專利名稱：：C-反應蛋白的結合劑的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及特異性結合某種蛋白質(在本發(fā)明中為c-反應蛋白)的分子及其用途的領域。
背景技術：
：對折疊多肽進行重新設計的目的在于增加我們對蛋白質結構的了解，并且還提供了具有剪切功能的新蛋白質的工程技術所需的平臺。經(jīng)設計的折疊多肽(其在配體的作用下發(fā)生了受到pH控制的、具有位點選擇性的自功能化過程)構成了用于構建各種復雜的分子體系的極好的工具箱，其中所述各種復雜的分子體系例如有模型糖蛋白或復雜受體。國際專利公開WO03/080653的目的是提供經(jīng)折疊的、配體修飾的螺旋-環(huán)-螺旋的多肽支架結構，該多肽支架結構與識別和報告之類的重要的生物傳感事件有關。選擇人碳酸酐酶II(HCAII)與其抑制劑(4-羧基苯磺酰胺)之間良好表征的相互作用來作為原理實證的證明。C-反應蛋白是一種血漿蛋白，其在發(fā)炎期間以及在組織受損之后以增加的量在血流中循環(huán)。測定CRP的水平以用于評價(例如)發(fā)炎和心血管疾病風險增加的程度。此外，重要的是在心臟手術期間也要測量CRP的水平。發(fā)明概述本發(fā)明涉及經(jīng)進一步修飾從而特異性地與C-反應蛋白(CRP)結合的多肽支架結構。在下文中，這種經(jīng)修飾的多肽支架結構被稱為"CRP-特異性結合劑"、"CRP-結合劑，，或簡稱為"結合劑"，除非另外指明，否則這些術語可交換使用。在第一個方面中，本發(fā)明涉及CRP-特異性結合劑，其包含具有根據(jù)SEQIDN0:l序列的多肽，其中至少1個磷酸膽堿衍生物與所述多肽和多肽支架結構連接，所述多肽支架結構由四螺旋束構成，該四螺旋束由具有根據(jù)SEQIDNO:1序列的多肽的二聚體形成，其中所述CRP-特異性結合劑通過引入包含磷酸膽堿衍生物和可任選的報告基團的結合部分而被修飾，其中所述報告基團可以產生可檢測的信號。所述二聚體的2個原聚體可以通過(例如)二硫鍵而彼此共價連接，但是也可以以非共價的形式彼此結合。此外，每個原聚體都可以被用作結合劑。本發(fā)明還涉及用于產生根據(jù)所述第一實施方案的多肽的方法，該方法包括以下步驟-合成具有根據(jù)SEQIDNO:l序列的多肽；衍生物與所述多肽的未封閉的賴氨酸接觸；、、'-可任選地，在適于報告基團與賴氨酸發(fā)生連接的條件下使報告基團與所述多肽的未封閉的賴氨酸接觸。在另一個方面中，本發(fā)明涉及根據(jù)所述第一方面的結合劑在治療和診斷應用中以及在生物技術應用中的用途，其中所述治療和診斷應用例如為將所述結合劑摻入到藥物或診斷用的組合物中以及用于檢測樣品(例如得自心臟手術中的或懷疑患有炎癥的患者)中CRP的濃度的測定，其中所述的生物技術應用例如為蛋白質純化或結合鑒定。圖1為本發(fā)明所用的肽支架結構的文庫的概況。圖2示出了本發(fā)明的CRP-結合劑與CRP的親和性。圖3是使用本發(fā)明的CRP-結合劑進行CRP檢測的示意圖。圖4分別示出了天然丙酮酸激酶、與連接體結合的丙酮酸激酶以及與CRP-結合劑結合的丙酮酸激酶的活性。圖5為分別由本發(fā)明的激酶結合的CRP-結合劑和激酶結合的CRP-特異性抗體所產生的信號強度的對比圖。圖6為由檢測得自人、馬和狗的CRP所使用的、本發(fā)明的激酶結合的CRP-結合劑所產生的信號強度的對比圖。發(fā)明詳述另人驚奇的是，本發(fā)明人示出了通過將磷酸膽堿連接在某一位置處可以急劇地增加CRP與多肽支架結構之間的結合親和力。單獨的磷酸膽堿與CRP的結合親和力為~1juM，支架多肽與CRP的結合親和力為~100-1000jjM，然而用磷酸膽堿衍生物修飾的所述多肽與crp的結合親和力可為納摩爾級。未經(jīng)修飾的支架結構與CRP的表面結合，而磷酸膽堿衍生物被引入到所述多肽支架結構上的結合位點內部的位置處或者與所述多肽支架結構上的結合位點非常接近的位置處。為了到達CRP上的結合位點，磷酸膽堿衍生物可以具1-12個碳原子(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個碳原子)的間隔物。本發(fā)明的結合劑的另一個令人驚奇的優(yōu)點在于它們與得自不同哺乳動物的CRP都具有高的親和力，這一點與CRP-特異性抗體截然不同，CRP-特異性抗體通常與得自一種哺乳動物物種的CRP以高親和力結合，而與得自其他物種的CRP則以較低的親和力結合。所述多肽支架結構還可以根據(jù)電荷的變化而改變，以便使該多肽支架結構與CRP的結合親和力達到最佳。這可以優(yōu)選地通過在所述多肽中將帶電的氨基酸殘基更換為不帶電的氨基酸殘基，或者通過使所述多肽中的氨基酸殘基帶有不同的電荷來實現(xiàn)，反之亦然。例如，Val或Ala(不帶電荷)可以更換為Glu(帶1個負電荷)或Arg(帶1個正電荷)。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，所述多肽支架結構具有至少2個可以分別連接CRP-結合部分和報告基團的賴氨酸殘基?；镜亩嚯闹Ъ芙Y構原聚體具有根據(jù)SEQIDN0:l的序列。所述原聚體可以采用本領域技術人員已知的任何方法制備，所述方法例如有重組技術或傳統(tǒng)的自動化固相多肽合成技術。一個或多個位置處可以為賴氨酸。這些位置優(yōu)選選自位置8、10、15、17、22、25、34和37。然后，根據(jù)以下所述的方法使CRP-結合部分和可任選的報告基團與賴氨酸連接。所述報告基團可以為能夠與賴氨酸殘基連接并且能夠產生可檢測信號的任何基團。報告基團的優(yōu)選實例為熒光探針，例如丹磺?；⑾愣顾?、熒光素、羅丹明和OregonGreen衍生物。所述報告基團還可以是酶(例如磷酸烯醇丙酮酸激酶)或可檢測的顆粒(例如金質納米顆粒)。可以根據(jù)供貨商的說明書或釆用其他傳統(tǒng)方法使所述報告基團與賴氨酸殘基連接。優(yōu)選的是，在新合成的原聚體還在樹脂上時，使所述報告基團與所述原聚體連接。所述CRP-結合部分為包含磷酸膽堿部分和間隔物的磷酸膽堿衍生物。所述間隔物的長度取決于配體與所述支架結構連接的位置以及配體與CRP結合的位置。所述間隔物通常為l-12個碳原子的脂肪族鏈，該脂肪族鏈可任選地被親水性基團所取代，從而增強其溶解性。通過使原聚體與磷酸膽堿衍生物的活性酯接觸，使得磷酸膽堿衍生物與原聚體連接。所述活性酯具有以下所示的通式OP(OH)20(CH2)2N+(CH3)2(CH2)nC00R1(I)其中1<n<12,并且W為pKa為約6-8的離去基團。其中n為4、6或11并且W為對硝基苯基的活性酯的合成在以下的試驗部分中有所描述。如試驗部分所公開的那樣將磷酸膽堿衍生物引入到多肽支架結構中。本發(fā)明的CRP-結合劑還可以可任選地通過連接體與固體支持物結合。許多固體支持物(例如片、板、珠子和膜)和連接體是市售可得的，并且技術人員可以根據(jù)本發(fā)明的CRP-結合劑的使用環(huán)境而將它們結合起來。結合測定方法
技術領域：
：本發(fā)明的一個方面涉及使用本發(fā)明的結合劑進行的結合測定方法，更具體地說，本發(fā)明的一個方面涉及用于消除由生物樣品中類風濕因子或人抗小鼠抗體(HAMA)造成的干擾的方法。不同類型的夾心測定法(sandwichassays):故廣泛4吏用。最普通的方法之一是夾心ELISA法，在該方法中，使用抗體來捕獲抗原并使用另一種標記抗體來檢測結合的抗原。這些抗體通常都是哺乳動物來源的。在所述的測定方法中，存在于樣品(通常得自諸如血液或血清之類的體液中)中的抗哺乳動物IgG的抗體可以通過檢測抗體與捕獲抗體相結合而模擬抗原的行為，從而導致假陽性反應。這種假陽性反應可以在基于多克隆抗體和單克隆抗體的夾心測定中觀察到。越來越多的患者被給予小鼠單克隆抗體以進行診斷或治療。施用單克隆抗體通常會誘導患者體內發(fā)生抗體反應12;從而產生人抗鼠類動物抗體(HAMA)。已知，當HAMA存在于患者的血清中時，基于小鼠單克隆抗體的夾心型測定會產生假陽性結果。隨著使用單克隆抗體進行治療的患者的數(shù)量的增多，在臨床化學試驗中將產生越來越多的問題。此外，在許多免疫測定中，類風濕因子(RF)是產生干擾的主要原因。RF是與哺乳動物IgG的Fc部分發(fā)生反應的自身抗體。RF可以是IgA種類、IgG種類或IgM種類。在60%至80%的患有類風濕性關節(jié)炎(RA)的患者的血清中具有RF活性。在患有其他相關組織疾病和許多其他疾病的患者的血清中也發(fā)現(xiàn)了RF。雖然RF與IgG的Fc-部分發(fā)生反應，但是RF在與不同種類的IgG的反應性中顯示出異質性。在涉及抗體的測定方法中，這種與其他種類的IgG的反應性可以產生假陽性反應。經(jīng)典的用于RF的試驗為凝集試驗，該試驗中，RF與兩種(如果是IgM-RF試驗，則為更多種)不同的哺乳動物IgG分子發(fā)生反應，從而導致凝集。在夾心ELISA中，同樣的反應也將產生假陽性反應，這是由于在抗原(該抗原為對所述測定方法進行設計以便將其檢測出來的抗原)不存在的情況下檢測抗體與捕獲抗體發(fā)生了結合的原因。由于抗-IgG的抗體通常直接針對IgG分子的Fc部分，所以解決上述問題的一個方法是在所述的測定中使用Fab片段。然而，對IgG進行酶切以產生Fab片段是耗時的，并且通常導致抗體滴度減少，并且不會降低由抗-Fab的抗體所產生的干擾。此外，為了避免上文中提及的問題，已經(jīng)采用引入小鼠IgG或小鼠血清或者引入層析法來除去起干擾作用的抗體。引入正常小鼠IgG或正常小鼠血清有時不會消除假陽性反應。通過層析法除去起干擾作用的抗體是耗時的，并且很少適用于常規(guī)分析。因此，本發(fā)明的一個方面是將所述測定方法中的至少一種抗體變成根據(jù)本發(fā)明的、不會被HAMA或RF結合的結合劑。在這方面的一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于測定樣品中C-反應蛋白的濃度的方法，該方法包括-使所述樣品與根據(jù)權利要求1-6中任意一項所述的第一多肽二聚體接觸，其中所述第一多肽與固體支持物結合；-使所述樣品與根據(jù)權利要求3-6中任意一項所述的、其上連接有報告基團的第二多肽二聚體接觸，以及-檢測所述第二多肽二聚體上所述報告基團的存在及缺乏情況。實驗部分磷酸膽堿衍生物PC6、PC11和PC4的合成如上文中說明的那樣，與所述多肽支架結構連接的磷酸膽堿衍生物可以具有1-12碳原子的間隔物。在上述磷酸膽堿衍生物中，PC表示磷酸膽堿，PC后的數(shù)字表示間隔物的長度，即PC6表示具有6個碳原子的間隔物。關于PC6的合成，我們首先選擇一種如方案1所概述的簡短的途徑。在第一步驟中，通過在催化氫化條件下使用甲醛將相應氨基酸烷基化，從而以較高的產率制備出6-二甲基氨基己酸。使用強酸性陽離子交換劑對所得叔胺進行簡單純化。3然后，將羧酸官能團酯化，從而以基本定量的產率生成甲基酯，并且無需純化步驟。通常，隨后僅以適當?shù)漠a率進行使用了溴化物的烷基化過程，其中所述溴化物是由二乙基磷酰氯和2-溴乙醇容易地制得的。4在經(jīng)過RPHPLC純化后，用氫氧化鋰使甲基酯裂解，并且以幾乎定量的產率得到羧酸，并且無需純化。活性酯的生成是按照Kim等人的方法使用氯曱酸對硝基苯酯、一種堿和DMAP來進行的。5在經(jīng)過RPHPLC純化后，獲得了所述的活性酯，產率僅為28%。磷酸基團的最終脫保護過程是使用TMSBr在溫和的條件下進行的，從而沒有影響羧酸酯。6另一方面，對于某些底物而言，該反應過程中生成副產物是該過程的已知的缺點。7但是，除了單脫保護的磷酸酯和不具有磷酸基團的季胺之外，我們得到了所需的磷酸酯，產率為25%。關于PC11的制備，為了避免繁瑣的純化過程和溶解性問題，我們選擇在固相上合成的途徑(方案2)，該途徑包括若干步驟。因此，利用DIC方法使Fmoc保護的十一酸與Wang樹脂相連，產率為66%。8在使用哌啶脫保護后，用曱酸和硼氫化鈉完成二甲基化過程。9對季胺的烷基化步驟是緩慢的反應過程，并需要IO當量的溴化物并需要加熱4天。1Q在使粗產物從樹脂上裂解下來之后，釆用我們在制備PC6過程中使用的相同的方法將該粗產物轉變?yōu)榛钚怎ァＡ姿峄鶊F的最終脫保護步驟與PC6中的過程相似，并且有副產物形成，但是得到了27%的所需產物。方案1PC6-對硝基苯基酯的合成磷酸2-溴-乙基酯二乙基酯。將由2-溴乙醇(1.42mL，20mmol)和無水吡啶(3.23mL，40mmol)在無水二氯甲烷(25mL)中形成的溶液冷卻至0C。向其中滴加二乙基磷酰氯(3.36mL，23mmol)，并在室溫下將所得的反應混合物攪拌24小時。加入二乙酯(40mL)和1NHCl(40mL)，將形成的有機層分離出來，并用1NHC1和飽和的NaHC03進行連續(xù)的洗滌，然后在MgSO,上干燥。在溶劑蒸發(fā)后，采用柱層析(硅膠，乙酸乙酯戊烷=1:l)純化殘余物，從而得到為淺黃色油狀物的產物(4.85g，18.6mmol，93%)。！11NMR(CDC13,400MHz)&=1.34(dt，6H，2xCH3，3J[H，H]=7.2Hz，4J(H，P)-1.2Hz);3.52(t，2H，CH2Br，3J=6Hz);4.13(dq，4H，2xCH2CH3，3J(H，H)=7.2Hz，3J(H，P)=7.2Hz);4.28(dt，4H，2xOCH2CH2Br，3J(H，H)=6.4Hz,3J(H，P)=8.4Hz)。13CNMR(CDC13，100.5MHz)5=16.0(d，2xCH3，3J=6.8Hz);29.4(d，CH2Br，2J-7.6Hz);64.0(d，OCH2，2J=5.3Hz);66.5(d，OCH2，2J-5.3Hz)。6-二曱基氨基己酸。在過量的甲醛(4mL)和10。/。Pd/C(0.5g)存在的條件下，在室溫、&壓力為90psi的條件下將由氨基酸(l.32g，10mmol)在水中形成的溶液在Parr裝置中氫化36小時。將催化劑通過過濾除去，并用熱水洗滌2次。將混合的水層通過DOWEX50WX2-100離子交換柱。在將該交換柱用水洗滌之后，用2y。的含水Nm)H對該柱進行洗脫，從而得到為無色晶體的純凈產物(l.39g，8，7mmol,87%)。6-二甲基氨基己酸甲酯。在30分鐘內，向由6-二甲基氨基己酸(1.37g,8.6mmol)在無水甲醇(50mL)中形成的冰冷卻的溶液中滴加亞硫酰氯(9mL)。將所得反應混合物溫暖至室溫，并攪拌過夜。在減壓下使溶劑蒸發(fā)。反復加入甲醇，隨后再進行蒸發(fā)，從而以幾乎定量的產率得到為無色固體的、純的曱基酯。'HNMR(DMSOd6，400MHz)5=1.27(m，2H，CH2);1.53(m，2H，CH2);1.63(m，2H，CH2);2.31(t，2H，I=7.6Hz，CH2);2.67(s，6H，N(CH3)2);2.96(t，2H，3J=8Hz，CH2);3.57(s，3H，COOCH》。13CNMR(DMSOd6，100,5MHz)5=23.1;23.8;25.3;32.9;41.7;51.2;56.0;173.1。三氟乙酸[2-二乙氧基-磷酰氧基]-乙基]-(5-甲氧基羰基-戊基)-二甲基銨。將曱基酯(1.73g，10mmol)溶解于無水乙腈(15mL)中，并加入K2C03(1.38g，10mmol)。將所得懸浮液在氮氣下回流36小時。在所得混合物冷卻至室溫后，加入水，并通過加入TFA將pH調至2。所得溶液采用rpHPLC(SupelcoDiscoveryC18，21.2mmx15cm,5fim，A:5%IPA，95%H20，0.1%TFA;B:90%IPA，10%H20,0.1%TFA;在14分鐘內B由0%升至15%，tR=11.8min)進行純化，并將所得物凍干，從而得到為淺黃色油狀物的TFA的季胺鹽(l.06g，3.Ommol，30%)。LC-MS(Phe誦enexGemini,C18，5jum，150x3.0mm，A:0.1%的甲酸水溶液，B:0.1%的甲酸乙腈溶液，在10分鐘內B由10%升至50%),tR=6.4min(LSD信號)，對于[M+H]+,m/z=354.2。力NMR(CD30D，400MHz)5=1.41-1.50(m，8H,2xOCH2CH3和CH》;1,77(m，2H，CH2);1.90(m，2H，CH2);2.44(t，2H，CH2，3J=7.2Hz);3.25(s，6H，N(CH3)2);3.48(m，2H，CH2);3.72(s，3H，C00CH3)3.82(m，2H，CH2);4.26(dq，4H，2xCH2CH3，3J(H，H)=6.8Hz，3j(HiP)=8.0Hz);4.58(brs，2H，CH2)。13C證(CD30D，100.5MHz)5=16.4(d，2xOCH2CH3，3J=6.1Hz);23.3(CH2);25.3(CH2);26.7(CH2);34.4(CH2);52.0(CH3);52.2(CH3);62.1(d，CH2，2J=5.3Hz);64.8(CH2);66.1(d，CH2，2J=6.1Hz);66.7(CH2);175.5(CO)。三氟乙酸(5-羧基-苯基)-[2-(二乙氧基-磷酰氧基)-乙基]-二甲基銨。將TFA的季胺鹽(200mg,0.56mmol)溶解于叔丁醇/水(2:1,9mL)的混合物中，并加入LiOHH20(47mg，1.12mmol)。將所得反應混合物在室溫下攪拌3小時，并在減壓下除去有機溶劑。用O.1NHC1將所得含水溶液的pH調至7，隨后將該混合物凍干，并在未進行純化的條件下進一步使用。LC-MS(Phe誦enexGemini,C18，5|am,150x3.0mm，A:0.1%的甲酸水'溶液，B:0.1%的甲酸乙腈溶液，在10分鐘內B由10°/。升至40%),tR=6.8min(LSDsignal),對于[M+H]+,m/z=340.2。力腿(CD3OD，400MHz)5=1.34-1.42(m，8H，2xOCH2CH3和CHJ;1.67(m,2H，CH2);1.80(m，2H，CH2);2.20(t，2H，CH2，3J=7.6Hz);3.16(s，6H，N(CH3)2);3.40(m，2H，CH2);3.72(brs，2H，CH2);4.18(dq，4H，2xCH2CH3，3J(H，H)=7.0Hz，3J(H，P)=8.0Hz);4.50(brs，2H，CH2)。13CNMR(CD3OD，100.5MHz)5=16.4(d，2xOCH2CH3，3J=6.8Hz);23.2(CH2);26,5(CH2);27.1(CH2);37.9(CH2);52.0(CH3);62.1(d，CH2，2J=4.6Hz);64.5(CH2);66.1(d，CH2，2J=6.1Hz)，66.8(CH2);181.3(CO)。三氟乙酸[2-(二乙氧基-磷酰氧基)-乙基]-二甲基-[5-(4-硝基-苯氧羰基)-戊基]-銨。向由羧酸(26mg，0.076mmol)在無水乙腈(3mL)中形成的溶液中連續(xù)加入三乙胺(O.01mL，0.084mmol)、氟甲酸對硝基苯酯(31mg，0.15mmol)和DMAP(lmg)。4小時后，通過加入0.1%的TFA水溶液4吏反應停止，隨后采用rpHPLC(SupelcoDiscoveryC18，21.2mmx15cm，5|um，A:5%IPA，95%H20，0.1%TFA，B:90%IPA，10%H20，0.1%TFA，在12分鐘內B由20%升至40%,tR-10.3min)進行純化，從而得到為無色油狀物的對硝基苯酯(IOmg，0.022mmol,28%)。LC-MS(PhenomenexGemini,C18,5pm，150x3.0mm，A:0.1%的甲酸水溶液，B:0.1%的曱酸乙腈溶液，在8分鐘內B由10%升至90%)tK-4.3min(UV信號)，對于[M+H]+，m/z-461.5。^腿(CDC13，300MHz)5=1.34(t，6H，2xOCH2CH3，3J=7.2Hz);1.48(m，2H，CH2);1.81(m，4H，2xCH2);2.63(t，2H，CH2，3J=7.2Hz);3.27(s，6H，N(CH3)2);3.51(m，2H，CH2);3.92(m，2H，CH2);4.14(dq，4H，2xCH2CH3，3J(H，H)=7.5Hz，3J(H，P)=7.5Hz);4.47(m，2H，CH2);7.27(d，2H，3J=9Hz，Phe-H);8,25(d，2H，3J-9Hz，Phe-H)。13CNMR(CDC13，75.4MHz)5=16.0(d，2xOCH2CH3，3J=6.6Hz);22.4(CH2);23.8(CH2);25.4(CH2);33.6(CH2);51.6;60.8(d，CH2，2J=4.8Hz);63.3();64.7(d，CH2，2J=5.9Hz);65.7;122.5(2xPhe-CH);125.2(2xPhe-CH);145.3(Phe-C;155.3(Phe-C);170.8(CO)。三氟乙酸二曱基-[5-(4-硝基-苯氧羰基)-戊基]-(2-膦酰氧基-乙基)-銨。將被保護的對硝基苯酯(20mg，0.043mmol)溶于無水乙腈(3mL)中，并加入三甲基溴硅烷(O.11mL，0.87mmol)。將所得反應混合物在室溫下攪拌24小時。在向其中加入0.1%的TFA水溶液(lmL)后，所得溶液采用rpHPLC(SupelcoDiscoveryC18，21.2mmx15cm,5|am，A:0.1%的TFA水溶液，B:0.1%的TFA乙腈溶液，在14分鐘內B由17%升至30%，tR=12.7min)進行純化，從而得到作為TFA鹽的磷酸膽堿衍生物PC廣對硝基苯酯(4.6mg，0.011mmol，25%)。LC-MS(PhenomenexGemini,C18，5|um，150x3.0mm,A:0.1°/。的甲酸水溶液，B:0.1%的甲酸乙腈溶液，在10分鐘內B由10%升至90%)tR=3.8min(UV信號)，對于[M+H]+，m/z=405.5。方案2三氟乙酸(10-羧基-癸基)-[2-(二乙氧基-磷酰氧基)-乙基]-二曱基-銨將Fmoc-十一酸(635mg，1.5mmol)溶于無水DMF(2ml)中，并加入由二異丙基碳二亞胺(O.12ml，0.75mmol)在無水二氯甲烷(10ml)中形成的溶液。將所得的黃色混合物在0X:下攪拌20分鐘。在除去揮發(fā)性的二氯甲烷之后，將對稱酐溶液加入Wang樹脂(250mg，1.2mmol/g，0.3mmol)中。加入DMAP(18mg，0.15mmol)，并將所得反應混合物攪拌過夜(W.C.Chan,P.D.WhiteinFmocSolidPhasePeptideSynthesis,APracticalApproach(Eds.:W.C.Chan,P.D.White)OxfordUniversityPress,Oxford2000，pp.55-56.)。將樹脂用DMF(5x2min)和二氯甲烷(5x2min)洗滌，并用乙醚進行收縮。將該過程重復l次，并根據(jù)對Fmoc-哌咬加合物進行的UV分光光度測定法，測定最終的取代水平為0.8醒ol/g(66°/。)。(ibid.，pp62-63)在用20。/fl的派咬/DMF進行Fmoc脫保護后，使樹脂在THF中溶脹。向其中加入由THF(2ml)、甲醛(40%，0.7ml,1mmol)和乙酸(0.7ml)形成的混合物，并將樹脂溫育5分鐘。然后，加入氰基硼氫化鈉(62mg，1mmol)，并將樹脂在室溫下攪拌過夜。此后，將樹脂用THF、H20和MeOH依次洗涂。E.G.Brown,J.M.NussTetrahedronLett1997，38，8457-8460。使樹脂在DMF中溶脹，并加入磷酸二乙酯-(2-溴-乙酯)/磷酸2-溴乙酯二乙酯(520mg，2mmol)和DIEA(O.03ml,0.2mmol)，然后將所得反應混合物加熱至60X:，并持續(xù)4天。將所得樹脂用DMF和DCM洗滌，并用MeOH進行收縮。J.Cai，B.WatheyTetrahedronLett.2001，42,1383-1385。最后，通過將產物與TFA/H20/TIS(95:2.5:2.5)的混合物一起攪拌2h，從而將所述產物從樹脂上裂解下來。在有機溶劑蒸發(fā)之后，使用了羧酸，并加入水，然后將產物凍干并且沒有進行進一步的純化。三氟乙酸[2-(二乙氧基-磷酰氧基)-乙基]-二甲基-[10-(4-硝基-苯氧羰基)-癸基]-銨向由羧酸X在無水乙腈(5ml)中形成的溶液中連續(xù)加入三乙胺(0.03ml，0.2mmol)、氯曱酸對硝基苯酯(80mg,0.39mmol)和DMAP(7mg)。4小時后，通過加入0.1%的TFA水溶液使反應停止，隨后釆用RPHPLC(SupelcoDiscoveryC18，21.2mmx15cm,5jum，A:濃度為0，1%的由TFA在IPA/H20(5:95)中形成的溶液，B:濃度為0.1%的由TFA在IPA/H2O(90:10)中形成的溶液，在20分鐘內B由15%升至45%,tR=16.5min)對所得產物進行純化，從而得到為無色油狀物的對硝基苯酉旨X(4mg，0.007mmol，。/。)。LC-MS(Phe醒enexGemini,C18，5jam,150x3.0mm,A:0.1°/。的甲酸水溶液，B:0.1°/。的甲酸乙腈溶液，在IO分鐘內B由10%升至90°/。)tR=5.2min(UV信號)；M=三氟乙酸二甲基-[10-(4-硝基-苯氧羰基)-癸基]-(2-膦酰氧基-乙基)-銨將被保護的對硝基苯酯(4mg，0.007mmol)溶于無水乙腈(3ml)中，并且分別在O小時、12小時和24小時后加入三甲基溴硅烷(O.11ml,0.07mmol)。將所得反應混合物在室溫下共攪拌36小時。在向其中加入O.r/。的TFA水溶液(lml)之后，通過rpHPLC(HichromC8，21.2mmx25cm,10jam,A:濃度為0.1%的由TFA在ACN/H20(10:90)中形成的溶液，B:濃度為0.1%的由TFA在ACN/H20(90:10)中形成的溶液，在15分鐘內B由40°/。升至60%,tR=14.2min)對所得溶液進行純化，從而得到作為TFA鹽的磷酸膽堿衍生物(l.1mg，0.002mmol，27%)。LC-MS(Phe誰enexGemini,C18，5jlim，150x3.0mm,A:0.1%的甲酸水溶液，B:0.1%的甲酸乙腈溶液，在IO分鐘內B由10°/。升至90%)tR=5.9min(UV信號)，M=475.4(M+)。PC44-二甲基氨基丁酸甲酯與制備PC6的過程相同!H證(D20，400MHz)5=2.06(m，2H，CH2);2.56(t，2H，3J=7.2Hz，CH2);2.93(s，6H，N(CH3)2);3.22(m，2H，CH2);3.75(s，3H，C00CH3)。13CNMR(CD3OD，100.5MHz)5=20.9;31.2;43.5;52.3;58.1;174.3。IX-MS(Phe議enexGemini,C18,5|am，150x3.0mm,A:0.1%的曱酸水溶液，B:0.1%的甲酸乙腈溶液，在IO分鐘內B由10°/。升至50%)tR=1.3min(ELSD信號);M=146.4((M+H)+)。h3oh3三氟乙酸[2-二乙氧基-磷酰氧基]-乙基]-(3-甲氧基羰基-丙基)-二甲基銨將曱酯X(516mg，3.5mmol)溶于無水乙腈(8ml)中，并加入K2C03(484mg，3.5mmol)。將所得懸浮液在氮氣下回流24h。在將其冷卻至室溫后，加入水，并通過加入TFA將pH調至2。所得溶液采用rpHPLC(SupelcoDiscoveryC18，21.2mmx15cm,5pm，A:0.1%的TFA，5W的IPA水溶液，B:0.1%的TFA，10%的IPA水溶液，在10分鐘內B由0%升至10%,tR=8.8min)進行純化，并將所得物凍干，從而得到為淺黃色油狀物的TFA的季胺鹽。力腿(CD30D，400MHz)5=1.36(t，6H，2x0CH2CH3，3J-6.8Hz);2.08(m，2H，CH2);2,47(t，2H，CH2，3J-7.2Hz);3.20(s，6H，N(CH3)2);3.45(m，2H，CH2);3.70(s，3H,C00CH3);3.76(t，2H，CH2，3J=4.4Hz);4,18(dq，4H，OCH2CH33J(H，H)=7.2Hz，3J(H，H)=7.2Hz);4.52(bs，2H，CH2)。13C腿(CD30D，100.5MHz)5-16.4(d，2xOCH2CH3，3J=6.1Hz);19.0(CH2);30.7(CH2);52.3(CH3);52.4(CH3);62.1(d，CH2，2J=4.5Hz);64.4(CH2);65.4(CH2);66.1(d，CH2，2J=6.0Hz);174.0(CO)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>三氟乙酸(3-羧基-丙基)-[2-(二乙氧基-磷酰氧基)-乙基]-二甲基銨與制備PC6的過程相同LC-MS(Phe議enexGemini,C18，5|am，150x3.0mm,A:0.1%的甲酸水溶液，B:0，1%的甲酸乙腈溶液，在IO分鐘內B由10%升至50%)tR=1.8min(ELSD信號)；M-312.3<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>三氟乙酸[2-(二乙氧基-礴酰氧基)-乙基]-二甲基-[3-(4-硝基-苯氧羰基)-丙基]-銨向由羧酸在無水乙腈(5ml)中形成的溶液中連續(xù)加入三乙胺、氯甲酸對硝基苯酯和DMAP。4小時后，通過0.1%的TFA水溶液使反應停止，隨后采用RPHPLC(SupelcoDiscoveryC18，21.2mmx15cm,5pm,A:0.1%的TFA，5°/。的IPA水溶液，B:0.1%的TFA，10%的IPA水溶液，在13分鐘內B由10%升至30%,tR=11.8min)進行純化，從而得到為無色油狀物的對硝基苯酯。LC-MS(PhenomenexGemini,C18，5叫150x3.0mm，A:0.1%的甲酸水溶液，B:0.1%的甲酸乙腈溶液，在10分鐘內B由10°/。升至90%)U=3.1min(UV信號);M=433.2(M+)。用于制備PC6的備選方案前幾年，開發(fā)出了用于制備磷酸膽堿配體PC6的備選策略。下文中將對此進行概述。將這種用于制備PC6(化合物9)的策略概括于方案3中。由于即使使磷酸官能團以被保護的形式來進行其他必需的轉化步驟，其也被認為是麻煩的，所以將磷酸化過程選擇作為最后的步驟。通過Eschweiler-Clarke形式的反應過程(用甲醛和氫/鈀/碳進行處理)，對市售可得的氨基己酸2進行N，N-二甲基化n'12,并通過用曱醇的鹽酸溶液進行處理來將所得產物(3，86%)酯化，從而得到甲基酯4(96%)。通過使曱基酯4與被單甲氧基三苯甲基保護的溴乙醇1反應來實現(xiàn)季銨化過程，從而形成衍生物5(73%)。未被保護的溴乙醇也能與曱基酯4反應，但是反應產率較低，并且產物更難以檢測和純化。單曱氧基三苯甲基保護基團賦予了重要的中間產物5以親油性和TLC可檢測性(UV光可見并且可進行酸染色)。用氫氧化鋰/水/叔丁醇對衍生物5進行皂化，得到了相應的酸6，在未對酸6(95W進行分離的情況下，用溶解于吡啶中的對硝基苯酚和二異丙基碳二亞胺對其進行處理，得到了對硝基苯酯7(86%)。由于對硝基苯酯7易于發(fā)生自縮合，所以用曱酸對對硝基苯酯7進行簡單的處理便得到了相應的醇8，該醇8在下一步驟中被直接使用。將醇8粗品在ox:下溶解于乙腈中，并使其首先與過量的氯氧化磷和三乙胺反應，然后再與水反應，從而在HPLC純化后由對硝基苯酯7得到了所需的單磷酸酯9，產率為22%?；衔?顯示出了所期望的醒R和LC-MS光語，并且在pH為酸性的水溶液(O.1y。TFA)中穩(wěn)定存在。但是，為了方便儲存，將化合物9作為DMS0儲備溶液存放于冰箱中。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>方案3，試劑，條件和產率a:CH20，H2，Pd/C(86%);b:CH30H，HC1(96%);c:Na2C03,CH3CN(73%);d:LiOH，t-BuOH/H20(95%);e:DIPCDI，吡咬(86W;f:HC00H/H20;g:P0C13，TEA;h:H20(22%,由對硝基苯酯7得到).常規(guī)方法-在減壓下進行濃縮[浴溫〈401C]。使用VarianUnity500MHz分光計在298。K下記錄醒R光鐠。只報告所選的NMR數(shù)據(jù)。通過合適的2-D試驗來確證分配。采用Perkin-ElmerSCIEXAPI150-EX質譜儀以直接進樣模式來進行針對稀釋的曱醇或乙腈溶液的電噴霧質譜(ES-MS)測定。使用供應商提供的軟件在AppleMacintoshQuadra計算機上記錄陽離子模式的光鐠，并對其進行處理。在SilicaGelF254(Merck,Darmstadt,Germany)板上進行TLC，并采用UV光和/或用5%的茚三酮丁醇溶液或5%的硫酸乙醇溶液進行染色來實施檢測。除非另作說明，否則在Matrexsilicagel60A(35-70jam,Amicon)上進行柱層析。使用VarianHPLC系統(tǒng)來實施制備性HPLC的過程，其中所述VarianHPLC系統(tǒng)由9012梯度泵、9065二極陣列檢測器、以及運行VarianStarHPLC軟件的PC計算機系統(tǒng)構成。用得自InternationalSorbentTechnology有限公司(MidGlamorgan,UK)的IsoluteC-18EC反相硅膠(40-70微米顆粒尺寸)填滿開放式玻璃柱，并用特定的溶劑洗脫該IsoluteC-18EC反相硅膠。除非另作說明，否則其他試劑和溶劑均購買具有高商業(yè)品質的種類，并且在無需進一步純化的條件下使用。2-單曱氧基三苯甲氧基-l-溴乙醇(l)-該化合物的制備方法與相應的三苯甲基衍生物的制備方法類似13。簡言之，在室溫下將單甲氧基三苯曱基氯(3.09g，10mmol)加入到由溴乙醇(l.0g，8.0mmol)在無水吡啶(5mL)中形成的溶液中。12小時后，TLC(己烷乙酸乙酯=9:1)顯示存在2個1^吸收點，一個吸收點(主要的)的rf值為0.9，一個吸收點(次要的)的rf值為0.7。向所述溶液中加入水(O.1mL)，并且在室溫下將所得混合物攪拌15分鐘后，該混合物被隔在乙酸乙酯和2M硫酸水溶液之間，然后用碳酸氫鈉水溶液洗滌有機層，并濃縮該有機層。通過柱層析在硅膠(160g)上純化殘余物(其中所述硅膠裝于濃度比為95:5的戊烷-乙酸乙酯中)，并用逐步梯度為95:5至90:10的戊烷-乙酸乙酯進行洗脫。收集主要的部分，從而得到作為漿狀物的1(2.75g，87%),其在靜置過程中發(fā)生結晶?？晒┻x用的其他方式是，省略層析過程，并使?jié){狀物粗品直接從曱醇中結晶析出，從而得到純的晶體，產率為40-50°/。。直接進樣模式的ES-MS顯示，在m/z273處形成1個巨大的峰(其為單甲氧基三苯甲基陽離子)，但是在419/421處形成了2個非常小的峰(M+Na)。H-NMR數(shù)據(jù)(CDC13):3.44/3.48(2個多重峰，2+2H，OCH2CH2Br)，3.83(s，3H，Ar0CH3)，6.88(d，2HiArH)，7.24-7.52(m，12H,Ar-H)。6-[N，N-二甲基氨基]-N-[2-(單甲氧基三苯甲氧基)-乙基]-己酸甲酯(5)-將由6-氨基己酸(2，13.2g)在含水曱醛(37。/n，40mL)中形成的溶液與Pd/C(1.0g)混合，并將所得混合物在室溫和50巴下、在Parr不銹鋼裝置中進行氫化，同時進行磁力攪拌。通過TLC(乙酸乙酯甲醇乙酸水=6:3:3:2，茚三酮檢測)方法進行的檢驗表明，起始物(rf0.7)幾乎完全轉化為遷移較慢的產物(rf0.5，褐色)。使反應混合物通過硅藻土床過濾，并將該過濾器床用水洗滌(20mL)，然后用水(60mL:進行稀釋，并使所得溶液緩慢通過Dowex-50Wx2(100目)的柱(其中Dowex-50Wx2為H+形式，0.7meq/mL，150mL，并用milli-Q水仔細地進行了預洗滌)。然后，用milli-Q水(200+100mL)洗滌所述的柱子，接著用2%的氨水(400mL)洗脫所得產物。通過TLC(乙酸乙酯甲醇乙酸水=6:3:3:2，茚三酮檢測)方法對洗脫物進行監(jiān)測。使合適的流分部分蒸發(fā)，然后凍干，從而得到半固體殘余物(13.7g，86%)。直接進樣模式的ES-MS顯示出，在m/z160.2處形成了一強峰(M+H)，其與N，N-二甲基化的產物(3)相應。將一部分產物(3)粗品物質(3.97g，25mmol)溶解于甲醇(75mL)中，并且在冰中冷卻并進行攪拌，同時在30分鐘內滴加亞硫酰氯(10mL，134mmo1)，然后停止冷卻，并將所得混合物置于室溫下過夜。通過TLC(乙酸乙酉旨曱醇乙酸水=10:3:3:2，茚三酮檢測)方法進行的檢驗表明，上述混合物轉化成移動稍快的化合物，并且該化合物的著色淺且顏色不同。其中還帶有少量之前步驟中的移動較快的雜質。16小時后，濃縮所得反應混合物，并將所得物與甲醇進行若干次共濃縮，從而得到一種在靜置時發(fā)生部分結晶的殘余物(5.05g)。該殘余物的直接進樣模式的ES-MS顯示出，在m/z174.0處形成了一強峰(M+H)，其與6-(N,N-二甲基氨基)-己酸甲酯(4)相應。將一部分產物(4)粗品物質(1.12g，純度約為75%，4.0mmol)、無水乙腈(25mL)、2-(單甲氧基三苯氧基)-2-溴乙醇(1，1.60g，4.0mmol)和固態(tài)無水碳酸鈉(800mg)回流(浴溫為70匸)過夜，而后，TLC表明僅發(fā)生了部分轉化，因此加入更多的化合物1(800mg，2.Ommol)和碳酸鈉(500mg),并將回流再持續(xù)24小時。然后，TLC表明大部分起始物質消失，并生成一種新的、遷移較快且發(fā)生茚三酮顯色的UV吸收點。該混合物被隔在二氯甲烷和水之間(其中所需的物質存在于有機相中)，然后將水相用少量的二氯甲烷洗滌，接著將所得的混合的有機層用少量的水洗滌，然后將所得物濃縮至小體積(10mL)，該濃縮物被隔在甲基叔丁基醚和水之間(現(xiàn)在，所需的物質存在與水相中)。將有機相用少量水洗滌，并將混合的水層用少量的甲基叔丁基醚洗滌。然后馬上對混合的水性溶液進行旋轉蒸發(fā)，從而除去非水性溶劑(大約除去了1/3體積的溶劑)，使殘余溶液通過Bond-ElutC-18-EC柱(35g，填充甲醇，然后用水平衡)，然后用水洗滌，然后先用20%、再用50°/。、最后用60%的甲醇水溶液進行洗脫。用60%的甲醇洗脫液洗脫作為純的條帶的所需物質。收集合適的流分，然后加入幾滴吡啶，并將所得溶液凍干，從而得到了為白色固體的化合物5(1.53g，73%)。ES-MS在m/z490處顯示出強的峰(M+)。H-NMR數(shù)據(jù)(CDC13):1.31(m，2H，H-4)，1.65(m，2H，H-3)，1.75(m，2H，H-5)，2.31(t，2H，H-2),3.30(s，6H，(CH3)2N)，3.47(m，2H，H-6)，3.62(m，2H,0CH2CH2N)，3.68(s，3H，C00CH3)，3.82(s，3H，Ar0CH3)，3.93(m,2H，0CH2C謹)，6.89(d，2H，ArH)，7.24-7.41(m，12H,ArH)。6-(N，N-二甲基氨基)-N-[2-(單甲氧基三苯氧基)-乙基]-己酸對硝基苯酯(7)-將化合物5(420mg，0.86mmo1)在2:1的丁醇-水(6.0mL)中形成的溶液與氫氧化鋰(72mg)混合，并將所得溶液在室溫下攪拌3小時，然后TLC(乙酸乙酯甲醇乙酸水-12:3:3:2)表明，所述混合物完全轉化成rf稍低的化合物。在此階段的ES-MS光鐠顯示出在m/z476.0和482.3處形成峰(分別為M+H和M+Li)。將所述混合物用水稀釋(10mL)，然后用0.1M的鹽酸水溶液將pH調至7.5，接著將所得溶液凍干，從而得到粗品6(510mg，混有氯化鋰)。將該粗品6物質(約0.86mmol)溶于無水吡啶(6.0mL)中，然后加入對硝基苯酚(400mg，2.86mmol)和二異丙基碳二亞胺(270microL，0.176mmol)。在RT下攪拌3小時后，加入另一部分二異丙基碳二亞胺(200微升)，并將所得混合物在r.t.下再攪拌24小時，而后TLC(乙酸乙酯甲醇乙酸水=15:3:3:2)表明反應完全。使所述混合物蒸發(fā)，然后將所得物與二氯曱烷-曱苯共蒸發(fā)3次，從而除去吡啶。所得殘余物被隔在0.2M的含水乙酸三乙基銨(pH5.O)和甲基叔丁基醚之間(其中每種溶劑均為約100mL,并且需要劇烈地搖動以使各種物質均被溶解)，TLC(乙酸乙酯甲醇乙酸水=10:3:3:2，UV和茚三酮檢測)表明，所得產物只存在于水相中，而大部分的對硝基苯酚和其他UV吸收雜質存在于有機相中。將該有機相用少量的含水緩沖溶液洗滌，并將混合的水相用甲基叔丁基醚洗滌，然后用二氯甲烷萃取(現(xiàn)在，TLC表明所述產物完全進入到有機相中)。將所述水層用少量的二氯甲烷洗滌，并將混合的有機層用少量的緩沖液洗滌，然后小心分離。在此階段，TLC表明形成了純度極高的物質，并且H-NMR也證實了這一點。將所述物質以溶液形式保存在冰箱中，如果需要的話，可以對其進行濃縮，從而得到漿狀的粗品7(440mg，86%)。按照所述的方式，在冷凍溫度下所述物質還可以保持數(shù)星期不變。所述物質的ES-MS顯示出在m/z596.8處形成了強的信號(M+)。H-NMR數(shù)據(jù)(CDC13):1.41(m，2H，H-4)，1.75-1.85(m，4H，H-3，H-5),2.63(t，2H，H-2)，3.24(s，6H，(CH3)2N)，3.49(m，2H，H-6)，3.62(m，2H，0CH2CH2N)，3.81(s，3H，Ar0CH3)，3.84(m，2H，0CH2CH2N)，6.89(d，2H，ArH)，7.24—7.41(m，12H,ArH)，8.28(d，2H，ArH)。6-(N，N-二甲基氨基)-N-[(2-磷酰氧基)-乙基]-己酸對硝基苯酯(9)-將由化合物7(55mg，0.10mmol)溶于甲酸(2mL)中形成的溶液在RT下保持60分鐘，然后將其濃縮，接著再與無水乙腈共濃縮3次。將所得殘余物8(通過TLC(乙酸乙酯甲醇乙酸水=6:3:3:2,茚三酮和UV檢測)和ES-MS(m/z325.2，M+)方法表明其純度較高)溶于無水乙腈(0.5mL)中，并將所得物加入到冷的(OK)、由氯氧化磷(0.019mL，0.2mmo1，剛剛蒸餾得到)和三乙胺(0.069mL，0.5mmol)在無水乙腈(O.5mL)中形成的溶液中。在將所得物在OiC下保持1小時后，加入更多的氯氧化磷(O.05mL)和三乙胺(O.05mL)，再過1小時后，加入水(O.05mL),并將所得混合物在Or下再攪拌1小時，而后TLC表明大部分的起始物質消失，并出現(xiàn)了遷移率極低(rf0.05)的UV吸收點。將所得的反應混合物用0.2%的TFA水溶液(3.8mL)稀釋，再用甲基叔丁基醚(3.5mL)洗滌，然后小心分離水相，并立刻在35X:下進行旋轉蒸發(fā)(減少至約2/3的體積)，然后將所得溶液注入SupelcoDiscoveryC-18柱(15x21.2cm,5microM)上的400微升的部分中，其中流速為8.0mL/min并且在40分鐘內水在乙腈中的濃度梯度從82%減少至58%(其中0.1%TFA的濃度被一直保持)。分別在18-20分鐘和24-26分鐘時觀察到一個主要的和一個次要的UV吸收(300nm)峰，這兩個峰分別與所需的產物9和起始物質8相應。將含有產物9的流分集中起來并濃縮至小體積，然后凍干，從而得到為無定形物質的純的產物9(9mg，由化合物7得到，產率為22W。LC-MS光鐠在m/z405.2處顯示出一個主要的信號(M+)。H-NMR數(shù)據(jù)(DMSO-d6):1.38(m，2H，H-4)，1.67-1.78(m，4H，H-3，H-5)，2.69(t，2H，H-2)，3.01(s，6H，(CH3)2N)，3.35(m，2H，H-6)，3.60(m，2H，0CH2CH2N)，4.24(m，2H，0CH2CH2N)，7.44(d，2H，ArH)，8.31(d，2H，ArH)。H-醒R數(shù)據(jù)(D20，HOD=4.68):1.35(m，2H，H-4)，1.66(m,2H，H-3或H-5)，1.72(m，2H，H-3或H-5)，2.59(t，2H，H-2)，3.02(s，6H，(CH3)2N)，3.28(m，2H，H-6)，3.52(m，2H，0CH2C咖，4.19(m，2H，0CH2C固)，7.22(d，2H，ArH)，8.19(d，2H，ArH)。肽的合成通過固相肽合成技術制備出16個含有42個殘基的肽的文庫(參見圖1)。所述文庫中的組分隨著帶電殘基的個數(shù)以及配體摻入的位置的變化而變化。在各種情況下，合成過程相同，在此以3-C15L8Cys24(TA4Cys(Acm)}的合成過程作為實例進行說明。利用標準的Fmoc化學法，在Pioneer自動化肽合成儀(AppliedBiosystems)上合成多肽。以0.2mmol/g的取代7jc平在Fmoc-PAL-PEG-PS樹脂上以0.lmmol的規(guī)模進行合成。使用以下氨基酸衍生物(得自NovabiochemAG):Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-0H、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH和Fmoc-Val-OH。Lysl5的側鏈受到Aloc保護，而Boc保護用于Lys8。將4倍過量的氨基酸衍生物用于各偶聯(lián)步驟中。在與DIEA(二異丙基乙胺，1M，溶于DMF中)連接的過程中，將TBTU(0-(7-苯并三唑-l-基)-l，1，3，3-四曱基脲四氟硼酸酯，0.5M，溶于DMF中)用作偶聯(lián)劑。除了Gln、Cys、Pro和His(90min)以及第一殘基Arg和Asn(2小時)外，均采用60min的標準偶聯(lián)時間。在傳統(tǒng)的自動化固相肽合成結束后，用乙酸酐使游離的N-末端乙?；缓髮渲靡宜狒?二氯甲烷(3:1)的混合物處理2小時，接著用二氯甲烷(6X)洗滌該樹脂，再用乙醚使樹脂收縮。用溶于氯仿/乙酸/N固(N-甲基嗎啉)(18:2:1)中的3當量的四(三苯基)鈀(O)處理2.5小時來除去Aloc保護基團。將樹脂連續(xù)用DIEA(濃度為0.5%，溶于DMF中)、二乙基二硫代氨基甲酸鈉(濃度為0.5%,溶于DMF中)、DMF和二氯甲烷洗滌，并用乙醚收縮。用溶于DMF中的HBTU(3當量)、HOBt(3當量)和DIEA(6當量)處理4個小時來使得7-甲氧基香豆素-3-羧酸(3當量)與Lysl5的側鏈偶聯(lián)。將樹脂用DMF和二氯甲烷洗滌，并用乙醚收縮。在室溫下，用TFA、TIS(三異丙基硅烷)和水(這三種物質的比例為95:2.5:2.5，每100mg的樹脂加入lml上述混合物)處理超過2個小時來將肽從樹脂上切下。在減壓下使TFA蒸發(fā)，并通過加入冷的二乙基醚使肽沉淀，然后進行離心、洗滌和凍干處理。通過RPHP1X(HichromC8，21,2mmx25cm，10jam,A:0.1°/。的TFA，10%的ACN水溶液，B:0.1°/。的TFA，10%的ACN水溶液，在18分鐘內B由38°/。升至46%，tR-16.0min)處理使粗產物得以純化。肽支架結構二聚體的制備二疏鍵的形成(H.Tamamura，A.Otaka，J.Nakamura，K，Okubo，T.Koide，K.Ikeda，T.Ibuka，N.FujiIntJ.PeptideProteinRes.1995，45,312-319.):將所述的3-C15L8Cys(Acm)24肽(2.4mg(0.51jnmol)溶于TFA(200pl)中，并加入三氟甲基磺酸銀(silvertriflate)(5mg，20jLimol)和苯曱醚(l滴)。將所得的反應混合物在4X:的水箱中溫育24小時。在加入乙醚之后，所述的肽發(fā)生沉淀，然后用冷的乙醚洗滌3次。向沉淀中加入DMSO(O.25ml)和lNHC1(1ml)。將反應混合物在室溫下攪拌22小時。將所得的懸浮液離心，并丟棄沉淀。用稀釋的NaOH中和所得的液體，并通過RP-HPLC(分析條件VarianC18,150x4.6mm，5ym，A:0.1%的TFA，10。/。的ACN水溶液，B:0.1°/。的TFA，10°/。的ACN水溶液，在30分鐘內B由30%升至60%，tR-23.4min)方法進行分析。PC6-對硝基苯酯與TA4+Cys(Acm)的反應本部分為用于將磷酸膽堿衍生物引入肽上的方法的具體實施例，在這種情況下，所述肽為在Cys殘基上具有保護基團Acm的TA4+。向由TA4+Cys(Acm)肽(500pg，0.1pmole)在100|uL0.1M的磷酸緩沖液(pH8)中形成的溶液中加入2.8jiL溶有O.1MPC6-對硝基苯酯的DMSO(0.3pmole，3當量)。將所得的反應混合物在40*€下溫育。LC-MS(Phe麵enexGemini,C18，5jum，150x3.0mm,A:0.1°/。的甲酸水溶液，B:0.1%的甲酸乙腈溶液，在10分鐘內B由100/0升至90°/。)tR=4.1min(UV信號)，對于[M+8H廣，m/z-670.5，對于[M+7H廣，m/z=766.1，對于[M+6H]"，m/z-893.3，對于[M+5H廣，m/z=1071.9。TA4+PC6Cys(Acm)肽在涂敷有F108-2-吡啶基二硫化物的多孔聚苯乙烯上的固定向由ta4+PC6Cys(Acm)肽(90pg，18nmol)在18jiL0.1M的磷酸緩沖液(pH8)中形成的溶液中加入1.8jaL的5(^的MeOH水溶液(其中溶有5mg/mL碘)(8.6jjg，34nmol，相對于巰基是2倍過量的)。將所得的反應混合物在25X:下溫育20分鐘，然后用PepCleanC18柱(得自Pierce)凈化，接著將其直接加入到50pL的懸浮液中，該懸浮液為含有IOmgF108-PDS涂敷的多孔顆粒的磷酸緩沖液。激酶與肽的接合向由TA/PC6Cys(Acm)肽(90jng，18nmol)在18juL0.1M的磷酸緩沖液(pH8)中形成的溶液中加入l.8uL的50。/。的MeOH水溶液(其中溶有5mg/mL殃)(8.6ng，34nmol，相對于巰基是2倍過量的)。將所得的反應混合物在25t:下溫育20分鐘，然后用PepCleanC18柱(得自Pierce)凈化，接著將其直接加入1.5mL含有1.3mg/ml的激酶-PDS的磷酸緩沖液中。TA4PC6CysH的形成PC6-對硝基苯酯與TA4Cys(Acm)的反應。向由TA4Cys(Acm)肽(1mg，0.2iumol)在lmL0.1M的磷酸緩沖液(pH8)中形成的溶液中加入10ML0.1M的PC6-對硝基苯酯DMS0溶液(0.8pmol，5當量)。將所得的反應混合物在4X:下溫育2天，然后用NAP-10柱(得自GEHealthcare)通過凝膠過濾進行純化，從而得到1.5mL的TA4PC6Cys(Acm)水溶液，并最終將其凍干。LC-MS(PhenomenexGemini,C18，5jim，150x3.0mm，A:0.1%的甲酸水溶液，B:0.1%的甲酸乙腈溶液，在10分鐘內B由10%升至90%)"=4.lmin(UV信號)，對于[M+6H廣，m/z-856.0，對于[M+5H廣，m/z-1026.8，對于[M+4H廣，m/z=1282.6。半胱氨酸的脫保護。將TA4PC6Cys(Acm)溶于lmL的TFA/苯甲醚(99:1)中，并加入6mg的AgOTf(20jimol，100當量)。將所得混合物在4X:下保持2小時后，用冷的醚使肽的銀鹽沉淀，然后通過離心進行分離，而后再用醚洗滌2次。向所得物中加入116juLDTT(10mg/ml)的乙酸(1M)溶液，并用1M的乙酸將所得溶液的體積增大至1mL。在25X:下經(jīng)過l夜之后，用NAP-15柱通過凝膠過濾純化肽，從而得到1.5mL的TA4PC6CysH水溶液，并將其凍干。LC-MS(PhenomenexGemini,C18，5pm，150x3.0mm,A:0.1%的甲酸水溶液，B:0.1%的曱酸乙腈溶液，在10分鐘內B由10%升至90%)tR=4.6min(UV信號)，對于[M+6H廣，m/z=843.5，對于[M+5H廣，m/z=1012.3，對于[M+4H]"，m/z=1264.6。TA一PC6CysH的形成PC6-對硝基苯酯與TA4+Cys(Acm)的反應。向由TA4+Cys(Acm)肽(1mg，0.2iumol)在lmL0.1M的磷酸緩沖液(pH8)中形成的溶液中加入10yL0.1M的PC6-對硝基苯酯的DMSO溶液(O.8jnmol，5當量)。將所得的反應混合物在41C下溫育過夜，然后用NAP-10柱(得自GEHealthcare)通過凝膠過濾進行純化，從而得到1.5mL的TA4+PC6Cys(Acm)水溶液，并最終將其凍干。LC-MS(PhenomenexGeminiC18，5ym，150x3.0mm，A:0.1°/。的甲酸水溶液，B:0.1%的甲酸乙腈溶液，在10分鐘內B由10%升至90%)^=4.0min(UV信號)，對于[M+8H廣，m/z-670.3，對于[M+7H]7+，m/z-766.1，對于[M+6H]"，m/z=893.4。半胱氨酸的脫保護。將TA4+PC6Cys(Acm)溶于lmL的TFA/苯甲醚(99:1)中，并加入6mg的AgOTf(20pmol，100當量)。將所得混合物在4'C下保持2小時后，用冷的醚使肽的銀鹽沉淀，然后通過離心進行分離，而后再用醚洗滌2次。向所得物中加入116pLDTT(10mg/ml)的乙酸(1M)溶液，并用1M的乙酸將所得溶液的體積增大至lmL。在25"C下經(jīng)過1夜之后，用NAP-15柱通過凝膠過濾純化肽，從而得到1.5mL的TA4+PC6CysH水溶液，并將其凍干。LC-MS(PhenomenexGemini,C18，5nm，150x3.0mm，A:0.1%的甲酸水溶液，B:0.1%的甲酸乙腈溶液，在10分鐘內B由10°/。升至90%)tR=4.6min(UV信號)，對于[M+8H]"，m/z=661.5，對于[M+7H;T+，m/z=755.9，對于[M+6H廣，m/z-881.6。配體向所述肽文庫的各種多肽支架結構中的引入以下給出用于引入磷酸膽堿衍生物的一個更加概括的方法。本領域的技術人員將能夠對所述方法進行修改，從而使其針對可能應用的具體條件達到最優(yōu)化。將所述文庫中的各種肽溶于lmL的50mM磷酸緩沖液(pH8)中，直至肽的濃度為lmM，由此形成儲備溶液。假設水的含量為25%，由肽的分子量來計算用于形成所述儲備溶液所需的肽的量。利用在355nm下值為20300M^cm—i的消光系數(shù)來確定各種儲備溶液的濃度。將100pL的各種儲備溶液轉移至微量滴定板的孔中，并加入2當量的溶于DMSO中的待檢測的配體活性酯(初始濃度為100mM)，然后使混合物反應1小時。親和性測定在微量滴定板的一組分開的孔中，將C-反應蛋白(CRP)溶于包含10mM的HEPES、150mM的NaCl和5mM的CaCl2的混合物(pH7.4)中，直至濃度為500nM。將用配體官能化的各種多肽和熒光團稀釋，并加入到含有目的蛋白的各個孔中，從而得到最終濃度為500nM的肽。作為陰性對照，在平行試驗中，使用具有熒光團但不具有配體的多肽來實施相同的過程。將微量滴定板引入到基于熒光的滴定板讀取器中，其中所述讀取器被設定為激發(fā)波長為355nm，發(fā)射波長為420nm。將這樣的肽作為"釆樣數(shù)"，所述肽在用配體官能化的形式下與不具有配體的形式下的熒光發(fā)射強度是不同的，并且選擇該肽用于更詳細的分析。使用熒光計來對親和性進行詳細分析的方法在表l和圖2中給出。所用多肽具有名為3-C15L8的序列。雖然C-反應蛋白具有5個磷酸膽堿的結合位點的事實使得對熒光強度的數(shù)據(jù)分析復雜化，但清楚的是，在5mM的CaCl2存在的條件下，C-反應蛋白與官能化的多肽的親和性與低nM解離常數(shù)一致，或者親和性更高。具有熒光團但不具有配體的多肽的相應試驗表明，熒光強度作為CRP濃度的函數(shù)沒有發(fā)生改變，表明多肽支架結構本身對CRP具有極低的親和性。因此，多肽與磷酸膽堿衍生物的結合形成了CRP的結合劑，其中官能化的多肽組分與CRP之間的協(xié)同作用導致總體上極高的親和性。表l:<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>固相CRP的檢測涉及本發(fā)明的結合劑(其與固相結合)的CRP檢測的一個實施方案示意性地顯示于圖3中。在該檢測中，CRP的捕獲是由與乳膠顆粒連接的CRP-結合劑完成的，并且識別信號是由與丙酮酸激酶綴合的結合劑產生的。所述激酶在所加入的PEP(磷酸烯醇丙酮酸)的幫助下將ADP磷酸化，從而形成ATP。而ATP又與螢光素酶形成了復合體，該復合體能夠使螢光素酶催化螢光素的氧化過程，從而形成氧化螢光素。該反應過程產生了光。光的強度成為樣品中激酶的量的直接量度，而激酶的量又成為所結合的CRP的量的量度。與乳酸顆粒結合的CRP-結合劑的制備將直徑為239nm的單分散性聚苯乙烯乳膠顆粒懸浮于含有聚合物表面活性劑PluronicF108的超純(Mi11iQ)水中，其中所述的聚合物表面活性劑PluronicF108具有與吡咬基二硫化物(PDS)接合的端基，從而允許其與含有巰基的配體連接。所述的表面活性劑分子通過它們的疏水性中心嵌段而吸附于所述顆粒上"。通過沉降流場分離(SdFFF)方法測定出，在經(jīng)過過夜吸附后，被各個顆粒吸附的Pluronic分子的數(shù)目為1650015。然后，將PDS基團用含有Cys的CRP-結合劑代替。上文給出了用于固定結合劑(Ta4+)的方法。通過SdFFF方法進行的分析表明，各顆粒吸附了2560個結合劑分子。對原樣形式的、或在經(jīng)過雙官能的連接體分子(SPDP，PierceBiotechnology,產品號21857)處理后的、或在通過二硫鍵橋與結合劑連接(上文給出的示例性方法)之后的丙酮酸激酶(得自兔肌的111型丙酮酸激酶；Sigma-Aldrich，產品號P9136-5KU)進行檢測。按照以下方式來分別對三種形式的丙酮酸激酶將ADP磷酸化的能力進行檢測將在50mM的甘氨酸-TRIS緩沖液(pH7.6)中含有0.36mg丙酮酸激酶的等分試樣均加入到"發(fā)光試劑"中，即，含有40iiL的0.5mg/mL的螢光素酶("熱穩(wěn)定的"，得自BioThemaAB，Stockholm)、10"L的8.9mg/mL的PEP(得自Sigma-Aldrich)、以及10jnL的15mM的螢光素(得自Sigma-Aldrich)的混合物。在時間t-0時，將10pL的ADP等分試樣(得自Sigma-Aldrich，2.6mg/mL)加入到各樣品混合物中，然后用CCD照相機在300秒內跟蹤發(fā)光情況。結果如圖4所示。三種形式的丙酮酸激酶在很大程度上具有相當?shù)幕钚?。與經(jīng)修飾的丙酮酸激酶相比，出乎意料的是，購買的丙酮酸激酶產品的活性稍差一些，這可能是由于在處理過程中(無意地)除去了少量抑制劑的原因。使用CCD照相機測定圖3所示類型的反應混合物的光子通量，并且還測定了以CRP的特異性抗體IgY作為CRP的結合劑(而沒有使用本發(fā)明的CRP-結合劑)的反應混合物的光子通量。所述試劑的濃度和總量與圖4中用于"發(fā)光試劑"的所述的情況相同。樣品為不含CRP的血清，或是含有12mgCRP/L的血清。最大的光子通量是由其中位于顆粒表面上的CRP-結合劑已經(jīng)從濃縮血清樣品中捕獲了CRP的混合物提供的。在經(jīng)過3個循環(huán)的洗滌和離心之后，允許混合樣品吸附結合劑-激酶的綴合物；然后，將其與上述發(fā)光試劑混合，從而允許其產生光子通量。同樣，允許含有抗體(抗-CRPIgY，由Prof.A.Larsson，UppsalaAcademicHospital惠贈)的顆粒與得自濃度(12mg/L)已知的血清中的CRP結合。如上所述，加入抗體-激酶綴合物，從而產生光子通量。將不含CRP的血清作為空白對照。除了剛剛描述的4種樣品之外，還存在一種樣品，該樣品只由涂敷有表面活性劑的納米顆粒構成，其中所述的納米顆粒的尺寸與4種實際樣品中帶有結合劑或抗體的顆粒的尺寸相同。所得結果如圖5所示。圖5清楚地示出，基于結合劑的CRP的檢測產生了強的信號，而由不含有CRP的血清產生的基于結合劑的信號形成了光強度為0的直的基線?；诳贵w的檢測在含有CRP的血清中產生了稍弱的信號，但是由不含CRP的血清所產生的信號來判斷，證實與結合劑類似物相比，抗體具有更高的非特異性吸附。在本研究中，涂敷有表面活性劑的顆粒是完全的空白對照。與圖5所示類似的試驗是在綴合有結合劑的乳膠顆粒(10jLiL，10%w/v聚苯乙烯顆粒，直徑為239nm)上進行的。將所述顆粒加入到100juL得自狗、馬或人的血清中，其中狗和馬的血清中CRP的含量是未知的，而人的血清中CRP的含為12mg/L。在將混合物溫育10分鐘后，將所述顆粒洗滌，然后離心，重復3次，然后與結合劑-激酶綴合物溫育15分鐘。在經(jīng)過3次洗滌之后，加入圖4所述的"發(fā)光試劑"，然后用得自BioThema的光度計掃描所述樣品，其中所述光度計用于測量累積產生的光子，并計算作為激酶濃度的量度的ATP生成的速率，而所述的激酶的濃度又與樣品中CRP的量成比例。所得結果示于圖6和表1中。由上述分析，清楚表明本發(fā)明的結合劑不僅具有捕獲得自人的CRP的能力，還具有捕獲得自狗和馬的CRP的能力。反應速率(pmol/min)0.045±0.007人CRP狗CRP馬CRP0.084±0.0090.026±0.007參考文獻Hansen^HJ.,LaFontame,G.,Newman,E.S.,Scliwartz,M.K.,Malkin,A.,Mojzisik,K.,Martin3.W.,Goldenberg,D.M.,(1989)Solvingtheproblemofantibodyinterferenceincommercial"s幼dwich"-typeimmunoassaysofcarcinoembryonicantigen.Clin.Chera,35,146-151,2Moseley,K.R_fKnapp,R.C.,Haisma,H.J,,〖1988)Anassayforthedetectionofhumananti-murineimmunoglobulinsintiiepresenceofCA125antigeaJ.Immunol-Methods,106,1-6.3R.P.Jain,R.M.Willi咖refraAafron2001,57,6505-6509.4A.Kamitani,N.Chatani,S.M咖i/4"gew.CAew.2003,〃<5,1435-1437;CAem.2003，42.1397-1399.5S.Kim,J.ILee,Y.C.Kim/'Og.C/i抓.1985,JO,560-565.6C.E.McKenaa,M.T.Higa'N.H.Cheung,M,CMcKcnnarefraAerfron丄e".1977,/S,155-158.b)C.E.McKenna,Jf.Schmidhauserj;Oiew.Soc.,Diew.Cbwm.1979,739.7P.A,Bartlet^L.A.McQuaid/j仿.CAem.5Vc,1984，706,7854-7860.8W.C.Chan,P,D.Whitein尸wocSo/M戶AosePepWde^"Aew's,J/Vocrica/^/iwocA(Eds.:W.C.Chan^P.D.White)OxfordUniversityPress,Oxford2000,pp.55-56.9E.G.Brown,J.M.Nuss7V/raAedrcwieff.1997,3&8457-8460.10J.Cai,B.WatheyrefroAe&oniert.2001,C1383-1385.11R.P.Jaii^R.M.Williams:Asymmetricsynthesisof(S)~(+)-caraitineandanalogs,71raAedw57(2001)(5505-09.'2S.Rahal,L.Badache:TheEschweiler-Clarkemethylationofaminoacids,J。Krna/rfe/aSoct'eie/4,ge"'en"eCA,'加'e4(1994),75-8513PAFowler,A.H.Haines,R.J.K,Taylor,E丄T.Chrystal,M.B.Giavestock:SynthesisandbiologicalactivityofacyclicanaloguesofNojirimycii^乂CS/VWw/(1994)2229-35."Bohner,M.'Ring,T.A,'Rapoport^N.andCaldwell,K.D."FibrinogenuptakebyPSlatexparticlescoatedwithvariousartiountsofaPEO/^PO/PEOtriblockcopolymer",J.BiomaterialsSci.，Polymered.,13(2002),733-746,15Andersson^M.,Fromell,K.,G函erg,E.,Artursson,P.，andCaldwell,K.D."CharacterizationofSurfaceModifiedNanoparticlesfor!-"vivoBiointeraction-ASedimentationField-FlowFractionationStudy",n'"/CV卿—(2005)77,5488-5493.權利要求1.具有根據(jù)SEQIDNO1的序列的多肽，其中至少一個磷酸膽堿衍生物與所述的多肽連接。2.由2個二聚化的根據(jù)權利要求1所述的多肽構成的多肽，其中所述的2個原聚體具有相同或不同的氨基酸序列。3.根據(jù)權利要求1或2所述的多肽，其中所述磷酸膽堿衍生物與原聚體之一的、位于位置8、17、22或34上的賴氨酸連接。4.根據(jù)權利要求1-3的任意一項中所述的多肽，其還具有與所述多肽連接的報告基團，該報告基團優(yōu)選地與原聚體之一的、位于位置10、15、25或37上的賴氨酸連接。5.根據(jù)權利要求1-4的任意一項中所述的多肽，其中所述的磷酸膽堿衍生物通過間隔物與所述多肽連接，所述間隔物包含長度為1-12個碳原子的碳鏈。6.根據(jù)權利要求1-5的任意一項中所述的多肽，其與C-反應蛋白的結合親和力小于IOO納摩爾。7.根據(jù)權利要求1-6的任意一項中所述的多肽，其中所述原聚體具有相同的序列或不同的序列，并且所述的序列選自SEQIDN0:3-18。8.用于生產根據(jù)權利要求2-7的任意一項中所述的多肽二聚體的方法，所述方法包括以下步驟-合成至少2個具有根據(jù)SEQIDNO:l的序列的多肽；-在適于所述磷酸膽堿衍生物與所述賴氨酸發(fā)生連接的條件下使者說磷酸膽堿衍生物與所述多肽之一的未封閉的賴氨酸接觸；-任選地，在適于所述報告基團與所述賴氨酸發(fā)生連接的條件下使報告基團與所述多肽之一的未封閉的賴氨酸接觸；以及-使所述多肽形成多肽二聚體。9.用于測定樣品中C-反應蛋白的濃度的方法，所述方法包括使所述樣品與根據(jù)權利要求l-7的任意一項中所述的多肽相接觸的步驟。10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其中所述樣品得自患病的哺乳動物。11.根據(jù)權利要求9-10的任意一項中所述的方法，其中所述的多肽二聚體與固體支持物結合。12.根據(jù)權利要求11所述的方法，其包括以下步驟-使所述樣品與根據(jù)權利要求1-7的任意一項中的第一多肽接觸，所述第一多肽與固體支持物結合；-使所述樣品與根據(jù)權利要求4-7的任意一項中的第二多肽接觸，所述第二多肽具有與其連接的報告基團；以及-檢測在所述第二多肽上的所述報告基團的存在或缺失情況。13.用于純化C-反應蛋白的方法，其包括使包含C-反應蛋白的組合物與根據(jù)權利要求1-7的任意一項中所述的多肽接觸。14.含有根據(jù)權利要求1-7的任意一項中所述的多肽的藥物組合物。15.含有根據(jù)權利要求1-7的任意一項中所述的多肽的診斷用組合物。全文摘要本發(fā)明涉及多肽二聚體，其中2個原聚體都具有根據(jù)SEQIDNO1的序列，并且其中至少1個磷酸膽堿衍生物與所述多肽連接。所述多肽對C-反應蛋白(CRP)顯示出特異的結合作用。本發(fā)明進一步涉及所述多肽在用于檢測CRP的濃度的測定中、以及在純化CRP和含有CRP的組合物中的用途。文檔編號C07K1/10GK101415727SQ200780012601公開日2009年4月22日申請日期2007年4月10日優(yōu)先權日2006年4月7日發(fā)明者L·巴爾策申請人:莫德普羅股份公司