專利名稱：：在用人胎兒肝干細(xì)胞注射的免疫缺陷動(dòng)物中產(chǎn)生抗體的方法在用人胎兒肝干細(xì)胞注射的免疫缺陷動(dòng)物中產(chǎn)生抗體的方法本發(fā)明涉及產(chǎn)生抗體的方法、抗體生成細(xì)胞的組合物、它們的生產(chǎn)方法及其用途。發(fā)明背景長(zhǎng)期以來(lái)認(rèn)為單克隆抗體(MAB)是癌癥的免疫療法、感染或自身免疫病等的妙方。然而，由于人抗小鼠的免疫應(yīng)答，人類中使用的笫一代鼠抗體很不成功。人抗體大部分來(lái)自攜帶有受限的一組人類Ig基因的轉(zhuǎn)基因小鼠或使用噬菌體展示、酵母展示或類似重組技術(shù)選自多數(shù)人工抗體庫(kù)。這些策略已經(jīng),皮設(shè)計(jì)用來(lái)消除針對(duì)人類背景中的單克隆抗體的任何免疫反應(yīng)。人抗體可以在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)中產(chǎn)生，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物經(jīng)免疫后能夠在沒(méi)有內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生的情況下產(chǎn)生人抗體。在此類種系轉(zhuǎn)基因小鼠中轉(zhuǎn)移人類種系免疫球蛋白基因陣列導(dǎo)致抗原攻擊時(shí)產(chǎn)生人抗體(見(jiàn)，例如，vanDijk，M.A.和vandeWinkel，J.G.，Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374;Jakobovits，A.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)2551-2555;Jakobovits，A"等人，Nature362(1993)255-258;Bruggemann，M.,等人，YearImmunol.7(1993)33-40)。人抗體也可在逸菌體展示文庫(kù)中產(chǎn)生(Hoogenboom，H.R.和Winter,G.，J.Mol.Biol.227(1992)381-388;Marks,J.D"等人，J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。Cole等人和Boerner等人的技術(shù)也適用于人單克隆抗體的制備(Cole等人，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss，p.77(1985》和Boerner，P.，等人，J,Immunol.147(1991)86-95)。然而此類轉(zhuǎn)基因小鼠只能提供具有受限的一組人類Ig基因的抗體-由轉(zhuǎn)染的免疫球蛋白基因陣列引起的那些?；趯?duì)人類免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)基因的小鼠的方法學(xué)已經(jīng)允許產(chǎn)生來(lái)自人類種系序列的抗體，根據(jù)報(bào)道所述抗體與鼠類的或小鼠-人嵌合抗體相比已經(jīng)降低所獲抗體藥物的免疫原性。然而，來(lái)自轉(zhuǎn)基因小鼠的人抗體與天然人類免疫所有組成成分相比在它們的多樣性、親和力及特異性上有限。類似地，基于噬菌體或酵母展示的組合文庫(kù)方法的主要缺點(diǎn)是抗體重鏈和輕鏈的隨機(jī)配對(duì)。為鑒定具有高親和力的重鏈和輕鏈對(duì)，原始抗體重鏈和輕鏈對(duì)——非同源對(duì)的解離需要篩選多數(shù)克隆。此外，此類非同源對(duì)可能呈現(xiàn)與人類自身抗原不想要的交叉反應(yīng)性。最后，由于固有的選擇偏限。，、、'…、、'、''Traggai,E.等人，Science304(2004)104-107描述了在移植了人類臍血細(xì)胞的Rag2-/-yc-/J、鼠中開發(fā)人類免疫系統(tǒng)的方法，其可用作評(píng)估對(duì)疫苗或活體感染性病原體的應(yīng)答和靶定人類免疫系統(tǒng)的藥學(xué)化合物的臨床前模型。已表明重建并隨后接種病原體的小鼠可產(chǎn)生低水平的破傷風(fēng)類毒素特異性抗體應(yīng)答。發(fā)明概述本發(fā)明包含從免疫缺陷型非人類動(dòng)物中產(chǎn)生人單克隆抗體的方法，所述方法包括使新生免疫缺陷型非人類動(dòng)物與人類胎兒肝干細(xì)胞(FL細(xì)胞)接觸來(lái)產(chǎn)生免疫移植的非人類動(dòng)物(重建動(dòng)物)，隨后使所述重建動(dòng)物與抗原接觸，從所述重建動(dòng)物中收集產(chǎn)生針對(duì)所述抗原的人抗體的人細(xì)胞，并從所述抗體產(chǎn)生細(xì)胞中分離所述抗體。本發(fā)明優(yōu)選包括本發(fā)明的方法，其特征在于通過(guò)轉(zhuǎn)化方法或細(xì)胞融合方法建立所述抗體產(chǎn)生細(xì)胞，優(yōu)選無(wú)限增殖的抗體產(chǎn)生細(xì)胞。優(yōu)選地所述無(wú)限增殖細(xì)胞能夠保持活力至少50代。優(yōu)選地，所述非人類動(dòng)物是嚙齒類動(dòng)物并更優(yōu)選為小鼠、大鼠或兔。進(jìn)一步優(yōu)選所述小鼠是1^82-/-^-/-、棵Rag2-A、NOD(NOD指根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選NOD.Cg-及^產(chǎn)^翻/V/產(chǎn)"SzJ)或SCID米色小鼠并且大鼠是棵大鼠。本發(fā)明包括本發(fā)明的方法，其特征在于所述FL細(xì)胞是人類造血胎兒肝干細(xì)胞(HFL細(xì)胞)，優(yōu)選CD133+、CD117+、CD31+和/或CD34+。在另一實(shí)施方案中，所述方法優(yōu)選地特征在于所述FL細(xì)胞是HFL細(xì)胞和人類非造血胎兒肝干細(xì)胞的組合。本發(fā)明包括本發(fā)明的方法，其特征在于所述抗體產(chǎn)生細(xì)胞是人類B細(xì)胞。本發(fā)明包括本發(fā)明的方法，其特征在于所述FL細(xì)胞經(jīng)腹膜內(nèi)、皮下或肝內(nèi)注射到動(dòng)物中用于接觸。本發(fā)明包括本發(fā)明的方法，其特征在于所述抗原是多肽、MHC/肽復(fù)合體或DNAo本發(fā)明包括本發(fā)明的方法，其特征在于所述抗原作為抗原、抗原片段、編碼抗原的DNA和/或抗原攜帶細(xì)胞與重建動(dòng)物接觸。本發(fā)明包括本發(fā)明的方法，其特征在于所述免疫缺陷非人類動(dòng)物與FL細(xì)胞接觸前接受亞致死照射。本發(fā)明包括本發(fā)明的方法，其特征在于所述小鼠與所述FL細(xì)胞接觸后5到18周小鼠第一次與抗原接觸。本發(fā)明包括本發(fā)明的方法，其特征在于所述小鼠與抗原接觸高達(dá)10次。本發(fā)明包括本發(fā)明的方法，其特征在于所述收集的細(xì)胞是人CD19+或CD22+細(xì)胞。本發(fā)明包括本發(fā)明的方法，其特征在于所述細(xì)胞通過(guò)雜交瘤技術(shù)建立。本發(fā)明包括本發(fā)明的方法，其特征在于融合伴侶細(xì)胞系是MFP-2、HK-128、K6H6/B5或Karpas707細(xì)胞系。本發(fā)明包括用于產(chǎn)生多數(shù)人類B細(xì)胞的方法，所述B細(xì)胞產(chǎn)生完全多數(shù)的針對(duì)抗原的人抗體，所述方法的特征在于使新生免疫缺陷的非人類動(dòng)物與FL細(xì)胞接觸來(lái)產(chǎn)生免疫重建動(dòng)物，隨后使所述重建動(dòng)物與抗原接觸，收集所述人類B細(xì)胞，產(chǎn)生所述完全多數(shù)的抗體。本發(fā)明包括非人類動(dòng)物用于產(chǎn)生本發(fā)明的產(chǎn)生抗原的無(wú)限增殖細(xì)胞的用途。如果所述無(wú)限增殖細(xì)胞是雜交瘤細(xì)胞，用于雜交瘤產(chǎn)生的一種融合伴侶是來(lái)自所述移植并重建動(dòng)物的人類B細(xì)胞，另一種融合伴侶是例如來(lái)自人、嚙齒動(dòng)物或其它動(dòng)物的骨髓瘤細(xì)胞?；蛘咄ㄟ^(guò)EBV轉(zhuǎn)化產(chǎn)生無(wú)限增殖的移植并重建的B細(xì)胞。本發(fā)明包含多數(shù)的人類B細(xì)胞，所述人類B細(xì)胞產(chǎn)生完全多數(shù)的針對(duì)人類蛋白質(zhì)的人抗體。本發(fā)明包含無(wú)限增殖細(xì)胞的組合物，其提供完全多數(shù)的針對(duì)人類蛋白質(zhì)的人抗體。本發(fā)明包含重建動(dòng)物用于產(chǎn)生多數(shù)無(wú)限增殖B細(xì)胞的用途，所述B細(xì)胞產(chǎn)生完全多數(shù)的針對(duì)人類蛋白質(zhì)的人抗體。本發(fā)明包括在非人類動(dòng)物中發(fā)生并產(chǎn)生單克隆人抗體的方法，所述抗體針對(duì)人類蛋白質(zhì)(包括片段)，其與所述非人類動(dòng)物的對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)有至少80。/。(BLAST)的同源性。此實(shí)例是CXCR5。人和鼠的CXCR5有84。/o的同源性。本發(fā)明因此提供方法來(lái)產(chǎn)生針對(duì)高保守蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)區(qū)的人抗體，即使所述蛋白質(zhì)或其片段在人和所述非人類動(dòng)物間具有至少95%或更高的同源性或甚至100%的同源性。因此本發(fā)明的另一目標(biāo)是對(duì)人類蛋白質(zhì)特異的單克隆人抗體，所述人類蛋白質(zhì)與非人類動(dòng)物，優(yōu)選小鼠、大鼠和/或兔的對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)具有至少95%,優(yōu)選98%并甚至100%同源性(BLAST)。本發(fā)明的優(yōu)選目標(biāo)是對(duì)人蛋白特異的單克隆人抗體，所述人類蛋白質(zhì)與對(duì)應(yīng)鼠類(小鼠)蛋白質(zhì)具有至少95%，更優(yōu)選98%并甚至100%同源性(BLAST)。本發(fā)明包括用于重組產(chǎn)生抗體的方法，其特征在于使新生免疫缺陷的非人類動(dòng)物與FL細(xì)胞接觸，隨后使所述非人類動(dòng)物與抗原接觸，從所述非人類動(dòng)物中收集產(chǎn)生針對(duì)所述抗原的人抗體的人細(xì)胞，并分離所述抗體，將可變區(qū)測(cè)序，構(gòu)建編碼重鏈和/或輕鏈至少CDRs的與人恒定鏈組合的表達(dá)載體，在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)所述載體并從所述宿主細(xì)胞或發(fā)酵上清液中分離所述抗體(免疫活性蛋白)。本發(fā)明包含用于重組產(chǎn)生抗體的方法，其特征在于使新生免疫缺陷的非人類動(dòng)物與FL細(xì)胞接觸，隨后使所述非人類動(dòng)物與抗原接觸，從所述非人類動(dòng)物中收集產(chǎn)生針對(duì)所述抗原的人抗體的人細(xì)胞，并從產(chǎn)生人抗體的所述人細(xì)胞中分離mRNA，產(chǎn)生抗體特異性cDNA(例如通過(guò)使用免疫球蛋白特異的引物)，構(gòu)建編碼重鏈和/或輕鏈至少CDRs與人恒定鏈組合的表達(dá)載體，在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)所述載體并從所述宿主細(xì)胞或發(fā)酵上清液中分離所述抗體(免疫活性蛋白)。本發(fā)明包括用于選擇產(chǎn)生人抗體的無(wú)限增殖細(xì)胞的方法，所述人抗體顯示出特異性結(jié)合抗原，所述方法的特征在于提供來(lái)自非人類動(dòng)物脾的產(chǎn)生完全多數(shù)人抗體的多數(shù)人類B細(xì)胞，將所述細(xì)胞或其亞群與無(wú)限增殖的骨髓瘤細(xì)胞融合或通過(guò)EBV轉(zhuǎn)化使所述B細(xì)胞或亞群無(wú)限增殖，并選擇產(chǎn)生人抗體的雜交瘤細(xì)胞，所述人抗體特異性結(jié)合所述抗原。本發(fā)明包括用于選擇產(chǎn)生抗體的無(wú)限增殖細(xì)胞的方法，所述抗體以至少1.5pg/ml的量對(duì)抗原顯示出至少l(T6mo1/1的特異結(jié)合親和力，所述方細(xì)胞，將所述細(xì)胞或其亞群與無(wú)限增殖的骨髓瘤細(xì)胞融合或通過(guò)EBV轉(zhuǎn)化使所述B細(xì)胞或亞群無(wú)限增殖，并選擇產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞，所述抗體對(duì)抗原顯示出至少l(T6mol/l的特異結(jié)合親和力。優(yōu)選地分離的抗體的量是至少1.5ng/ml。優(yōu)選地所述抗體對(duì)所述抗原顯示出至少l(T9mol/l的特異結(jié)合親和力。發(fā)明描述術(shù)語(yǔ)完全多數(shù)的人抗體或人免疫球蛋白基因指抗體或免疫球蛋白基因，其包含或編碼，-來(lái)自2號(hào)染色體(76個(gè)基因，其中31到35個(gè)是有功能的)上2pl1中至少20個(gè)，優(yōu)選31到33個(gè)K基因的K鏈，-來(lái)自22號(hào)染色體22qll位置中至少20個(gè)，優(yōu)選29到33個(gè)k基因和J基因的k鏈；(有4到5個(gè)功能性k鏈基因，XJ基因在每種基因之前)，和-來(lái)自14號(hào)染色體(11個(gè)重鏈基因，其中9個(gè)是有功能的并且分別對(duì)應(yīng)9個(gè)重鏈同種型n、5、yl、y2、y3、丫4、al、a2和s)上14q32中的至少5個(gè)，優(yōu)選9個(gè)重鏈基因的重鏈。例如，抗原可以是來(lái)自人類的物質(zhì)，像人類蛋白質(zhì)、激素、腫瘤相關(guān)的糖脂(例如US5，091，178)或參與天然發(fā)生的人類代謝的另一物質(zhì)。抗原也可以是健康人類耐受的來(lái)自非人類的物質(zhì)，使得此人類不以可檢測(cè)到的方式產(chǎn)生針對(duì)此類抗原的抗體。術(shù)語(yǔ)人類蛋白質(zhì)(其包括多肽)指人類的任意蛋白質(zhì)，其是天然耐受的或在自身免疫疾病中被攻擊的。術(shù)語(yǔ)人類蛋白質(zhì)根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)也包括所述蛋白質(zhì)的片段，其能夠在本發(fā)明合適的非人類動(dòng)物中誘導(dǎo)對(duì)此類人類蛋白質(zhì)特異的抗體。此類片段可以包括在例如更大蛋白質(zhì)中，例如眾所周知可以用來(lái)自另一物種像小鼠的同源蛋白質(zhì)通過(guò)免疫來(lái)誘導(dǎo)針對(duì)人類蛋白質(zhì)的抗體。人類蛋白質(zhì)優(yōu)選為耐受性人類蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)耐受性人類蛋白質(zhì)指人類的蛋白質(zhì)，其為天然耐受性的并在自身免疫疾病像古德帕斯丘綜合征、胰島素依賴型糖尿病(IDDM)、免疫性溶血性貧血、免疫性血小板減少性紫癜、重癥肌無(wú)力(MG)、多發(fā)性硬化(MS)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)或曱狀腺毒癥(格雷夫斯病)中不受攻擊的。例如，人類蛋白質(zhì)可以是跨膜分子(例如受體)或配體如生長(zhǎng)因子。示例性抗原包括分子如腎素；生長(zhǎng)激素，生長(zhǎng)激素釋放因子；曱狀旁腺素；促甲狀腺激素；脂蛋白；a-l-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；促濾泡素；降鈣素；黃體生成素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIII、因子IX、組織因子(TF)，和血管性血友病因子；抗凝血因子如C蛋白；心鈉素；肺表面活性物質(zhì)；纖溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活物(t-PA);鈴蟾肽；凝血酶；造血生長(zhǎng)因子；肺瘤壞死因子a和p;腦咖啡酶；RANTES(激活時(shí)受調(diào)節(jié)，通常T細(xì)胞表達(dá)和分泌)；人類巨噬細(xì)胞炎性蛋白質(zhì)(MIP-l-a);血清清蛋白如人血清清蛋白；Muellerian抑制物質(zhì)；松弛素A鏈；松弛素B鏈；前*〉弛素；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；微生物蛋白質(zhì)，如卩內(nèi)酰胺酶；DNA酶；IgE;細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(CTLA)，如CTLA-4;抑制素；激活蛋白；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF);激素或生長(zhǎng)因子受體；A蛋白或D蛋白；類風(fēng)濕因子；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子如骨衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神經(jīng)生長(zhǎng)因子如NGF-b;血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF);成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子如aFGF和bFGF;表皮生長(zhǎng)因子(EGF);轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)如TGF-a和TGF-卩，包括TGF-bl、TGF-b2、TGF-b3、TGF-b4或TGF-b5;腫瘤壞死因子(TNF)如TNF-a或TNF-j3;胰島素樣生長(zhǎng)因子I和II;胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白；CD蛋白如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22和CD40;促紅細(xì)胞生成素；骨資導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP);干擾素如干擾素a、p和^集落刺激因子(CSFs),例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF;白細(xì)胞介素(ILs)，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL陽(yáng)4、IL-5、IL畫6、IL誦7、IL-8、IL國(guó)9和IL-10;超氧化物歧化酶；T細(xì)胞受體；表面膜蛋白質(zhì)；衰變加速因子；病毒抗原例如，AIDS外殼的部分；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；歸巢受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；整聯(lián)蛋白如CDlla、CDllb、CDllc、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM;腫瘤相關(guān)的抗原如HER2、HER3或HER4受體，和任何上面列出蛋白質(zhì)的片段。其它人類蛋白質(zhì)是ErbB受體家族的成員如EGF受體、HER2、HER3或HER4受體；胂瘤壞死受體超家族的成員，包括DR5;前列腺干細(xì)胞抗原(PSCA);細(xì)胞黏著分子如LFA-1、Macl、p150.95、VLA畫4、ICAM-1、VCAM、a4/p7整聯(lián)蛋白，和av/卩3整聯(lián)蛋白包括其a或卩亞基(例如抗CDlla、抗CD18或抗CDllb抗體)；組織因子(TF);a干擾素(aIFN);白細(xì)胞介素，如IL-8;IgE;血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖癥(OB)受體或mpl受體。術(shù)語(yǔ)無(wú)限增殖細(xì)胞指雜交瘤細(xì)胞或通過(guò)其它方法，像EDV轉(zhuǎn)化、端粒酶置換或逆轉(zhuǎn)錄病毒無(wú)限增殖化使其無(wú)限增殖的細(xì)胞。如此處所用的術(shù)語(yǔ)動(dòng)物指非人類動(dòng)物，優(yōu)選嚙齒類動(dòng)物并尤其優(yōu)選小鼠或大鼠。優(yōu)選地，所述非人類動(dòng)物是嚙齒類動(dòng)物并更優(yōu)選地是小鼠、大鼠或兔。進(jìn)一步優(yōu)選的是所述小鼠是1^82-/-^-/-、棵Rag2-A、NOD或SCID米色小鼠并且所述大鼠是棵大鼠。SCID米色是攜帶scid突變的雙突變小鼠，所述scid突變由于V(D)J重組中的缺陷引起T和B淋巴細(xì)胞的缺失。它也攜帶米色突變，其導(dǎo)致細(xì)胞毒性T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞缺陷及NK細(xì)胞功能的選擇性缺損。SCID米色小鼠是接受人類造血細(xì)胞的潛在改良模型。優(yōu)選的NOD小鼠是NOD.Cg畫及"g/加^卿/V產(chǎn),賦/SzJ、NOD.Cg措f"http://^加，/SzJ、NOD.129S7(B6)匈/'函附/J、NOD.Cg-尸r/^""52附加池7J和NOD.CB17-尸/7W"力SzJ。每一品種缺少成熟的T和B細(xì)胞并且沒(méi)有可檢測(cè)的NK細(xì)胞毒素活性。品種支持用人類造血細(xì)胞增強(qiáng)移植，具有相對(duì)較長(zhǎng)的壽命并且顯著地對(duì)輻射更有抵抗力。及flg2對(duì)在T和B細(xì)胞中產(chǎn)生功能性抗原受體的V(D)J基因重排是必要的；純合的及"^-/-突變體沒(méi)有成熟的有功能的T和B細(xì)胞。常見(jiàn)的y(yc)KO小鼠缺少許多細(xì)胞因子包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15的功能受體。結(jié)果、淋巴細(xì)胞發(fā)育受到纟艮大損害。所述小鼠缺少自然殺傷(NK)細(xì)胞并僅產(chǎn)生少量的T和B細(xì)胞。如此所用，術(shù)語(yǔ)人抗體包括具有可變和恒定區(qū)(結(jié)構(gòu)域)的抗體，所述可變和恒定區(qū)因?yàn)樗鼈兣c確定的人類種系免疫球蛋白序列具有高序列相似性或同一性，所以可以被分配到這些種系序列。人抗體包括抗體的多種形式，優(yōu)選單克隆抗體，包括但不局限于完整抗體、單個(gè)重鏈或輕鏈、抗體片段、類別改變的抗體和遺傳改造的抗體(變體或突變抗體)，只要保留了本發(fā)明的特征性性質(zhì)。尤其優(yōu)選的是重組人抗體。如此處所用的術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"指所有具有基本上相同氨基酸序列的抗體分子制劑。如此處所用，術(shù)語(yǔ)"重組人抗體，，旨在包括通過(guò)重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所有人抗體，如從宿主細(xì)胞如NS0、HEK293或CHO細(xì)胞中分離的抗體，所述宿主細(xì)胞包含能夠表達(dá)所述抗體的重鏈和/或輕鏈的重組表達(dá)載體并且該載體能被轉(zhuǎn)染到此類宿主細(xì)胞中。此類重組人抗體具有重排形式的可變和恒定區(qū)。本發(fā)明的重組人抗體已經(jīng)在體內(nèi)進(jìn)行了體細(xì)胞高變。因此，重組抗體VH和VL區(qū)的氨基酸序列是可以分配給特定人類種系VH和VL序列的序列，但在體內(nèi)可以不天然存在于人抗體種系所有組成成分中。如此處所用"可變區(qū)"(輕鏈(VL)的可變區(qū)，重鏈(VH)的可變區(qū))表示直接參與抗體與抗原結(jié)合的每一對(duì)輕鏈和重鏈?？勺兊娜溯p鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域具有相同的一般結(jié)構(gòu)并且每一結(jié)構(gòu)域包含4個(gè)構(gòu)架區(qū)(FR),其序列高度保守，連接有3個(gè)"高變區(qū)"(或互補(bǔ)性決定區(qū)，CDRs)。構(gòu)架區(qū)采取p片層構(gòu)象并且CDRs可以形成連接所述P-層結(jié)構(gòu)的環(huán)。每一條鏈中的CDRs通過(guò)構(gòu)架區(qū)保持在它們?nèi)S結(jié)構(gòu)中并與來(lái)自其它鏈的CDRs—起形成抗原結(jié)合位點(diǎn)?？贵w重鏈和輕鏈CDR3區(qū)，優(yōu)選重鏈CDR3在本發(fā)明抗體的結(jié)合特異性/親和力中起特別重要的作用，并因此提供了本發(fā)明的另一目標(biāo)。當(dāng)在此處使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"高變區(qū)"或"抗體的抗原結(jié)合部分"指負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。高變區(qū)包含來(lái)自"互補(bǔ)性決定區(qū)"或"CDRs"的氨基酸殘基。"構(gòu)架"或"FR"區(qū)是除了如此處定義的高變區(qū)殘基之外的那些可變結(jié)構(gòu)域區(qū)。因此，抗體的輕鏈和重鏈包含從N-到C-末端的結(jié)構(gòu)域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。才艮才居Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thed.，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)的標(biāo)準(zhǔn)定義來(lái)確定CDR和FR區(qū)。"恒定結(jié)構(gòu)域"不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是顯示出多種效應(yīng)功能。根據(jù)它們重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，抗體或免疫球蛋白被分為如下類別IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且這些的若干可以進(jìn)一步分為亞類(同種型)，例如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4，IgAl和IgA2。對(duì)應(yīng)不同類免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別被稱作H、3、y、《和￡。提供以下實(shí)施例、參考文獻(xiàn)、序列表和圖來(lái)幫助理解本發(fā)明，在所附權(quán)利要求中給出的其真實(shí)范圍。應(yīng)理解可以在不背離本發(fā)明精神的情況下對(duì)提出的方法進(jìn)行#"改。從抗體產(chǎn)生細(xì)胞、腹水和/或上清液中分離抗體可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的方法像層析或透析來(lái)進(jìn)行。例如可以使用選自免疫親和純化、硫酸銨沉淀、A蛋白/G蛋白純化、離子交換層析、凝膠過(guò)濾和/或硫酸銨沉淀的一種或更多種方法來(lái)純化抗體。此類方法在Nau，D.R.，Optimizationofmonoclonalantibodypurification,In:TechniquesinProteinChemistry,Hugli，T.(編輯)，AcademicPress,NewYork,1989，頁(yè)339-347;Coligan，J.E.等人(編輯)，CurrentProtocolsinImmunology,JohnWiley&Sons,Inc.(2005)中有描述。除了雜交瘤產(chǎn)生，可以使用備選方法產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。此類方法例如基于抗體的核酸序列的鑒定。通常鑒定可變區(qū)、CDR區(qū)或甚至僅重鏈CDR3區(qū)的序列就足夠了。優(yōu)選地，從抗體產(chǎn)生細(xì)胞庫(kù)中分離mRNA并用于在合適表達(dá)載體中構(gòu)建編碼此類區(qū)域的cDNA庫(kù)。將cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞如NS0或CHO中并篩選特異性抗體的產(chǎn)生并鑒定和分離特異的克隆并用于在沒(méi)有雜交瘤產(chǎn)生的情況下產(chǎn)生抗體。FL細(xì)胞是能夠發(fā)育成多種血細(xì)胞類型例如B細(xì)胞、T細(xì)胞、粒細(xì)胞、血小板和紅細(xì)胞的千細(xì)胞。人類造血胎兒肝干細(xì)胞通常表達(dá)表面抗原CD31、CD34、CD117(c-kit)和/或CD133。才艮據(jù)本發(fā)明優(yōu)選4吏用表達(dá)CD133的FL細(xì)胞。也可以使用前體細(xì)胞(即胚胎干細(xì)胞)作為FL細(xì)胞，，所述前體細(xì)胞用細(xì)胞因子處理后發(fā)育成為FL細(xì)胞。表達(dá)CD133的FL細(xì)胞可以從人類胎兒肝臟中分離并通過(guò)CD133傳系，優(yōu)選通過(guò)免疫》茲性分離方法例如Miltenyi"MACSseparationsystem"進(jìn)一步分離。分離FL細(xì)胞的另一優(yōu)選方法包括用生物素綴合的CD133抗體標(biāo)記單核細(xì)胞并回收CD133陽(yáng)性干細(xì)胞群的額外步驟。在X染色體上攜帶細(xì)胞因子受體共有Y鏈C/c)無(wú)效突變的小鼠已經(jīng)由DiSanto，J.P.等人，Proc.Natl.Acad.Sd.USA92(1995)377-381描述。Yc一雌性可以與突變純合的雄性雜交，所述突變破壞了RAG2基因(Shinkai，Y.等人，Cell68(1992)855-867)。RAG2缺失雜合及yc缺失半合子的Fl雄性可以與yc:RAG2倍雌性回交。所獲后代的RAG2基因型可以通過(guò)tailDNAPCR來(lái)確定(Horton，R.M.等人，BioTechniques19(1995)6卯一691)。將RAG2雜合子育種來(lái)產(chǎn)生yc一RAG2一雌性和yc々RAG2一雄性小鼠(yc7RAG2-)。這些小鼠具有12901a、Balb/c和C57BL/6的混合背景。本發(fā)明的免疫重建通過(guò)將合適量的人FL細(xì)胞移植到新生的并預(yù)照射的免疫缺陷型動(dòng)物例如小鼠或大鼠的肝臟中發(fā)生?？梢杂眉兓幕驖饪s的抗原制劑、編碼所述抗原的核酸和/或表達(dá)所述抗原的細(xì)胞，通過(guò)免疫本發(fā)明免疫重建的非人類動(dòng)物，優(yōu)選免疫重建的嚙齒類動(dòng)物，最優(yōu)選地免疫重建的大鼠或小鼠來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的人單克隆抗體。然后獲得所述動(dòng)物的B細(xì)胞(例如脾的B細(xì)胞)并將其與合適的人融合伴倡，像骨髓瘤細(xì)胞融合來(lái)形成無(wú)限增殖的雜交瘤細(xì)胞，其通過(guò)與合適的人融合伴侶，像骨髓瘤細(xì)胞融合或通過(guò)用例如EBV將所述細(xì)胞無(wú)限增殖化來(lái)分泌針對(duì)抗原的人單克隆抗體。例如，可溶性抗原或其片段任選綴合到其它分子上，并用作產(chǎn)生抗體的免疫原。對(duì)于跨膜分子，如受體，這些受體的片段(例如受體的胞外結(jié)構(gòu)域)可以用作免疫原?；蛘?，表達(dá)跨膜分子的細(xì)胞可以用作免疫原。此類細(xì)胞可以來(lái)自天然來(lái)源(例如癌細(xì)胞系)或可以是通過(guò)重組技術(shù)轉(zhuǎn)化過(guò)而表達(dá)跨膜分子的細(xì)胞。用于制備抗體的其它抗原和其形式對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。優(yōu)選地，免疫重建的非人類動(dòng)物在第一次免疫時(shí)將是6-16周齡。例如，編碼目的抗原(例如CD20或HER3抗原)的DNA的純化或濃縮制劑可以用于經(jīng)肌內(nèi)免疫本發(fā)明免疫重建的非人類動(dòng)物?？梢杂每艉笕⊙@得的血漿樣品在免疫方案過(guò)程中監(jiān)測(cè)免疫反應(yīng)。血漿可以通過(guò)ELISA來(lái)篩選，并且免疫重建的非人類可以用于對(duì)應(yīng)B細(xì)胞的無(wú)限增殖化，所述免疫重建的非人類具有針對(duì)所述抗原的足夠效價(jià)的抗體。在處死并除去脾臟和淋巴結(jié)和外周血前用目的抗原經(jīng)靜脈內(nèi)對(duì)小鼠進(jìn)行加強(qiáng)。發(fā)現(xiàn)每一種抗原需要進(jìn)行2-3次融合。若干小鼠將用每一種抗原免疫?？梢苑蛛x小鼠淋巴細(xì)胞并基于標(biāo)準(zhǔn)方案使用PEG或電融合與人類的或異源骨髓瘤細(xì)胞融合來(lái)產(chǎn)生雜交瘤。電融合基于細(xì)胞膜可逆的結(jié)構(gòu)變化，其由電場(chǎng)效應(yīng)引起并應(yīng)用于多種細(xì)胞，用于相同或不同來(lái)源的兩個(gè)或更多細(xì)胞的融合，包括它們的完整結(jié)構(gòu)(核、膜、細(xì)胞器、細(xì)胞質(zhì))來(lái)產(chǎn)生新的有活力的細(xì)胞。然后篩選得到的雜交瘤用于產(chǎn)生抗原特異性抗體。例如，將來(lái)自免疫小鼠的脾和淋巴結(jié)衍生淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液融合到K6H6/B5非分泌型異源骨髓瘤細(xì)胞(ATCC、CRL1823)。將約2x105的細(xì)胞涂布在平底微量滴定板中，隨后在選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行約兩周的溫育。然后通過(guò)ELISA篩選各孔中針對(duì)抗原的人單克隆抗體(例如IgG)。通常10-14天后，一旦大范圍的雜交瘤生長(zhǎng)出現(xiàn)，就分析培養(yǎng)基。將分泌抗體的雜交瘤重新涂布，再次篩選，并且如果對(duì)針對(duì)抗原的人單克隆抗體仍然呈現(xiàn)陽(yáng)性，可以通過(guò)有限稀釋進(jìn)行亞克隆至少兩次。然后在體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆以在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生抗體用于表征?？乖梢酝ㄟ^(guò)任何合適的方法引入動(dòng)物中。優(yōu)選地，單獨(dú)或與合適免疫調(diào)節(jié)劑(例如CFA)組合經(jīng)脾內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、肌內(nèi)、皮下免疫動(dòng)物。每一種抗原的劑量?jī)?yōu)選在l-500ng的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法包括在最后一次注射后7-28天提供給動(dòng)物抗原1-500pg的加強(qiáng)劑量的額外步驟。優(yōu)選地，加強(qiáng)所述動(dòng)物1到5次。動(dòng)物的免疫可以在有或沒(méi)有藥物載體的情況下進(jìn)行。合適載體是例如IFA、Al3(OH)4、Abisco。此外，這些載體可以作為免疫刺激劑("佐劑")起作用。除了藥物載體，動(dòng)物的免疫可以在有或沒(méi)有佐劑的情況下進(jìn)行。增強(qiáng)組合物有效性的優(yōu)選佐劑包括但不局限于例如CFA、IFA、Al3(OH)4、Abisco。用于本發(fā)明的優(yōu)選的抗體產(chǎn)生細(xì)胞包括B細(xì)胞。可以通過(guò)從動(dòng)物中去胞。優(yōu)選地，通過(guò)從動(dòng)物中去除脾臟、淋巴結(jié)、外周血或骨髓或其部分來(lái)回收抗體產(chǎn)生細(xì)胞。圖l在移植后第15周對(duì)重建小鼠外周血的流式細(xì)胞分析。人類造血細(xì)胞移植。直方圖顯示的是三種代表性動(dòng)物的活的門控外周血細(xì)胞的覆蓋圖，所述代表性動(dòng)物在重建后15周用抗人CD45-FITCmAb染色(填充區(qū)域)，或同一動(dòng)物用同種型相匹配的、無(wú)關(guān)的對(duì)照mAb(暗線)的背景染色，其中所述對(duì)照mAb用作產(chǎn)生覆蓋直方圖統(tǒng)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)直方圖。統(tǒng)計(jì)代表指定區(qū)域(M1、M2)中事件相比于門內(nèi)事件總數(shù)目的數(shù)目和百分比。顯示了平均熒光強(qiáng)度。A:分子直方圖文件Probe.002X參數(shù)抗人CD45-FITC標(biāo)準(zhǔn)直方圖文件Probe.001X參數(shù)抗人CD45-FITC<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>B:分子直方圖文件Probe.004X參數(shù)抗人CD45-FITC標(biāo)準(zhǔn)直方圖文件Probe,003X參數(shù)抗人CD45-FITC標(biāo)簽事件%門控所有14622231.91Ml11833187.68M2213633.88C:分子直方圖文件Probe.006X參數(shù)抗人CD45-FITC標(biāo)準(zhǔn)直方圖文件Probe.005X參數(shù)抗人CD45-FITC標(biāo)簽事件%門控所有418195.59Ml299268.40M284419.30圖2人抗體在重建小鼠中產(chǎn)生能力的檢測(cè)。圖3免疫后第7周在重建小鼠的外周血中對(duì)人抗原特異性抗體的流式細(xì)胞術(shù)分析。顯示的是一只代表性重建并免疫的小鼠用不同血清稀釋(1/20(C)和1/150(D))染色的抗原陽(yáng)性細(xì)胞相比于作為陰性對(duì)照的對(duì)照小鼠(NMS)的正常血清(第二個(gè)直方圖(B))或相比于作為陽(yáng)性對(duì)照的純化的抗原特異性抗體(上方直方圖(A))的比率(。/。)。統(tǒng)計(jì)代表指定區(qū)域(M2和Ml標(biāo)簽顯示的是分別對(duì)抗原染色呈陽(yáng)性或陰性的細(xì)胞)中事件相比于門內(nèi)事件總數(shù)的數(shù)目和百分比。顯示了平均熒光強(qiáng)度。A:陽(yáng)性對(duì)照分子直方圖總事件6764標(biāo)準(zhǔn)直方圖總事件7072標(biāo)簽%門控%總數(shù)所有95.5495.05Ml2.022.01M293.5593.07B:陰性對(duì)照NMS分子直方圖總事件7093標(biāo)準(zhǔn)直方圖總事件7072標(biāo)簽%門控%總數(shù)所有■3899.87Ml99.3398.83M21.081.07C:血清小鼠1(1/20)對(duì)NMS分子直方圖總事件15544標(biāo)準(zhǔn)直方圖總事件7093標(biāo)簽_%門控_%總數(shù)所有160.13159.45Ml125.33124.80M234.8434.70D:血清小鼠1(1/150)對(duì)NMS分子直方圖總事件7102標(biāo)準(zhǔn)直方圖總事件7093標(biāo)簽_%門控_%總數(shù)所有100.0399.61Ml92,1891,79M27.867.82圖4重建小鼠中人類CXCR5抗體產(chǎn)生能力的檢測(cè)圖5第三次免疫后重建小鼠中人類CXCR5特異抗體產(chǎn)生能力的檢測(cè)。實(shí)施例材料與方法小鼠按照ICH、AAALAC和EUDirectiveonAnimalWelfare,86/609的指導(dǎo)方針在無(wú)特異病原體的情況下飼養(yǎng)和維持BALB/c背景的Rag2,小鼠。新生鼠再增殖測(cè)定出生當(dāng)日，新生小鼠在3-4小時(shí)間隔內(nèi)以滴定為亞致死的劑量2Gy/分鐘接受來(lái)自銫137源(Biobeam8000，STSGmbH,Braunschweig,德國(guó))的2x2Gy照射。照射后4-12小時(shí)，使用30號(hào)針頭(HamiltonBonaduzAG,Bonaduz，瑞士)向小鼠肝臟(i.h.)移植例如單獨(dú)的CD133+FL細(xì)胞或與25inlPBS中非造血CD13I肝臟細(xì)胞的組合或與生長(zhǎng)因子的組合。新生鼠始終接受來(lái)自單個(gè)供體的細(xì)胞。小鼠在3周齡時(shí)斷奶。小鼠的分析為獲得外周血細(xì)胞和血漿，乙醚麻醉后從小鼠眶后靜脈竇采血。流式細(xì)胞術(shù)分析及細(xì)胞分選對(duì)于FACS分析和細(xì)胞分選，使用生物素化或綴合有FITC、PE或APC的針對(duì)以下抗原的單克隆抗體CD3(UCHT1)、CD4(13B8.2)、CD8(B9.11)、CD40(MAB89)、CD80(MAB104)、CD83(HB15a)、CD86(HA5.2B7)(均為Imunotech/BeckmanCoulter,Marseille,法國(guó))、CD19(HIB19)、CD20(2H7)、CD34(581)、IL-3Ra/CD123(9F5)、CDllc(B-ly6)CD14(M5E2)(均為BDPharmingen，SanDiego，CA)、CD45(HI30)、CD45RA(MEM56)、HLA畫DR(TU36)(均為Caltag，Burlingame，CA)、TLR2(TL2.1)、TLRR4(HTA125)、TCRab(IP26)、(均為eBioscience，SanDiego，CA)、BDCA-1、BDCA-2、BDCA-4、CD25(4E3)(均為MiltenyiBiotec)、IgM(JacksonImmunoresearch，WestGrove，PA)、CCR7(3D12，M.Lipp提供，Berlin,德國(guó))。IOTestBetaMark用于Vbanalysis(Imunotech/BeckmanCoulter)。鏈霉抗生物素蛋白綴合的FITC、PE或APC(均為BDPharmingen)用于生物素化抗體的顯影。通過(guò)碘化丙錠染色排除死亡細(xì)胞。合適的同種型匹配的無(wú)關(guān)對(duì)照mAbs用于確定背景染色的水平。使用FACScalibur分析細(xì)胞并用FACSVantageSE(BectonDickinsonImmunocytometrySystems,MountainView,CA)分選細(xì)胞。胎兒肝細(xì)胞。胎兒肝細(xì)胞來(lái)源CambrexCorp.USA和StemCellTechnologiesCorp.USA。實(shí)施例1重建小鼠的免疫方法用lOOpg編碼人類HER3蛋白的質(zhì)粒DNA對(duì)三只Rag2、c一小鼠(3只雌性)進(jìn)行免疫。經(jīng)肌內(nèi)(i.m.)進(jìn)行共高達(dá)六次免疫。當(dāng)發(fā)現(xiàn)抗HER3的血清效價(jià)足夠時(shí)，在融合前3、2和1天用100^1PBS中的30照純化的HER3蛋白質(zhì)靜脈內(nèi)(i.v.)額外加強(qiáng)小鼠三次。實(shí)施例2移入后第15周重建小鼠的外周血的流式細(xì)胞術(shù)分析異氟烷麻醉小鼠然后從眼眶靜脈叢收集外周血用于通過(guò)使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)人類血細(xì)胞的陽(yáng)性率。收集的血液立刻與EDTA-2Na充分混合并在室溫保存直至分析。加入最適量FITC綴合的抗人類CD45抗體并與50^1全血在室溫下反應(yīng)20分鐘。隨后，使用FACS溶液完成溶血及固定并用FACSCalibur測(cè)定比例。圖1顯示的是在三只受測(cè)小鼠外周血中人類CD45陽(yáng)性細(xì)胞的比率(％)。實(shí)施例3重建小鼠中人類HER3抗體產(chǎn)生能力的檢測(cè)通過(guò)ELISA測(cè)定重建小鼠的外周血中總?cè)祟怚gG的量。將稀釋的小鼠血包被在MaxiSorb96孔板(NUNC)上并在室溫下溫育1小時(shí)。室溫下用2%CrotdnC溶液封閉1小時(shí)后進(jìn)行洗滌并隨后加入過(guò)氧化物酶綴合的抗人類IgG單克隆抗體。室溫下溫育45分鐘后進(jìn)行洗滌并加入ABTS底物溶液在室溫下反應(yīng)10分鐘。然后在405nm測(cè)定吸光度(圖2)。參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IgG濃度。實(shí)施例4免疫后第7周重建小鼠外周血中人類HER3抗體的流式細(xì)胞術(shù)分析重建后17周，用目的人蛋白質(zhì)免疫小鼠。用25-100jig/小鼠的編碼目的人類蛋白質(zhì)的DNA與作為佐劑用于加強(qiáng)免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子混合物經(jīng)肌內(nèi)共同進(jìn)行免疫。每四周進(jìn)行同樣的免疫并取血清用于通過(guò)FACS測(cè)定人類蛋白質(zhì)特異性抗體。短暫地向人類蛋白質(zhì)表達(dá)細(xì)胞中加入稀釋的抗血清并在室溫下溫育20分鐘。洗滌后加入最適量FITC綴合的抗人抗體并與細(xì)胞在室溫下進(jìn)一步反應(yīng)20分鐘。此后使用FACSCalibur測(cè)定染色的人類蛋白質(zhì)表達(dá)細(xì)胞的陽(yáng)性率。圖3顯示的是與作為陰性對(duì)照的正常小鼠血清(NMS)或作為陽(yáng)性對(duì)照的純化的人類蛋白質(zhì)特異性抗體相比，一只重建并免疫的小鼠中用不同的血清稀釋液(1/20和1/150)染色的人類蛋白質(zhì)陽(yáng)性細(xì)胞的比率(％)。實(shí)施例5使用Dynabeads進(jìn)行CD19+細(xì)胞的陽(yáng)性篩選按照標(biāo)準(zhǔn)Dynal方案DynabeadsCD19(PanB)(產(chǎn)品號(hào)U1.03/111.04)和DETACHaBEADCD19(產(chǎn)品號(hào)125.06)從外周血或脾細(xì)胞懸浮液中直接分離CD19+B細(xì)胞國(guó)向例如2.5xl()7制備的細(xì)胞中加入25|^1Dynabeads畫在2-8。C下輕微傾斜并旋轉(zhuǎn)溫育20分鐘畫將管放置于磁鐵上2分鐘-棄去上清液并溫和洗滌珠結(jié)合的細(xì)胞4次，使用如下步驟-每1x107Dynabeads⑧力口入1mlBuffer1-將管放置于磁鐵上1分鐘并棄去上清液-在緩沖液/培養(yǎng)基中重懸浮細(xì)胞用于下游應(yīng)用實(shí)施例6用于雜交瘤產(chǎn)生的電融合將分離的CD19+細(xì)胞計(jì)數(shù)并經(jīng)電融合方案(Eppendorf的ElectrofusionNo.58應(yīng)用)進(jìn)行融合-通過(guò)離心(200xg，室溫IO分鐘)收集分離的CD19+細(xì)胞和融合伴倡例如K6H6/B5-在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中重懸浮沉淀并測(cè)定細(xì)胞數(shù)目-將每個(gè)融合伴倡的細(xì)胞數(shù)目設(shè)定為例如每次融合3xl05-將兩種伴侶移液在一起并在室溫以200xg離心10分鐘-在電融合緩沖液中洗滌沉淀兩次，如上描述離心-每次融合在200|Lil電融合緩沖液中重懸浮沉淀國(guó)填充融合室并立刻融合(見(jiàn)Fusionapparat的應(yīng)用方案，Eppendorf)-融合后，允許融合室在室溫下保持10分鐘-用培養(yǎng)基沖洗融合室并轉(zhuǎn)移融合細(xì)胞至克隆平板-經(jīng)24小時(shí)培育(5%C02，37。C)后加入HAT選擇培養(yǎng)基-經(jīng)7-21天培育后計(jì)數(shù)并分析雜種。融合后14天，在建立的ELISA中分析生長(zhǎng)的人類雜交瘤(40個(gè)克隆)的總IgG及人類蛋白質(zhì)特異性IgG并檢測(cè)到至少6個(gè)克隆為陽(yáng)性。雜交瘤HER3ELISACONC(收/ml)IgGELISACONC(收/ml)IgFELISACONC(收/ml)G2:l0,0060,015<0G3:l0,1650,017<0C4:l<-0.0010,015<0E9:lO，OOl0,010<0G9:l0，0020,020<0C10:l0,0550,014<-0.001實(shí)施例7重建小鼠的免疫方法三只Rag2-、c一小鼠(4只雌性)用100叫編碼人類CXCR5蛋白質(zhì)的質(zhì)粒DNA進(jìn)行免疫。經(jīng)肌內(nèi)(i.m.)進(jìn)行共高達(dá)六次免疫。小鼠的加強(qiáng)當(dāng)發(fā)現(xiàn)抗CXCR5的血清效價(jià)足夠時(shí)，在融合前3、2和1天用lOOulPBS中的5乂106個(gè)CXCRS表達(dá)細(xì)胞靜脈內(nèi)(i.v.)額外加強(qiáng)小鼠三次。實(shí)施例8重建小鼠中人類CXCR5抗體產(chǎn)生能力的檢測(cè)通過(guò)ELISA測(cè)定重建小鼠外周血中總?cè)祟怚gG的量。將稀釋的小鼠血清包被在MaxiSorb96孔板(NUNC)上并在室溫下溫育1小時(shí)。室溫下用2%CroteinC溶液封閉1小時(shí)后進(jìn)行洗滌并隨后加入過(guò)氧化物酶綴合的抗人類IgG單克隆抗體。室溫下溫育45分鐘后進(jìn)行洗滌并加入ABTS底物溶液在室溫下反應(yīng)10分鐘。然后在405nm下測(cè)定吸光度(圖4)。參照標(biāo)準(zhǔn)曲線(250照/ml總?cè)祟怚gG)計(jì)算IgG濃度。實(shí)施例9第三次免疫后重建小鼠中人類CXCR5抗體的分析通過(guò)CXCR5特異ELISA測(cè)定重建小鼠血清中人類CXCR5特異IgG的量(圖5)。將稀釋的小鼠血清包被在MaxiSorb96孔板(NUNC)上并在室溫下溫育1小時(shí)。室溫下用2。/。CroteinC溶液封閉1小時(shí)后進(jìn)行洗滌并隨后加入過(guò)氧化物酶綴合的抗人類IgG單克隆抗體。室溫下溫育45分鐘后進(jìn)行洗滌并加入ABTS底物溶液在室溫下反應(yīng)10分鐘。然后在405nm下測(cè)定吸光度。權(quán)利要求1、從免疫缺陷型非人類動(dòng)物中產(chǎn)生人單克隆抗體的方法，所述方法包括將新生免疫缺陷型非人類動(dòng)物與人類胎兒肝干細(xì)胞(FL細(xì)胞)接觸來(lái)產(chǎn)生免疫移植的非人類動(dòng)物(重建動(dòng)物)，隨后將所述重建動(dòng)物與抗原接觸，從所述重建動(dòng)物中收集產(chǎn)生針對(duì)所述抗原的人抗體的人細(xì)胞，并從所述抗體產(chǎn)生細(xì)胞中分離所述抗體。2、權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述免疫重建的非人類動(dòng)物是嚙齒類動(dòng)物。3、權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于所述重建的非人類動(dòng)物是小鼠或大鼠。4、權(quán)利要求1到3的方法，其特征在于所述重建小鼠是Rag2—、c一、棵Rag2-A、NOD或SCID米色小鼠。5、權(quán)利要求1到4的方法，其特征在于所述FL細(xì)胞是人類造血胎兒肝干細(xì)力包(HFL細(xì)胞)。6、權(quán)利要求1到5的方法，其特征在于所述FL細(xì)胞是HFL細(xì)胞和人類非造血胎兒肝干細(xì)胞的組合。7、權(quán)利要求1到6的方法，其特征在于所述抗體產(chǎn)生細(xì)胞是人的B細(xì)胞。8、權(quán)利要求1到7的方法，其特征在于所述抗原是多肽。9、權(quán)利要求1到8的方法，其特征在于所述抗原作為抗原、抗原片段、MHC/肽復(fù)合體、編碼抗原的DNA和/或抗原攜帶細(xì)胞與所述重建動(dòng)物接觸。10、權(quán)利要求1或9的方法，其特征在于所述重建的非人類動(dòng)物在與所述FL細(xì)胞接觸前被亞致死照射。11、權(quán)利要求1到10的方法，其特征在于所述小鼠在與所述FL細(xì)胞接觸后5到18周第一次與所述抗原接觸。12、權(quán)利要求1到11的方法，其特征在于所述小鼠與所述抗原接觸高達(dá)10次。13、權(quán)利要求1到12的方法，其特征在于所述收集的細(xì)胞是人CD19+或CD22+細(xì)胞。14、權(quán)利要求1到13的方法，其特征在于所述細(xì)胞通過(guò)雜交瘤技術(shù)建立。15、權(quán)利要求1到14的方法，其特征在于所述融合伴侶細(xì)胞系是MFP-2、HK-128、K6H6/B5或Karpas707細(xì)胞系。16、用于產(chǎn)生多數(shù)人類B細(xì)胞的方法，所述人類B細(xì)胞產(chǎn)生多數(shù)針對(duì)抗原的人抗體，所述方法的特征在于將新生免疫缺陷的非人類動(dòng)物與FL細(xì)胞接觸來(lái)產(chǎn)生免疫重建動(dòng)物，隨后將所述重建動(dòng)物與抗原接觸，從所述非人類動(dòng)物中收集所述產(chǎn)生多數(shù)抗體的人類B細(xì)胞。17、多數(shù)人類B細(xì)胞，其產(chǎn)生完全多數(shù)的針對(duì)人類蛋白質(zhì)的人抗體。18、無(wú)限增殖B細(xì)胞的組合物，其提供完全多數(shù)的針對(duì)人類蛋白質(zhì)的人抗體。19、重建動(dòng)物用于產(chǎn)生多數(shù)無(wú)限增殖B細(xì)胞的用途，用于產(chǎn)生完全多數(shù)的針對(duì)人類蛋白質(zhì)的人抗體。20、重組產(chǎn)生抗體的方法，其特征在于將新生免疫缺陷的非人類動(dòng)物與FL細(xì)胞接觸，隨后將所述非人類動(dòng)物與抗原接觸，從所述非人類動(dòng)物中收集產(chǎn)生針對(duì)所述抗原的人抗體的人細(xì)胞，并分離所述抗體，將可變區(qū)測(cè)序，構(gòu)建編碼重鏈和/或輕鏈至少CDRs與人恒定鏈組合的表達(dá)載體，在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)所述載體并從所述宿主細(xì)胞或發(fā)酵上清液中分離所述抗體(免疫活性蛋白)。21、重組產(chǎn)生抗體的方法，其特征在于將新生免疫缺陷的非人類動(dòng)物與FL細(xì)胞接觸，隨后將所述非人類動(dòng)物與抗原接觸，從所述非人類動(dòng)物中收集產(chǎn)生針對(duì)所述抗原的人抗體的人細(xì)胞，并從產(chǎn)生人抗體的所述人細(xì)胞中分離mRNA，產(chǎn)生抗體特異性cDNA(例如通過(guò)使用免疫球蛋白特異性引物)，構(gòu)建編碼重鏈和/或輕鏈至少CDRs與人恒定鏈組合的表達(dá)載體，在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)所述載體并從所迷宿主細(xì)胞或發(fā)酵上清液中分離所述抗體(免疫活性蛋白)。22、包含完全多數(shù)的針對(duì)抗原的人免疫球蛋白基因的多數(shù)人類B細(xì)胞用于產(chǎn)生針對(duì)所述抗原的單克隆抗體的用途，其特征在于所述多數(shù)B細(xì)胞具有用于產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞的至少106個(gè)B細(xì)胞/ml的濃度。23、用于選擇產(chǎn)生人抗體的無(wú)限增殖細(xì)胞的方法，所述人抗體顯示出特異性結(jié)合抗原，所述方法的特征在于提供來(lái)自非人類動(dòng)物脾的產(chǎn)生完全多數(shù)人抗體的多數(shù)人類B細(xì)胞，將所述細(xì)胞或其亞群與無(wú)限增殖骨髓瘤細(xì)胞融合或通過(guò)EBV轉(zhuǎn)化使所述B細(xì)胞或亞群無(wú)限增殖，并選擇產(chǎn)生人抗體的雜交瘤細(xì)胞，所述人抗體顯示出特異性結(jié)合所述抗原。24、選擇產(chǎn)生抗體的無(wú)限增殖細(xì)胞的方法，所述抗體顯示出對(duì)抗原至少10—6mo1/1的特異結(jié)合親和力，所述方法的特征在于提供來(lái)自非人類動(dòng)物的脾的產(chǎn)生完全多數(shù)人抗體的多數(shù)的人類B細(xì)胞，將所述細(xì)胞或其亞群與無(wú)限增殖的骨髓瘤細(xì)胞融合或通過(guò)EBV轉(zhuǎn)化4吏所述B細(xì)胞或亞群無(wú)限增殖，并選擇產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞，所述抗體顯示出對(duì)抗原至少l(r6mol/l的特異結(jié)合親和力。全文摘要本發(fā)明涉及從免疫缺陷型非人類動(dòng)物中產(chǎn)生人單克隆抗體的方法，所述方法包括將新生免疫缺陷型非人類動(dòng)物與人類胎兒肝干細(xì)胞(FL細(xì)胞)接觸來(lái)產(chǎn)生免疫移植的非人類動(dòng)物(重建動(dòng)物)，隨后將所述重建動(dòng)物與抗原接觸，從所述重建動(dòng)物中收集產(chǎn)生針對(duì)所述抗原的人抗體的人細(xì)胞，并從所述抗體產(chǎn)生細(xì)胞中分離所述抗體。文檔編號(hào)C07K16/00GK101400702SQ200780008799公開日2009年4月1日申請(qǐng)日期2007年5月9日優(yōu)先權(quán)日2006年5月11日發(fā)明者A·利夫克,B·穆勒-貝克曼,T·施奈澤爾,V·利夫克申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司