專利名稱：：抑制肉質(zhì)食品中致病細(xì)菌生長(zhǎng)的含有蛋黃免疫球蛋白的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種食品添加劑的制備方法及其應(yīng)用，該食品添加劑含有IgY(蛋黃免疫球蛋白)，能夠抑制肉質(zhì)食品中致病細(xì)菌的生長(zhǎng)。技術(shù)背景為了提高肉質(zhì)加工食品(如火腿、香腸和烤肉)的質(zhì)量，基于這些食品來(lái)自不同的肉質(zhì)來(lái)源(如豬肉、羊肉、牛肉和雞肉)的事實(shí)，需要適用于廣大領(lǐng)域的核心工藝。在改進(jìn)肉質(zhì)加工食品的整體性質(zhì)上起到了重要作用的工藝包括各種各樣的工藝，例如，基于使用新的香料的改善口感的工藝，基于使用具有較高持水能力的蛋白質(zhì)基原料的降低成本的工藝，基于添加酶或蛋白質(zhì)基原料的改善質(zhì)地和風(fēng)味的工藝，以及能夠?qū)⒂蔁釋?dǎo)致的變質(zhì)最小化的非熱能滅菌工藝。在這些工藝中，通過(guò)將熱處理最小化對(duì)肉質(zhì)食品進(jìn)行滅菌的非熱能滅菌工藝對(duì)于顯著提高肉質(zhì)食品的質(zhì)量是最至關(guān)重要的。目前正在開發(fā)的兩類處理工藝包括利用天然的抗微生物的物質(zhì)的化學(xué)處理工藝和使用電場(chǎng)、磁場(chǎng)、超高壓或光能的物理處理工藝。關(guān)于當(dāng)前的技術(shù)水平以及不穩(wěn)定的生產(chǎn)成本，利于天然的抗微生物的物質(zhì)的非熱能滅菌工藝在食品工業(yè)中的應(yīng)用更具有優(yōu)勢(shì)。包括細(xì)菌素(bacteriocine)提取物、藥用殼聚糖(Chitosan)、藥用溶菌酶、藥用鈣(calciummedicine)、各種有機(jī)酸、葡萄柚籽提取物、聚賴氨酸(polylysine)以及維生素B1衍生物在內(nèi)的各種天然的抗微生物的物質(zhì)己經(jīng)被開發(fā)并可以商購(gòu)得到。目前使用2%-3%的有機(jī)酸(例如乳酸鉀和乳酸鈣)來(lái)防止細(xì)菌從而確保肉質(zhì)食品的安全。但是，大多數(shù)商購(gòu)抗菌物質(zhì)具有滅活機(jī)能，即表面活性劑能損傷在細(xì)菌細(xì)胞的疏水性和親水性區(qū)域的細(xì)菌細(xì)胞膜，使微生物滅活，但是，問(wèn)題在于，表面活性劑的抗菌效果在蛋白質(zhì)基食品中(例如含有大量極性基團(tuán)的肉質(zhì)加工食品)受到了極大地妨礙。正是因?yàn)槭澄镏械木哂袠O性基團(tuán)的蛋白質(zhì)預(yù)先使抗菌物質(zhì)的表面活性劑不能有效地到達(dá)并與細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)合，因而不能實(shí)現(xiàn)有效地滅菌。由于在培養(yǎng)基上表現(xiàn)出優(yōu)異的滅菌或抑制生長(zhǎng)效果的商購(gòu)抗菌物質(zhì)在真正的食品(特別是蛋白質(zhì)食品)中出現(xiàn)了效果減弱的重大缺陷，因此除了從有機(jī)酸中獲得的天然抗菌物質(zhì)外，能夠被用在肉質(zhì)加工食品中的抗菌物質(zhì)受到了很大的限制。因此，最重要的是開發(fā)并安全使用能夠應(yīng)用于以蛋白質(zhì)為主要成分的肉質(zhì)加工食品的具有滅菌和抑制細(xì)菌生長(zhǎng)功能的天然抗菌物質(zhì)。這也將是非熱能滅菌的基礎(chǔ)，因?yàn)殚_發(fā)和安全使用有效的天然抗菌物質(zhì)將是將變質(zhì)和由二次熱處理滅菌引起的產(chǎn)量下降最小化的差異化技術(shù)。關(guān)于前述方面，通過(guò)開發(fā)抑制肉質(zhì)食品中致病細(xì)菌生長(zhǎng)的含有IgY的組合物而完成了本發(fā)明，該組合物具有不同的抗菌機(jī)理并且能夠用作肉質(zhì)加工食品的有效的天然防腐劑，研究并分析本發(fā)明組合物應(yīng)用于肉質(zhì)加工食品時(shí)的抑制生長(zhǎng)的效果。IgY是一種抗體，是一種特異性免疫球蛋白，它能從母雞母體通過(guò)蛋黃傳遞給胚胎。天然抗菌物質(zhì)和表面活性劑在制備方法和功能機(jī)理上是完全不同的。為了產(chǎn)生IgY，將待殺滅的或抑制生長(zhǎng)的靶向致病細(xì)菌(例如螺旋桿菌(//e/z'co6a"er)，大腸埃希氏菌(￡.co//)，金黃色葡萄球菌d//z;/ococ薦m^ew)和沙門氏菌(5WmoMe〃a))注射到母雞母體內(nèi)以在蛋黃中產(chǎn)生一種能夠抵御靶向細(xì)菌的特異性免疫球蛋白(抗體)。這種在蛋黃中積聚的特異性免疫球蛋白被稱為IgY，有別于一般的抗菌素，它的特點(diǎn)是對(duì)人體沒(méi)有副作用，并且對(duì)細(xì)菌也沒(méi)有耐受性。迄今為止，IgY只是主要被用于功能蛋、奶制品、豆奶、功能餐和功能性化妝品產(chǎn)品。在先前的案例中沒(méi)有如本發(fā)明所建議的將IgY用于肉質(zhì)食品中。沒(méi)有在先嘗試以殺滅和抑制多種能夠在肉質(zhì)食品安全和質(zhì)量方面起到負(fù)面作用的致病細(xì)菌為目而使用IgY，或者將IgY加工成粉末狀或液態(tài)物質(zhì)。目前在韓國(guó)以及國(guó)外存在的研究和開發(fā)的案例形成專利和研究文獻(xiàn)的是專利登記號(hào)為0437500的韓國(guó)專利涉及一種食品添加劑，是通過(guò)將兩種能夠引起口腔疾病的鏈球菌變體(Streptococcusmutants)和伊氏放線菌(Actinomycesisraelii)作為抗原，將它們分別注射到不同的雞體中，產(chǎn)生能夠抗每個(gè)相關(guān)致病細(xì)菌的IgY。此外，該專利還涉及含有特殊食品添加劑的功能性冰激淋。專利登記號(hào)為0415911的韓國(guó)專利涉及如何生產(chǎn)能夠預(yù)防腸炎的雞蛋，通過(guò)將能引起腸炎和胃炎的大腸埃希氏菌和引起腸炎的幽門螺桿菌(7/e/^oZ^"w同時(shí)注射到幼雞體內(nèi)。此外，專利登記號(hào)為0406870的韓國(guó)專利提出了如何從蛋黃的水溶性成分中分離和純化IgY。專利登記號(hào)為0392564的韓國(guó)專利介紹了如何生產(chǎn)功能性雞蛋，該功能性雞蛋具有特異性免疫球蛋白，該免疫球蛋白能抗導(dǎo)致痤瘡的痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)。申請(qǐng)?zhí)枮?001-0046634的韓國(guó)專利申請(qǐng)涉及功能性豆奶和含有含抗螺旋桿菌(//e//C06a"e。的IgY的液態(tài)蛋黃的酸奶。本領(lǐng)域的大多數(shù)研究文獻(xiàn)和論文描述如何從蛋黃制備IgY抗體以及IgY的特性，對(duì)于滅菌和抑制生長(zhǎng)的研究?jī)H使用幾種特殊的細(xì)菌，例如螺旋桿菌(/^//coZ^"w)、大腸埃希氏菌(￡.co//)和沙門氏菌(5Wwo"e〃a)。正如本文所討論的，本發(fā)明的動(dòng)機(jī)是基于這樣的事實(shí)現(xiàn)在關(guān)于IgY的研究、發(fā)展和商業(yè)化高度集中在功能性原料和食品，而用于肉質(zhì)加工食品的有效的天然抗菌物質(zhì)還沒(méi)有商業(yè)化應(yīng)用。通過(guò)發(fā)明一種可商業(yè)化應(yīng)用的對(duì)靶向細(xì)菌具有選擇性抗生效果的天然抗菌物質(zhì)，我們能夠發(fā)展并完善先進(jìn)的非熱能滅菌技術(shù)，該技術(shù)使公司的高品質(zhì)的產(chǎn)品以各種形式商品化，如在封裝以及烹調(diào)后立即將產(chǎn)品裝盤而無(wú)需任何額外的熱處理的無(wú)菌包裝產(chǎn)品
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供抑制肉質(zhì)食品中致病細(xì)菌生長(zhǎng)的含有IgY的組合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種通過(guò)使用前述組合物殺滅肉質(zhì)加工食品中的致病細(xì)菌和抑制肉質(zhì)加工食品中的致病細(xì)菌的生長(zhǎng)的方法。本發(fā)明包括下述幾個(gè)步驟含有IgY的蛋黃的生產(chǎn)步驟；從蛋黃中分離IgY并純化的步驟；含有IgY的液態(tài)蛋黃和蛋黃粉末的制備步驟；檢驗(yàn)前一步驟獲得的IgY的穩(wěn)定性的步驟；檢測(cè)和評(píng)價(jià)含有IgY的蛋黃粉末和液態(tài)蛋黃的抗菌效果的步驟。本發(fā)明提供了一種IgY的制備方法，該方法包括下述步驟O通過(guò)給雞注射疫苗來(lái)生產(chǎn)含有特異性免疫球蛋白的雞蛋，該疫苗能抗使產(chǎn)品變質(zhì)的致病細(xì)菌和其它微生物；ii)對(duì)從雞蛋中分離出的蛋黃進(jìn)行低溫滅菌；和iii)向已滅菌的蛋黃中加入酸性水溶液并將得到的混合物離心分離。在步驟ii)中，低溫滅菌在50-75'C下進(jìn)行15分鐘至1小時(shí)。如果滅菌溫度低于50°C，滅菌不能充分地進(jìn)行。如果溫度高于75r，蛋黃將會(huì)由于熱而變性。如果滅菌時(shí)間少于15分鐘，滅菌不能充分地進(jìn)行，然而也沒(méi)必要使滅菌時(shí)間長(zhǎng)于1小時(shí)，因?yàn)闇缇鷷r(shí)間長(zhǎng)于1小時(shí)也不會(huì)帶來(lái)更好的滅菌效果。在步驟iii)中，其特征在于，離心分離是在通過(guò)向已滅菌的蛋黃中加入酸性水溶液將最終酸度調(diào)節(jié)至pH值為5.2-5.5之后進(jìn)行的。此外，本發(fā)明還提供了含有特異性免疫球蛋白的蛋黃，該蛋黃是通過(guò)下述兩個(gè)步驟特別制備的步驟l，該步驟通過(guò)給雞注射能抗使產(chǎn)品變質(zhì)的致病細(xì)菌和其它微生物的疫苗來(lái)生產(chǎn)含有特異性免疫球蛋白的雞蛋；和，步驟2，該步驟對(duì)從雞蛋中分離出的蛋黃進(jìn)行低溫滅菌。經(jīng)過(guò)滅菌的蛋黃在低溫下能被凍干或冷凍干燥，以使它變成含有IgY的蛋黃粉末。此外，本發(fā)明還提供了對(duì)肉質(zhì)食品具有殺菌或抑制腐爛功能的食品添加劑組合物，該組合物含有下述組中的一種或幾種上述IgY，含有上述IgY的蛋黃，以及含有上述IgY的蛋黃粉末。圖1說(shuō)明本發(fā)明的IgY的制備過(guò)程；圖2說(shuō)明本發(fā)明的IgY的抗菌活性滴定度的曲線圖；圖3說(shuō)明本發(fā)明的IgY的酸度和溫度穩(wěn)定性的曲線圖；圖4說(shuō)明了在2(TC下GrillWinner香腸的每個(gè)儲(chǔ)存階段，含有IgY的蛋黃粉末的滅菌和抑制生長(zhǎng)的效果的曲線圖；圖5舉例說(shuō)明沙門氏菌的細(xì)胞膜被本發(fā)明的IgY破壞的機(jī)理；圖6為表明在20"C下GrillWinner香腸的每個(gè)儲(chǔ)存階段，含有本發(fā)明的IgY的蛋黃粉末的滅菌和抑制生長(zhǎng)的效果的照片；其中，A是對(duì)照組，B是經(jīng)IgY處理的實(shí)驗(yàn)組；圖7為本發(fā)明的IgY對(duì)0157:H7(大腸埃希氏菌0157:H7)的滅菌效果的曲線圖；圖8為本發(fā)明的IgY對(duì)腸炎沙門氏菌(Sa/wo"e〃aew&n力'fifo)的滅菌效果的曲線圖；圖9為本發(fā)明的IgY對(duì)鼠傷寒沙門氏菌"a/mowe〃a的滅菌效果的曲線圖；圖10為用電子顯微鏡觀察到的本發(fā)明的IgY對(duì)O157:H7(大腸埃希氏菌(五^/7eWc/2^co//0157:H7))的細(xì)胞膜的破壞機(jī)理；圖11為用電子顯微鏡觀察到的經(jīng)本發(fā)明的液態(tài)IgY處理的GrillWi皿er香腸；將經(jīng)過(guò)IgY處理的香腸在37i:下放置7天后進(jìn)行觀察；其中，A是對(duì)照組，B是經(jīng)IgY處理的實(shí)驗(yàn)組。具體實(shí)施方式根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"IgY"或蛋黃中的免疫球蛋白的意思是從母雞母體通過(guò)蛋黃傳遞給胚胎的特異性免疫球蛋白(抗體)。本發(fā)明的技術(shù)術(shù)語(yǔ)IgY包括所有類型的IgY組合物，例如液態(tài)或粉末狀物質(zhì)。大約有20種致病細(xì)菌和其它微生物能使肉質(zhì)加工食品變質(zhì)。它們包括嗜水氣單胞菌(v4m附o"os/^ra/M(3)、蠟狀芽孢桿菌(萬(wàn)ac/腸cer潔)、空腸彎曲菌(G3wp//o6ac^7'咖m')、產(chǎn)氣莢膜梭菌(C7o/nW謂/e^/h'"gms)、0157:H7(大腸埃希氏菌0157:H7)、乳酸桿菌aacto6fl"7/w)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(丄^er/(3wo"oc_y)、酉良酒酵母(Sacc/2"ramycescerev/w'ae)、腸炎沙門氏菌(5"a/,"e〃ae"&rk逾)、鼠傷寒沙門氏菌(5"a/mo"e〃a(y//z/柳Mr/M附)、金黃色葡萄球菌(5^a//^/ococci^awrews)、表皮葡萄球菌((SVa//2;v7ococcMSe//cferw/(i/s)、肉毒梭菌(C7astr/tZ/MmZo/w//ww/w)、弓瓜菌(F6廠z'ospp)禾口青霉菌(戶em'cz'〃/wm)。在上述20種細(xì)菌中，本發(fā)明只選擇了12種致病細(xì)菌作為最終的靶向細(xì)菌，包括革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌以及耐熱型產(chǎn)孢菌類Gpwe/om7W)。這些細(xì)菌具有可能導(dǎo)致進(jìn)行了較高強(qiáng)度的熱處理和較低強(qiáng)度的熱處理的產(chǎn)品以及沒(méi)有進(jìn)行后續(xù)滅菌處理的無(wú)菌包裝產(chǎn)品發(fā)生腐爛，產(chǎn)生氣體，形成痰狀物質(zhì)，和形成食物毒素的危險(xiǎn)。本發(fā)明所述的使產(chǎn)品變質(zhì)的致病細(xì)菌和微生物包括0157:H7(大腸埃希氏菌0157:H7，革蘭氏陰性菌)、腸炎沙門氏菌(5Wwo"e〃ae"&W^fo)、鼠1勞寒《少I、，氏菌(Sa/m。"e〃a/);//H'附wrz.w附)、空腸彎曲菌(Gawp_y/o6ac&ry'ey'ww/)、金黃色葡萄球菌(&ap/^/ococcwm/Mus，革蘭氏陽(yáng)性菌)、表皮葡萄球菌(Stop/^/ococcwe//fl^/mW^)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(ZiWeWawowoc^ogms)、蠟狀芽孢桿菌(5a"7/wc^ews，革蘭氏陽(yáng)性菌和耐熱型產(chǎn)抱菌類G;or^/br附ers))、產(chǎn)氣英膜梭菌(C7ofr/^'w附per^777ge"s)、以及酉良、酒酵母(Sacc/zara，cescerev&z'ae)，酉良酒酵母(iSacc/zaram_yc&scerev/w'ae)是能導(dǎo)致食品變質(zhì)的典型的細(xì)菌之一。本發(fā)明還提供了關(guān)于IgY或含有IgY的蛋黃的信息，所述IgY或含有IgY的蛋黃對(duì)上述被認(rèn)為是引起食品變質(zhì)的致病細(xì)菌和其它微生物的靶向細(xì)菌具有優(yōu)異的抗菌活性。根據(jù)本發(fā)明，將篩選后的靶向細(xì)菌注射到母雞體內(nèi)，首先從母雞產(chǎn)的蛋的蛋黃中獲得IgY(特異性抗體，能夠阻止被注射的12種細(xì)菌)。產(chǎn)品中含有大量的蛋白質(zhì)，其次是脂質(zhì)、灰分和水。能抵御12種致病微生物的抗體IgY的總含量為15.5毫克/克(圖1)。為了直接驗(yàn)證IgY對(duì)12種細(xì)菌的滅殺和抑制效果，用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，一種間接的酶免疫響應(yīng)的方法)來(lái)觀察抗原抗體響應(yīng)過(guò)程中光密度(OD，OpticalDensity)值的變化。光密度值的增加表明IgY對(duì)特異的病原體的選擇性響應(yīng)較高。因此，這可以被用作表明具有強(qiáng)的殺滅和抑制生長(zhǎng)效果的間接的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，除了腸炎沙門氏菌(5""/附o"e〃ae"&n'"tfo)禾卩鼠傷寒沙門氏菌(/S<3/mowe〃a(y//z/mwn'wm)以外，本發(fā)明的IgY對(duì)12種病原體中的大多數(shù)顯示出高的光密度值，這說(shuō)明IgY能夠抑制特異的病原體生長(zhǎng)。IgY的滅活機(jī)理可以被理解為對(duì)抗體與細(xì)胞膜結(jié)合的響應(yīng)。詳細(xì)地說(shuō)，IgY不是單克隆抗體而是多克隆抗體，在與細(xì)菌一起培養(yǎng)6個(gè)小時(shí)的期間內(nèi)，它的數(shù)量增加，且顯示出限制細(xì)菌生長(zhǎng)的特異的殺菌功能。在一段時(shí)間內(nèi)抑制細(xì)菌繁殖的作用是通過(guò)下述機(jī)理產(chǎn)生的IgY的Fab片段的兩個(gè)位點(diǎn)與細(xì)菌的膜外蛋白質(zhì)(菌毛)或脂多糖結(jié)合產(chǎn)生粘著作用并因此破壞細(xì)胞膜的功能。為了生產(chǎn)含有IgY的液態(tài)蛋黃，將含有IgY的雞蛋搗碎分離出蛋黃，雞蛋的抗菌效果通過(guò)ELISA被間接證明。然后，在50-75'C下以低速將蛋黃攪拌15-60分鐘，同時(shí)殺菌。通過(guò)這種方法，使用低溫滅菌得到無(wú)菌條件下的含有IgY的液態(tài)蛋黃。此外，如果使在低溫下攪拌的含有IgY的蛋黃在l-l(TC的冷卻室內(nèi)冷卻過(guò)夜，并在無(wú)菌條件下噴霧干燥，然后就能夠獲得含有IgY的蛋黃粉末。更進(jìn)一步說(shuō)，IgY水溶液也可以通過(guò)下述方法制備得到將分離出的蛋黃在低溫下攪拌，然后用pH值為2-5的酸性水溶液將蛋黃稀釋6-9倍，得到最終的酸度為pH值為5.2-5.5。然后，將蛋黃溶液在1-10。C的冷卻條件下放置至少6小時(shí)(優(yōu)選6-24小時(shí))，并在3000-6000rpm下離心分離15-60分鐘。用這種方法，IgY在上層清液中，顆粒狀的蛋清蛋白被分離，得到IgY水溶液。此外，通過(guò)將IgY水溶液凍干(冷凍干燥)，也可以得到粉末狀的IgY。由于便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸，在很多用途中粉末狀物質(zhì)比液態(tài)物質(zhì)更有用。上述說(shuō)明的分離IgY的方法是有效的，采用簡(jiǎn)單的只使用離心分離機(jī)(離心機(jī))和冷凍干燥機(jī)作為必要設(shè)備的方法，獲得的大于90%的抗體活性滴定度是安全的。將IgY應(yīng)用于實(shí)際的肉質(zhì)加工食品后，觀察由該方法制備的IgY的殺菌和抑制生長(zhǎng)的效果。每一種具有抗12種病原體效果的混合有IgY的粉末和液體被分別應(yīng)用于作為食物樣本的GrillWinner香腸(商標(biāo)名稱，韓國(guó)CJ株式會(huì)社)。在生產(chǎn)香腸的過(guò)程中，IgY的加入量為香腸重量的0.5重量％。觀察香腸在10°C、15"C和35'C下放置8天直到56天的狀況，分析總細(xì)菌數(shù)、感官測(cè)試和表明腐爛的氣體的產(chǎn)生。分析結(jié)果顯示出殺菌和抑制生長(zhǎng)的效果，該效果包括沒(méi)有由1(^個(gè)微生物的殺滅和抑制生長(zhǎng)引起的細(xì)菌生成氣體。在具有良好的抗菌效果的基礎(chǔ)上，IgY不會(huì)影響加工得到的食物的味道，IgY的最大優(yōu)勢(shì)是有望克服現(xiàn)有商購(gòu)天然抗菌物質(zhì)的使用范圍有限的問(wèn)題。另一方面，本發(fā)明涉及殺滅和抑制使肉質(zhì)食品變質(zhì)的病原體和其它微生物生長(zhǎng)的方法，該方法通過(guò)采用上述組合物對(duì)肉質(zhì)食品進(jìn)行處理。針對(duì)這一點(diǎn)，所述組合物應(yīng)該在有效量的范圍內(nèi)使用。而對(duì)處理方法沒(méi)有特別要求，可以在加工食物的過(guò)程中將組合物加入到肉質(zhì)食品中。下面，將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。還應(yīng)該清楚地理解的是，前面只是通過(guò)舉例來(lái)描述，因此，本發(fā)明并不限于該具體的實(shí)施方式。實(shí)施例1:通過(guò)分離和純化制備含有IgY的蛋黃及其組合物通過(guò)下述方法(圖1)制得含有IgY的粉末狀和液態(tài)的蛋黃。關(guān)于整個(gè)制備過(guò)程，挑選出12種在肉質(zhì)食品的衛(wèi)生和質(zhì)量方面會(huì)造成問(wèn)題的病原體，每種細(xì)菌疫苗被注射到隨機(jī)抽樣的母雞體內(nèi)，以獲得對(duì)細(xì)菌具有特異性的IgY物質(zhì)。將IgY分離和純化以檢測(cè)它的活性。通過(guò)低溫滅菌和干燥方法制得含有IgY的液態(tài)蛋黃或蛋黃粉末，間接地證明其有效的抗菌功能。通過(guò)下述方法對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明步驟l:含有IgY的雞蛋的生產(chǎn)為了理想地完成本發(fā)明，將能夠抗包括桿菌(&"7//^)、梭菌(C/o^7W"m)、沙門氏菌(Sa/附o"e〃a)和大腸埃希氏菌(Eco//)在內(nèi)的12種靶向細(xì)菌的疫苗注射到單個(gè)的12周到21周大的白冠來(lái)亨雞體內(nèi)，分別獲得含有能抗12種細(xì)菌的IgY的12種雞蛋。注射的細(xì)菌疫苗是通過(guò)熱處理或化學(xué)處理使細(xì)胞膜變性而被滅活的細(xì)菌，將該細(xì)菌與免疫刺激物質(zhì)混合，并通過(guò)胸腔肌肉注入雞的體內(nèi)。為了產(chǎn)生最大量的抗體，至少注射兩次疫苗。在本發(fā)明中，在初次注射疫苗后，記憶細(xì)胞B被激活，然后進(jìn)行第二次注射使細(xì)胞以幾何級(jí)數(shù)進(jìn)行分裂而產(chǎn)生大量的特異性抗體。步驟2:IgY的分離和純化在本發(fā)明中，將IgY從雞蛋的蛋黃中分離，并通過(guò)ELISA(—種免疫酶響應(yīng)的方法)間接檢測(cè)它的抗菌功能，以確定該含有IgY的蛋黃是否適用。有效地分離IgY是非常重要的，它是來(lái)自蛋黃液態(tài)成分中的一種水溶性成分。因此，在本發(fā)明中，將蛋黃與9倍的酸性的鹽溶液(pH值為5.0-5.5)混合，6小時(shí)后，低密度脂蛋白從混合物中沉淀出來(lái)，只有水溶性物質(zhì)(IgY)能夠通過(guò)離心而分離。將分離出的IgY凍干。通過(guò)ELISA(OD值為450nm)(抗菌效果的一個(gè)間接參數(shù))用OD值分析得到抗特異的病原體的IgY的特征活性。高的OD值間接說(shuō)明它具有高的抗病原體的抗菌效果。結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，IgY對(duì)病原體和其它使產(chǎn)品變質(zhì)的細(xì)菌具有有效的抗菌效果。特別值得注意的是，對(duì)于7種病原體的抗菌效果特別優(yōu)異，例如，0157:H7(大腸埃希氏菌0157:H7)和腸炎沙門氏菌(&/mo"e//ae"^7'"(&，革蘭氏陰性菌)、金黃色葡萄球菌(Sto;^;;/o"ccwa"^w，革蘭氏陽(yáng)性菌)、單核細(xì)胞增生李斯牛寺氏菌(丄/Wer/a附o"ocj^oge"s)、蠟狀芽f包桿菌(5flc/〃wscerews'革蘭氏陽(yáng)性菌和耐熱產(chǎn)孢菌類)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(C7o/nW/wmpe/yh'"gem)、禾卩釀酒酵母(Sacc/2aramycescereWWae)，它們是典型的使產(chǎn)品變質(zhì)的微生物。根據(jù)實(shí)施例的結(jié)果，除了腸炎沙門氏菌和鼠疫沙門氏菌，IgY組合物顯示出抗12種病原體中的大部分病原體的有效的OD值，這說(shuō)明它對(duì)特異的病原體具有優(yōu)異的抑制生長(zhǎng)的性能(參見(jiàn)表l)。表1含有本發(fā)明的IgY的蛋黃的生化特性<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>步驟3:制備含有IgY的液態(tài)蛋黃和蛋黃粉末由于本發(fā)明的含有IgY的蛋黃的抗菌效果表現(xiàn)出了有效的值，下一步是制備含有IgY的液態(tài)蛋黃和蛋黃粉末。將含有IgY的雞蛋搗碎分離蛋黃，通過(guò)上述ELISA法間接證明了IgY的抗菌效果。然后將蛋黃以低速攪拌，同時(shí)在62'C的低溫下滅菌30分鐘。下一步，將液態(tài)蛋黃在(C的冷卻室中冷卻過(guò)夜，然后在無(wú)菌條件下噴霧干燥制備得到蛋黃粉末。制備粉末過(guò)程的產(chǎn)率為83%，蛋黃粉末中的IgY的活性為90.7。/。，這說(shuō)明了在該過(guò)程后相當(dāng)高OD值的IgY被保留下來(lái)。按照實(shí)施例制得的組合物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例l:IgY穩(wěn)定性的測(cè)試為了將本發(fā)明的IgY作為商購(gòu)天然抗菌物質(zhì)而商業(yè)化，有必要確保IgY在各種條件下的穩(wěn)定性。因此，在上述實(shí)施例中設(shè)定的pH值和溫度條件下對(duì)穩(wěn)定性的研究結(jié)果表明，在pH值為3或更低的情況下，由于變性而喪失功能，而且在pH值為9或更高的情況下，抗體功能下降。由于加工食品的酸度一般在pH值為4-7，測(cè)得在這個(gè)范圍內(nèi)IgY能夠保持很好的活性?？偟膩?lái)說(shuō)，為了在食物中使用雞蛋衍生材料，在65"下實(shí)施5分鐘巴斯德殺菌。在這種情況下，IgY顯示出99n/。的抗菌活性。但是，當(dāng)在75'C或更高溫度下加熱l小時(shí)，它的抗菌活性會(huì)減少60%以上。因此，能夠總結(jié)出，這種物質(zhì)適用于非熱能滅菌產(chǎn)品(如圖3)。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2:含有12種IgY的蛋黃粉末的抗菌活性測(cè)試在本實(shí)驗(yàn)實(shí)施例中，分析了將含有對(duì)12種病原體具有抗菌效果的IgY的蛋黃粉末應(yīng)用于實(shí)際的肉質(zhì)加工食品中的滅菌和抑制生長(zhǎng)的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)生產(chǎn)的GrillWinner香腸含有0.5重量％的含有IgY的蛋黃粉末時(shí)，在2(TC的儲(chǔ)存溫度下儲(chǔ)存21天后，觀察到的滅菌效果為10'(如圖4所示)。這樣的抗菌效果是由于特異性免疫球蛋白(IgY)與細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)合而使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生形變，從而使細(xì)菌的細(xì)胞膜的功能被削弱或者喪失(如圖5所示)。因?yàn)镮gY具有基于使細(xì)菌的功能退化的抗菌機(jī)制，它在抑制生長(zhǎng)方面的作用更為有用，而不是通過(guò)殺菌滅活。對(duì)于制得的肉質(zhì)食品(例如火腿或香腸)不能完全被滅菌，微生物安全性是為了抑制病原體的生長(zhǎng)并且將細(xì)菌控制在10M02以下。由于IgY對(duì)特異的病原體具有選擇性抑制生長(zhǎng)的作用，可以注意到，IgY在微生物安全性方面是有效的。因此，當(dāng)加入含有具有選擇性抗菌功能的IgY的蛋黃粉末時(shí)，可以有效地殺滅和控制靶向細(xì)菌的生長(zhǎng)，并且不會(huì)影響(產(chǎn)品的)味道。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3:含有2種IgY的液態(tài)蛋黃的抗菌效果的測(cè)試在本實(shí)驗(yàn)實(shí)施例中，通過(guò)應(yīng)用于實(shí)際的肉質(zhì)加工食品，分析含有對(duì)特別的兩種病原體具有抗菌活性的IgY的蛋黃粉末的滅菌和抑制生長(zhǎng)的作用。兩個(gè)靶向病原體包括近來(lái)經(jīng)常出現(xiàn)在肉質(zhì)加工食品中的李斯特菌a^en'fl)和沙門氏菌(5Wmo"e^)。在本實(shí)驗(yàn)中，將在預(yù)先的測(cè)試中表現(xiàn)對(duì)這些病原體有作用的兩種IgY混合，并進(jìn)行測(cè)試。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)加工的GrillWinner香腸含有0.5重量％的含有IgY的液態(tài)蛋黃時(shí)，在15"的儲(chǔ)存溫度下儲(chǔ)存14天后，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)細(xì)菌總數(shù)有明顯的變化。但是，在沒(méi)有添加IgY的對(duì)照組中，生成了粘液質(zhì)，間接地說(shuō)明香腸處于腐爛狀態(tài)，并且由于產(chǎn)生氣體，包裝袋膨脹，然而，在實(shí)驗(yàn)組中沒(méi)有觀察到這種狀態(tài)改變，這說(shuō)明產(chǎn)品質(zhì)量良好。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3再次證實(shí)了實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2的關(guān)于IgY具有優(yōu)異的抑制微生物生長(zhǎng)的作用的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例4:本發(fā)明的IgY的抗菌效果測(cè)試將0157:H7(大腸埃希氏菌0157:H7)、腸炎沙門氏菌(Sa/mo"e〃ae"fen'^fc)和鼠傷寒沙門氏菌(Sa/mowe〃a0^/2/wMn'ww)的每種疫苗注射，以獲得對(duì)每種微生物具有抗菌效果(殺滅和抑制生長(zhǎng))的液態(tài)IgY。將液態(tài)IgY凍干以制成粉末狀物質(zhì)，然后采用基于免疫酶響應(yīng)方法的ELISA證明對(duì)包括0157:H7(大腸埃希氏菌0157:H7)、腸炎沙門氏菌(Sa/mo"e〃ae"teW^fc)和鼠傷寒沙門氏菌(5"a/mo"e〃a/^7/n'mwn'ww)在內(nèi)的每種特異的病原體的抗菌效果。然后，分別制備含有106-107CFU/mlO157:H7(大腸埃希氏菌0157:H7)、腸炎沙門氏菌"a/wo"e〃a和鼠傷寒沙門氏菌(5^/mo"e//aO^/n'mMn'Mm)的三種鹽溶液，然后分別向三種鹽溶液中加入相應(yīng)的抗0157:H7(大腸埃希氏菌0157:H7)的IgY粉末2.34毫克/毫升、抗腸炎沙門氏菌(5^/mo"e//aewfen'^fo)的IgY粉末0.9毫克/毫升和抗鼠傷寒沙門氏菌(&/mo"e〃a^//z/附wWMm)的IgY粉末0.63毫克/毫升。通過(guò)檢測(cè)細(xì)菌數(shù)量的減少來(lái)研究對(duì)三種類型的微生物的滅菌和抑制生長(zhǎng)的作用隨著時(shí)間的變化。除了靶向細(xì)菌的選擇，IgY粉末的制備與實(shí)施例l相同。結(jié)果表明，抗0157:H7(大腸埃希氏菌0157:H7)的IgY粉末的滅菌效果為102(CFU/ml)(99%的0157:H7被殺滅)。(如圖7所示)。對(duì)于腸炎沙門氏菌"a/wo"e〃ae"&nW^y),滅菌效果表現(xiàn)為101(CFU/ml)(90%的腸炎沙門氏菌(Sa/wo"e〃ae"/en力'cfc)被殺滅)(如圖8所示)?？故髠抽T氏菌(Sa/wo"e〃a0^/2^mn'iw7)的IgY粉末的滅菌效果為101(CFU/ml)(90%的鼠傷寒沙門氏菌(5"a/mo"e〃aO^/2/wwn'wm)被殺滅)(如圖9所示)。為了指出IgY對(duì)0157:H7(大腸埃希氏菌0157:H7)的滅菌或抑制生長(zhǎng)的作用機(jī)理，用電子顯微鏡觀察用IgY處理過(guò)的0157:H7(大腸埃希氏菌0157:H7)。如圖10所示，IgY免疫金標(biāo)記粒子被吸附在0157:H7(大腸埃希氏菌0157:H7)的細(xì)胞膜上。在大約4個(gè)小時(shí)后，該病原體的細(xì)胞膜被破壞以致該病原體死亡或抑制生長(zhǎng)。將根據(jù)實(shí)施例1步驟2分離出的IgY水溶液凍干得到的IgY粉末加入到GrillWinner香腸中。制得的香腸含有0.05重量％的上述IgY粉末，并將其放置在35'C的培養(yǎng)器中。7天后，觀察并分析由微生物(病原體和其它使產(chǎn)品變質(zhì)的微生物)生長(zhǎng)引起的香腸表面發(fā)生的變化。結(jié)果表明，沒(méi)有經(jīng)過(guò)IgY處理的對(duì)照組(A)，由于微生物的生長(zhǎng)，結(jié)構(gòu)被完全破壞，如圖11所示。但是，在添加了本發(fā)明的IgY的實(shí)驗(yàn)組中，微生物被殺滅或被抑制生長(zhǎng)，因此，產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)完好。這證實(shí)了本發(fā)明的IgY具有優(yōu)異的抗菌效果。含有本發(fā)明的對(duì)12種病原體具有抗菌作用的IgY的組合物，被設(shè)計(jì)用來(lái)殺滅和抑制病原體細(xì)菌的生長(zhǎng)，對(duì)導(dǎo)致食物中毒和肉質(zhì)食品腐爛的細(xì)菌具有突出的抗菌效果。本發(fā)明的組合物還在低溫、非熱能處理?xiàng)l件下對(duì)病原體細(xì)菌顯示出優(yōu)異的殺滅和抑制生長(zhǎng)的效果。因此，在食品滅菌工業(yè)中這是一個(gè)杰出的發(fā)明，因?yàn)樗軐⑻烊粴⒕鷦┮愿鞣N方式商業(yè)化應(yīng)用。權(quán)利要求1、一種特異性蛋黃免疫球蛋白的制備方法，該方法包括下述步驟i)通過(guò)給雞注射疫苗來(lái)生產(chǎn)含有特異性免疫球蛋白的雞蛋，該疫苗能抗使產(chǎn)品變質(zhì)的致病細(xì)菌和其它微生物；ii)對(duì)從所述雞蛋中分離出的蛋黃進(jìn)行低溫滅菌；和iii)向已滅菌的蛋黃中加入酸性水溶液并將得到的混合物離心分離。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性蛋黃免疫球蛋白的制備方法，其中，步驟ii)中，所述低溫滅菌在50-75X:下進(jìn)行15分鐘至l小時(shí)。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性蛋黃免疫球蛋白的制備方法，其中，在實(shí)施步驟iii)的離心分離之前，通過(guò)向已滅菌的蛋黃中加入酸性水溶液將最終酸度調(diào)節(jié)至pH值為5.2-5.5。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性蛋黃免疫球蛋白的制備方法，其中，所述使產(chǎn)品變質(zhì)的致病細(xì)菌和其它微生物為嗜水氣單胞菌(Arawoww/z_y<ira/7Ma)、蠟狀芽孢桿菌(B腦.〃mcerews)、空腸彎曲菌(C謹(jǐn)p/2/0Z)ac&rm')、產(chǎn)氣莢膜梭菌(C7o/r/<i/ww;eryHwgera)、大腸埃希氏菌0157:H7(￡^/7^&/7&0//0157:117)、乳酸桿菌(丄actoZ)ac/〃w)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(丄/他r/awo"oqytogera)酉良酒酵母(Sacc/w!ra，cescerev/57'ae)、腸炎t少l、，ft"^^^1"/^^"^//"er"/(^/s)、鼠i^寒》少n氏菌(5^/附0"6//"^p/z/mwr/MW)、金黃色葡萄球菌(S鄉(xiāng)/^/ococcz^awmM1)禾口表皮葡萄球菌(S鄉(xiāng)/2y/0c0ccws5、一種特異性蛋黃免疫球蛋白，該特異性蛋黃免疫球蛋白是由權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的特異性蛋黃免疫球蛋白的制備方法制備得到的。6、含有特異性蛋黃免疫球蛋白的蛋黃，該蛋黃是由包括下述步驟的方法制備得到的i)通過(guò)給雞注射疫苗來(lái)生產(chǎn)含有特異性免疫球蛋白的雞蛋，該疫苗能抗使產(chǎn)品變質(zhì)的致病細(xì)菌和其它微生物；和ii)對(duì)從所述雞蛋中分離出的蛋黃進(jìn)行低溫滅菌。7、含有特異性蛋黃免疫球蛋白的蛋黃粉末，該蛋黃粉末是通過(guò)將權(quán)利要求6所述的蛋黃冷凍干燥而制備得到的。8、對(duì)肉質(zhì)加工食品具有滅菌或抑制腐爛功能的食品添加劑組合物，該組合物含有選自由權(quán)利要求5所述的特異性蛋黃免疫球蛋白、權(quán)利要求6所述的含有特異性蛋黃免疫球蛋白的蛋黃以及權(quán)利要求7所述的含有特異性蛋黃免疫球蛋白的蛋黃粉末所組成的組中的一種或幾種物質(zhì)。全文摘要本發(fā)明涉及一種抑制肉質(zhì)食品中的致病細(xì)菌生長(zhǎng)的含有IgY的組合物，IgY是一種從蛋黃中得到的特異性免疫球蛋白。本發(fā)明的IgY靶向的使肉質(zhì)加工產(chǎn)品變質(zhì)的12種具有代表性的細(xì)菌和其它微生物包括嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、空腸彎曲菌(Camphlobacterjejuni)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clotridiumperfringens)、0157:H7(Escherichiacoli，大腸埃希氏菌0157:H7)、乳酸桿菌(Lactobacillus)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogens)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)。12種細(xì)菌以抗原的形式被分別注射到雞體內(nèi)，以獲得本發(fā)明的抗12種病原體的IgY。文檔編號(hào)C07K16/00GK101400701SQ200780008575公開日2009年4月1日申請(qǐng)日期2007年3月12日優(yōu)先權(quán)日2006年3月10日發(fā)明者孫京鉉,宋珉錫,尹熙南,李惠珍,趙元一申請(qǐng)人:Cj第一制糖株式會(huì)社;Igy公司