁場有響應(yīng)的顆粒、微顆?；蛑樽?。所述顆粒自身可以具有磁性、順磁性或超順磁性。當(dāng)使用超順磁或鐵磁材料時它可被外部磁體或施加的磁場所吸引。顆粒可以具有固體核心部分，所述核心部分是磁響應(yīng)的并且被一個或多個非磁響應(yīng)層所包圍。作為替代，所述磁響應(yīng)部分可以是圍繞于非磁響應(yīng)核心的層或者可以是安置于非磁響應(yīng)核心之中的顆粒。核酸多核普酸可以是DNA、RNA或合成的DNA類似物例如PNA。這三種鏈類型中任何類型的單鏈化合物和雙鏈雜合物也包含在此術(shù)語的范圍內(nèi)。釋放、洗脫通過與溶液或組合物相接觸以移除絕大部分結(jié)合在固相材料表面或孔的材料。RNA:包括但不限于信4吏RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運RNA(tRNA)和核糖體RNA(rRNA)。樣品含有或者懷疑含有核酸的液體?？捎糜诒景l(fā)明方法的典型樣品包括體液，例如血液(其可以是如通常在收集血液樣品中發(fā)現(xiàn)的抗凝血)、血漿、血清、尿、精液、唾液、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織提取物等。其它類型的樣品包括溶劑、海水、工業(yè)水樣、食物樣品和環(huán)境樣品(例如土壤或水)、植物材料、真核生物、細(xì)菌、質(zhì)粒和病毒、真菌、以及來自原核生物的細(xì)胞。固相材料具有可吸引核酸分子之表面的材料。材料的形式可以是顆粒、微顆粒、納米顆粒、纖維、珠子、膜、濾器(filter)和其它支持物(例如試管和微孔)。取代指基團上的至少一個氫原子被非氫基團所替代。應(yīng)注意，關(guān)于取代基，除非另有明確指出，其意為可以存在多點取代。本發(fā)明涉及用于從生物樣品中快速簡便地獲得RNA的方法。所述方法使用了固相結(jié)合材料和酸性溶液，RNA從樣品中所含核酸來源釋放出來而進入所述酸性溶液中。選擇具有在不首先實施任何預(yù)裂解以破壞細(xì)胞或病毒的情況下直接從生物樣品釋放RNA能力的所述固相結(jié)合材料。通過固相作用直接釋放RNA進入酸性環(huán)境和隨后在酸性條件下將釋放的RNA捕獲至所述固相使得降解最小化。另外，申請人發(fā)現(xiàn)有可能從具有RNA酶活性的樣品中回收核糖核酸而不需要依靠加入RNA酶失活化合物或蛋白質(zhì)，例如胍鹽、高濃度離液劑或RNA酶抑制蛋白和抗體。實際上所述方法可用于從蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物、完整細(xì)胞和病毒中捕獲和提取RNA?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明的方法從任何含有核酸的生物樣品(特別是完整細(xì)胞和病毒)中提取RNA。這些材料的常見來源包括但不限于細(xì)菌培養(yǎng)物或沉淀、血液、尿、細(xì)胞、體液(例如尿、痰、精液、CSF、血液、血漿和血清)或者來自組織勻漿物。本發(fā)明的方法可以在不需要使它們經(jīng)受其它預(yù)先步驟的情況下應(yīng)用到包括下列的樣品活的、死的或凋亡的完整細(xì)胞和組織，或者培養(yǎng)的細(xì)菌、植物或動物細(xì)胞系。特別地，完全不需要使用任何預(yù)破壞或裂解。從混懸液(即來自生物流體或細(xì)胞培養(yǎng)物)中的細(xì)胞里提取RNA可以從例如低速離心沉淀細(xì)胞和棄去培養(yǎng)基開始。使用本領(lǐng)域公知的組織破壞法可以從完整組織或器官中提取RNA，所述方法例如通過使用手動勻漿器或自動勻漿器(例如Waring攪拌器)或其它組織勻漿器進行勻漿。所述勻漿物可以通過粗濾器(例如粗棉布)以除去大塊物質(zhì)或者可在低速下離心制備物以分離顆粒材料。本發(fā)明方法是快速的，通常僅需要數(shù)分鐘就可完成。重要的是，本方法所得的RNA具有足夠的純度使得它可用于臨床或其它下游應(yīng)用，例如用于逆轉(zhuǎn)錄酶自身或接著進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增(RT-PCR)，RNA印跡分析和體外翻譯。有利地，在使用本方法之前不需要分離細(xì)胞，僅僅需要簡單的設(shè)備以實施本方法。在根據(jù)本發(fā)明方法處理樣品之前不需要預(yù)先的裂解或乙醇沉淀步驟。不需要也不使用用于裂解細(xì)胞或病毒的去污劑或離液物質(zhì)。在本發(fā)明的一個實施方案中，含有RNA的所選生物樣品(例如含細(xì)胞和/或病毒的液體)與酸性溶液簡單混合以形成混合物。所述樣品和混合物僅僅需要在混合物中相接觸短短數(shù)秒鐘。不需要進行其它的處理。在所述混合物形成的同時或之后，所述混合物與固相結(jié)合材料合并，選擇這樣的固相結(jié)合材料，其具有在不首先實施任何預(yù)裂解以破壞細(xì)胞或病毒的情況下直接從生物樣品釋放RNA的能力。通過所述顆粒的作用直接釋放RNA進入酸性環(huán)境和隨后在酸性條件下將釋放的RNA快速捕獲至這些顆粒使得降解最小化。除去上清，以及任選地用一種或多種清洗緩沖液清洗含有核酸的固相。如果需要，可接著洗脫所述固相以從固相解離RNA。在一個實施方案中，使用堿性溶液從所述固相或顆粒洗脫RNA。通常，用于此目的的堿的理想濃度是至少1(T4M,優(yōu)選約lmM至約1M。在另一個實施方案中，如果需要，本發(fā)明的方法可通過任選地使用RNA酶抑制劑(例如金精三羧酸(aurintricarboxylicacid)、DTT或DEPC)來實施。本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇其它的RNA酶抑制劑來用于此目的。所有的所述步驟可在單個容器中或單個支持物上快速連續(xù)進行，而不需要專門的設(shè)備(例如離心機)。所述方法可改造用于以串行或并行方式處理大量樣品的自動平臺。所有結(jié)合和清洗步驟優(yōu)選在短時間內(nèi)完成，優(yōu)選不超過l分鐘。清洗步驟可優(yōu)選在10秒鐘內(nèi)進行。洗脫優(yōu)選在不超過1分鐘內(nèi)進行。在一個示例性方案中，含有RNA來源的100微升樣品在1.5毫升微量離心管中與100微升酸性溶液混合，通過渦旋短暫混合。然后加入在酸性溶液中的磁性結(jié)合微顆粒，將混合物渦旋混勻30秒。在磁力臺上將上清與所述顆粒分離。用200微升酸性溶液清洗顆粒兩次，用200微升水清洗兩次。將清洗后的顆粒在堿性洗脫液中渦旋混勻1分鐘，以洗脫RNA。固相材料在一個實施方案中，本發(fā)明的RNA提取方法使用固相結(jié)合材料以快速結(jié)合RNA,由此允許RNA與其它樣品成分相分離。選擇具有在不首先實施任何預(yù)裂解以破壞細(xì)胞或病毒的情況下直接從生物樣品釋放核酸的能力的固相結(jié)合材料。在本發(fā)明方法中用于結(jié)合核酸的材料包含確定其尺寸、形狀、孔隙率和機喊性能的基質(zhì)。所述_^質(zhì)的形式可以^1顆粒、微顆粒、纖維、珠子、膜和其它支持物(例如試管和微孔)。多種具體材料和其制備描述于申請人的共同未決美國專利申請公開2005/0106576、2005/0106577、2005/0106589、2005/0106602、2005/0136477和2006/0234251。在一個實施方案中，所述材料還包含處于表面或其附近的共價連接的核酸結(jié)合部分，其允許捕獲和結(jié)合不同長度的核酸分子。表面不僅僅指固相材料的外周，還指固相材料內(nèi)任何可接近孔洞區(qū)的表面。在另一個實施方案中，所述材料還包含處于表面或其附近的非共價連接的核酸結(jié)合部分，其允許捕獲和結(jié)合不同長度的核酸分子。所述非共價連接的核酸結(jié)合部分通過與表面上帶相反電荷殘基的靜電引力與所述固體基質(zhì)相連，或者通過疏水引力與所W面相連。這些帶有共價或非共價連接之核酸結(jié)合基團的材料的基質(zhì)可以是任何適宜的物質(zhì)。優(yōu)選的基質(zhì)材料選自二氧化硅、玻璃、不溶性合成聚合物、不溶性多糖和金屬材料以及用二氧化硅、玻璃、合成聚合物或不溶性多糖包被的磁響應(yīng)材料，所述金屬材料選自金屬、金屬氧化物和金屬硫化物。示例性材料包括由共價相連的表面官能團包被或官能化的基于二氧化硅的材料，所述官能團用于破壞細(xì)胞和吸引核酸。還可以包括合適的表面官能化的基于碳7K化合物的材料和具有此表面官能性的聚合物材料。用作核酸結(jié)合基團的表面官能團包括能夠破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性以及使核酸吸引到固體支持物的任何基團。這樣的基團包括但不限于下文描述的羥基、硅烷醇基、羧基、氨基、銨、季銨和季鱗鹽和叔锍鹽類型的材料。其中，具有季銨、季鱗或叔锍鹽基團的材料是優(yōu)選的。對于許多應(yīng)用來說，優(yōu)選所述固體材料是顆粒的形式。優(yōu)選地，所述顆粒尺寸小于約50微米，更優(yōu)選小于約10微米。小顆粒更易于分散在溶液中，具有更高的表面積/體積比。較大的顆粒和珠子也可用于使用重力沉淀或離心的方法中。兩種或多種不同尺寸顆粒的混合物在一些應(yīng)用中可以是優(yōu)選的。優(yōu)選地所述固相還可包含磁響應(yīng)部分，其通常是順磁或超順磁微顆粒的形式。所述磁響應(yīng)部分允許借助磁場吸引和操縱。這樣的磁性微顆粒通常包含磁性金屬氧化物或金屬硫化物核心，所述核心通常被吸附或共價結(jié)合的層所圍繞以保護磁性成分。核酸結(jié)合基團可以與此層共價結(jié)合，由此包被所述表面。所述磁性金屬氧化物核心優(yōu)選是鐵氧化物或鐵硫化物，其中鐵是F^+或Fe"或二者皆有。包裹在有機聚合物層內(nèi)的磁性顆粒已經(jīng)7厶開，例如見美國專利4,654,267、5,411,730和5，091，206中和出版物(TetrahedronLett"40(1999)，8137-8140)中。具有多種不同類型殼的包被磁性顆粒有商業(yè)供應(yīng)。如美國專利申請公開2005/0106576、2005/0106577、2005/0106589、2005/0106602、2005/0136477和2006/0234251中所教導(dǎo)的，所述殼可以被官能化。商品磁性二氧化硅或磁性聚合物顆?？捎米髦苽淇捎糜诒景l(fā)明的磁性固相結(jié)合材料的起始材料。合適類型的具有表面羧基的聚合物顆粒已知有商品名為SeraMagiM(Seradyn)和BioMag(PolysciencesandBangsLaboratories)。合適類型的二氧化珪磁性顆粒已知有商品名為MagneSilTM(Promega)。ChemicellGmbH(Berlin)提供表面具有羧基或氨基的二氧化硅磁性顆粒。在一個末端含有三烷氧基硅烷基團的接頭基團可以連接到金屬材料或者包被的金屬材料的表面，所述包的被金屬材料例如是包被二氧化硅或玻璃的磁性顆粒。優(yōu)選的三烷氧基硅烷化合物具有下式R、Si(OR)3，其中R是低級烷基，W是選自直鏈、支鏈和環(huán)的有機基團并包含1-100個原子。所述原子優(yōu)選地選自C、H、B、N、O、S、Si、P、鹵素和堿金屬。代表性Ri基團是3-氨基丙基、2-氰乙基和2-羧乙基以及如下文更充分描述的含有可切割部分的基團。在一個優(yōu)選實施方案中，三烷氧硅烷基化合物包含可切割中央部分和活性基團末端部分，其中所述反應(yīng)性基團可以通過與叔胺、叔膦或有機硫的反應(yīng)而一步轉(zhuǎn)變?yōu)榧炬j鹽或叔鎗鹽。已發(fā)現(xiàn)可以在使用氟離子的過程中將這樣的接頭基團安置在金屬顆粒以及包被玻璃或二氧化珪的金屬顆粒的表面。所述反應(yīng)可以在有機溶劑中進行，所述溶劑包括低級醇和芳香族溶劑(包括甲苯)。合適的氟來源在這些有機溶劑中有較好的溶解性，所述氟來源包括氟化銫和氟化四烷基銨鹽。在可用于本發(fā)明方法的一些固相結(jié)合材料中所含的核酸結(jié)合(nucleicacidbinding,NAB)基團可用作雙重目的。NAB基團吸引和結(jié)合具有各種長度以及堿基組成或序列的核酸、多核普酸和寡核苷酸。它們還可具有一定的從細(xì)胞包膜中釋放核酸的能力。核酸結(jié)合基團包括例如，羧基、胺和季鎗或叔鎗基團或者多于一種這些基團的混合物。胺基可以是NH"烷基胺和二烷基胺。優(yōu)選的核酸結(jié)合基團是季鎗或叔鎗基團(-QR/或-QR3+)，其包括三烷基季銨基團(-NR3+)、季鱗基(-PR3+)，其包括三烷基鱗或三芳基鱗或者混合烷基芳基鱗基團，以及叔锍基(-SR2+)。所述固相可含有多于一種的本文所述核酸結(jié)合基團。可使用多于一種尺寸的顆粒的混合物。還可以使用上述固相結(jié)合材料與多種其它具有或不具有NAB基團的固相結(jié)合材料的混合物。也可使用含有季鎗或叔鎗基團(-<3112+或-0113+)的固相材料，其中R基是至少4個碳原子的烷基，其尤其可有效結(jié)合核酸，但是也可使用少至一個碳原子的烷基以及芳基。這些固相材料以很高強度保持結(jié)合的核酸，在現(xiàn)有技術(shù)已知的大多數(shù)洗脫條件下抵抗對所述核酸的移除或洗脫。低離子強度和高離子強度的大多數(shù)已知洗脫條件對于移除所結(jié)合的核酸是無效的。與含DEAE和PEI基團的常規(guī)陰離子交換樹脂不同，不論反應(yīng)介質(zhì)的pH如何，季錄或叔総固相材料都保持帶正電。優(yōu)選實施方案使用這樣的固相結(jié)合材料，其中所述核酸結(jié)合基團通過可選擇性切割的連接鍵與所述基質(zhì)相連。切斷所述連接鍵有效地將任何結(jié)合核酸與固相"斷開"?？梢酝ㄟ^任何化學(xué)、酶、光化學(xué)或其它特異性切斷可切割接頭中的鍵但是不破壞目的核酸的方法切斷所述連接鍵。這些可切割固相材料包含固體支持物部分，其包含如上所述的基質(zhì)。用于吸引和結(jié)合核酸的核酸結(jié)合(NAB)部分通過可切割接頭部分與所述固體支持物的表面相連。美國專利申請公開2005/0106576、2005/0106577、2005/0106602、2005/0136477和2006/0234251描述了具有可切割連接鍵的合適材料，其中公開內(nèi)容通過參考并入本文。效狀態(tài)，片狀物料沿第二傳送方向越過轉(zhuǎn)轍器傳送，從而僅在第一轉(zhuǎn)向邊發(fā)生一次轉(zhuǎn)向例如卯。。反之，在有效狀態(tài)轉(zhuǎn)轍器將片狀物料引向第二轉(zhuǎn)向邊，以及它在第二轉(zhuǎn)向邊例如再次完成轉(zhuǎn)向卯。，從而可以借助轉(zhuǎn)轍器將總的轉(zhuǎn)向調(diào)整為90°或180°。為此目的，第二傳送面在設(shè)在轉(zhuǎn)轍器下游的區(qū)域內(nèi)有兩個重疊段，它們中的第一段導(dǎo)向第二轉(zhuǎn)向邊。因此，當(dāng)轉(zhuǎn)轍器起作用時，片狀物料在第一段上面?zhèn)魉?。若反之轉(zhuǎn)轍器不起作用，則片狀物料在轉(zhuǎn)轍器和第二段上面不改變傳送方向地繼續(xù)傳送。然而，在轉(zhuǎn)轍器上面繼續(xù)傳送的片狀物料，也可以在第一傳送面末端通過第三直線狀轉(zhuǎn)向邊以與針對第二轉(zhuǎn)向邊已說明的類似的方式轉(zhuǎn)向。在這種情況下優(yōu)選地，第三轉(zhuǎn)向邊的傾斜角|33與第二轉(zhuǎn)向邊的傾斜角(32—致，從而使繞第二與繞第三轉(zhuǎn)向邊轉(zhuǎn)向后的片狀物料的傳送方向一致，但平行移動。以此方式，沿一個傳送段傳送的片狀物料可以分配到兩個傳送段上，它們優(yōu)選地可以互相平行并尤其平行于第一傳送段布置，以及在轉(zhuǎn)向邊的寬度選才奪為一致時處于一個7>共的傳送面內(nèi)。以相應(yīng)的方式，第二傳送面可以沿第二傳送方向進一步延長，并具有附加的轉(zhuǎn)轍器及轉(zhuǎn)向邊，以便能根據(jù)轉(zhuǎn)轍器或轉(zhuǎn)向邊的數(shù)量控制另一些傳送于排出片狀物料的傳送段的設(shè)備，特別適用于前言說明的片狀物料處理設(shè)備，其中并列地布置有多個輸出窗口。以相應(yīng)的方式，第二傳送面也可以沿第二傳送方向的反向延長并集成另—些"第一"轉(zhuǎn)向邊，以便將片狀物料從多個"第一"傳送段引向第二傳送面。當(dāng)前述包括一個輸入傳送段和多個排出傳送段的設(shè)備沿相反的傳送方向運行時，也產(chǎn)生同樣的效果。至此主要只說明了轉(zhuǎn)向設(shè)備的導(dǎo)向體。此外轉(zhuǎn)向設(shè)備還相宜地包括傳送裝置，用于沿至少各個傳送面主動傳送片狀物料。優(yōu)選地采用這種傳送裝置，即，使片狀物料在借助它傳送時與傳送面保持接觸，尤其壓靠在傳送面上。由此可以取消集成在導(dǎo)向體或轉(zhuǎn)向板中的傳送機構(gòu)。片狀物料可例如沿各個傳送面借助一條或多條傳送帶和/或一個或多個傳送輥運動。在這里建議，為了沿第二傳送面和繞至少一個轉(zhuǎn)向邊，亦即例具有可切割接頭基團的另一類固相材料具有烯酮二硫縮醛(ketenedithioacetal)作為可切割部分，如美國專利6，858，733和6,872,828所公開的。通過過氧化物酶和過氧化氳的酶促氧化，烯酮二硫縮醛經(jīng)歷雙鍵的氧化性切割。過氧化物酶過氧化物^RaSH所述可切割部分可以具有所示結(jié)構(gòu)，包括在吖啶(acridan)環(huán)上具有取代的類似物，其中R"Rb和Rc都是有機基團，其各自含有l(wèi)至約50個選自C、N、O、S、P、Si和鹵素的非氫原子，其中Ra和Rb可以相連接形成環(huán)。多種其它可切割基團對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。另一組具有可切割接頭基團的固相材料具有可光切割的接頭基團，例如硝基取代的芳香醚和酯。根據(jù)公知反應(yīng)，鄰硝基節(jié)酯被紫外光切割。酸性溶液用于本發(fā)明方法的酸性溶液一般包括具有低于中性pH的任何水溶液，優(yōu)選所述溶液具有l(wèi)-5范圍內(nèi)的pH，更優(yōu)選約2-4。所述酸可以4_有機或無機酸?？梢允褂脽o機酸例如鹽酸、硫酸和高氯酸?？墒褂冒▎昔人?、二羧酸、三羧酸和Jl&酸的有機酸，以及所述酸的鹽。代表性酸包括曱酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸以及檸檬酸、甘氨酸和丙氨酸。鹽可以具有任何水溶性反離子，優(yōu)選堿金屬或堿土金屬離子。包含過渡金屬鹽的酸性溶液也可用于實施本發(fā)明。優(yōu)選的過渡金屬包括Fe、Mn、Co、Cu和Zn鹽。不像通過化學(xué)裂解提取RNA的其它方法，本方法中所用的酸性溶液不含去污劑或化學(xué)裂解劑例如離液物質(zhì)(如胍鹽)。沒有使用用于任意這些功用的有機溶劑，例如DMF或DMSO。在不存在其它可溶性添加劑的情況下，所述酸性介質(zhì)和所述固相結(jié)合材料的組合足以允許從樣品中提取完整的RNA，甚至是含有RNA酶的樣品也是如此。可以將所述樣品和所述酸性溶液相混合，同時通過在該酸性溶液中提供固相而將混合物與所述固相合并。作為替代，所述樣品可以首先與所述酸性溶液混合以形成混合物，然后將所述混合物與所述固相合并。清洗溶液如果使用的話，可用于實施本發(fā)明的清洗溶液可以有助于從結(jié)合RNA中除去其它成分。在一個實施方案中，清洗溶液可包含與結(jié)合步驟所用相同或相似的酸性溶液。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用酸性溶液清洗是有利的，這可能是為了除去殘余的RNA酶活性。使用中性pH的水或緩沖液進一步清洗可用于在洗脫之前中和所述酸。應(yīng)制備或處理水和緩沖液以確保它們不具有RNA酶活性。洗脫試劑在一個實施方案中，通過將所述固相材料與釋放所結(jié)合RNA進入溶液的試劑相接觸來從所述固相中洗脫所結(jié)合RNA。所述溶液應(yīng)溶解并足以保存釋放的RNA。洗脫在釋放溶液中的RNA應(yīng)與下游分子生物學(xué)過程相容。在另一個實施方案中，用于從固相結(jié)合材料上釋放核酸的試劑是通過切割固相結(jié)合材料中存在的可切割接頭基團來起作用。一種優(yōu)選試劑是至少10"M的強堿性水溶液。濃度為至少10"M的堿金屬氫氧化物、氫氧化銨、四烷基氫氧化銨、堿金屬碳酸鹽和堿金屬氧化物的溶液可有效地從所切割固相上快速切割和洗脫RNA。當(dāng)所述可切割基團是二硫(S-S)基團時，洗脫/切割試劑將含有二硫鍵還原劑，例如硫醇(如乙硫醇、巰基乙醇或DTT)。當(dāng)所述可切割基團是過氧(O-O)鍵時，洗脫/切割試劑將含有還原劑，例如硫醇、胺或膦。當(dāng)所述可切割基團可酶促切割時，洗脫/切割試劑將含有合適的酶。酯需要酯酶或水解酶；酰胺或肽鍵需要蛋白酶或肽酶；糖苷基團需要糖苷酶。當(dāng)所述可切割基團是l，2-二氧環(huán)丁烷部分時，可以熱切割所述二氧環(huán)丁烷，洗脫試劑可以是上述的堿性溶液。當(dāng)所述可切割基團是可誘發(fā)的1,2-二氧環(huán)丁烷部分時，洗脫/切割試劑將含有化學(xué)或酶試劑以通過去除保護基團產(chǎn)生不穩(wěn)定氧陰離子來誘導(dǎo)所述基團的切割。當(dāng)所述可切割基團是可轉(zhuǎn)變成不穩(wěn)定1,2-二氧環(huán)丁烷的富電子C-C雙鍵時，洗脫/切割試劑將含有單線態(tài)氧來源(例如光敏染料)。本領(lǐng)域已知與可見光和分子氧反應(yīng)產(chǎn)生氧單線態(tài)激發(fā)態(tài)的這些染料，包括例如孟加拉玫瑰紅(RoseBengal)、伊紅Y(EosinY)、茜素紅S(AlizarinRedS)、剛果紅(CongoRed)和橙G(OrangeG)、熒光素染料、羅丹明染料、赤蘚紅B、葉綠酸三鈉鹽、氯高鐵血紅素鹽、血卟啉、亞甲基藍(lán)、結(jié)晶紫、孔雀石綠(MalachiteGreen)和富勒烯。在另一個實施方案中，用于從固相結(jié)合材料釋放RNA的包含季錄NAB基團的試劑選自申請人的共同未決美國專利申請公開2005/0106589中7>開的組合物。所述釋放步驟可以在室溫下實施，但是可使用任何適宜的溫度。洗脫溫度對于本發(fā)明的分離核酸方法的成功似乎不是關(guān)鍵的。優(yōu)選室溫，但是在一些情況下升高溫度可以增加洗脫速率。本發(fā)明的試劑盒在另一個實施方案中，提供用于實施本發(fā)明方法的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明從樣品中分離核糖核酸的試劑盒包含至少一種固相結(jié)合材料以及酸性溶液，所選的固相結(jié)合材料被選擇成具有在不首先進行任何預(yù)裂解的情況下從生物樣品中直接釋放核酸的能力。所述固相結(jié)合材料包含基質(zhì)，其可以是顆粒、微顆粒、磁性顆粒、纖維、珠子、膜以及其它支持物(例如試管和微孔)的形式。所述基質(zhì)與核酸結(jié)合部分共價或非共價連接，任選地通過可切割接頭。所述核酸結(jié)合部分包含至少一種類型的基團，其選自羧基、NH2、烷基胺、二烷基胺基、季銨基(包括三烷基銨基)、季鱗基(包括三烷基鱗、三芳基鱗或者混合烷基芳基鱗基)以及叔锍基。作為本發(fā)明試劑盒中一種要素的所述酸性溶液一般地包括pH低于中性的任何水溶液。優(yōu)選地，所述溶液具有1-5范圍內(nèi)的pH，更優(yōu)選約2-4。所述酸可以是有機或無機酸。無機酸例如鹽酸、硫酸和高氯酸是可用的。可使用包括單羧酸、二羧酸、三羧酸和氨基酸的有機酸，以及所述酸的鹽。代表性酸包括甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸以及檸檬酸、甘氨酸和丙氨酸。鹽可以具有任何水溶性反離子，優(yōu)選堿金屬或堿土金屬離子。包含過渡金屬鹽的酸性溶液在實施本發(fā)明中也是可用的。優(yōu)選的過渡金屬包括Fe、Mn、Co、Cu和Zn鹽。試劑盒還可以包含洗脫試劑，以及一種或多種任選的清洗緩沖液和其它試劑盒常規(guī)組分，例如使用手冊、實驗方案、緩沖液和稀釋劑。洗脫試劑可以選自強堿性水溶液，例如濃度至少為10"M(優(yōu)選約lmM至約1M)的堿金屬氫氧化物或氫氧化銨溶液；二硫鍵還原劑，例如硫醇(包括乙硫醇、巰基乙醇或DTT);過氧化物還原劑(例如硫醇、胺或膦)以及酶(例如酯酶、水解酶、蛋白酶、肽酶、糖苦酶或過氧化物酶)。在一個實施方案中，其中固相結(jié)合材料含有可切割接頭，例如可通過與單線態(tài)氧來源反應(yīng)而被切割的富電子烯基，所述試劑盒可包含如上所述的光敏染料。實施例1.用于分離RNA的固相材料。合成由三丁基娥NAB基團和可切割芳基硫酯連接鍵官能化的磁性顆粒。a)制備磁鐵。在l小時中將氣氬吹入5升瓶中的3升I型水中。在氬氣下加入濃NBUOH(28%，180毫升)。通過滴液漏斗在約1小時里加入50亳升在1MHC1中的2MFeCh和200亳升在1MHC1中的1MFeCl3的混合物。通過下述步驟將固體收集在兩個燒瓶中，每次以500-600毫升份倒入帶有外部盤狀磁體的燒瓶中，并倒出上清。通過用超聲分散在500-600毫升I型水中然后吸引到磁體并倒出上清來清洗所述固體。重復(fù)所述過程直至上清的pH大約為8.5。合并兩個瓶中的內(nèi)容物使得所述磁鐵以約500亳升的總體積保存。b)將3-曱基氨丙基三曱氧基硅烷(149.8克)加入到500毫升燒瓶中，通入氬氣。將所述燒瓶置于冰浴中之后，用注射器緩慢加入丙烯酰氧基三甲基硅烷(119.6克)。攪拌所述反應(yīng)5分鐘，除去水浴，繼續(xù)攪拌2個小時。不經(jīng)進一步純化即使用產(chǎn)物。實施例c)磁鐵包被。用I型水將來自步驟a)的含有5.0克磁鐵的一定量磁鐵漿稀釋至140亳升，對混合物超聲。15分鐘后加入乙醇(1.25升)。30-45分鐘后加入濃NH4OH(28%,170亳升)。將來自步驟b)的1.5克甲硅烷酯的溶液和13.5克Si(OEt)4的乙醇溶液在卯分鐘時間內(nèi)分三份加入到反應(yīng)中。然后加入20-30毫升乙醇中3.75克曱硅烷酯化合物的溶液，攪拌混合物并再超聲卯分鐘。攪拌過夜。將混合物以每份500亳升轉(zhuǎn)移進兩個1升燒瓶中，依靠磁性分離所述顆粒。依次用4x250毫升曱醇、2x250亳升I型水、lx250亳升pHl的稀釋于I型水中的HC1(在將混合物放回磁體上之前保持10分鐘)、4x250亳升I型水、4x250毫升甲醇以及2x250毫升丙酮清洗所述固體。過夜風(fēng)干固體。在此步驟過程中，甲硅烷酯發(fā)生水解導(dǎo)致產(chǎn)生羧酸基團。d)將來自前一步驟的磁性羧酸官能化顆粒(1.0克)置于30毫升亞石克酰氯中，回流4小時。過量亞石克酰氯從磁性固體中倒出。用CH2C12清洗所述顆粒數(shù)次，繼續(xù)下一步驟。e)用0.22克1,4-苯二硫酚和0.52毫升二異丙基乙基胺處理懸于50毫升CH2Cl2中的酰氯官能化顆粒。對混合物超聲5分鐘，用軌道搖床攪拌過夜。利用磁性分離依次用CH2C12、1:1CH2Cl2/CH3OH、CH3OH、1:1CH2Cl2/CH3OH和CH2C12清洗所述固體。將固體風(fēng)干過夜。f)用0.81克三丁基膦處理前一步驟顆粒(約0.9克)和25毫升CH2C12的混合物。對所述混合物超聲5分鐘，用軌道搖床攪拌過夜。利用磁性分離依次用CH2C12、1:1CH2Cl2/CH3OH、CH3OH、1:1CH2Cl2/CH3OH和CH2Cl2清洗所述固體。將固體風(fēng)干過夜。g)用0.25克4-氯甲基苯甲酰氯和0.52毫升二異丙基乙胺處理前一步驟顆粒(約0.8克)和25毫升CH2C12的混合物。對所述混合物超聲5分鐘，用軌道搖床攪拌過夜。利用磁性分離依次用CH2C12、1:1CH2Cl2/CH3OH、CH3OH、1:1CH2Cl2/CH3OH和CH2C12清洗所述固體。收集固體并干燥過夜。h)用0.41克三丁基膦處理前一步驟顆粒(約0.7克)和25亳升CH2Ch的混合物。對所述混合物超聲5分鐘，用軌道搖床攪拌共7天。利用磁性分離依次用1:1CH2Cl2/CH30H和CH30H清洗所述固體。收集并干燥固體。實施例2.較大顆粒尺寸的固相材料。合成三丁基鱗NAB基團和可切割芳基硫酯連接鍵官能化的磁性顆粒。a)將3-甲基氨丙基三曱氧基硅烷(149.8克)加入到500亳升燒瓶，充入氬氣。將所述燒瓶置于冰浴中之后，用注射器緩慢加入丙烯酰氧基三甲基硅烷(119.6克)。攪拌所述反應(yīng)5分鐘，除去冰浴，繼續(xù)攪拌2個小時。不經(jīng)進一步純化即使用產(chǎn)物。b)用140亳升I型水和1.25升乙醇稀釋5.0克商品磁鐵(Strem目錄號93-2616，1-5微米)。30-45分鐘后加入濃NH4OH(28%，170毫升)。將來自步驟b)的1.5克甲硅烷酯和13.5克Si(OEt)4的乙醇溶液在卯分鐘時間內(nèi)分三部分加入到反應(yīng)中。然后加入20-30亳升乙醇中的3.75克甲硅烷酯化合物溶液，攪拌混合物并再超聲卯分鐘。過夜攪拌。將混合物以每份500亳升轉(zhuǎn)移進兩個1升的燒瓶中，依靠磁性分離所述顆粒。依次用4x250毫升甲醇、2x250毫升I型水、lx250毫升pH1的稀釋于I型水中的HC1(在將混合物放回磁體上之前保持10分鐘)、4x250毫升I型水、4x250毫升甲醇以及2x250毫升丙酮清洗所述固體。過夜風(fēng)干固體。在此步驟過程中，甲硅烷酯發(fā)生水解而導(dǎo)致產(chǎn)生羧酸基團。d)將來自前一步驟的磁性羧酸官能化顆粒(1.0克)置于30亳升亞硫酰氯中，回流4小時。過量亞石危酰氯從磁性固體中倒出。用CH2C12清洗所述顆粒數(shù)次，繼續(xù)下一步驟。e)用0.22克1，4-苯二硫酚和0.52毫升二異丙基乙基胺處理懸于50毫升CH2Cl2中的酰氯官能化顆粒。對混合物超聲5分鐘，用軌道搖床攪拌過夜。利用磁性分離依次用CH2C12、1:1的CH2Cl2/CH3OH、CH3OH、1:1的CH2Cl2/CH3OH和CH2C12清洗所述固體。將固體風(fēng)干過夜。f)用0.81克三丁基膦處理前一步驟顆粒(約0.9克)和25毫升CH2C12的混合物。對所述混合物超聲5分鐘，用軌道搖床攪拌過夜。利用磁性200780008550.6說明書第20/28頁分離依次用CH2C12、1:1CH2Cl2/CH3OH、CH3OH、1:1CH2Cl2/CH3OH和CH2Cl2清洗所述固體。將固體風(fēng)干過夜。g)用0.25克4-氯甲基苯甲酰氯和0.52毫升的二異丙基乙胺處理前一步驟顆粒(約0.8克)和25毫升CH2C12的混合物。對所述混合物超聲5分鐘，用軌道搖床攪拌過夜。利用磁性分離依次用1:1CH2Cl2/CH3OH和CH3OH清洗所述固體。收集固體并干燥過夜。h)用0.41克三丁基膦處理前一步驟顆粒(約0.7克)和25毫升CH2C12的混合物。對所述混合物超聲5分鐘，用軌道搖床攪拌共7天。利用磁性分離依次用CH2C12、1:1CH2Cl2/CH3OH、CH3OH、1:1CH2Cl2/CH3OH和CH2Cl2清洗所述固體。收集并干燥固體。實施例3.合成官能化磁性聚合物通過磁力的幫助將含有25亳克固體的珠子(Dynal磁性COOH珠，批號G36710)等分試樣倒出。然后用3xl毫升水和3xl亳升CH3CN清洗珠子，之后干燥4小時。所述珠子懸于加入了28.8毫克EDC的1mLCH2C12中，振搖30分鐘。將1,4-苯二硫酚(30毫克)溶液加入到混合物。對管子超聲1分鐘，振搖過夜。除去上清，依靠磁力用4xl毫升的CH2C12、1毫升1:1甲醇:CH2Cl2、4xl毫升甲醇和4xl毫升CH2C12清洗所述珠子。將所述珠子懸于1毫升加入了140微升三丁基膦的CH2Cl2+。將反應(yīng)混合物渦旋l分鐘，總共振搖3天。通過保持在磁體上倒出溶劑。依靠磁力用4x1亳升CH2C12、1毫升1:1甲醇:CH2Cl2、4xl毫升曱醇、1毫升1:1曱醇:CH2Ch和4x1毫升CH2C12清洗所述珠子。用2毫克4-氯甲基苯甲酰氯和52微升二異丙基乙胺處理1毫升CH2C12中前一步驟顆粒(約25亳克)的混合物。對所述混合物渦旋10秒，超聲5分鐘，用軌道搖床攪拌過夜。利用磁力分離依次用4xl毫升CH2C12、1毫升1:1甲醇:CH2Cl2、4xl毫升甲醇、1毫升1:1甲醇:CH2Ch和4x1亳升CH2CV清洗所述固用30亳克三丁基膦處理1毫升CH2C12和前一步驟顆粒(25毫克)的混合物。對所述混合物超聲2分鐘，用軌道搖床攪拌共6天。利用磁力分離依次用4xl毫升CH2C12、3xl毫升甲醇、2xl毫升水清洗所述固體。通過加入1毫升水制成珠子貯備溶液(25毫克/毫升)。實施例4.合成官能化磁性聚合物用磁力收集來自2x0.535毫升Sera-Mag磁性羧酸酯修飾微顆粒懸液(Seradyn)(其含有共50毫克顆粒)的磁性顆粒，將上清倒出。然后用3xl毫升水、3xl毫升CH3CN和3x1亳升CH2CV清洗珠子。所述珠子懸于加入了60毫克EDC的3.6毫升CH2C12中，振搖30分鐘。制備接頭將1,4-苯二硫酴(11.97克)溶解于300毫升。將所述溶液冷卻至-78"C。在1個小時中逐滴加入100毫升CH2C12中8.86克4-氯曱基苯甲酰氯和3.8亳升吡啶的溶液。使反應(yīng)溶液升溫至室溫，維持過夜。完成后用任一種清洗液清洗l克的不純固體產(chǎn)物得到200毫克純產(chǎn)物。通過色語法可以從濾出液中分離更多的量。將400微升DMF中的接頭(60毫克)溶液加到所述混合物中。對所述管超聲l分鐘，振搖過夜。將所述珠子分為兩份各25亳克的部分，分別進行處理。除去上清，利用磁力分離依次用4xl毫升CH2C12、1毫升1:1曱醇:CH2Ch、4xl亳升甲醇、1毫升1:1曱醇:012<:12和4xl毫升CH2C12清洗所述珠子。在添加了75微升三丁基膦的10毫升CH2Cl2中懸浮所述顆粒。將所述反應(yīng)混合物渦旋1分鐘，振搖共7天。將所述珠子分為兩份各25毫克的部分，分別進行處理。通過保持在磁體上倒出溶劑。利用磁力分離依次用3x1亳升CH2C12、1毫升1:1甲醇:CH2Cl2、4x1亳升甲醇和2xl毫升水清洗珠子。通過加入1亳升水制得珠子貯備溶液(25亳克/亳升)'實施例5.用于提取RNA的酸性溶液。應(yīng)用簡單的測試系統(tǒng)來證明本發(fā)明方法在回收RNA上的效用以及評價多種條件和試劑的相對效率。制備100微升測試溶液和100微升胎牛血清(FBS)的混合物。加入2微升1微克/微升的螢光素酶RNA，將混合物渦旋混勻1分鐘。將混合物與100微升測試溶液中2毫克實施例1顆粒的懸液合并，渦旋混勻30秒。在磁力臺上將液體從顆粒中除去，依次用2x200微升測試溶液和2x200微升0.1%DEPC處理水清洗所述顆粒。依次通過下列步驟提取RNA，將50微升50mMNaOH與所述顆粒合并，渦旋混勻1分鐘并移除洗脫液。在乙錠染色凝膠上分析初始結(jié)合反應(yīng)的上清，通過熒光染色確定從溶液中除去并結(jié)合至所述顆粒的RNA的量。在乙錠染色凝膠上分析洗脫液，通過熒光染色確定由所述方法提取的RNA的量和品質(zhì)。使用下述溶液導(dǎo)致RNA的定量結(jié)合，洗脫絕大部分所結(jié)合的RNA。測試溶液巡測試溶液邁檸檬酸鉤0.3M4.0甘氨酸0.3M3.0檸檬酸鈉0.3M3.5甘氨酸0.3M2.5檸檬酸鈉0.3M3.0甘氨酸0.05M2.5檸檬酸鈉0.05M3.0戊二酸鈉0.3M4.0醋酸鐘0.3M4.0戊二酸鈉0.3M3.2醋酸鉀0.05M4.0琥珀酸鈉0.3M4.0醋酸鐘0.3M3.7琥珀酸鈉0.3M3.8醋酸鈉0.3M4.0實施例6.從大腸桿菌培養(yǎng)物提取RNA。使用簡單的測試系統(tǒng)以證明本發(fā)明方法在從培養(yǎng)物中培養(yǎng)的大腸桿菌里回收RNA的效用，以及用于評價多種條件和試劑的相對效率。沉淀200微升份的大腸桿菌培養(yǎng)物，并除去培養(yǎng)基。將所述沉淀與200微升測試溶液和2亳克實施例1的顆粒合并，渦旋混勻30秒。在磁力臺上從顆粒中除去液體，然后依次用2x200微升清洗溶液和2x200微升0.1%DEPC處理水清洗所述顆粒。通過下列步驟分離RNA，將50微升50mMNaOH和20mMtrispH8.8的溶液與所述顆粒合并，渦旋混勻l分鐘并移除洗脫液。在乙錠染色凝膠上分析初始結(jié)合反應(yīng)的上清，通過熒光染色確定已經(jīng)從溶液中除去并結(jié)合至所述顆粒的RNA的量。在乙錠染色凝膠上分析洗脫液，通過熒光染色確定由所述方法提取的RNA的量和品質(zhì)。使用下述溶液導(dǎo)致回收到絕大部分量的完整RNA。相比之下，在0.1。/。DEPC處理水中結(jié)合沉淀和清洗顆粒僅僅產(chǎn)生降解的RNA。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>實施例7.從大腸桿菌培養(yǎng)物中提取RNA的其它條件。根據(jù)實施例6的方法使用下述測試酸性溶液進行大腸桿菌的分離，如電泳凝膠中條帶圖樣所示也產(chǎn)生完整RNA。測試溶液醋酸鋅0.05M+0.1M醋酸銨pH4.0曱基三丁基鱗硫酸甲酯0.1M-1M琥珀酸鈉0.05MpH3實施例8.從ArmoredRNA中提取RNA。ArmoredRNA(AmbionDiagnostics,Austin,TX)是蛋白質(zhì)包裹的ssRNA,其表現(xiàn)為假病毒顆粒。一種HIV-B序列的ArmoredRNA包含來自gag區(qū)的片段和病毒衣殼蛋白，其用于測試本發(fā)明用于從復(fù)雜樣品中分離RNA的方法。在血漿中從ArmoredRNA提取RNA的典型步驟如下。100微升EDTA抗凝血漿(Equitech-Bio,Inc.,Kerrville，TX)與5微升ArmoredRNA(含有50,000個拷貝)組成的105微升溶液與100微升測試溶液(例如50mMKOAc，pH4.0)合并，短暫渦旋混勻所述混合物。l分鐘后，將所述混合物與100微升50mMKOAc(pH4.0)中的2毫克實施例l顆粒合并，對所得漿液渦旋混勻30秒。在磁力臺上分離所述顆粒，然后依次用2x200微升50mMKOAc(pH4.0)和2x200微升0.1%DEPC處理水清洗。通過與50微升50mMNaOH渦旋混合1分鐘并移除除去溶液來洗脫RNA。與對照進行比較，在對照中105微升血漿/ArmoredRNA與2毫克顆粒和代替測試溶液的200微升0.1%DEPC處理水合并。使用引物對對含有RNA的洗脫液進行RT-PCR擴增以擴增基因片段。使用iScriptTM—步法RT-PCR試劑盒和SYBRGreen(Bio-Rad)利用iCycler設(shè)備(Bio-Rad)進行擴增反應(yīng)以進行擴增和檢測。下述測試溶液允許回收可擴增的RNA，如CT值顯著低于水對照所示。測試溶液醋酸鉀0.3MpH4.0醋酸鐘0.05MpH4.0醋酸0.05M醋酸02M三氟醋酸0.05M鹽酸吡咬0.05M鹽酸0.025M鹽酸四丁基鱗0.05M醋酸鉀0.05M+,醋酸0.05M醋酸鋅0.05MpH4.0醋酸鉀0.05M，pH4.0+三氟醋酸0.05M50:50pH1.870:30pH2.180:20pH2.5醋酸鋅0.05M,pH4.0+三氟醋酸O.OSlM(犯加)醋酸鎂0.05MpH4.0醋酸銨0.05M四丁基醋酸銨O.OSM四乙基醋酸銨0.05M醋酸鋅0.05M,pH4.0+三氟醋酸(pH2.0,2.5.3.0,3.5)醋酸辭0.05M+甘氛酸0.05MpH3.3醋酸鋅0.05M+.摔檬酸鈉0.05MpH3.3醋酸鋅0.05M+檸檬酸鈉O.05MPH4.2氯化鋅0.0SM+.甘氨酸鈉0.(bMpH"5氯化鋅0.05M+檸檬酸鈉O.05MpH2.5實施例9.從ArmoredRNA提取RNA。在一個替代性方法中，胎牛血清(FBS)(Invitrogen,Carlsbad,CA)用來替代血漿。與對照進行比較，在對照中105微升FBS/ArmoredRNA與2亳克顆粒和代替測試溶液的200微升0.1%DEPC處理水合并。如實施例4所述通過RT-PCR分析含RNA的洗脫液。除了下文所列出的之外，實施例4的大部分測試溶液都允許回收可擴增的RNA，如CT值顯著低于水對照所示。測"i式溶液甘氨酸0.05MpH2.5甘氨酸0.3MpH2.5甘氨酸0.3MpH3.0檸檬酸鈉0，3MpH3.5檸檬酸鈉0.1MpH3.5檸檬酸鈉0.3MpH3.0實施例10.使用實施例1、2、3和4的每種固相材料以及多種酸性溶液都成功實施了實施例8中用于分離和擴增加到血漿中的ArmoredRNA的方法。固相酸性溶液實施例i醋酸鈷0.05M，pH4.0實施例1醋酸錳0.05M,pH4.0實施例1醋酸鈷O.OSM+醋酸鉀0.0SM,pH4.0實施例2醋酸鉀0.0SM，pH4.0實施例2醋酸辭0.05M,pH4.0實施例3醋酸鋅0.05M，pH4.0實施例4醋酸鋅0.05M,pH4.0實施例11.從血漿提取和分析HIVRNA。本發(fā)明方法用于從來自EDTA抗凝血處理的HIV陽性血漿中提取RNA。使用COBASAMPLICORHIV-lMONITORTESTver.1.5(RocheDiagnostics)檢測樣品中HIVRNA的存在。此檢測是用于定量HIV-lRNA的自動化RT-PCR檢測，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA拷貝，PCR擴增gflg基因高度保守區(qū)中的155個堿基對序列，帶生物素標(biāo)記的擴增子與結(jié)合了磁性顆粒的寡核苷酸探針雜交，生物素標(biāo)簽與親和素-辣根過氧化物酶綴合物結(jié)合，使用TMB進行顯色檢測。試劑盒提供的樣品制備方法用如下所述的本發(fā)明所用方法替代。HIVRNA提取方法1.在100微升50mMKOAc(pH4)中制備2亳克實施例1顆粒的漿液。2.將100微升50mMKOAc(pH4)加到100微升血漿。點觸渦旋所述混合物，在室溫孵育l分鐘。3.將血漿溶液加入到珠子漿液，渦旋混勻30秒。4.除去上清，加入200微升50mMKOAc(pH4)。渦旋5秒。5.重復(fù)步驟46.除去上清，加入200微升0.1%DEPC處理的水。渦旋5秒。7.重復(fù)步驟6。8.除去所有剩余緩沖液。加入50微升50mMNaOH，渦旋1分鐘。9.將洗脫液轉(zhuǎn)移到潔凈的1.5毫升管。10.將150微升0.1%DEPC處理水加入到所述顆粒進行再次洗脫，渦旋l分鐘。11.將第一和第二次洗脫液合并。12.將50微升合并的洗脫液加入到HIV-1MONITORTest,ver.1.5。在進行COBASAMPLICOR擴增、雜交和免疫結(jié)合之后，制備系列稀釋液，然后進行檢測。當(dāng)使用上述方案時，分析已知含有1.88xl05HIV顆粒/毫升的血漿樣品允許在ELISA中檢測1:729的稀釋液。實施例12.從人全血中提取RNA。使用簡單的測試系統(tǒng)以證明本發(fā)明方法用于從人全血中回收RNA的效用。作為仍含有完整RNA的新鮮抽取血液的模型，培養(yǎng)的人T淋巴細(xì)胞(Jurkat)被摻入到全血(CPD抗凝血)中以評價多種條件和試劑的相對效率。沉淀收集7xl()S個Jurkat細(xì)胞，除去培養(yǎng)基。將所述沉淀與100微升人全血合并。所述血液與含2毫克實施例1或2顆粒的100微升測試溶液合并，渦旋混勻30秒。在磁力臺上從所述顆粒除去液體，依次用2x500微升清洗溶液和2x500微升0.1%DEPC處理水清洗所述顆粒。通過下述步驟分離RNA,將所述顆粒與50微升50mMNaOH和20mMtrispH8.0的溶液合并，渦旋混勻1分鐘，然后移除所述溶液。用50微升100mM醋酸鋅pH4中和所述洗脫液，通過下述步驟重新結(jié)合新的珠子，將被中和的洗脫液與含2毫克實施例l或2之顆粒的100微升測試溶液合并，渦旋混勻30秒。在磁力臺上從所述顆粒除去液體，依次用2x500微升清洗溶液和2x500微升0.1%DEPC處理水清洗所述顆粒。通過下述步驟分離RNA，將所述顆粒與50微升50mMNaOH和20mMtrispH8.0的溶液合并，渦旋混勻1分鐘，然后移除所述溶液。對含RNA的洗脫液進行RT-PCR和PCR，其使用引物對以擴增GAPDH及18S基因的RNA和DNA。使用iScript—步法RT-PCR試劑盒和SYBR⑧Green(Bio-Rad)利用iCycleri殳i(Bio-Rad)進行擴增反應(yīng)以進行擴增和檢測。獲得了陽性擴增結(jié)果(RT-PCR的CT<PCR的CT)。固相酸性溶液實施例1醋酸鋅0.05M，pH4.0實施例13,3-二甲基戊二酸0.05M，pH3.2實施例2醋酸鋅0.05M，pH4.0權(quán)利要求1.從含有至少一個細(xì)胞或病毒的生物樣品中提取核糖核酸的方法，其包括a)使所述樣品與酸性溶液接觸以形成混合物；b)將所述混合物與選定的具有在不首先進行任何預(yù)裂解情況下從生物樣品中直接釋放核糖核酸之能力的固相結(jié)合材料合并，其中不使用離液劑或去污劑來實現(xiàn)裂解，由此所述固相結(jié)合材料引起細(xì)胞和病毒的裂解以釋放核糖核酸；和c)將核糖核酸結(jié)合到所述固相上。2.權(quán)利要求l的方法，其還包括d)將所述樣品與在其上結(jié)合了核糖核酸的所述固相相分離;e)任選地用至少一種清洗溶液清洗所述固相；和來從所述固相上洗脫所結(jié)合的核糖核酸。3.權(quán)利要求l的方法，其中形成所述樣品與所述酸性溶液的混合物的步驟與將所述混合物與所述固相合并的步驟同時進行。4.權(quán)利要求l的方法，其中先形成所述樣品與所述酸性溶液的混合物，再進行所述混合物與所述固相合并的步驟。5.權(quán)利要求l的方法，其中所述固相選自顆粒、微顆粒、纖維、珠子、膜、試管和微孔。6.權(quán)利要求l的方法，其中所述固相包含基質(zhì)部分和核酸結(jié)合部7.權(quán)利要求6的方法，其中所述基質(zhì)部分選自二氧化硅、玻璃、不溶性合成聚合物、不溶性多糖、金屬、金屬氧化物和金屬硫化物。8.權(quán)利要求6的方法，其中所述基質(zhì)部分選自包被二氧化硅、玻璃、合成聚合物或不溶性多糖的磁響應(yīng)材料。9.權(quán)利要求1的方法，其中所述固相包含直徑小于IO微米的微顆粒.10.權(quán)利要求9的方法，其中所述微顆粒是磁響應(yīng)性的。11.權(quán)利要求9的方法，其中使用多于一種尺寸之顆粒的混合物.12.權(quán)利要求ll的方法，其中至少一種尺寸的顆粒具有核酸結(jié)合部分，至少一種其它尺寸的顆粒不具有核酸結(jié)合部分。13.權(quán)利要求6的方法，其中所述固相材料還包含共價連接的核酸結(jié)合部分，該核酸結(jié)合部分允許捕獲和結(jié)合核糖核酸。14.權(quán)利要求l的方法，其中所述固相材料還包含非共價連接的核酸結(jié)合部分，該核酸結(jié)合部分允許捕獲和結(jié)合核糖核酸。15.權(quán)利要求l的方法，其中所述固相材料還包含基于二氧化硅的材料，其被共價引入的表面官能團所官能化，所述官能團用于破壞細(xì)胞和吸引核酸，并且所述官能團選自羥基、硅烷醇基、羧基、氨基、銨、季銨和季鱗鹽以及叔銃鹽。16.權(quán)利要求l的方法，其中所述固相材料還包含具有共價引入之表面官能團的聚合物材料，所述官能團用于破壞細(xì)胞和吸引核酸，并且所述官能團選自羥基、硅烷醇基、羧基、氨基、銨、季銨和季緣鹽以及叔銃鹽。17.權(quán)利要求13的方法，其中所述核酸結(jié)合部分包含多個核酸結(jié)合基團，其選自羧基、NH2、烷基胺、和二烷基胺基、季錄或叔錄基團或者多于一種這些基團的混合物。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述核酸結(jié)合部分包含多個核酸結(jié)合基團，其選自三烷基季銨、三烷基季鱗、三芳基季鱗、混合烷基芳基季雜基團以及叔锍基。19.權(quán)利要求13的方法，其中所述核酸結(jié)合基團選自三烷基季銨和三烷基季鱗基團，其中每個烷基都具有至少4個碳原子，并且其中所述核酸結(jié)合基團引起細(xì)胞和病毒裂解以釋放核糖核酸。20.權(quán)利要求6的方法，其中所述固相結(jié)合材料包含通過可選擇性切割之連接鍵結(jié)合到基質(zhì)上的核酸結(jié)合基團。21.權(quán)利要求l的方法，其中所述酸性溶液包括pH在l-5范圍內(nèi)的水溶液。22.權(quán)利要求21的方法，其中所述酸性溶液包括pH在2-4范圍內(nèi)的水溶液。23.權(quán)利要求21的方法，其中所述酸性溶液包括有機或無機酸的水溶液，所述有機或無機酸選自吡啶鹽、無機酸、單羧酸、二羧酸、三羧酸和氨基酸，以及它們的堿金屬、堿土金屬、過渡金屬、NH4+、季銨和季鱗鹽。24.權(quán)利要求2的方法，其中用于從所述固相釋放所結(jié)合核糖核酸的試劑包括堿濃度為1mM至1M的堿性溶液。25.權(quán)利要求l的方法，其中所述固相材料包含具有三丁基鱗核酸結(jié)合基團的磁性顆粒，所述基團通過可切割的芳基硫酯連接鍵而連接到磁性顆?；|(zhì)上。26.權(quán)利要求25的方法，其中所述固相材料具有下式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中<image>imageseeoriginaldocumentpage4</image>代表被共價連接的接頭基團官能化的基于二氧化硅的磁性顆粒。27.權(quán)利要求l的方法，其中所述生物樣品選自細(xì)菌培養(yǎng)物、來自細(xì)菌培養(yǎng)物的沉淀細(xì)胞、血液、血漿、血清、尿、痰、精液、CSF、植物細(xì)胞、動物細(xì)胞和組織勻漿物。28.從選自細(xì)菌培養(yǎng)物、來自細(xì)菌培養(yǎng)物的沉淀細(xì)胞、血液、血漿、血清、尿、痰、精液、CSF、植物細(xì)胞、動物細(xì)胞和組織勻漿物的生物樣品中提取核糖核酸的方法，所述樣品含有至少一個細(xì)胞或病毒，所述方法包括a)將所述樣品與pHl-5范圍內(nèi)的酸性溶液接觸以形成混合物，其中所述酸性溶液包括有機或無機酸的水溶液，所述有機或無機酸選自吡啶鹽、無機酸、單羧酸、二羧酸、三羧酸和氨基酸，以及它們的堿金屬、堿土金屬、鋅、NH4+、季銨和季鱗鹽；b)將所述混合物與包含基質(zhì)部分和核酸結(jié)合部分的固相結(jié)合材料合并，其中選擇所述固相結(jié)合材料，使之具有在不首先進行任何預(yù)裂解情況下從生物樣品中直接釋放核糖核酸的能力，其中不使用離液劑或去污劑來實現(xiàn)裂解，由此所述核酸結(jié)合基團引起細(xì)胞和病毒的裂解以釋放核糖核酸；和c)將核糖核酸結(jié)合到所述固相上。29.權(quán)利要求28的方法，其中所述固相材料包含具有三丁基鱗核酸結(jié)合基團的磁性顆粒，所述基團通過可切割的芳基硫酯連接鍵而連接到磁性顆?；|(zhì)上。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述固相材料具有下式其中響代表被共價連接的接頭基團官能化的基于二氧化硅的磁性顆粒。31.權(quán)利要求30的方法，其還包括d)將所述樣品與在其上結(jié)合了核糖核酸的所述固相相分離；e)任選地用至少一種清洗溶液清洗所述固相；和f)通過將所述固相材料與包含堿性溶液以釋放所結(jié)合RNA進入溶液的試劑相接觸來從所述固相上洗脫所結(jié)合的核糖核酸，所述堿性溶液具有1mM至1M的堿濃度.32.從選自細(xì)菌培養(yǎng)物、來自細(xì)菌培養(yǎng)物的沉淀細(xì)胞、血液、血漿、血清、尿、痰、精液、CSF、植物細(xì)胞、動物細(xì)胞和組織勻漿物的生物樣品中分離核糖核酸的方法，所述樣品含有至少一個細(xì)胞或病毒，所述方法包括a)將所述樣品與pHl-5范圍內(nèi)的酸性溶液接觸以形成混合物，其中所述酸性溶液包括有機或無機酸的水溶液，所述有機或無機酸選自吡啶鹽、無機酸、單羧酸、二羧酸、三羧酸和氨基酸，以及它們的堿金屬、堿土金屬、過渡金屬、NH4+、季銨和季鱗鹽；b)將所述混合物與包含磁性顆粒的固相結(jié)合材料合并，所述磁性顆粒具有通過可切割芳基硫酯連接鍵而連接到磁性顆粒基質(zhì)上的三丁基鱗核酸結(jié)合基團，其中選擇所述固相結(jié)合材料，使之具有在不首先進行任何預(yù)裂解情況下從生物樣品中直接釋放核糖核酸的能力，其中不使用離液劑或去污劑來實現(xiàn)裂解，由此所述核酸結(jié)合基團引起細(xì)胞和病毒的裂解以釋放核糖核酸；和c)將核糖核酸結(jié)合到所述固相上；d)將所述樣品與在其上結(jié)合了核糖核酸的所述固相相分離；e)任選地用至少一種清洗溶液清洗所述固相；和f)用切割試劑切割該可選擇性切割的連接鍵，由此從所述固相結(jié)33.權(quán)利要求32的方法，其中所述可切割的連接鍵選自可水解切割的基團、二硫化物基團、過氧鍵、可被酶切割的基團、可切割的1，2-二氧環(huán)丁烷部分、其中所述雙鍵連接了至少一個O、S或N原子的富電子C-C雙鍵、烯酮二硫縮醛化合物，以及選自硝基取代芳香醚和酯的可光切割接頭基團，其中所述酶選自酯酶、水解酶、蛋白酶、肽酶和糖普酵o34.權(quán)利要求33的方法，其中所述可水解切割的基團選自羧酸酯、羧酸酐、硫酯、碳酸酯、硫代碳酸酯、氨基甲酸酯、酰亞胺、磺酰胺、磺酰亞胺和磺酸酯。35.權(quán)利要求34的方法，其中通過與包含堿性溶液的試劑反應(yīng)來切割所述可水解切割的連接鍵，所述堿性溶液具有1mM至1M的堿濃度。全文摘要本發(fā)明公開了用于從生物樣品中快速簡便地提取和分離RNA的方法和材料，其涉及使用酸性溶液和固相結(jié)合材料，所述固相結(jié)合材料具有在不首先進行預(yù)裂解以破壞細(xì)胞或病毒的情況下釋放生物樣品中核酸的能力，所述生物樣品包括全血。其中不需要或者不使用用于裂解細(xì)胞或病毒的去污劑或離液物質(zhì)?？墒褂帽景l(fā)明方法分離病毒、細(xì)菌和哺乳動物基因組RNA。本發(fā)明方法所分離的RNA適用于下游過程例如RT-PCR。文檔編號C07H23/00GK101400689SQ200780008550公開日2009年4月1日申請日期2007年2月8日優(yōu)先權(quán)日2006年2月8日發(fā)明者哈希姆·阿哈萬-塔夫蒂申請人:魯米金公司